UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA
LUDMILA CRUZ DOS SANTOS PIETRA ALEXIA LIMA DOS SANTOS
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DA FRAÇÃO HEXÂNICA DA ENTRECASCA DE Maytenus rigida Mart.
São Cristóvão-SE 2017
LUDMILA CRUZ DOS SANTOS PIETRA ALEXIA LIMA DOS SANTOS
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DA FRAÇÃO HEXÂNICA DA ENTRECASCA DE Maytenus rigida Mart.
São Cristóvão-SE 2017
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Departamento de Farmácia da Universidade Federal de Sergipe, como requisito para obtenção do título de Bacharel em Farmácia.
Área de concentração: Ciências da Saúde.
LUDMILA CRUZ DOS SANTOS PIETRA ALEXIA LIMA DOS SANTOS
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DA FRAÇÃO HEXÂNICA DA ENTRECASCA DE Maytenus rigida Mart.
Data da defesa: 31/05/2017 Nota final: _____
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________ Prof. Dr. Charles dos Santos Estevam
Orientador
Universidade Federal de Sergipe - UFS
___________________________________________ Prof. Dr. Samuel Bruno dos Santos
1º Examinador
Universidade Federal de Sergipe – UFS
___________________________________________ Prof. Dra. Kelly Cristina dos Santos Teixeira
2º Examinador
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Departamento de Farmácia da Universidade Federal de Sergipe, como requisito para obtenção do título de Bacharel em Farmácia.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos à Deus pela vida, por iluminar nosso caminho e pela capacidade que nos deu de
desenvolver este trabalho e concluir mais uma etapa de nossas vidas. O Senhor é TOP!
Aos nossos pais (José dos Santos, Marluce Cruz, Sônia Cristina, Kelber José e a avó,
Aparecida Ferreira), pelo apoio e palavras de conforto e incentivo nos momentos mais tensos. Aos nossos familiares, e irmãos (Pablo Rodrigo, Uriel Lucas, Pablo José e Pâmela Cruz), por
acreditarem em nós e em nossos sonhos, pelo apoio e paciência, pelas conversas (muitas vezes sem sentido) nos momentos de pausa quando a mente já não trabalhava tão bem; obrigada por serem nossa base e porto seguro e por nos oferecerem o melhor de vocês sempre.
Amamos vocês. E tudo vira família!
Ao Prof. Dr. Charles dos Santos Estevam, pela paciência, orientação e ombro amigo, não só durante o desenvolvimento deste trabalho, como também por todo o tempo em que nos acolheu em seu laboratório de pesquisa durante toda a graduação (uma vida!), chegamos tão miúdas e medrosas frente a um vasto conhecimento que hoje respeitamos e damos tanto valor.
Ao Prof. Dr. Samuel Bruno, nosso co-orientador, por sua amizade, apoio e conselhos. Ao Prof. Dr. Antônio Santos Dias, pela amizade, puxões de orelha e ensinamentos, por ser um
exemplo para nós. Você foi singular para a nossa formação acadêmica e crescimento pessoal.
À Prof. Andréa Shan e a toda família do Laboratório de Química de Produtos naturais e Bioquímica, pelo companheirismo e partilha do saber, cada um contribuiu muito para o nosso
aprendizado e crescimento profissional. As nossas amigas Andressa da Silva, Melina Vieira e Karina Mota, que apesar de nossas diferenças e de estarmos em cursos diferentes, nossa amizade foi além do laboratório e dos portões da universidade, são muitos “eitas”, mas cada um deles vale a pena com vocês. À Clívia Rolemberg, Kelly Cristina, Clisiane Carla, que se tornaram mais que companheiras de trabalho, cooperando quando necessário e sempre com
muita alegria a nos oferecer, vocês fazem parte disso.
Aos amigos de curso (Guilherme, Wesley, Yamaara, Ingrid e Daniely), melhor, amigos da vida, que fizeram e THANKS GOD! ainda fazem parte do nosso dia a dia, compartilhando os
conhecimentos, dificuldades, alegrias e porque não tristezas. Nosso muito obrigada. Empatia bateu e ficou por aqui!
Por fim a todos aqueles que de uma forma direta ou indiretamente contribuíram para que esse momento se tornasse realidade. Muito obrigada!
Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades, lembrai-vos de que as grandes coisas do homem foram conquistadas do que parecia impossível” Charles Chaplin
RESUMO
O uso de plantas medicinais para fins terapêuticos vem aumentando no decorrer do tempo, isto, promove a inserção de novas substâncias no mercado farmacêutico para utilização em enfermidades humanas, ressaltando aquelas causadas por microrganismos. Atualmente a saúde pública vem enfrentando obstáculos com o aumento da resistência bacteriana agravando-se pelas dificuldades na descoberta de novos fármacos. Maytenus rigida Mart., é uma planta conhecida popularmente como “Bom-nome”, pertence à família Celastraceae e seu gênero, Maytenus, é considerado pantropical. Usada na medicina popular, é empregada nos casos de dores em geral, infecções e inflamações. Este estudo buscou identificar os principais constituintes químicos, bem como avaliar a atividade antimicrobiana e citotóxica da fração hexânica de M. rigida. A prospecção fitoquímica foi analisada a partir de um conjunto de reações colorimétricas e de precipitação. Observou-se a presença de grupos de metabólitos do tipo flavonoides e triterpenóides encontrados na fração utilizada. Para a avaliação citotóxica foi realizado o ensaio de MTT utilizando a linhagem celular de macrófagos J774. A viabilidade das células tratadas foi superior a 75%, demonstrando ausência de efeito citotóxico. A atividade antimicrobiana foi avaliada por determinação dos halos de inibição através do método de difusão em ágar Mueller-Hinton, e a concentração inibitória mínima por turvação dos caldos de cultura. Com base nesses ensaios, verificou-se que a fração utilizada apresentou atividade antimicrobiana para Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Enterobacter aerogenes, com halos de inibição de 9 mm, 14 mm e 15 mm respectivamente. Os experimentos foram feitos em triplicata, analisados por Análise de variância (ANOVA), seguido de pós teste Tukey (p<0,05). Assim, a fração hexânica apresentou metabólitos secundários que corroboram para um potencial efeito à atividade antimicrobiana e biológica, além de favorecer significativamente a viabilidade dos macrófagos J774.
Palavras-chave: Maytenus rigida Mart., atividade antimicrobiana, fração hexânica,
ABSTRACT
The use of medicinal plants for therapeutic purposes has been increasing over time, this, promotes the insertion of new substance in the pharmaceutical market for the use in human diseases, highlighting those caused by microorganisms. Currently the public health come facing obstacles with the increase of bacterial resistance aggravated by the difficulties in discovering new drugs. Maytenus rigida Mart., is a plant popularly known by "Bom-nome", belongs to the Celastraceae family and its gender, Maytenus, is considered pantropical. Used in folk medicine, is employed in cases of pain in general, infections and inflammation. This study looked for identify the main chemical constituents, as well as evaluate the antimicrobial and cytotoxic activity of the hexanic fraction of the specie Maytenus rígida Mart. The phytochemical prospection was analyzed from a set of colorimetric and precipitation reactions. The presence of groups of flavonoid and triterpenoid type metabolites found in the fraction used. For the cytotoxic analysis the MTT assay was performed using the J774 macrophages cell line. The viability of the treated cells was above 75%, demonstrating the absence of cytotoxic effect. The antimicrobial activity was evaluated by determination of the inhibition halos (millimeters) by the method of diffusion in Mueller-Hinton agar, and the minimum inhibitory concentration by turbidity of the culture broths. Based on these test, it was verified that the fraction used showed antimicrobial activity for Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Enterobacter aerogenes, with inhibition halos of 9 mm, 14 mm and 15 mm respectively. The experiments was done in triplicate, analyzed by Analysis of Variance (ANOVA) followed by Tukey post test (p<0,05). Thereby, the hexanic fraction, shown secondary metabolites that corroborate to a potential effect to the antimicrobial and biologic activity, besides favoring significantly (p < 0,05) the viability of the macrophages J774.
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Detecção colorimétrica de antocianinas, antocianidinas e flavonoides...4
TABELA 2. Detecção colorimétrica de leucoantocianidinas, catequinas e flavononas...5
TABELA 3. Constituintes químicos presentes na fração hexânica da entrecasca de Maytenus
rigida Mart...9
TABELA 4. Dados do Dimetilsufóxido (veículo) e da fração hexânica da entrecasca de
Maytenus rigida sobre a viabilidade celular em macrófagos
J774...10
TABELA 5. Atividade antimicrobiana da fração hexânica da entrecasca de Maytenus rigida...
LISTA DE ABREVIATURAS
ANOVA: Análise de Variância
BHI: Brain Heart Infusion
CHCL3: Clorofórmio
DMSO: Dimetilsufóxido
DO: Densidade ótica
EHE: Extrato hidroetanólico
ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Ensaio Imunoenzimático)
FHX: Fração hexânica
FeCL3: Cloreto férrico
H2SO4: Ácido sulfúrico
HCl: Ácido clorídrico
MIC: Concentração inibitória mínima
MTT: Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide (Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)2,5-diifeniltetrazólio)
Na2SO4: Sulfato de sódio
NaOH: Hidróxido de sódio
OMS: Organização Mundial da Saúde
SUS: Sistema Único de Saúde
TSB: Caldo tríptico de soja
UFS: Universidade Federal de Sergipe
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 1
2. METODOLOGIA ... 3
2.1. Coleta e Identificação do Material Vegetal ... 3
2.2. Preparo do Extrato ... 3
2.3. Prospecção Fitoquímica para Classes de Metabólitos Secundários ... 3
2.3.1. Teste para Fenóis e Taninos ... 3
2.3.2. Teste para Antocianinas, Antocianidinas e Flavonoides ... 4
2.3.3. Teste para Leucoantocianidinas, Catequinas e Flavononas... 4
2.3.4. Teste para Esteroides e Triterpenoides (Liebermann-Buchard) ... 5
2.3.5. Teste para Saponinas ... 5
2.3.6. Teste para Alcaloides... 6
2.4. Análise de Citotoxicidade ... 6
2.4.1. Viabilidade Celular de Macrófagos J774 ... 6
2.5. Atividade Antimicrobiana ... 7
2.5.1. Teste de Difusão em Ágar ... 7
2.5.2. Concentração Inibitória Mínima (MIC) ... 8
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 8 3.1. Prospecção Fitoquímica ... 8 3.2. Análise de Citotoxicidade ... 10 3.3. Atividade Antimicrobiana ... 11 4. CONCLUSÃO ... 13 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 14
1 1. INTRODUÇÃO
O uso de plantas medicinais, na maioria das vezes é o principal recurso terapêutico para algumas comunidades. A utilização de plantas com a finalidade de obtenção da cura e tratamento de diversas doenças remete aos tempos mais remotos, e permanece até o presente. A procura por substâncias bioativas tem tido destaque nas instituições de pesquisa brasileiras tendo em vista que o Brasil dispõe de uma ampla biodiversidade em sua flora, contando com cerca de 13% da diversidade florística global (SILVA; DUARTE; VIEIRA, 2014).
A Organização Mundial de Saúde (OMS) define planta medicinal como sendo todo e qualquer vegetal, que possui em um ou mais órgãos, substâncias que podem ser utilizadas com fins terapêuticos ou que sejam percursores de fármacos semi-sintéticos. A utilização de produtos naturais para o tratamento de doenças é uma prática que vêm sendo promovida por instituições de saúde (SANTOS et al., 2011). A utilização destes tem sido preconizada uma vez que a saúde pública vem enfrentando obstáculos quanto ao aumento da resistência bacteriana, agravando-se pelas dificuldades na descoberta de novas substâncias antimicrobianas.
As plantas produzem substâncias denominadas de metabólitos secundários. Essas substâncias desempenham diversas funções biológicas no vegetal, como proteção contra predadores, fornecimento de cor e proteção à radiação solar (DEWICK, 2002). Além disso, as classes dos metabólitos secundários, tais como cumarinas, flavonoides, alcaloides e terpenóides promovem uma gama de atividades biológicas, como ação antitumoral, anti-inflamatória, antibacteriana, antiparasitária, antiviral, entre outras (COUTINHO et al., 2009; MIDDLETON et al., 2000; VUNDA et al., 2012). Logo, pode-se destacar a importância das plantas medicinais para o desenvolvimento de pesquisas farmacológicas, sendo possível encontrar novas substâncias que possam atuar como agentes terapêuticos ou servir como matéria-prima na produção dos mesmos (WHO, 1998). Vale ressaltar que o interesse das plantas como recurso terapêutico está além do intuito de desenvolver medicamentos fitoterápicos, relacionando-se também ao ato de registrar o material vegetal de acordo com sua utilização dentro de uma comunidade, sua função no contexto da medicina tradicional, bem como a incorporação do material na rede de saúde pública, principalmente na atenção primária à saúde no setor do Sistema Único de Saúde (SUS) (BITTENCOURT et al., 2002; PIRES et al., 2014).
Sabendo que a importância do uso de plantas medicinais vai além da medicina tradicional, a espécie escolhida para este trabalho foi a Maytenus rigida Mart., pertencente à
2 família Celastraceae, sendo coletada no estado de Sergipe. Essa família compreende 85 gêneros e é composta por mais de 900 espécies dispostas em regiões tropicais e subtropicais em todo o mundo, e estas possuem um longo histórico de uso na medicina popular, principalmente na América do Sul (JOLY, 1993). No Brasil a família Celastraceae é representada por três gêneros:
Maytenus Juss., Austroplenckia Lund. e Franhofera Mart. O gênero Maytenus apresenta
distribuição pantropical, e é também o maior e mais diversificado da família Celastraceae, tendo 40% das suas espécies no Brasil, sendo este composto por espécies de porte arbóreo, arbustivo e subarbustivo (CARVALHO-OKANO; LEITÃO FILHO, 2004). Além disso, as espécies deste gênero são ricas em metabólitos bioativos da classes dos terpenos ou isoprenóides (GUTIEERREZ et al., 2007), aos quais são atribuídos diversas atividade biológicas, tais como antimalária (MUREGI et al., 2007; MUTHAURA et al., 2007), anti-inflamatória e antioxidante (BRUNNI et al., 2006; BUFFA et al., 2004; VELLOSA et al., 2006).
As espécies da família Celastraceae são estudas não somente por conta da diversidade de atividades biológicas, mas também pela ampla distribuição espacial, sua composição química e a complexidade de seus metabólitos secundários, destacando-se os triterpenos pentacíclicos (SILVA; DUARTE; VIEIRA, 2014). Silva, Duarte e Vieira (2014) relataram que as espécies Maytenus ilicifolia e Maytenus aquifolium, ambas nativas do Brasil e utilizadas pela medicina popular, são usadas em infusão aquosa para o tratamento úlceras e problemas gastrointestinais. A espécie do gênero Maytenus rigida, também nativa do Brasil, é conhecida popularmente como "Bom-homem", "Bom-nome", "Cabelo-de-negro", "Casca grossa" e "Pau-de-colher", se apresenta como uma árvore de pequeno porte e sua entrecasca é popularmente empregada nos casos de dores em geral, infecções e inflamações (AGRA et al., 2008; MOTA; ALBUQUERQUE, 2002). O extrato etanólico das cascas de M. rigida apresenta atividade anti-inflamatória, antiulcerogênica e antidiarreica (SANTOS et al., 2007).
Levando em consideração o pouco relato de ensaios na literatura sobre a espécie M.
rigida Mart. quanto ao seu potencial biológico e a importância do conhecimento sobre esse
assunto, bem como a necessidade de investigação da composição química e toxicidade do vegetal, fora sua utilização na medicina popular, o objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade biológica, compreendendo a análise citotóxica e antimicrobiana, além do perfil fitoquímico da fração hexânica da entrecasca do vegetal. A justificativa para escolha desta espécie é a presença de metabólitos do tipo terpenóides e flavonoides, aos quais são atribuídos uma série de atividades biológicas, destacando-se a ação antimicrobiana.
3 2. METODOLOGIA
2.1. Coleta e Identificação do Material Vegetal
Foram coletados 2,5 Kg da entrecasca de Maytenus rigida, em 21 de julho de 2015, no povoado Olho D’Água Do Casado, localizado a 09º38´31´´S e 37º47´18´´W, no município de Canindé do São Francisco, Sergipe - Brasil. Um espécime do material foi depositado e registrado no herbário da Universidade Federal de Sergipe sob o número 00767, e a identificação botânica foi realizada pelo Professor Doutor Carlos Dias da Silva Júnior do Departamento de Biologia da própria universidade.
2.2. Preparo do Extrato
Foram separados 2,3 Kg da entrecasca do vegetal e posto para secagem em estufa de circulação e renovação de ar a 37ºC até peso constante. Logo após, o material foi reduzido a pó com auxílio de um moinho de facas, e posteriormente foi submetido à extração por maceração exaustiva em etanol 90% durante 5 dias. O extrato foi filtrado e concentrado em evaporador rotatório sob pressão reduzida para eliminação do solvente e obtenção do extrato hidroetanólico (EHE) da entrecasca de Maytenus rigida. Parte do extrato hidroetanólico foi dissolvida em solução de Metanol/Água (2:3) e submetida a extração líquido-líquido com solventes para obtenção de frações, um dos solventes utilizado para extração foi o solvente hexano. A fração hexânica (FHX) obtida foi levada a evaporador rotatório para eliminação do solvente.
2.3. Prospecção Fitoquímica para Classes de Metabólitos Secundários
A prospecção foi realizada com a fração hexânica de Maytenus rigida, conforme Matos (2009), tendo como objetivo detectar a ocorrência dos constituintes químicos presentes na amostra. Para isto, foram utilizados 10 mg da fração hexânica, dissolvidos em etanol, 3 mL do extrato diluído foi distribuído em 7 tubos de ensaio para realização dos testes descritos a seguir.
2.3.1. Teste para Fenóis e Taninos
4 metálicos formando precipitados, e do cloreto de ferro em oxidar os fenóis. Ao tubo de ensaio contendo a fração hexânica foram adicionadas três gotas de solução alcoólica de cloreto férrico (FeCl3) 1 mol.L-1, depois de agitar foi observado qualquer variação de cor e/ou formação de precipitado escuro abundante. Como controle da reação foi utilizada uma amostra contendo somente água e FeCl3. O surgimento de cor variando entre azul e vermelha é indicativo da presença de fenóis, enquanto a formação de precipitado azul escuro indica a presença de taninos pirogálicos (taninos hidrolisáveis) e de cor verde, a presença de taninos flobabênicos (taninos condensados ou catéquicos).
2.3.2. Teste para Antocianinas, Antocianidinas e Flavonoides
O teste baseia-se na capacidade dos esqueletos flavônicos de mudarem de cor por ressonância eletrônica com equilíbrio ácido-base. Para o ensaio foram necessários três tubos de ensaio. Um dos tubos foi acidificado a pH 3 com ácido clorídrico (HCl) 3 mol.L-1 e os outros dois tubos foram alcalinizados a pH 8,5 e 11 com hidróxido de sódio (NaOH) 1 mol.L-1. A observação de qualquer mudança da coloração da solução foi analisada conforme descrito na Tabela 1.
Tabela 1. Detecção colorimétrica de antocianinas, antocianidinas e flavonoides
Cor
Constituintes pH = 3 pH = 8,5 pH = 11
Antocianidinas e antocianinas
Vermelha Lilás Azul-púrpura
Flavonas, flavonois e xantonas
- - Amarela
Chalconas e auronas Vermelha -
Vermelho-púrpuro
Flavononóis - -
Vermelho-laranja Fonte: Matos, 2009.
2.3.3. Teste para Leucoantocianidinas, Catequinas e Flavononas
5 temperatura. As hidrólises alcalinas e ácidas facilitam a identificação dos núcleos flavônicos. Para este ensaio, acidificou-se um tubo com a amostra por adição de HCl 3 mol.L-1 até pH 1-3 e alcalinizou-se outro tubo com NaOH 1 mol. L-1 até pH 11. Os tubos foram aquecidos cuidadosamente com auxílio de uma lamparina. A observação de qualquer mudança na coloração foi comparada com os tubos correspondentes utilizados no teste anterior, sendo a intepretação dos resultados feita com base na Tabela 2.
Tabela 2. Detecção colorimétrica de leucoantocianidinas, catequinas e flavononas
Constituintes
Cor
Meio Ácido Meio Alcalino
Leucoantocianidinas Vermelha -
Catequinas (taninos catéquicos) Pardo-amarelada -
Flavononas - Vermelho-laranja
Fonte: Matos, 2009.
2.3.4. Teste para Esteroides e Triterpenoides (Liebermann-Buchard)
Este teste é utilizado para averiguar a presença de núcleo esteroidal ou triterpenoidal. Para este ensaio foram utilizados 10 mL de uma solução contendo a fração hexância em béquer e, foi deixada para secar em banho-maria. Extraiu-se o resíduo seco do béquer por três vezes com porções de 1-2 mL de clorofórmio (CHCL3). A solução clorofórmica foi filtrada em um pequeno funil fechado com algodão coberto com alguns miligramas de sulfato de sódio (NA2SO4) anidro para um tubo de ensaio seco. Adicionou-se 1mL de anidrido acético e agitou-se suavemente. Foi acrescentado três gotas de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado, agitou-agitou-se e foi observado se ocorria o desenvolvimento de cores. A coloração azul seguida de verde permanente é um indicativo à presença de esteroides livres, enquanto a cor parda à vermelha indica triterpenoides pentacíclicos livres.
2.3.5. Teste para Saponinas
Este teste baseia-se no fato de que os heterosídeos saponosídeos (saponinas) tem propriedades detergentes e surfactantes e, quando tratados com HCl e aumento de temperatura, sofrem hidrólise, precipitam as agliconas e perdem suas propriedades detergentes. Foi usado neste ensaio os resíduos insolúveis em clorofórmio, separados no teste anterior, o material foi
6 solubilizado em água destilada e filtrado em um tubo de ensaio. Agitou-se fortemente o tubo com a solução por 2-3 minutos e foi observado a formação de espuma. O aparecimento de espuma persistente e abundante indica a presença de saponinas. Para confirmação da presença do metabólito, adicionou-se 2 mL de HCl concentrado ao conteúdo do tudo de ensaio que foi colocado imerso em banho-maria por 1 hora. Posteriormente, neutralizou-se, resfriando e agitando. A presença de precipitado e a não formação de espuma confirma a presença de saponina.
2.3.6. Teste para Alcaloides
Este teste baseia-se na precipitação de alcaloides ao interagir com o reagente Dragendorff. Este reagente consiste numa solução de iodeto de bismuto de potássio, em ácido diluído. Quando em contato com a amostra que contém alcaloides e compostos nitrogenados, formam precipitados. A solução apresenta mudança de coloração que varia de amarela à vermelha alaranjada. O precipitado é obtido através da formação de um complexo entre o átomo de bismuto e os grupamentos aminas presentes nos compostos a serem analisados. Foi diluída uma pequena quantidade a fração hexânica, transferiu-se para o tubo de ensaio e foram adicionadas 3 gotas de Dragendorff observando o resultado.
2.4. Análise de Citotoxicidade
2.4.1. Viabilidade Celular de Macrófagos J774
A viabilidade das células J774 (2 x 104 células) foi avaliada em triplicata após 24 horas de exposição contínua à fração hexânica (FHX) da Maytenus rigida e medida através do ensaio colorimétrico de redução do MTT (3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide) a formazan, conforme Mosmann (1983). Segundo este ensaio, a quantidade de formazan produzido é proporcional ao número de células viáveis. Após a aderência celular em placa de 96 poços, o meio de cultura foi substituído posteriormente por 200 μL de meio de cultura contendo a fração diluída em dimetilsulfóxido (DMSO) na concentração de 0,075%. As concentrações testadas da FHX foram 30, 100 e 300 μg.mL-1. Em seguida, a placa foi incubada por 24 h. Decorrido este tempo, o meio de cultura foi substituído por 200 μL de uma solução a 0,5mg.mL-1 do corante MTT, previamente filtrado em membrana milipore de 0,22 μm. Diante
7 disso, a placa foi incubada por 3 horas, para que ocorresse a redução do MTT à formazan. Após este período, todo o sobrenadante foi cuidadosamente aspirado e 200 μL de DMSO foram adicionados em cada poço para a solubilização do formazan. Posteriormente, todo o conteúdo foi transferido para uma nova placa e encaminhada ao leitor de ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) com absorbância ajustada a 570 nm. Para análise, os resultados foram normalizados de acordo com a equação abaixo, na qual VC corresponde à viabilidade celular e DO refere-se à densidade ótica:
% VC = [DO (células tratadas) − DO (branco)/DO (controle) − DO (branco)] × 100.
2.5. Atividade Antimicrobiana
Os testes de susceptibilidade microbiana pelo método de difusão em ágar Mueller-Hinton (CLSI, 2003) e determinação da Concentração Inibitória Mínima (MIC) foram realizados em triplicata para cada microrganismo em ambos os testes, sendo as cepas padrões de microrganismos gram positivos Staphylococcus aureus (ATCC 25 923), Enterococcus durans,
Enterococcus hirae (SS1225/ IAL 03/10), e microrganismos gram negativos Klebsiella pneumoniae (ATCC 700603), Escherichia coli (ATCC 25922) e Enterobacter aerogenes
(ATCC 13 048). A atividade antimicrobiana foi avaliada pela determinação dos halos de inibição em milímetros, sendo a interpretação dos resultados seguidas conforme SANTOS et al., (2011), onde os halos de inibição formados foram comparados com a tabela de referência, levando os microrganismos a serem classificados em relação a determinado agente como resistente, com zona de inibição igual e/ou inferior a 8 mm, intermediário, de 9 a 15 mm de zona de inibição, e sensível, entre 15 a 25 mm.
2.5.1. Teste de Difusão em Ágar
O teste foi realizado pelo método de Bauer et al., (1996), utilizando culturas overnight (35º C ±2) em 5 mL de caldo tripticase soja (TSB), reajustados para padrão 0,5 de Mac Farland, onde 100 foram inoculados em placas de Petri contendo 4 mm de Ágar Mueller-Hinton (pH 7,2 – 7,4) previamente solidificado. Posteriormente, discos de papel filtro com 6 mm de diâmetro, postos sobre a superfície do meio contendo os microrganismos, foram impregnados com 20 μL do extrato vegetal em diferentes concentrações, no caso refere-se à fração hexânica de Maytenus
8
rigida Mart. Os reagentes usados na dissolução do extrato foram utilizados como controle
negativo (CLSI, 2003), enquanto o antimicrobiano gentamicina 10 μg/mL - 120 μg/mL com atividade conhecida para cepas padrão ATCC, refere-se ao controle positivo.
2.5.2. Concentração Inibitória Mínima (MIC)
A concentração inibitória mínima foi determinada para cada microrganismo no qual o extrato vegetal apresentou atividade antimicrobiana, ressaltando que todos os ensaios foram realizados em triplicata. Culturas bacterianas desenvolvidas em caldo BHI por 6 horas a 35º C ±2 e diluídas a 108 UFC/mL foram inoculadas em tubos contendo caldo TSB, com diferentes concentrações do extrato, feitas por diluição seriada 1:2. Seguida a incubação de 24 horas a 37º C, observou-se a ocorrência de turvação dos caldos de culturas para determinação da concentração inibitória mínima (OSTROSKY et al., 2008), ou seja, a menor concentração capaz de inibir o crescimento de microrganismos.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Prospecção Fitoquímica
A triagem fitoquímica é o ensaio inicial e qualitativo para tomar conhecimento dos constituintes presentes na amostra vegetal, a partir disso pode-se avaliar as classes de metabólitos presentes, designando através de estudos na literatura à qual atividade biológica as substâncias são responsáveis. As informações de metabólitos secundários coletadas em uma triagem fitoquímica são importantes para o desenvolvimento de pesquisas, por exemplo, pois pode-se chegar ao isolamento de princípios ativos viáveis no desenvolvimento de novos fármacos (SILVA et al., 2010). Diante disso foi realizada a prospecção fitoquímica da fração hexânica da entrecasca de M. rigida, a qual apresentou os compostos químicos expostos na Tabela 3.
9 Tabela 3. Constituintes químicos presentes na fração hexânica da entrecasca de Maytenus
rigida Mart.
Constituintes Químicos Fração Hexânica
Alcaloides - Antocianidinas - Antocianinas - Catequinas + Chalconas e Auronas - Esteroides - Fenóis - Flavanonas + Flavanonóis + Flavonas + Flavonoides + Flavonóis - Leucoantocianidinas - Quinonas - Saponinas - Taninos +
Triterpenóides pentacíclicos livres +
Xantonas +
O sinal (+) indica a presença do metabólito, enquanto o sinal (-) indica ausência do metabólito.
Nota-se a presença de metabólitos como taninos, xantonas, compostos do tipo triterpenóides, e do grupo dos flavonoides. A literatura mostra que a espécie Maytenus ilicifolia, pertencente à família Celastraceae, a qual a M. rigida também faz parte, apresentou na composição química do seu extrato compostos do tipo taninos, terpenos e flavonoides (COLACITE, 2015). As atividades biológicas de alguns desses compostos são pouco conhecidas, como por exemplo, os terpenos; nessa classe há diversas estruturas diferentes que levam a compostos distintos e, consequentemente a atividades farmacológicas em potencial (ROBERTS, 2007).
A fração hexânica de M. rigida apresentou importantes compostos, dentre eles os taninos, que são metabólitos que apresentam como característica a sua capacidade de complexação com moléculas e macromoléculas, além de agir no sequestro de radicais livres permitindo uma série de aplicações farmacológicas, entre elas o controle de bactérias, insetos e fungos (JESUS; CUNHA, 2012). A fração em estudo apresentou compostos do grupo dos flavonoides, que estão associados a algumas atividades biológicas, como atividade antibacteriana, aintinflamatória, antioxidante e diurética (FERNANDES et al., 2005). Vale destacar que a busca preliminar por metabólitos secundários, mesmo que de forma qualitativa,
10 auxiliam na interpretação de resultados para ensaios biológicos. A positividade em determinadas atividades biológicas pode estar associada com o sinergismo dos compostos presentes no produto natural.
3.2. Análise de Citotoxicidade (in vitro)
Neste estudo, a fração hexânica de M. rigida, favoreceu de maneira significativa (p<0,05) a viabilidade dos macrófagos J774 em todas as concentrações testadas 30, 100 e 300 µg.mL-1 (Tabela 4) quando comparadas com as células não tratadas utilizadas como controles. Percebe-se também que o veículo utilizado não interferiu nos resultados, visto que não houve diferença significativa entre ele e a fração hexânica.
Tabela 4. Dados do Dimetilsufóxido (veículo) e da fração hexânica da entrecasca de Maytenus
rigida sobre a viabilidade celular em macrófagos J774.
Amostras Concentração Viabilidade Celular
Dimetilsufóxido (DMSO) – Veículo 0,075% 98,218 ± 1,442 (98%)
Fração Hexânica 30 µg/mL 100 µg/mL 300 µg/mL 99,083 ± 2,856 (99%) 101,527 ± 0,779 (101%) 104,454 ± 2,110 (104%) Os dados os quais refere-se à viabilidade celular foram expostos em média ± desvio padrão da média.
As concentrações testadas apresentaram níveis de viabilidade celular acima de 75%, quase não apresentando morte celular, ou seja, a fração hexânica não diminuiu a viabilidade dos macrófagos J774 em 75%, sendo que esse valor não é considerado citotóxico para uma amostra vegetal segundo Ribeiro et al., (2012). Diante do exposto, pode-se afirmar que a fração hexânica de M. rigida não apresenta toxicidade à linhagem de macrófagos J774.
Em outros estudos com plantas do mesmo gênero foram observados comportamentos semelhantes. No trabalho de Colacite, (2015) foi usado suspensão de hemácias para análise citotóxica do extrato de Maytenus ilicifolia, sendo observada baixa toxicidade em
11 concentrações de 1000 µg.mL-1 e 500 µg.mL-1 visto que, não ocorreu lise total das células. Enquanto no estudo de Hurtado et al. (2015) foi analisado a genotoxicidade do extrato alcoólico da entrecasca de Maytenus guianensis em células meristemáticas de Allium cepa, e os resultados revelaram baixa genotoxicidade em concentrações de até 200 µg.mL-1. Em outro estudo com a mesma espécie, porém com o método colorimétrico do MTT em células de hepatocarcinoma (HepG2), Hurtado et al. (2016), observou que nenhuma amostra da entrecasca apresentou toxicidade. Fivelman et al. (2004) explica que quando os compostos são administrados com outras substâncias, é possível a ocorrência de efeitos sinérgicos, que podem resultar em efeitos diferentes do observado ao utilizar compostos isolados, podendo diminuir a toxicidade, ou causar o efeito inverso.
Apesar do ensaio de citotoxicidade do presente estudo com a fração hexânica de M.
rigida não ter apresentado efeito citotóxico, a investigação da toxicidade em maiores
concentrações da amostra ou de outros extratos se faz necessária, pois a maioria das plantas pode ser tóxica quando utilizada em doses elevadas (KALEGARI et al., 2011). Atrelado a isso, a prática do uso de plantas medicinais sem devida orientação pode-se tornar perigosa, devido à composição química variável e sua possível toxicidade.
3.3. Atividade Antimicrobiana
No presente estudo, a fração hexânica da entrecasca de M. rigida apresentou atividade antimicrobiana, conforme pode ser observado na (Tabela 5). O método de difusão usado para análise antimicrobiana, consiste em colocar a amostra (FHX) em discos de papel, e estes em contato com o meio de cultura sólido inoculado previamente com o microrganismo. Após o período de incubação, o diâmetro do halo de inibição é medido, obtendo de forma qualitativa o resultado da sensibilização do microrganismo à amostra (SANTOS et al., 2011). Como critério de medidas para determinar o valor do halo de inibição e classificar a suscetibilidade do microrganismo à amostra, Santos et al. (2011) sugeriu o seguinte padrão: diâmetro do halo de inibição do crescimento ≥ 15mm é considerado sensível; 9 a 15mm (intermediário) e ≤ 8mm (resistente).
É possível observar na Tabela 5 que ocorreu resistência apenas para os microrganismos
Enterococcus durans e Klebsiella pneumoniae, gram positivo e gram negativo,
12 8mm. Para os outros microrganismos testados, os resultados obtidos mostram um potencial efeito antimicrobiano de M. rigida.
Tabela 5. Atividade antimicrobiana da fração hexânica da entrecasca de Maytenus rigida. Fração Hexânica
Microrganismos Diâmetro de Halo de Inibição de Crescimento (mm) Concentração Inibitória Mínima (MIC) - mg.mL-1 Staphylococcus aureus 9,00 ± 0,82 4 mg.mL-1 Escherichia coli 14,00 ± 3,32 0,25 mg.mL-1 Enterococcus durans 7,67 ± 1,32 4 mg.mL-1 Enterobacter aerogenes 15,67 ± 1,44 0,125 mg.mL-1 Klebsiella pneumoniae 8,00 ± 1,20 4 mg.mL-1
Dados referente ao diâmetro do halo de inibição expresso em média ± desvio padrão da média, enquanto a menor concentração capaz de inibir o crescimento dos microrganismos mostra-se em mg.mL-1.
A atividade antimicrobiana pode ser atribuída à presença de metabólitos secundários do grupo dos flavonoides, por sua capacidade de se complexar com proteínas solúveis e extracelulares, e também com a parede celular das bactérias (COELHO et al., 2003), além da presença dos triterpenos pentacíclicos livres, pertencentes à classe dos terpenóides. Essas substâncias são provenientes do metabolismo secundário das plantas, que nelas tem a funcionalidade de defesa ou atração (SIMÕES, 2007). Há vários componentes químicos capazes de inibir o crescimento microbiano, porém, compostos como taninos e flavonoides são considerados os principais responsáveis pelo potencial antimicrobiano (COLACITE, 2015).
Os resultados obtidos para a fração hexânica de M. rigida sendo sensível para os microrganismos E. coli com diâmetro de halo de inibição de crescimento igual a 14 mm, na concentração mínima de 0,25 mg.mL-1 e E. aerogenes com halo de inibição igual a 15,67 mm, na concentração mínima de 0,125 mg.mL-1, divergem de Santos et al. (2011), que em seu estudo mostrou que o extrato bruto da mesma espécie não apresentou resultados positivos para a espécie E. coli, o qual mostrou-se resistente, porém apresentou sensibilidade à S. aureus com diâmetro de halo de inibição de crescimento variando de 8-13 mm, numa concentração mínima de 400 mg.mL-1. Essa divergência pode ser atribuída à presença ou ausência de alguns grupos de metabólitos secundários, que pode variar de acordo com o tamanho e idade da planta, tempo de coleta, parte coletada, época e local de coleta (BLANK et al., 2007).
13 4. CONCLUSÃO
Os resultados obtidos no presente trabalho mostram que a fração hexânica da entrecasca de Maytenus rigida Mart. apresenta atividades biológicas em potencial. Na análise citotóxica, foi observada ausência de efeitos citotóxicos para as concentrações de 30 µg/mL, 100 µg/mL e 300 µg/mL frente à linhagem J774 de macrófagos. Quanto ao ensaio antimicrobiano a fração hexânica apresentou atividade positiva para os microrganismos Staphylococcus aureus,
Escherichia coli e Enterobacter aerogenes, com considerável inibição do crescimento
bacteriano para os dois últimos. O efeito antimicrobiano observado pode ser atribuído à presença de metabólitos secundários do tipo flavonoides, taninos e terpenóides, encontrados nos testes qualitativos da triagem fitoquímica.
Diante disso, se faz necessário mais estudos voltados às atividades biológicas das plantas medicinais, incluindo a espécie Maytenus rigida, visto que esta apresentou efeito antimicrobiano e baixa toxicidade nas concentrações utilizadas. O conhecimento acerca desta espécie pode representar novas possibilidades quanto à formulação de produtos com ação antimicrobiana, e fornecer bases para o consumo seguro à população.
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