FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
TALITA CRISITNA DELLARIVA
"Avaliação do Consensus-Degenerate Hybrid
Oligonucleotide Primer (CODEHOP) e do painel para
herpesvírus na detecção dos herpesvírus humano em
amostras de plasma de pacientes transplantados de
células progenitoras hematopoiéticas (TCPH)."
CAMPINAS 2016
AVALIAÇÃO DO CONSENSUS-DEGENERATE HYBRID OLIGONUCLEOTIDE PRIMER (CODEHOP) E DO PAINEL PARA HERPESVÍRUS NA DETECÇÃO DOS
HERPESVÍRUS HUMANO EM AMOSTRAS DE PLASMA DE PACIENTES TRANSPLANTADOS DE CÉLULAS PROGENITORAS HEMATOPOIÉTICAS
(TCPH).
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências, na Área de Concentração em Clínica Médica.
ORIENTADOR: SANDRA HELENA ALVES BONON COORIENTADOR: SANDRA CECÍLIA BOTELHO COSTA
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA
ALUNA TALITA CRISTINA DELLARIVA, E ORIENTADA PELA PROFª. DRª. SANDRA HELENA ALVES BONON.
CAMPINAS 2016
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
TALITA CRISTINA DELLARIVAORIENTADOR(A): SANDRA HELENA ALVES BONON
COORIENTADOR(A): SANDRA CECILIA BOTELHO COSTA
MEMBROS:
1. PROF(A). DR(A). SANDRA HELENA ALVES BONON
2. PROF(A). DR(A). CLÁUDIA DE MOURA
3. PROF. DR. MAGNUN NUELDO NUNES DOS SANTOS
Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico este trabalho aos meus avós
Sonia e Narciso e Mafalda e Odécio
pela esperança depositada em mim e
serem minha inspiração a continuar
...a Deus que me guia em toda caminhada e sempre me mostra que após a tempestade existe a
calmaria.
...aos responsáveis pela minha criação e educação, minha mãe Sonia, que me serviu seus
ombros e ouvidos amigos durante os momentos de alegrias, bravezas e tristeza e me deu os
mais sábios conselhos; e meu pai Edson, por ser aquele que sempre se orgulhou e apoiou
minhas conquistas. Palavras não descrevem minha gratidão a vocês! Amo-os
incondicionalmente.
...ao meu namorado Mauro, quem me faz ser, a cada dia, uma pessoa melhor e me estimula a
buscar sempre mais e não desistir mesmo quando tudo parece do avesso. Obrigada por ser
minha realidade e meu conto de fadas, seu apoio, companheirismo e amor foram (e são)
essenciais para mim.
...aos meus familiares, madrinha e padrinho, tias e tios, primos e primas, meus sogros,
cunhada e agregados por também participarem e contribuírem, de alguma forma e cada um a
seu jeito, durante minha formação profissional e pessoal.
...aos meus grandes amigos biólogos, que os carregarei para sempre comigo, Mariana, Felipe,
Karine, Bruna, Karen, Rafael, Renan, Luciano, Alini e Roberta por compartilharem comigo
áudios infinitos e experiências de vida, de profissão e etc..etc..etc...
...aos meus colegas professores, coordenadores e diretores que me mostram diariamente lições
valiosas sobre a linha tênue de ser professor, mestre, docente. Não deixo de lado os
aprendizados vindos de meus alunos, que são em parte responsáveis pela profissional que a
cada dia tento me tornar.
...aos amigos e colegas do Laboratório de Virologia da FCM-UNICAMP, Rodrigo, Lucas,
Carla, Silvia, Aline, Renato e tantos outros com quem tive o prazer de compartilhar grande
parte do tempo. Obrigada pela paciência em me ensinarem e me ouvirem em todas as
situações, pelos almoços e festinhas. Sentirei saudades.
...a Profa. Dra. Sandra Helena Alves Bonon, a orientadora que abriu as portas de seu
laboratório a mim, recém-formada, e depositou sua confiança em meu trabalho. Espero ter
atingido suas expectativas. Muito obrigada pelas oportunidades e pelos valiosos
ensinamentos que moldaram muito do que sou hoje, profissionalmente e pessoalmente.
...a Comissão de Pós Graduação da FCM-UNICAMP por seu trabalho e à agência
financiadora do projeto, processo nº 2014
/16244-9, Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado de São Paulo (FAPESP), com a qual foi possível ingressar no curso e me permitiu
grandiosas experiências.
Processo nº 2014/16244-9, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP).
"As opiniões, hipóteses e conclusões ou recomendações expressas neste material são de responsabilidade do(s) autor(es) e não necessariamente refletem a visão da FAPESP".
infecções em pacientes imunocomprometidos e transplantados em geral. Especificamente em pacientes submetidos a transplante de células progenitoras hematopoéticas, os membros da família Herpesviridae têm sido associados com a ocorrência de altas taxas de morbidade e mortalidade. Atualmente, métodos moleculares de detecção e quantificação de agentes infecciosos têm sido amplamente implementados em rotina de laboratórios a fim de se minimizar os impactos e evitar manifestações clínicas causadas pelas herpesviroses. Objetivos: No presente estudo foram padronizadas e otimizadas as técnicas de COnsensus-Degenerate Hybrid Oligonucleotide Iniciador em formato Nested-PCR (NPCR CODEHOP), para a detecção das subfamílias de Herpesvírus Humano e, do Painel de Herpesvírus Humano em formato Nested-PCR Touchdown (NPCR-TD) na detecção do genoma das espécies de herpesvírus em amostras de plasma de pacientes transplantados de células progenitoras hematopoéticas e, posteriormente, ambas as técnicas foram avaliadas a partir da comparação com a técnica de NPCR, já estabelecida em laboratório, usada como referência padrão. Resultados: A partir da otimização da técnica de NPCR CODEHOP foi possível detectar as três subfamílias de herpesvírus em amostras controle positivo e nas amostras estudadas e, a comparação com a NPCR usada como referência padrão indicou que há concordância moderada entre as técnicas e acurácia acima de 80%. Através da NPCR-TD, todas as espécies puderam ser amplificadas pela técnica otimizada e, pela comparação com a técnica referência padrão, obteve-se concordâncias consideráveis e substanciais para as diferentes espécies, enquanto que a acurácia manteve-se acima de 90%. Pela comparação das medianas de positividade de dias após o transplante não houve diferença significante entre as técnicas, indicando que podem ser aplicadas para detecção precoce de infecção ativa pelos Herpesvírus Humano. Conclusões: As técnicas permitiram aumentar as possibilidades de estudos moleculares a serem realizados em amostras clínicas no laboratório e identificar precocemente os pacientes com maior risco de desenvolver doença por herpesvírus após o transplante, favorecendo a utilização de drogas antivirais somente nestes casos.
Introduction: Human herpesviruses are an important group can cause infections in
immunocompromised patients and transplanted in general. Specifically in patients undergoing transplantation of hematopoietic stem cells, the members of the Herpesviridae family have been associated with the occurrence of high rates of morbidity and mortality. Currently, molecular methods of detection and quantification of infectious agents have been widely implemented in routine laboratories in order to minimize the impacts and prevent clinical manifestations caused by herpesviruses.
Objectives: It was standardized and optimized Consensus-Degenerate Hybrid
Oligonucleotide Primer in Nested-PCR technique (CODEHOP NPCR) for the detection of human herpesvirus subfamilies and Human Herpesvirus Panel in nested PCR Touchdown format (TD NPCR) to detect the genome of the species of herpesviruses in plasma samples of patients transplanted hematopoietic stem cells and, subsequently, both techniques were evaluated from the comparison with the NPCR technique already established in the laboratory, used as a reference pattern.
Results: From the optimization of CODEHOP NPCR technique was able to detect
the three subfamilies of herpesviruses in positive control samples and the samples studied, and the comparison with the NPCR used as reference standard indicated that there is a moderate correlation between the technical and accuracy above 80%. Through the TD NPCR, all species could be amplified by this technique optimized and, the comparison with the reference standard technique, considerable and substancial concordance was obtained for the different species, whereas the accuracy remained above 90%. By comparing the positivity median days after transplantation there was no significant difference between the techniques, indicating that can be applied for early detection of active infection by Human Herpesvírus.
Conclusions: The techniques have increased the possibilities for molecular studies
to be conducted in clinical samples in the laboratory and the early identification of patients at higher risk of developing disease herpesvirus after transplantation, favoring the use of antiviral drugs only in these cases.
Figura 2: Estrutura geral dos herpesvírus.
Figura 3: Representação esquemática do ciclo de replicação dos herpesvírus.
Figura 4: Representação da distribuição estimada de pessoas com infecção
prevalente de HSV-2 em 2012, por idade, sexo e região.
Figura 5: Representação de erupções em decorrência da reativação em HZ.
Figura 6: Representação de uma inclusão viral por CMVH.
Figura 7: Eletromicrografia de HHV-6 recém-replicado dentro de uma célula T
isolada.
Figura 8: Partículas virais de EBV observadas através de microscopia eletrônica,
revestidas por um envelope membranoso.
Figura 9: Detecção de células infectadas com HHV-8 em amostra de lesão de
Sarcoma de Kaposi;
Figura 10: Representação esquemática do funcionamento da NPCR.
Figura 11: Representação esquemática do protocolo de termociclagem da NPCR
TD.
Figura 12: Representação da sequência conservada de aminoácidos alvo da DNA
polimerase em LOGOS e a região degenerada.
Figura 13: Descrição do funcionamento do CODEHOP submetido aos primeiros
ciclos da NPCR (a) e nos ciclos subsequentes (b).
Figura 14: Amplificação das subfamílias de herpesvírus.
Figura 15: Painel Viral por NPCR TD.
Figura 16: Sequência correspondente ao fragmento do HSV-1 pesquisado
Figura 17: Sequência correspondente ao fragmento do HSV-2 pesquisado.
Figura 18: Sequência correspondente ao fragmento do VZV pesquisado.
Figura 19: Sequência correspondente ao fragmento do EBV pesquisado.
Figura 22: Sequência correspondente ao fragmento do HHV-7 pesquisado.
Figura 23: Sequência correspondente ao fragmento do HHV-8 pesquisado.
Figura 24: Sequência correspondente ao fragmento de HSV- 1 pela NPCR
CODEHOP.
Tabela 1 - Tipos celulares nos quais cada HHV, agrupados em subfamílias,
apresentam tropismo para infecção lítica e estabelecimento de latência.
Tabela 2 - Modalidades de transplante de medula óssea.
Tabela 3 - Características apresentadas pelo Grupo de Estudo.
Tabela 4 - Sequência de iniciadores que flanqueiam uma região conservada do
gene da β 2 - Microglobulina utilizados na PCR.
Tabela 5 - Relação de iniciadores para as espécies de herpesvírus, suas sequências
e pares de bases respectivos.
Tabela 6 - Relação de iniciadores consenso-degenerados utilizados na reação de
NPCR CODEHOP e suas sequências respectivas.
Tabela 7 - Relação do número e porcentagem de amostras positivas para as
subfamílias de HHV acompanhada pela mediana de positividade (dias após o transplante), através da aplicação da técnica de NPCR CODEHOP.
Tabela 8 - Relação do número e porcentagem de amostras positivas para as
subfamílias e espécies de HHV acompanhada pela mediana de positividade, em dias após o transplante, através da aplicação da técnica NPCR TD.
Tabela 9 - Relação ao número e porcentagem de amostras positivas para as
subfamílias e espécies de HHV acompanhada pela mediana de positividade, em dias após o transplante, através da aplicação da técnica de NPCR “padrão-ouro”.
Tabela 10 - Mediana de dias de positividade de início de detecção de infecção ativa
pelos HHV por NPCR e NPCR CODEHOP.
Tabela 11 - Mediana de dias de positividade de início de detecção de infecção ativa
pelas subfamílias de HHV por NPCR e NPCR TD.
Tabela 12 - Mediana de dias de positividade de início de detecção de infecção ativa
pelos HHV por NPCR CODEHOP e NPCR TD.
Tabela 13 - Valores referentes à sensibilidade, especificidade, valor preditivo
positivo, valor preditivo negativo e acurácia entre as técnicas de NPCR CODEHOP e NPCR “padrão-ouro” para as subfamílias α-herpesvirinae e γ-herpesvirinae.
NPCR “padrão-ouro” para a subfamília β-herpesvirinae.
Tabela 15 - Valores referentes à sensibilidade, especificidade, valor preditivo
positivo, valor preditivo negativo e acurácia entre as técnicas de NPCR TD e NPCR “padrão-ouro” para as subfamílias α-herpesvirinae e γ-herpesvirinae.
Tabela 16 - Valores referentes à sensibilidade, especificidade, valor preditivo
positivo, valor preditivo negativo e acurácia entre as técnicas de NPCR TD e NPCR “padrão-ouro” para a subfamília β-herpesvirinae
Tabela 17 - Comparação entre infecção pelas subfamílias detectadas pela NPCR
“padrão-ouro” e NPCR CODEHOP.
Tabela 18 - Comparação entre a detecção do DNA das subfamílias pela NPCR
“padrão-ouro” e NPCR TD.
Tabela 19 - Comparação entre as amostras positivas obtidas para cada espécie de
HHV, através das técnicas de NPCR TD e NPCR “padrão-ouro”.
Tabela 20 - Comparação na detecção de infecção ativa por HHV com NPCR
de NPCR CODEHOP, NPCR TD e NPCR “padrão-ouro” de acordo com os dois grupos de subfamílias de herpesvírus.
Gráfico 2 - Comparação do número de amostras positivas obtidas para as técnicas
de NPCR TD e NPCR “padrão-ouro” de acordo com as espécies de HHV.
Gráfico 3 - Comparação das medianas, em dias, de positividade das amostras para
as técnicas de NPCR CODEHOP, NPCR TD e NPCR “padrão-ouro” de acordo com os dois grupos de subfamília de herpesvírus.
A – Adenina
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária C – Citocina
CD4+ – Cluster of Diferentiation 4 (Grupamento de Diferenciação) CD34+ - Cluster of Diferentiation 34 (Grupamento de Diferenciação) CMVH – Citomegalovírus Humano
CODEHOP – Consensus-Degenerate Hybrid Oligonucleotides Iniciador CPH – célula progenitora hematopoética
CPOM – célula progenitora de osso marrom CPP - Células Progenitoras Periféricas
dATP - Desoxirribonucleotídeos Fosfatados Adenina dCTP - Desoxirribonucleotídeos Fosfatados Citocina DECH – Doença do Enxerto- contra-Hospedeiro dGTP - Desoxirribonucleotídeos Fosfatados Guanina DMC - Doença Multifocal de Castleman
DNA – ácido desoxirribonucleico
dNTP – Desoxirribonucleotídeos Fosfatados DST – Doença Sexualmente Transmissível
dTTP - Desoxirribonucleotídeos Fosfatados Timina EBV – Epstein-Barr Vírus
EDTA - Ácido Etilenodiamino Tetracético FDA – Food and Drug Administration G – Guanina
HHV – Herpesvírus Humano
HHV-6 – Herpesvírus Humano tipo-6 HHV-7 – Herpesvírus Humano tipo-7 HHV-8 – Herpesvírus Humano tipo-8 HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana HSV-1 – Herpesvírus Simplex tipo -1 HSV-2 – Herpesvírus Simplex tipo-2 HZ – Herpes Zoster
IgG – Imunoglobulina G IgM – Imunoglobulina M IL - Infusão de Leucócitos Kpb – kilobases
LEP - Linfoma de Efusão Primária LLA - Leucemia Linfóide Aguda LLC - Leucemia Linfóide Crônica LMA - Leucemia Mielóide Aguda LMC - Leucemia Mielóide Crônica LNH - Linfoma Não-Hodgkin Mg++ - Magnésio
mL - mililitros
MM - Mieloma Múltiplo MO - Medula Óssea
NPCR – Reação em Cadeia da Polimerase em formato Nested
NPCR CODEHOP – Reação em Cadeia da Polimerase em formato Nested Consensus-Degenerate Hybrid Oligonucleotides Primes
NPCR-TD – Reação em Cadeia da Polimerase em formato Nested Touchdown PANHERPES – Painel de Herpesvírus Humano
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
PCR TD – Reação em Cadeia da Polimerase em formato Touchdown PHN – Neuralgia pós herpética
PSSM – Position-Specific Scoring Matrix
PTLD - Posttransplant Limphoproliferative Disease RDC – Resolução da Diretoria Colegiada
RIC – Condicionamento de Intensidade Reduzida RNA – Ácido ribonucleico
rpm – Rotação por Minuto
SIDA – Sindrome da Imunodeficiência Adquirida SK – Sarcoma de Kaposi
TCPH – Transplante de Células Progenitoras Hematopoéticas TEB - Tris-EDTA-Borato
Tm – Temperatura de melting
TMO – Transplante de Medula Óssea VPP – Valor Preditivo Positivo
VPN – Valor Preditivo Negativo VZV – Varicella-Zoster Vírus
α – alfa β – beta γ – gama μL – microlitro μM - micromolar ® – marca registrada % – porcentagem ºC – graus Celsius
1. Introdução ... 22 2. Objetivos ... 26 2.1. Objetivo Geral ... 26 2.2. Objetivos Específicos ... 26 3. Revisão da Literatura ... 27 3.1. Família Herpesviridae ... 27 3.1.1. Taxonomia ... 27 3.1.2. Estrutura Geral... 28 3.1.3. Características Gerais ... 28 3.1.4. Subfamília Alphaherpesvirinae ... 31 3.1.4.1 Características Gerais ... 31
3.1.4.2 Herpesvírus Simplex tipo-1 ... 32
3.1.4.3. Herpesvírus Simplex tipo-2 ... 33
3.1.4.4. Varicella-Zoster Vírus ... 35
3.1.4.5. Alphaherpesvirinae e Transplante de Células Progenitoras Hematopoéticas ... 36
3.1.5. Subfamília Betaherpesvirinae ... 37
3.1.5.1. Características Gerais ... 37
3.1.5.2. Citomegalovírus Humano ... 38
3.1.5.3. Herpesvírus Humano tipo-6 ... 39
3.1.5.4. Herpesvírus Humano tipo-7 ... 41
3.1.5.5. Betaherpesvirinae e Transplante de Células Progenitoras Hematopoéticas ... 42
3.1.6. Subfamília Gammaherpesvirinae ... 43
3.1.6.1. Características Gerais ... 43
3.1.6.2. Epstein-Barr Vírus ... 43
3.1.6.3. Herpesvírus Humano tipo-8 ... 44
3.1.6.4. Gammaherpesvirinae e Transplante de Células Progenitoras Hematopoéticas (TCPH) ... 46
3.2.2.1. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ... 53
3.2.2.2. Reação em Cadeia da Polimerase em formato Nested PCR (NPCR) 53 3.2.2.3. Reação em Cadeia da Polimerase em formato NPCR TD (NPCR-TD) ... 54
3.2.2.4. COnsensus-Degenerate Hybrid Oligonucleotides Iniciadores em formato NPCR (NPCR CODEHOP) ... 55
3.2.2.5. Vantagens e Desvantagens dos Métodos Diagnósticos ... 57
4. Pacientes e Métodos ... 59
4.1. Pacientes ... 59
4.1.1. Critérios para definição de infecção ativa e doença por Herpesvírus Humano ... 62
4.1.2. Correlação clínico-laboratorial ... 62
4.2. Métodos ... 63
4.2.1. Extração de DNA a partir do plasma e NPCR ... 63
4.2.2. Detecção do gene da Beta 2 - Microglobulina Humana ... 64
4.2.3. NPCR para Herpesvírus Humano (padrão ouro) ... 64
4.2.4. Painel de Herpesvírus Humano em formato NPCR-TD ... 65
4.2.5. NPCR CODEHOP para detecção das subfamílias de Herpesvírus Humano ... 67
4.2.6. Sequenciamento ... 67
4.2.6.1. Purificação ... 68
4.2.6.2. Reação de sequenciamento ... 68
4.3. Análises Estatísticas ... 69
4.4. Cuidados especiais para evitar contaminação das amostras durante as reações ... 69
4.5. Biossegurança ... 70
5. Resultados ... 71
5.1. Otimização dos métodos moleculares utilizando controles positivos para Herpesvírus Humano ... 71
5.2. Utilização da técnica otimizada de NPCR CODEHOP em amostras de plasma
de pacientes TCPH na detecção das subfamílias de Herpesvírus Humano ... 74
5.3. Utilização do painel de Herpesvírus Humano em formato NPCR-TD em amostras de plasma de pacientes TCPH para detecção das espécies de Herpesvírus Humano ... 76
5.4. Utilização da técnica de NPCR “padrão-ouro” em amostras de plasma de pacientes TCPH para detecção das espécies de Herpesvírus Humano ... 77
5.5. Comparação entre as técnicas de NPCR CODEHOP, NPCR-TD e NPCR “padrão-ouro” em número de amostras positivas para as subfamílias e espécies de Herpesvírus Humano ... 79
5.6. Comparação entre as técnicas de NPCR CODEHOP, NPCR-TD e NPCR “padrão-ouro” da mediana de positividade das amostras, em dias, após TCPH de acordo com as subfamílias de Herpesvírus Humano ... 81
5.7. Correlação dos resultados obtidos com a utilização das técnicas de NPCR CODEHOP e NPCR-TD comparadas à NPCR “padrão-ouro” de acordo com as subfamílias de Herpesvírus Humano ... 83
5.8. Comparação entre a técnica de NPCR-TD E NPCR “padrão-ouro” de acordo com as espécies de Herpesvírus Humano ... 87
5.9. Resultados obtidos pelas técnicas a partir do grupo controle sadio ... 90
5.10. Resultados do sequenciamento dos fragmentos de DNA dos Herpesvírus Humano amplificados ... 90
6. Discussão ... 94
Conclusões... 102
Referências ... 104
1. Introdução
Nos últimos anos, o transplante de células progenitoras hematopoéticas (TCPH), vem sendo cada vez mais empregado no tratamento de neoplasias hematológicas benignas ou malignas, hereditárias ou adquiridas ao longo da vida. Entretanto, tal procedimento apresenta risco de rejeição do enxerto e por isso drogas imunossupressoras são administradas precocemente na prevenção de doenças do enxerto contra hospedeiro (DECH). Esse quadro aumenta sobremaneira o risco de infecções, especialmente aquelas decorrentes da supressão da imunidade celular1.
Sabe-se que existem fatores que pré-dispõem o paciente a desenvolver infecções e que podem estar relacionados à doença de base e aos tipos e complicações relacionados ao transplante (regime de condicionamento, tipo de enxerto, presença de DECH aguda e/ou crônica, terapia imunossupressiva ministrada após transplante e recidiva da doença de base)1,2,3. Dentre todos esses fatores, a imunodepressão sofrida pelo paciente devido ao uso de imunossupressores é um dos principais fatores associado à ocorrência de infecções.
Um quadro infeccioso é, normalmente, desenvolvido por agentes como bactérias, fungos e vírus. No caso desses últimos, o grupo dos Herpesvírus Humano (HHV) está relacionado com substancial morbidade e mortalidade em pacientes submetidos ao TCPH em decorrência de reativação ou infecções primárias4,5. A natureza caracteristicamente persistente das infecções herpéticas permite a ocorrência de reativação viral com numerosas consequências clínicas durante os períodos de imunodepressão. Os efeitos celulares e imunológicos são importantes contribuintes para o risco de infecções oportunistas por outros microorganismos (bactérias e fungos) e rejeição do órgão em transplantes de órgãos sólidos6.
Os HHV são representados por oito diferentes espécies apresentando, cada uma delas, um perfil temporal único de reativação7. Durante a fase aguda, mais especificamente nos primeiros 30 dias pós-transplante os vírus detectados com mais frequência são os Herpesvírus Simplex tipo 1 (HSV-1), Epstein-Barr Vírus (EBV) e Herpesvírus Humano tipo 6 (HHV-6), em um período mais tardio o Varicella Zoster Vírus (VZV) e o Citomegalovírus Humano (CMVH) tendem a ser reativados,
enquanto que a reativação do Herpesvírus Humano tipo 7 (HHV-7) parece não apresentar consistente predileção temporal8.
A espécie de HHV mais comum em transplantes de órgãos sólidos e TCPH é o CMVH, o qual tem o enxerto como alvo para o desenvolvimento da infecção. A reativação do HHV-6 tem ocorrido em 33-48% dos pacientes submetidos ao TCPH9 e assim associada à reativação do CMVH. Um estudo realizado em pacientes TCPH monitorados pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) mostrou que pacientes com doença por CMVH estavam mais propensos a ter, coincidentemente, o DNA do HHV-7 em células mononucleares do sangue periférico, precedendo o início da doença, do que em pacientes com infecção por CMVH assintomática10 e, outro estudo associou a presença de HHV-7 como fator de indução para a reativação do HHV-611. A contribuição do HHV-6 e HHV-7 à doença em receptores de TCPH não é ainda completamente esclarecida, mas há evidências que esses vírus podem causar doenças substanciais.
Em receptores de TCPH, a reinfecção ou a reativação do VZV pode facilmente causar viremia que por sua vez, na ausência de agentes antivirais, pode resultar na disseminação do herpesvírus e gerar graves complicações. Em relação aos efeitos e complicações causadas pelo HHV-8 em pacientes TCPH, apesar de haver estudos a respeito, seu papel ainda não é claro. Sala e colaboradores (2011) relataram mais recentemente o acometimento de um paciente pediátrico com o Sarcoma de Kaposi (SK) visceral associado ao HHV-8, complicação esta muito rara após transplante alogênico. Desse modo, essas observações sugerem que SK associado ao HHV-8 deve ser levado em consideração no diagnóstico diferencial de complicações tardias pós-transplante12.
Nesse âmbito, existe uma grande necessidade de diagnósticos rápidos e eficientes para o tratamento dos pacientes submetidos ao TCPH em casos de infecções virais e, atualmente, pode-se dizer que já foram desenvolvidos inúmeros recursos diagnósticos bem como um arsenal terapêutico específico para o tratamento da doença causada principalmente pelo CMVH5,13. Uma das medidas profiláticas mais utilizadas é a utilização da estratégia da terapia preemptiva e, atualmente, métodos moleculares de detecção e quantificação de agentes infecciosos são utilizados na rotina a fim de propiciar um tratamento precoce com
antivirais adequados, de modo que somente os pacientes positivos recebam o tratamento preemptivo13.
A identificação e o monitoramento das infecções causadas por herpesvírus é feita por meio de diversos procedimentos como a cultura viral, a antigenemia e sorologia14. Com o desenvolvimento da biologia molecular, técnicas moleculares têm sido frequentemente incorporadas ao diagnóstico laboratorial, já que, por sua elevada sensibilidade, podem revelar resultados positivos independente de dados clínicos correspondentes14,15.
Na técnica de PCR, além da alta sensibilidade, também é possível ter boa especificidade na determinação de uma espécie viral de acordo com o tipo de iniciador utilizado para a amplificação dos fragmentos de DNA viral presente nas amostras clínicas16,17. Ademais, o desenvolvimento de especializações na técnica de PCR tem aumentado suas possibilidades de aplicação, como é o caso da Nested-PCR (NNested-PCR), que consiste em duas reações sequenciais nas quais são utilizados dois conjuntos de iniciadores, um capaz de amplificar um número maior de pares de bases do fragmento de interesse – externo – e o outro construído a partir da região interna do mesmo fragmento – interno. A aplicação dessa variável da PCR permite obter uma maior especificidade dos produtos de amplificação, apesar de aumentar os riscos de contaminação no preparo da reação17.
O desenvolvimento de especializações da técnica de PCR conta tanto com alterações na forma de termociclagem, podendo ser citadas as formas hot-start e a Touchdown, bem como na modificação dos protocolos de reação. Nesse parâmetro, outra especialização da PCR que têm sido cada vez mais aprimorada e utilizada traz um conjunto de iniciadores diferenciados. A chamada PCR mediada por COnsensus-Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primer (CODEHOP) foi descrita em 1998 por Rose e sua equipe e se baseia em um conjunto de iniciadores obtidos a partir de aminoácidos consenso-degenerado de regiões conservadas dentro de uma família de gene18. Essa técnica permitiu solucionar problemas recorrentes quando utilizadas os métodos de PCR com iniciadores consenso e PCR com iniciadores degenerados separadamente, de modo a unir, em um mesmo iniciador, as características consenso-degenerado18,19,20.
Levando-se em consideração os níveis de sensibilidade e as peculiaridades das técnicas moleculares diante dos efeitos dos HHV em pacientes
TCPH, pretendeu-se com este trabalho padronizar e otimizar a técnica de CODEHOP em formato NPCR (NPCR CODEHOP) desenvolvida para amplificação das subfamílias de herpesvírus e descrita por Hermouet e colaboradores (2003)21, bem como estabelecer um Painel para HHV (PANHERPES) em formato NPCR Touchdown (NPCR-TD), o qual fosse capaz de amplificar as oito espécies de HHV em amostras de plasma de pacientes submetidos à TCPH em um único experimento.
A PCR é uma técnica que tem sido utilizada para diminuir o tempo de execução e custos em relação às outras técnicas diagnósticas, como as imunológicas e a cultura celular, pois com quantidades mínimas de ácidos nucléicos é possível se obter uma máxima sensibilidade em relação aos resultados, proporcionando um diagnóstico precoce mesmo antes do início dos sintomas da infecção viral nos pacientes estudados. Com o aprimoramento de especializações da PCR na detecção das espécies de HHV seria possível reduzir ainda mais o tempo para a obtenção do diagnóstico, de dias para apenas algumas horas e, consequentemente, haveria uma possível redução no desperdício de reagentes, evitando sobras e, até mesmo, diminuindo possíveis formas de contaminação, o que acarretaria em uma diminuição de gastos.
Dessa forma, seria possível desenvolver e estabelecer, em laboratório, técnicas moleculares com vantagens em relação ao tempo de execução e custo, permitindo diagnosticar infecções ativas em questão de horas e não mais dias ou semanas economizando reagentes e assim aumentar as possibilidades de estudos moleculares.
2. Objetivos
2.1. Objetivo Geral
Padronizar as técnicas de NPCR CODEHOP e do PANHERPES em formato NPCR Touchdown na detecção do genoma das subfamílias e espécies, respectivamente, de HHV em amostras de plasma de pacientes TCPH.
2.2. Objetivos Específicos
Utilizar a técnica de NPCR CODEHOP na triagem das amostras de DNA extraídas de plasma de pacientes submetidos ao TCPH para determinação do genoma das subfamílias de HHV;
Utilizar o PANHERPES na detecção do genoma das espécies de HSV-1, HSV-2, VZV, EBV, CMVH, HHV-6A e B, HHV-7 e HHV- 8 pela NPCR TD em amostras de plasma de pacientes submetidos ao TCPH;
Avaliar a precocidade dos métodos em relação à detecção da infecção ativa causada pelos HHVs nas amostras de plasma dos pacientes submetidos ao TCPH;
Avaliar a concordância, acurácia, sensibilidade, especificidade e valores preditivos dos testes NPCR CODEHOP e PANHERPES NPCR TD em relação à detecção da infecção ativa pelos HHV nas amostras de plasma dos pacientes submetidos ao TCPH utilizando a técnica NPCR como referência padrão.
Comparar os resultados obtidos com as técnicas do grupo de pacientes submetidos ao TCPH com um grupo controle saudável aplicando as mesmas técnicas.
3. Revisão da Literatura
3.1. Família Herpesviridae
3.1.1. TaxonomiaA família Herpesviridae, membro da ordem Herpesvirales – criada em 2008, pelo Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (ICVT) é constituída por cerca de 130 espécies de herpesvírus descritas atualmente22. Essas espécies apresentam ampla disseminação na natureza tendo diversos animais como hospedeiros, porém, apenas oito delas são capazes de infectar humanos23,24.
Tal família encontra-se dividida em três subfamílias: Alphaherpesvirinae (α-herpesvirinae), Betaherpesvirinae (β–herpesvirinae) e Gammaherpesvirinae (γ– herpesvirinae), apresentadas na Figura 1 e sendo a classificação baseada na similaridade das sequências e no tropismo tecidual entre as espécies, além de também considerar diferenças em propriedades biológicas dos herpesvírus e, bem como na respectiva patogenicidade25,26.
3.1.2. Estrutura Geral
A arquitetura das partículas infecciosas é comum a todos os herpesvírus, ou seja, apresentam DNA de fita dupla e linear, circundado por um revestimento proteico de simetria icosaédrica formada por 162 capsômeros arranjados e circundado por um envoltório proteolítico28,29. Apresentam também, uma estrutura amorfa e, por vezes assimétrica, localizada entre o capsídeo e o envelope proteolítico, denominada tegumento30,31. Essas estruturas descritas são representadas na Figura 2.
Entre as espécies de herpesvírus é possível distinguí-las através do genoma de grande tamanho, o qual varia entre ~130kpb e 250kpb, além das diferentes glicoproteínas de superfície encontradas no envelope de cada espécie.
Figura 2: Estrutura geral dos herpesvírus32.
3.1.3. Características Gerais
O nome Herpesviridae, derivado da palavra grega “herpein” (ëρπης), remete ao significado de rastejar indicando uma característica fundamental das espécies virais que compõem tal família: a capacidade de estabelecer infecções persistentes durante toda a vida do hospedeiro (período de latência) e sofrendo reativação em períodos de imunodepressão relativa33,34. Além disso, outras características também são compartilhadas entre todos os membros da família
Herpesviridae, como por exemplo, uma transcrição altamente regulada e a morfologia do virion35.
Considerando que as espécies de herpesvírus são biologicamente bem adaptadas aos seus hospedeiros, as principais células alvo para latência são as células mononucleares sanguíneas e os gânglios nervosos31. Na Tabela 1 abaixo são apresentados os tipos celulares pelos quais os HHV, agrupados em subfamílias, possuem tropismo tanto durante a infecção lítica quanto no estabelecimento de latência.
Tabela 1 - Tipos celulares nos quais cada HHV, agrupados em subfamílias,
apresentam tropismo para infecção lítica e estabelecimento de latência26.
Família Espécie Replicação Lítica Sítio de Latência
HSV-1 Epitelial e queratinócito Neurônio α HSV-2 Epitelial e queratinócito Neurônio
VZV Epitelial, Células T, monócitos e células endoteliais
Neurônio
CMVH Macrófago, células endoteliais, epiteliais e fibroblastos
CD34+, CPH, Monócito
β HHV-6 Célula T CPOM
HHV-7 Célula T Célula T
γ EBV Células B e epiteliais Célula B
HHV-8 Linfócitos Células B
Legenda: CPH – célula progenitora hematopoética; CPOM – célula progenitora de osso marrom.
Em relação as infecções primárias estabelecidas pelos HHV em indivíduos imunocompetentes, pode-se dizer que são, geralmente, assintomáticas e tendem a resultar em uma resposta imunitária eficiente37. Em crianças recém-nascidas ou indivíduos imunocomprometidos é possível aparecer sintomas mais graves que podem levar ao óbito.
O processo de replicação dos herpesvírus envolve diversas etapas sequenciais. O contato inicial entre vírus e hospedeiro ocorre através da interação das glicoproteínas virais com receptores da superfície celular hospedeira38,39. O tropismo restrito de alguns HHV é em decorrência da expressão de receptores
tecido-específico. Em seguida, os herpesvírus podem entrar na célula através de duas vias: (A) pela fusão direta do envelope viral com a membrana plasmática da célula alvo ou (B) por endocitose seguida de fusão entre as membranas viral e celular no compartimento endossomal permitindo a liberação do nucleocapsídeo no citoplasma do hospedeiro39,40,41. O genoma viral é replicado pela DNA polimerase celular ativada por proteínas do tegumento viral. O processo é coordenado e regulado em fases, as quais resultam na produção de proteínas iniciais imediatas – alfa –, proteínas iniciais precoces – beta – e proteínas tardias – gama. Fatores nucleares são responsáveis pela regulação do processo e, é a inter-relação destes que determinará se a infecção será lítica, persistente ou latente.
Em seguida, pró-capsídeos vazios passam a ser organizados no núcleo, onde serão preenchidos com DNA viral. As glicoproteínas são sintetizadas e em seguida, difundem-se para a membrana nuclear. Os capsídeos contendo DNA interagem com as porções da membrana nuclear modificadas pelas glicoproteínas virais e é enviado ao retículo endoplasmático e então transferido, por uma vesícula, para o complexo de Golgi, onde as glicoproteínas são processadas. O vírus abandona a célula por exocitose ou lise celular40,41. Todos esses processos são esquematizados na Figura 3 abaixo.
Figura 3: Representação esquemática do ciclo de replicação dos herpesvírus.
Legenda: Ligação do vírus com receptores e fusão com a membrana plasmática; transporte pelo nucleocapsídeo do genoma viral ao núcleo da célula hospedeira; transcrição e translação em três fases: imediatamente precoce (alfa), precoce (beta) e tardia (gama); liberação das proteínas alfa realizam o controle celular; as proteínas beta são enzimas ; e as proteínas gama são estruturais e incluem o capsídio viral e as glicoproteínas; a replicação do genoma é feita antes da transcrição dos genes tardios; migração das proteínas do capsídeo para dentro do núcleo, agrupamento dos capsídeos imaturos e preenchimento com o genoma viral.
3.1.4. Subfamília Alphaherpesvirinae
3.1.4.1 Características Gerais
Alphaherpesvirinae é composta pelos gêneros Simplexvirus e Varicellavirus, nos quais são incluídas as espécies HSV-1, HSV-2 e VZV, respectivamente28. A classificação desses vírus foi baseada, inicialmente, de acordo com suas propriedades biológicas compartilhadas e posteriormente nas sequências dos respectivos genomas31,41.
Os membros desta subfamília acometem uma ampla variedade de células humanas, incluindo células da mucosa e pele; apresentam um ciclo reprodutivo curto, elevada citopatogenecidade e apresentam uma primo infecção aguda com tendência a estabelecer infecções latentes em gânglios sensitivos, com período de recidiva31. Em relação à replicação do VZV, especificamente, este apresenta um ciclo mais lento e acomete um número menor de tipos celulares em comparação aos herpesvírus do gênero Simplexvirus42.
3.1.4.2 Herpesvírus Simplex tipo-1
O vírus HSV-1 foi documentado pela primeira vez pelo médico grego Hipócrates (460/377 a.C.) e foi denominado como herpes devido ao aspecto das lesões que causava. Em 1968, os pesquisadores Nahmias e Dowdle classificaram o vírus herpes no gênero Simplex e, com base em diferenças imunológicas, epidemiológicas e clínicas separaram este vírus em duas espécies diferentes, classificando-os em HSV-1 e HSV-243.
O HSV-1 é o principal agente etiológico de lesões vesiculares da região orofacial, enquanto HSV-2 causa lesões na região genital, principalmente44,45. Entretanto, é possível o HSV-1 acarretar em lesões na região genital e, embora mais raro, o HSV- 2 se manifestar na região orofacial44,46.
Assim como todos os membros da família Herpesviridae, o HSV-1 é um vírus crônico e de caráter recidivo, o que significa que é capaz de aparecer e desaparecer espontaneamente e permanecer no indivíduo ao longo de toda a sua vida47. A infecção primária tende a ocorrer, normalmente, durante os primeiros anos de vida e sua transmissão se dá por via oral ou mesmo pequenas escoriações na pele. O período de incubação dos vírus do gênero Simplexvirus é de 4 a 5 dias48,49 e em 90% dos casos, a inoculação inicial do HSV-1 apresenta uma infecção assintomática, detectável apenas através da presença de anticorpos44.
Entretanto, infecções sintomáticas podem ocorrer e, geralmente, acometem crianças recém-nascidas, ainda sem imunidade suficiente contra o HSV-1. Em geral, os sintomas recorrentes apresentados são gengivoestomatite oral, acompanhada por vesiculações pequenas e de curta duração, precedida por sintomas prodrômicos – formigamento, dor e queimação – que ocorrem devido à replicação inicial nas terminações nervosas sensitivas da epiderme e mucosa
labial44. Febre, mal-estar, disfagia, adenopatia48,49,50, confusão mental, alteração de consciência, perda de memória e mudanças de personalidade também podem surgir51. A manifestação clínica mais grave é a encefalite herpética que ocorre quando o HSV-1 infecta o tecido cerebral52.
A infecção por HSV-1 é bastante frequente e sua prevalência é de 60% a 80% da população mundial, o que pode significar que há um vasto reservatório viral. Dados atuais relacionados a fatores como idade, etnia e localização geográfica indicam que infecções por HSV-1 apresentam uma prevalência superior às infecções por HSV-2. Nos Estados Unidos da América (EUA), em 2010, estudos estimaram que 53,9% dos indivíduos eram soropositivos para HSV-1 e, no Reino Unido cerca de 50% entre homens e mulheres eram soropositivos até os 30 anos de idade53. As taxas de soroprevalência variam geograficamente e de acordo com o perfil socioeconômico. Em populações não expostas a fatores de risco, esta prevalência tende a se elevar linearmente com a idade, com picos durante a infância e a adolescência54. No Brasil, constam os seguintes dados de soroprevalência por faixa etária (homens e mulheres): de 1 a 4 anos: 36% de indivíduos infectados, de 15 a 19 anos: 83,3% são infectados e acima de 45 anos: 94,6%44,48,55.
3.1.4.3. Herpesvírus Simplex tipo-2
O HSV-2 é o principal responsável pelo surgimento de úlceras genitais, além de estar associado ao aumento do risco de aquisição de HIV, herpes neonatal e, ainda que de forma mais rara, apresentar infecções com prejuízos neurológicos a longo prazo e altas taxas de mortalidade56. Suas características biológicas se assemelham às dos demais membros da subfamília Alphaherpesvirinae, com uma infecção crônica e incurável57. Diferentemente do HSV-1 em latência, o HSV-2 torna-se latente em gânglios lombo sacrais58.
A doença causada pelo HSV-2 é transmitida através do contato sexual entre parceiros e, portanto, considerada uma doença sexualmente transmissível (DST) e, pode ser também transmitida ao recém-nascido durante o trabalho de parto em decorrência do contato direto entre a mucosa e a pele59. Sendo então a exposição sexual o principal fator de risco, a tendência de aumento da soroprevalência do HSV-2 está relacionada ao aumento da idade e ao número de parceiros ao longo da vida60,61.
A prevalência global do HSV-2 foi estimada em 11,3% no ano de 2012 entre pessoas com idade de 15 e 19 anos. A soroprevalência varia muito em função da região do mundo, entretanto ela é quase duas vezes mais elevada em mulheres do que em homens, com 14,8% e 8%, respectivamente, da prevalência global54, conforme mostrado na Figura 4.
Figura 4: Representação da distribuição estimada de pessoas com infecção
prevalente de HSV-2 em 2012, por idade, sexo e região54.
Na infecção primária, o HSV-2 acomete células epiteliais e terminações nervosas, seguida de um transporte axonal retrógrado para estabelecimento da infecção persistente nos gânglios sacrais. A reativação viral está associada a uma resposta inflamatória persistente, com altas concentrações de células T CD4+ e células dendríticas inflamatórias, localizada nas superfícies de mucosa e pele da região genital62. Entretanto, vale ressaltar que, na maioria dos casos, as infecções são assintomáticas. Sintomas clínicos que podem surgir durante a primo infecção e reativação viral são febre, mialgias, dores de cabeça, sintomas de meningite asséptica58 e exantema de distribuição abaixo da cintura.
Apesar de o HSV-2 apresentar acentuada tendência a recorrência (média de quatro episódios/ano), a excreção e a transmissão do vírus não ocorrem somente a partir de pessoas infectadas sintomáticas, mas também por aquelas assintomáticas. Um estudo realizado por Garnett e colaboradores concluiu que há uma chance seis vezes maior de transmissão do herpes do homem para a mulher, comparada com a mulher para o homem63,59.
3.1.4.4. Varicella-Zoster Vírus
O VZV estabelece relação evolucionária entre HSV-1 e HSV-2, compartilhando grande homologia entre seus genoma64, e apresenta como principal característica a capacidade de estabelecer latência em neurônios ganglionares ao longo de toda a neuroaxis65.
Por muitos séculos, acreditou-se que diferentes agentes etiológicos eram responsáveis pela Varicela e pelo Herpes Zoster (HZ). Até então, os estudos haviam sido conduzidos de maneira independente e inúmeras dificuldades técnicas eram encontradas ao se tentar relacionar ambas as enfermidades65. Somente no século XX, após inúmeros estudos epidemiológicos, imunológicos e das características histopatológicas encontradas nas lesões de pele, pôde-se compreender que HZ e Varicela apresentavam o mesmo agente etiológico. Toda a biologia do VZV, entretanto, só pôde ser definida em meados de 1953, após Thomas Weller e colaboradores isolarem o vírus66,67. Estudos posteriores de DNA confirmaram que não havia diferença entre os agentes virais isolados de pacientes com as diferentes entidades clínicas47.
A infecção primária pelo VZV usualmente resulta na Varicela, uma doença altamente contagiosa e que está associada ao surgimento de exantema de aspecto máculo papular predominantemente na região da face e tronco; em poucas horas as manchas progridem de vesículas à pústulas e, posteriormente, formam-se crostas. Nesse período, febre e coceiras são frequentes68,69 e as células T são produtivamente infectadas pelo vírus, provavelmente, contribuindo para a disseminação viral37.
O VZV torna-se latente em neurônios do gânglio do nervo cranial, em gânglios da raiz dorsal e gânglios autônomos ao longo de todo o neuroeixo70 até que um ambiente favorável para sua reativação seja criado, como por exemplo, o declínio natural da imunidade mediada por células com o decorrer da idade71.
Como resultado da reativação do VZV latente, em torno de 10% a 20% dos casos, surge o HZ que, apesar de ser causado pelo mesmo vírus, apresenta manifestações clínicas distintas à infecção primária71. Trata-se de uma doença infecciosa aguda caracterizada por erupções máculo palular ou vesicular e dores com distribuição dérmica, que ocorrem em um curto intervalo de tempo entre si, conforme apresentado na Figura 5 abaixo68. A dor é tão grande que chega a resultar
na sensação de queimadura. Dentre as complicações graves comuns ao HZ têm-se a neuralgia pós-herpética (PHN), definida como dor de duração superior a noventa dias após as erupções; distúrbios neurológicos como meningoencefalite, mielite, vasculopatia e doença ocular – necrose da retina externa aguda ou progressiva70,73
.
Figura 5: Representação de erupções em decorrência da reativação em HZ68. O VZV é transmitido de pessoa a pessoa através do contato direto ou de secreções respiratórias e, raramente, através de contato com lesões de pele. Quase todas as crianças desenvolvem a Varicela e tornam-se infectadas de forma latente. Apesar de os dados epidemiológicos serem um tanto variáveis, diferentes estudos mostraram um aumento do aparecimento do HZ com a idade68.
3.1.4.5. Alphaherpesvirinae e Transplante de Células Progenitoras Hematopoéticas
Em pacientes submetidos ao TCPH, frequentemente, observa-se a reativação dos HSV e VZV, sendo recorrente em cerca de 80% dos pacientes soropositivos para tais herpesvírus e na ausência de profilaxia antiviral74. Tal reativação costuma ocorrer durante a fase de aplasia da medula óssea a qual se segue o condicionamento1.
Diversas manifestações clínicas costumam ser recorrentes no período de reativação de herpesvírus, sendo os HSV responsáveis por um amplo espectro de doenças tais como: lesões orais semelhantes à mucosite em decorrência da quimioterapia e úlceras no palato, língua e nariz; supressão da medula óssea; e ainda, a possibilidade de a infecção se estender para órgãos vizinhos acarretando
outras complicações, como encefalite e hepatite, em situações mais raras, e esofagite ou pneumonia focal74,75. Em pacientes submetidos ao TCPH, as lesões genitais ocasionadas pelo HSV-2 são menos frequentes1.
Nesses pacientes, a reativação do VZV, se comparada à de outros herpesvírus, apresenta incidência relativamente alta (>20%)76 no período pós-transplante. Normalmente, tal reativação resulta no HZ e também é considerada importante causa de encefalite viral74.
A terapia antiviral é comum aos α-herpesvírus, sendo o tratamento com aciclovir o mais indicado. Esse medicamento é amplamente utilizado em casos de doença muco cutânea ou visceral ocasionadas por HSV e no tratamento de infecção por VZV75. Saral e colaboradores (1981) e Kawamura e colaboradores (2013) demonstraram em seus trabalhos a diminuição da incidência de reativação dos HSV após o tratamento profilático dos pacientes com aciclovir, além de também contribuir na redução da progressão e da disseminação da infecção por VZV74. Outros antivirais, como o famciclovir, são recomendados na presença de manifestações clínicas menos graves de reativação de ambos os gêneros de herpesvírus75 e, em casos de infecções resistentes aos antivirais citados, foscarnet e cidofovir são recomendados77,78.
3.1.5. Subfamília Betaherpesvirinae
3.1.5.1. Características Gerais
A subfamília Betaherpesvirinae engloba espécies de vírus de dois gêneros distintos: Citomegalovirus e Roseolovirus. Os principais representantes de tais gêneros são o CMVH e os HHV-6 e HHV-7, respectivamente.
De modo geral, todos os componentes dessa subfamília compartilham determinadas características como o número restrito de células hospedeiras, a alteração da morfologia da célula (“olho de coruja”) observada na Figura 6, um ciclo reprodutivo longo e uma disseminação lenta em meio de cultura, além de apresentar a capacidade de estabelecer latência em diversos tecidos79.
3.1.5.2. Citomegalovírus Humano
O CMVH foi isolado pela primeira vez há cerca cinquenta anos por três pesquisadores, quase que de forma simultânea, em amostras de diferentes tecidos47. A partir da década de 60, a alta incidência do CMVH em áreas de transplantes fez com que a infecção pelo CMVH fosse considerada de grande importância clínica e, a partir de então, passou a ser reconhecido como o principal patógeno em hospedeiros imunodeprimidos80,81.
Esse herpesvírus tem a capacidade de infectar os mais diversos tipos celulares, por exemplo, fibroblastos, macrófagos, células endoteliais e células musculares lisas82,83 (Figura 6). Nos últimos anos, o aumento do número de infecções oportunistas tem sido relacionado à infecção por CMVH em diferentes pacientes, tanto em receptores de órgãos quanto em indivíduos imunocomprometidos47.
Figura 6: Representação de uma inclusão viral por CMVH84.
A transmissão do CMVH pode ocorrer por diversas formas, sendo as disseminações orais e respiratórias consideradas dominantes (saliva, lágrimas e urina, por exemplo). Existem estudos que sugerem a transmissão via sexual, através do leite materno (transmissão vertical), transfusões sanguíneas ou de órgãos transplantados85,86.
Infecções por CMVH são consideradas endêmicas e de alta prevalência na população em geral. Atualmente é considerada a infecção congênita viral mais
comum em todo o mundo, sendo a soroprevalência desse herpesvirus inversamente proporcional ao status econômico do local87 com taxas de 40% a 60% em população de classe média e 80% a 85% em grupos sociais menos favorecidos88.
As manifestações clínicas resultantes de uma infecção por CMVH dependem da condição do sistema imunitário do indivíduo e do modo de contaminação do mesmo47. A primo infecção em indivíduos saudáveis, geralmente, é assintomática e quando apresenta sintomatologia, cerca de 10% dos casos, se assemelha à Síndrome da Mononucleose (febre, fadiga, dor muscular). Em se tratando de indivíduos imunocomprometidos, os sintomas são bastante variados, incluindo febre, leucopenia, trombocitopenia, hepatite, enterite e pneumonia, ou mesmo sequelas indiretas como rejeição do enxerto e comprometimento da resposta imune celular85,89.
Assim como os demais herpesvírus, após a infecção aguda, o vírus não é eliminado do organismo permanecendo sob a forma latente. As células mononucleadas do sangue periférico parecem ser os principais sítios de latência do CMVH. A reativação viral pode ocorrer em decorrência de diferentes situações, principalmente devido alteração da imunidade85, como por exemplo, na realização de transplante ou desenvolvimento da Síndrome da Imunodeficiência Adquirira (SIDA). Nesses casos, sintomas mais graves podem surgir incluindo pneumonia90, hepatite91, encefalite, mielite92, colite, a retinite (inflamação da retina), neuropatia93.
3.1.5.3. Herpesvírus Humano tipo-6
O HHV-6 foi isolado pela primeira vez em 1986, por Salahuddin e colaboradores, em doentes com distúrbios linfoproliferativos e, posteriormente, em doentes com SIDA47,94. Estudos identificaram duas variantes do HHV-6: A e B, as quais se distinguem por características genéticas, imunológicas e moleculares e, apesar de apresentarem grau de similaridade de nucleotídeos maior do que 90% possuem patogênese e manifestações clínicas diferentes95.
Não existem testes sorologicos convenientes para discriminar as variantes do HHV-6. Evidências sugerem que a maioria das infecções em pacientes imunocompetentes são causadas pela variante HHV-6 B e está associada ao aparecimento do exantema súbito e outras manifestações clínicas96, enquanto que a variante A parece ser detectada mais frequentemente em imunocomprometidos e
aparenta ser, potencialmente, mais neurotrópica97, porém, seu papel etiológico ainda não está claro.
Estudos soroepidemiológicos sugerem que o HHV-6 encontra-se disseminado na população. Estima-se que mais de 90% das crianças com menos de um ano de idade e adultos sejam soropositivos para HHV-698. Apesar de não se conhecer ao certo a principal via de transmissão deste herpesvírus, estudos sugerem que a saliva ocupe o lugar central como veículo de transporte (transmissão horizontal), já que as glândulas salivares são consideradas reservatório desse vírus. Além disso, o HHV-6 parece estar associado à transmissão vertical47.
A infecção e a multiplicação do HHV-6 se dão em diversos tipos celulares, preferencialmente em linfócitos T CD4+ (Figura 7), com os quais apresentam tropismo e, tendem a permanecer em células mononucleares do sangue periférico, na saliva e no líquido cefalorraquidiano, sem causar sintomatologia (períodos de latência ou dormência)99.
Figura 7: Eletromicrografia de HHV-6 recém-replicado dentro de uma célula T
isolada100.
A infecção primária causada pelo HHV-6 é assintomática e ocorre quase que exclusivamente na infância. Estudos sorológicos indicam que o pico da infecção pelo HHV-6 é observada entre 6 a 9 meses101 e provoca o exantema súbito (roséola do lactante ou “sexta doença”) caracterizada por febre e erupções cutâneas, além de o vírus também estar associado à convulsões febris em crianças. Em adultos, a infecção pelo HHV-6 é considerada mais rara, porém em adultos imunocomprometidos, receptores de transplante de órgãos e HIV positivos é recorrente com sintomatologia ainda não definida102.
Estudos recentes têm sugerido que o genoma do vírus HHV-6 é capaz de se integrar ao DNA da célula hospedeira, tanto in vivo como in vitro, nas terminações dos cromossomos103,104 com uma frequência de 0,2-0,8% e podendo estar presente em células germinativas105. Tais descobertas se fundamentam pela presença de sequências teloméricas nos cromossomos humanos que se assemelham a sequências repetidas na porção terminal do genoma do HHV-6 e também pela proteína U94, a qual funciona como mediador da integração do DNA nas células humanas106. Essa integração entre HHV-6 e o DNA hospedeiro foi descrita e quantificada em indivíduos saudáveis, estando presente em cerca de 1% dos doadores de sangue107.
3.1.5.4. Herpesvírus Humano tipo-7
O HHV-7 foi isolado em 1990 em linfócitos T purificados de células mononucleares de sangue periférico por Frenkel e colaboradores108. Esse mesmo grupo de pesquisadores também descreveu que o HHV-7 apresenta altas homologias, genéticas e biológicas, com o HHV-6 tipo A e B, sendo considerado um agente etiológico adicional do exantema súbito (Roseola infantum)47,109.
Basicamente, é um vírus ubíquo e leucotrópico, com tropismo pelos linfócitos T CD4+ que, após a primo-infecção permanece latente nas células mononucleadas do sangue periférico podendo ser reativado após a estimulação das mesmas72,110.
A prevalência de HHV-7 é bastante significativa em crianças infectadas também pelo HHV-6, entretanto as infecções ocorrem em períodos distintos, sendo a infecção primária por HHV-7 tardia se comparada à do HHV-6109. Em aproximadamente 65% dos casos, a infecção ocorre até os 2 anos de idade e 90% dos indivíduos são soropositivos aos 5 anos de idade111,112.
Em relação à transmissão do HHV-7, acredita-se que a saliva seja a via mais provável, uma vez que o HHV-7 replica-se em glândulas salivares humanas96. Entretanto, outras formas de transmissão também são consideradas, como a transmissão vertical (através da passagem pela placenta ou de forma hereditária); após o parto através do aleitamento materno113; e mesmo a transmissão nosocomial/iatrogênica (através de órgãos transplantados, transfusão de sangue,
células progenitoras hematopoiéticas gerando infecção primária ou infecção recorrente)111.
Assim como os outros herpesvírus, o HHV-7 é capaz de estabelecer infecção latente por toda a vida do hospedeiro e se reativar durante estado de imunodepressão114. Entretanto, entre os herpesvírus, o HHV-7 apresenta uma baixa capacidade de causar doenças sintomáticas em indivíduos imunocompetentes. Quando ocorre um quadro sintomático, este é associado ao aparecimento de roséolas, como na infecção por HHV-6 e, raramente, estado febril, tendo os sinais duração de cerca de seis dias.
3.1.5.5. Betaherpesvirinae e Transplante de Células Progenitoras Hematopoéticas
Em indivíduos imuncomprometidos, as infecções pelos β-herpesvírus são frequentemente relatadas, principalmente as associadas ao CMVH. Um dos fatores relacionados ao aumento dessa ocorrência é o emprego, cada vez mais comum, de medicamentos imunodepressores115. Grande parte das infecções decorre de uma reativação de infecções latentes, porém, em pacientes receptores de órgãos transplantados (rim, medula e coração), a infecção primária pode ocorrer se considerado o órgão do doador a fonte da infecção116.
Normalmente, as infecções costumam ocorrer durante a fase de pós-pega do enxerto sendo, geralmente, subclínicas. Contudo, a ocorrência da replicação em pacientes imunocomprometidos pode desencadear problemas clínicos mais graves, como quadros de febre prolongada e pneumonia intersticial em pacientes116. Em se tratando de infecção por CMVH, casos mais graves podem ser relacionados ao desenvolvimento de infecções oportunistas por outros microorganismos, como por exemplo, bactérias gram-negativas, Toxoplasma gondii, Pneunocystis carini, Candida albicans e entre outros1.
Quanto às infecções causadas pelo HHV-6, sabe-se que são frequentes e, geralmente, relacionadas ao atraso na “pega” celular de monócitos e plaquetas, aumento da necessidade de infusão de plaquetas, DECH grau III e IV, além de poder ser associada a distúrbios no Sistema Nervoso Central (SNC)117,118.
Em contraste com as infecções por HHV-6, a reativação do HHV-7 após TCPH é pouco comum119 e existem poucas evidências para uma associação com
doenças, embora casos de sintomas no SNC tenham sido descritos120. Contudo, assim como o HHV-6, achados de estudos prospectivos sugerem que o HHV-7 apresenta efeitos indiretos importantes, tais como o aumento do risco de doença por CMVH121. Além disso, o HHV-7 tem sido relacionado com a presença tanto do CMVH quanto do HHV-6 resultando em episódios de febre e infecção concomitante122.
De modo geral, os pacientes imunocomprometidos são passíveis de tratamento, uma vez que as infecções pelos β-herpesvírus podem acarretar quadros clínicos graves com potencial para o óbito. Atualmente, apenas o ganciclovir e o foscarnet são aprovados pelo FDA. Ambas as drogas possuem pouca biodisponibilidade oral e elevada toxicidade e agem de forma virostática, ou seja, inibindo a replicação viral enquanto são administradas111.
3.1.6. Subfamília Gammaherpesvirinae
3.1.6.1. Características Gerais
A subfamília Gammaherpesvirinae é composta por dois principais gêneros: o Lymphocryptovirus e o Rhadinovirus e seus principais representantes são, respectivamente, o Epstein-Barr vírus (EBV) e o Herpesvírus Humano tipo 8 (HHV-8) ou Herpesvírus associado ao Sarcoma de Kaposi (SKHV).
Para tal grupamento, a capacidade de infectar células linfoides e então se tornarem latentes é a principal característica compartilhada entre ambas as espécies.
3.1.6.2. Epstein-Barr Vírus
O EBV foi descoberto em 1964, por Tony Epstein, Yovnne Barr e Burt Achong após examinarem biópsias de tumores recém-extirpados de Linfoma de Burkitt. O Epstein-Barr, assim denominado, era tido como o primeiro candidato causal de um tumor humano123. Em 1968 foi demonstrado que o mesmo era o agente etiológico da mononucleose infecciosa (MI)124. A infecção por EBV têm sido relacionada com outras doenças além da MI: leucoplasia pilosa, carcinoma de nasofaringe, desordens mieloproliferativas, linfomas pós-transplantes, linfomas de células T e Doença de Hodgkin125 representam algumas delas.
O EBV é um herpesvírus ubíquo, linfotrópico e epiteliotrópico e extremamente comum. Quase 90% dos indivíduos adultos da população apresentam anticorpos contra ele126, entretanto, estima-se que de 10 a 20% que apresentem quadro de MI não tenham infecção pelo EBV, já que a síndrome de MI associada ao CMVH tem sido descrita desde 1965.
Estudos indicam que a principal via de transmissão do EBV ocorre pela saliva, além de também ocorrer via objetos contaminados (escova de dente, talheres, louças, entre outros) ou mesmo através de transfusões sanguíneas e órgãos transplantados125.
Transcorrida a infecção, o EBV torna-se latente em linfócitos B do sangue periférico e permanecerá por toda a vida do indivíduo. Entretanto, ainda é incerto como o EBV estabelece sua replicação em indivíduos saudáveis, uma vez que o vírus, normalmente, não se replica nos linfócitos B recém-infectados127. As tonsilas parecem ser candidatas para o sítio de replicação do EBV128,129,130. Durante a latência do EBV, ocorre então a proliferação da célula infectada, e não das partículas virais, como ocorre na infecção lítica viral128. Como resultado de infecção primária têm-se viremia transitória seguida por uma resposta rápida e imune.
Figura 8: Partículas virais de EBV observadas através de microscopia eletrônica,
revestidas por um envelope membranoso131.
3.1.6.3. Herpesvírus Humano tipo-8
Em 1994, o HHV-8 foi descrito pela primeira vez por Chang e colaboradores como Herpesvírus Humano tipo 8 (HHV-8), também chamado de
Herpesvírus associado ao SK (SKHV)132,133. O HHV-8 está associado, com bastante segurança a três doenças: o Sarcoma de Kaposi (SK) e duas enfermidades linfoproliferativas raras: o Linfoma de Efusão Primária (LEP) e a doença Multifocal de Castleman (DMC)133. A característica principal deste herpesvírus é a transformação celular e a capacidade de causar lesões tumorais em seus hospedeiros134.
A soroprevalência referente ao HHV-8 na população em geral de países como os Estados Unidos é em torno de 1% a 5%135. Essas porcentagens tendem a se elevar quando considerados grupos específicos, como em homens que mantêm relações sexuais com companheiros do mesmo sexo, independente de apresentarem HIV, a porcentagem passa a ser de 20% a 77%. Em países Mediterrâneos e regiões da África sub-Saariana a prevalência também tende a ser maior, de 10% a 20% nos primeiros e entre 30% a 80% nos últimos136.
Um possível mecanismo proposto para a patogenicidade do HHV-8 seria a partir da síntese de produtos homólogos a receptores celulares importantes no crescimento e diferenciação celular, como enzimas e proteínas que estimulam a divisão celular, inibem a apoptose e modulam a função imune, produzindo, então, efeitos carcinogênicos137. O HHV-8 infecta linfócitos B em divisão, durante a mitose133 e persiste em latência, sob a forma de um epissoma em células infectadas133,138 e, apenas uma pequena parcela dos genes deste vírus são expressos139.
Figura 9: Detecção de células infectadas com HHV-8 em amostra de lesão de SK140. As características clínicas da primo infecção do HHV-8 não são claramente definidas, já que na maioria dos casos trata-se de uma infecção
