Desenvolvimento e validação de métodos por HPLC-DAD-ELSD para controle de qualidade químico do látex do caule e do fruto de mangaba (Hancornia speciosa Gomes)

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA. ALAN DIEGO DA CONCEIÇÃO SANTOS. DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS POR HPLC-DADELSD PARA CONTROLE DE QUALIDADE QUÍMICO DO LÁTEX DO CAULE E DO FRUTO DE MANGABA (Hancornia speciosa GOMES). São Cristóvão – Sergipe FEVEREIRO/2012.

(2) ALAN DIEGO DA CONCEIÇÃO SANTOS. DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS POR HPLC-DADELSD PARA CONTROLE DE QUALIDADE QUÍMICO DO LÁTEX DO CAULE E DO FRUTO DE MANGABA (Hancornia speciosa GOMES). Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação. em. Química. da. Universidade Federal de Sergipe como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Química.. Orientador: Prof. Dr. Paulo Cesar de Lima Nogueira Co-orientadora: Profª. Drª. Valéria Regina de Souza Moraes. São Cristóvão – Sergipe 2012.

(3) FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE. S237d. Santos, Alan Diego da Conceição Desenvolvimento e validação de métodos por HPLC-DADELSD para controle de qualidade químico do látex do caule e do fruto de mangaba (Hancornia speciosa Gomes) / Alan Diego da Conceição Santos ; orientador Paulo Cesar de Lima Nogueira. – São Cristóvão, 2012. 152 f. : il. Dissertação (Mestrado em Química) – Universidade Federal de Sergipe, 2012.. 1. Química vegetal. 2. Mangaba. 3. Látex. 4. Análise cromatográfica. I. Nogueira, Paulo Cesar de Lima, orient. II. Título. CDU 547.9:581.192:582.923.5.

(4) Com amor e gratidão dedico este trabalho aos meus pais, Juciara e Azequias, por consumirem suas vidas em virtude do meu crescimento e bem estar....

(5) Agradecimentos especiais A Jesus Sacramentado por todo amor misericordioso e amizade. Sem sua presença silenciosa nada disso seria possível! Aos meus pais, Juciara e Azequias, por todo amor incondicional e por me ensinarem que a vida é um presente de valor inestimável do criador. Aos meus irmãos Wesley e Taciara por construírem parte do que eu sou. A minha namorada, Vanessa Ávila, por aceitar dividir comigo o lado árduo da vida acadêmica. Obrigado pelo companheirismo, pela compreensão, pela paciência com minha ausência e pensamentos distantes... Aos meus avós, tios (as), primos (as), padrinhos e madrinhas por todo o incentivo acompanhado de mimos inestimáveis. Vocês são lugar de repouso. Aos meus amigos do Grupo de Oração Sementes de Paz (em especial: Ivo e Irone, Paulo e Regi e Otávio Neto) por toda a acolhida, ensinamentos e oração. Vocês são prova que o “ser irmão” vai além dos laços sanguíneos. A minha grande amiga "acadêmica” Thalita Bispo, por abrir os meus olhos para a beleza da pesquisa, minha incentivadora!!! Ao meu amigo Andryel Vilanova, pela presença dissimulada!.

(6) Agradecimentos Agradeço ao Prof. Dr. Paulo Cesar de Lima Nogueira (amante da ciência) por me inserir nesse universo intrigante que é a pesquisa, pelos ensinamentos e confiança. A Universidade Federal de Sergipe e ao Departamento de Química pela oportunidade de execução deste trabalho. A todos os professores do Departamento de Química/UFS, em especial aos professores, Valéria Regina de Souza Moraes, Emmanoel Vilaça Costa, Samísia Maria F. Machado e Sandro Navickiene pela contribuição na minha formação. Aos meus “parceiros” durante o curso de mestrado, Givanilton Brito e Vilma Menezes, pelas horas de estudo e desabafos. A geração antiga do LABORGANICS Daniele Santos, Sandra Ribeiro e Wesley Gomes e a Adriano Aquino, hoje doutorandos, pela amizade e incentivo. Aos meus amigos do LABORGANICS (Aline Menezes, Charlene Souza, Eraldo, Iara Lisboa, Jemmyson Romário, Leociley Menezes, Lívia Dutra, Marília Sampaio, Pedro Ernesto, Susy, Thanany Brasil e Valéria Santana) e do LPPN (Darlisson Alexandria, Givanildo, Hugo Cesar, Paloma Prata e Rafaely Lima). Agradeço a todos pela amizade, apoio, incentivo, colaboração e momentos descontraídos. Vocês tornaram meu caminho menos árduo!! Ao Prof. Dr. Antonio G. Ferreira do Departamento de Química da UFSCar, pela colaboração e aquisição dos espectros de ressonância magnética nuclear. A CNPq pela concessão da bolsa de estudo A FAPITEC/SE, COPES/UFS, PAIRD/UFS e PROCAD/CAPES pelo apoio financeiro que permitiu a realização desse trabalho. Enfim, a todos que diretamente ou indiretamente que contribuíram para a realização deste trabalho..

(7) SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS................................................................................................................I LISTA DE TABELAS..........................................................................................................VII LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS...........................................................................IX RESUMO...............................................................................................................................XII ABSTRACT.........................................................................................................................XIII 1. INTRODUÇÃO...................................................................................................................01 1.1 - Látex.................................................................................................................................05 1.2 - Controle de qualidade de amostras vegetais.....................................................................06 1.3 - Arranjo de diodos (DAD) e Espalhamento de luz (ELSD) como detectores para análise de amostras vegetais por HPLC................................................................................................07 1.4 - Perfil cromatográfico e quantificação de marcadores químicos para controle de qualidade de amostras vegetais..................................................................................................................10 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...........................................................................................11 2.1 - Aspectos botânicos...........................................................................................................12 2.2 - Aspectos químicos............................................................................................................14 2.3 - Aplicações terapêuticas e aspectos farmacológicos.........................................................18 2.4 - Propriedades tecnológicas do látex de H. speciosa Gomes..............................................20 3. OBJETIVOS........................................................................................................................21 3.1 – Objetivos Gerais...............................................................................................................22 3.2 – Objetivos Específicos.......................................................................................................22 4. PARTE EXPERIMENTAL...............................................................................................23 4.1 – Materiais e equipamentos.................................................................................................24 4.2 – Limpeza do material.........................................................................................................25 4.3 – Material vegetal................................................................................................................25 4.3.1 – Obtenção do látex do caule da mangabeira.........................................................25 4.3.2 – Obtenção do látex dos frutos da mangabeira.......................................................26 4.3.3 – Polpa comercial do fruto da mangabeira.............................................................26 4.4 – Preparo das amostras do látex de H. speciosa e dos marcadores químicos....................................................................................................................................27.

(8) 4.4.1 – Látex do caule......................................................................................................27 4.4.2 – Látex dos frutos...................................................................................................27 4.4.3 – Marcadores químicos do látex dos frutos............................................................27 4.5 – Condições cromatográficas de análise.............................................................................28 4.5.1 – Método qualitativo para o látex do caule da mangabeira....................................28 4.5.2 – Método qualitativo para o látex dos frutos da mangabeira..................................28 4.6 – Validação de métodos cromatográficos analíticos...........................................................29 4.6.1 – Validação do método analítico para o perfil cromatográfico do látex do caule de Hancornia speciosa...................................................................................................................29 4.6.1.1 – Teste da precisão de injeção....................................................................29 4.6.1.2 – Teste da repetibilidade............................................................................29 4.6.1.3 – Estabilidade da amostra do látex do caule..............................................30 4.6.1.3.1 – Estabilidade de curta duração.....................................................30 4.6.1.3.2– Estabilidade após ciclos de descongelamento e congelamento............................................................................................................................30 4.6.1.4 – Robustez..................................................................................................30 4.6.2 – Validação do método cromatográfico para a quantificação de éster diidroxilado de lupeol em látex do fruto de H. speciosa e polpa comercial...................................................................................................................................31 4.6.2.1 – Condições analíticas do método quantitativo..........................................31 4.6.2.2 – Preparo da solução estoque, padrões de calibração e amostras controle de qualidade...................................................................................................................................31 4.6.2.3 – Linearidade..............................................................................................32 4.6.2.4 – Seletividade.............................................................................................32 4.6.2.5 – Limite de detecção (LD) e quantificação (LQ).......................................32 4.6.2.6 – Precisão...................................................................................................33 4.6.2.7 – Exatidão...................................................................................................33 4.6.2.8 – Robustez..................................................................................................34 4.6.2.9 – Estabilidade.............................................................................................34 4.6.2.9.1 – Estabilidade de curta duração.....................................................34 4.6.2.9.2– Estabilidade após ciclos de descongelamento e congelamento............................................................................................................................34.

(9) 4.7 – Isolamento dos marcadores químicos do látex do caule de H. speciosa Gomes.......................................................................................................................................35 4.8 – Identificação dos marcadores químicos...........................................................................35 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................................36 5.1 – Otimização das condições cromatográficas de análise: látex do caule de H. specisoa Gomes.......................................................................................................................................37 5.1.1 – Primeira etapa do processo de otimização: uso do gradiente exploratório...............................................................................................................................38 5.1.2 – Segunda etapa do processo de otimização: avaliação dos parâmetros da eluição gradiente....................................................................................................................................42 5.1.3 – Preparo da amostra do látex do caule..................................................................45 5.2 – Validação do método analítico para o perfil cromatográfico do látex do caule de H. speciosa.....................................................................................................................................52 5.3 – Aplicação do método analítico desenvolvido: análise das amostras comerciais do látex do caule de H. speciosa.............................................................................................................56 5.4 – Isolamento dos marcadores químicos do látex do caule de H. speciosa Gomes.......................................................................................................................................61 5.5 – Identificação do marcadores químicos.............................................................................66 5.5.1 – Identificação e determinação estrutural HSG 2...................................................66 5.5.2 – Identificação e determinação estrutural HSG 3...................................................75 5.5.3 – Identificação e determinação estrutural HSG 6...................................................80 5.6 – Otimização das condições cromatográficas de análise: látex dos frutos de H. speciosa.....................................................................................................................................89 5.7 – Validação do método cromatográfico para quantificação do marcador químico éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol................................................................................................100 5.7.1 – Seletividade.......................................................................................................101 5.7.2 – Linearidade .......................................................................................................103 5.7.3 – Limite de detecção e limite de quantificação....................................................105 5.7.4 – Precisão e exatidão............................................................................................105 5.7.5 – Estabilidade ......................................................................................................107 5.7.6 – Robustez ...........................................................................................................108 5.8 – Aplicação do método.....................................................................................................108.

(10) 6. CONCLUSÃO...................................................................................................................111 7. REFERÊNCIAS................................................................................................................114.

(11) I. LISTA DE FIGURAS Figura 1: Foto de um espécime (1) e do fruto (2) de Hancornia speciosa Gomes..................13 Figura 2: Extração do látex do caule Harcornia speciosa Gomes...........................................26 Figura 3: Cromatogramas para a seleção de condições para o método em HPLC-DAD. Os números. correspondem. às. condições. apresentadas. na. Tabela. 1.................................................................................................................................................41 Figura 4: Cromatogramas (λ = 220 nm) para a seleção de condições para o método em HPLC-DAD.. Os. números. correspondem. às. condições. apresentadas. na. Tabela. 2.................................................................................................................................................44 Figura 5: Cromatogramas para a seleção do modo de preparo do látex do caule de H. speciosa para análise em HPLC-DAD: (preto) látex tratado com ácido acético e secado em centrifugador; (vermelho) látex sem ácido acético e secado em centrifugador e (azul) látex secado em liofilizador. Os cromatogramas foram obtidos utilizando a condição 11 descrita na Tabela 2....................................................................................................................................46 Figura 6: Perfil Cromatográfico do látex do caule de H. speciosa obtido com a eluição gradiente: 5-50% H2O (A): ACN (B) em 50 min; vazão: 1,0 mL/min; λ= 220nm; Vinj = 20 µL; coluna analítica Phenomenex LUNA® 5μm C18 (250 x 4,6 mm) adaptada a uma coluna guarda C18 (4 x 3,0 mm, Phenomenex)...............................................................................................48 Figura 7: Espectros de absorção UV das bandas cromatográficas assinaladas na Figura 6 (apresentados de 1 a 7)..............................................................................................................49 Figura 8: Projeção tridimensional obtido por HPLC-DAD da amostra do látex do caule da H. speciosa.....................................................................................................................................50.

(12) II. Figura 9: Perfil cromatográfico do látex do caule da H. speciosa por HPLC-ELSD obtido com a eluição gradiente: 5-50% H2O (A): ACN (B) em 50 min; vazão: 1,0 mL/min; ELSD: temperatura do tubo mantido em 70˚C e fluxo de N2 pressurizado em 353 KPa; Vinj = 20 µL; coluna analítica Phenomenex LUNA® 5μm C18 (250 x 4,6 mm) adaptada a uma coluna guarda C18 (4 x 3,0 mm, Phenomenex)...............................................................................................51 Figura 10: Perfil cromatográfico comparativo do látex do caule de H. speciosa por HPLCDAD-ELSD. (Preto) Cromatograma monitorado pelo DAD e (Vermelho) cromatograma monitorado pelo ELSD.............................................................................................................52 Figura 11: Cromatogramas sobrepostos (n = 6) de amostras de látex do caule de H. speciosa monitorados pelo DAD (220 nm). LCA (látex proveniente de Aracaju), LCP (látex adquirido em Pontal), LCI (látex obtido em Itabaiana), LCB (látex proveniente de Boquim) e LCU (látex adquirido em Umbaúba).................................................................................................57 Figura 12: Cromatogramas sobrepostos (n = 6) de amostras de látex do caule de H. speciosa monitorados pelo ELSD. LCA (látex proveniente de Aracaju), LCP (látex adquirido em Pontal), LCI (látex obtido em Itabaiana), LCB (látex proveniente de Boquim) e LCU (látex adquirido em Umbaúba)............................................................................................................58 Figura 13: Cromatogramas fingerprint das amostras de látex do caule de H. speciosa (HPLCDAD). LCA (látex proveniente de Aracaju), LCP (látex adquirido em Pontal), LCI (látex obtido em Itabaiana), LCB (látex proveniente de Boquim) e LCU (látex adquirido em Umbaúba). Obs.: * Picos presentes em todas as amostras do látex do caule............................59 Figura 14: Cromatogramas fingerprint das amostras de látex do caule de H. speciosa (HPLCELSD). LCA (látex proveniente de Aracaju), LCP (látex adquirido em Pontal), LCI (látex obtido em Itabaiana), LCB (látex proveniente de Boquim) e LCU (látex adquirido em Umbaúba). Obs.: * Picos presentes em todas as amostras do látex do caule.......................................60 Figura 15: Cromatograma (λ = 220 nm) do látex do caule de H. speciosa em sistema semipreparativo. Condições cromatográficas: item 4.7. Os picos coletados estão indicados no cromatograma............................................................................................................................62 Figura 16: Perfil cromatográfico do látex do caule de H. speciosa acompanhado dos compostos isolados em escala analítica (λ = 220 nm)..............................................................63.

(13) III. Figura 17: Cromatogramas (λ = 220 nm) das bandas cromatográficas HSG 2, HSG 3, HSG 4 e HSG5 purificadas no sistema semi-preparativo, com seus respectivos espectros de absorção UV no tempo de retenção em que eluem. Condições de análise: item 4.5.1............................64 Figura 18: Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) da amostra HSG 2.........................66 Figura 19: Ampliação da região entre 6,98-7,06 ppm do espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) da amostra HSG 2......................................................................................................67 Figura 20: Ampliação da região entre 6,05-6,17 ppm do espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) da amostra HSG 2......................................................................................................67 Figura 21: Ampliação da região entre 3,93-4,27 ppm do espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) da amostra HSG 2......................................................................................................68 Figura 22: Ampliação da região entre 3,56-3,91 ppm do espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) da amostra HSG 2. ....................................................................................................68 Figura 23: Ampliação da região entre 2,012-2,080 ppm do espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) da amostra HSG 2. ..........................................................................................69 Figura 24: Espectro de RMN de 13C (100 MHz, CD3OD) da amostra HSG 2........................69 Figura 25: Mapa de correlação HSQC (1H: 400 MHz,. 13. C: 100 MHz, CD3OD) da amostra. HSG 2........................................................................................................................................70 Figura 26: Ampliações do mapa de correlação HSQC (1H: 400 MHz,. 13. C: 100 MHz,. CD3OD) da amostra HSG 2......................................................................................................71 Figura 27: Mapa de correlação HMQC (1H: 400 MHz,. 13. C: 100 MHz, CD3OD) da amostra. HSG 2........................................................................................................................................72 Figura 28: Ampliações do mapa de correlação HMQC (1H: 400 MHz,. 13. C: 100 MHz,. CD3OD) da amostra HSG 2......................................................................................................72 Figura 29: Estrutura química do ciclohexiletanóide glicosilado cornosídeo (HSG 2)............73 Figura 30: Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) da amostra HSG 3.........................75.

(14) IV. Figura 31: Ampliação da região entre 4,08-7,00 ppm do espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) da amostra HSG 3......................................................................................................76 Figura 32: Ampliação da região entre 2,41-3,94 ppm do espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) da amostra HSG 3......................................................................................................77 Figura 33: Espectro de RMN de 13C (100 MHz, CD3OD) da amostra HSG 3........................78 Figura 34: Mapa de correlação HMBC (1H: 400 MHz,. 13. C: 100 MHz, CD3OD) da amostra. HSG 3........................................................................................................................................80 Figura 35: Estrutura química do ciclohexiletanóide glicosilado dihidrocornosídeo (HSG 3)...............................................................................................................................................80 Figura 36: Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) da amostra HSG 6.........................83 Figura 37: Ampliação da região entre 6,65-7,12 ppm do espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) da amostra HSG 6......................................................................................................83 Figura 38: Ampliação da região entre 4,38-5,08 ppm do espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) da amostra HSG 6......................................................................................................84 Figura 39: Ampliação da região entre 3,10-3,90 ppm do espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) da amostra HSG 6......................................................................................................84 Figura 40: Espectro de RMN de 13C (100 MHz, CD3OD) da amostra HSG 6........................85 Figura 41: Ampliação da região entre 56,0 e 87,0 ppm do espectro de RMN de. 13. C (100. MHz, CD3OD) da amostra HSG 6............................................................................................85 Figura 42: Mapa de correlação HSQC (1H: 400 MHz,. 13. C: 100 MHz, CD3OD) da amostra. HSG 6........................................................................................................................................86 Figura 43: Ampliações do mapa de correlação HSQC (1H: 400 MHz,. 13. C: 100 MHz,. CD3OD) da amostra HSG 6......................................................................................................87 Figura 44: Mapa de correlação HMBC (1H: 400 MHz,. 13. C: 100 MHz, CD3OD) da amostra. HSG 6........................................................................................................................................87.

(15) V. Figura 45: Ampliações do mapa de correlação HMBC (1H: 400 MHz,. 13. C: 100 MHz,. CD3OD) da amostra HSG 6......................................................................................................88 Figura 46: Estrutura química da (7,8)-treo-4,7,9,9’-tetrahidroxi-3,3’-dimetoxi- 8-O-4’neolignana-7-O-β-D-glicopiranosídeo (HSG 6).......................................................................89 Figura 47: Cromatograma obtido a partir das seguintes condições: coluna Microsorb MV1005C18, modo isocrático 100% de ACN por 30 min em um fluxo de 0,8 mL/min, volume de injeção 20µL.............................................................................................................................90 Figura 48: Cromatogramas (λ = 200 nm) obtidos a partir das seguintes condições: coluna Microsorb MV100-5C18, fluxo de 0.8 mL/min, volume de injeção 20µL: (Análise 1) modo isocrático 85% de ACN:H2O, (Análise 2) modo isocrático 80% de ACN:H2O ambos por 30 min............................................................................................................................................92 Figura 49: Cromatogramas (λ = 200 nm) obtidos a partir das seguintes condições: coluna hexil-fenil LUNA, fluxo de 0.8mL/min, volume de injeção 20µL: (Análise 3) modo isocrático 100% de ACN:H2O, (Análise 4) modo isocrático 90% de ACN:H2O ambos. por 30. min............................................................................................................................................93 Figura 50: Cromatogramas (λ = 200 nm) obtidos a partir das seguintes condições: coluna hexil-fenil LUNA®, modo isocrático 90% de ACN:H2O, fluxo de 0,8 mL/min, volume de injeção 20µL: (A) lupeol; (B) mistura de ésteres 3- β-O-acil lupeol; (C) éster diidroxilado 3β-O-acil. lupeol. e. (D). extrato. diclorometano. do. látex. dos. frutos. de. H.. speciosa.....................................................................................................................................94 Figura 51: Cromatogramas (λ = 200 nm) para a seleção de condições para análise do látex dos frutos de H. speciosa Gomes em HPLC-DAD obtidos a partir das condições de análise (57) descritas na Tabela 11...........................................................................................................95 Figura 52: Projeção tridimensional obtido por HPLC-DAD da amostra do látex dos frutos de H. speciosa................................................................................................................................96 Figura 53: (A) Perfis cromatográficos monitorado com o DAD (200nm): extrato diclorometano do látex dos frutos (preto); marcadores químicos: éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol (vermelho), mistura de ésteres 3- β-O-acil lupeol (azul), e lupeol (magenta); (B) Perfil.

(16) VI. cromatográfico do látex dos frutos de H. speciosa monitorado pelo DAD (preto) e pelo ELSD (vermelho).................................................................................................................................97 Figura 54: (A) Cromatogramas obtidos por DAD (200 nm): extrato diclorometano do látex dos frutos (preto), látex dos frutos liofilizado (vermelho) e polpa comercial (azul); (B) Cromatogramas obtidos por ELSD: extrato diclorometano do látex dos frutos (magenta), látex dos frutos liofilizado (verde) e polpa comercial (azul).............................................................98 Figura 55: Estrutura química do éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol...................................100 Figura 56: Cromatograma típico: polpa da mangaba (vermelho), éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol (azul) e polpa da mangaba fortificada (preto); (A) obtido pelo DAD; (B) obtido pelo ELSD. As condições experimentais para obtenção desses cromatogramas são descritos no item 4.6.2.1..............................................................................................................................102 Figura 57: Curvas analíticas obtidas para a quantificação de éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol pelo DAD: padronização externa (A) e padronização por adição de padrão (B); e pelo ELSD: padronização externa (C)............................................................................................104 Figura 58: Cromatograma representativo da polpa comercial de mangaba, obtido pelo DAD (vermelho) e pelo ELSD (preto). Picos selecionados para quantificação: (1) éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol e (2-4) mistura de ésteres de lupeol............................................................109.

(17) VII. LISTA DE TABELAS Tabela 1: Condições cromatográficas avaliadas na primeira etapa da otimização do método para análise do látex do caule de H. speciosa, com detecção em 220 nm................................40 Tabela 2: Condições cromatográficas avaliadas na segunda etapa da otimização do método para análise do látex do caule de H. speciosa, com detecção em 220 nm................................43 Tabela 3: Valores de desvio padrão relativo entre os tempos de retenção, área e altura das bandas cromatográficas avaliadas nas análises da amostra do látex do caule de H. speciosa (precisão de injeção).................................................................................................................53 Tabela 4: Valores de desvio padrão relativo entre os tempos de retenção, área e altura das bandas. cromatográficas. avaliadas. nas. análises. de. amostra. de. H.. speciosa. (repetibilidade)..........................................................................................................................53 Tabela 5: Valores de desvio padrão relativo entre os tempos de retenção, área e altura das bandas cromatográficas avaliadas nas análises de amostra de H. speciosa Gomes (estabilidade).............................................................................................................................54 Tabela 6: Valores de desvio padrão relativo entre os tempos de retenção, área e altura das bandas. cromatográficas. avaliadas. nas. análises. de. amostra. de. H.. speciosa. (robustez)..................................................................................................................................55 Tabela 7: Valores de massa e de rendimento obtido no isolamento dos marcadores químicos....................................................................................................................................62 Tabela 8: Dados de RMN de 1H (400 MHz) e de. 13. C (100 MHz) em CD3OD da HSG-2. (cornosídeo) em comparação com dados da literatura..............................................................74 Tabela 9: Dados de RMN de 1H (400 MHz) e de. 13. C (100 MHz) em CD3OD da HSG-3. (dihidrocornosídeo) em comparação com dados da literatura..................................................79 Tabela 10: Dados de RMN de 1H (400 MHz) e de 13C (100 MHz) em CD3OD da HSG 6 em comparação com dados da literatura.........................................................................................82 Tabela 11: Condições cromatográficas avaliadas na otimização do método para análise do látex dos frutos da H. speciosa, com detecção em 220 nm, volume de injeção de 20 µL e vazão de 0,8 mL/min.................................................................................................................91.

(18) VIII. Tabela 12: Parâmetros de linearidade usando as soluções padrões.......................................105 Tabela 13: Dados do estudo de precisão, intra- e inter-dias, do método para quantificação de éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol........................................................................................106 Tabela 14: Dados do estudo de exatidão, intra- e inter-dias, do método para quantificação de éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol........................................................................................107 Tabela 15: Teor de éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol de polpa e látex liofilizado utilizando DAD e ELSD..........................................................................................................................109 Tabela 16: Teor dos ésteres de lupeol (indicados na figura 11) em polpa comercial de mangaba por HPLC-DAD-ELSD...........................................................................................110.

(19) IX. LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 1D Unidimensional 2D Bidimensional ACE Angiotensin Converting Enzyme (Enzima Conversora de Angiotensina) ACN Acetonitrila ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária C18 Fase sólida à base de sílica modificada com grupos octadecil C8 Fase sólida à base de sílica modificada com grupos octil CQA Controle de Qualidade de Alta Concentração CQB Controle de Qualidade de Baixa Concentração CQM Controle de Qualidade de Média Concentração d Dupleto DAD Diode array detector (Detector de arranjo de diodos) dd Dupleto duplo ddd Duplo dupleto duplo DPR Desvio padrão relativo ELSD Evaporative light scattering detector (Detector evaporativo por espalhamento de luz) F Fluxo UFSCar Universidade Federal de São Carlos GC Gas Chromatography (Cromatografia em fase gasosa) HCOOH Ácido fórmico HMBC Heteronuclear multiple bond correlation HPLC High Performance Liquid Chromatography (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) HPLC-DAD-ELSD High Performance Liquid Chromatography coupled with diode array detection and evaporative light scattering detector (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detectores de arranjo de diodos e evaporativo por espalhamento de luz).

(20) X. HSQC Heteronuclear single quantum coherence Hz Hertz IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística J Constante de acoplamento escalar LA Comprimento da coluna analítica LABORGANICS Laboratório de Pesquisa em Química Orgânica de Sergipe LCA Látex do caule de Aracaju LCB Látex do caule de Boquim LCI Látex do caule de Itabaiana LCP Látex do caule de Pontal LCU Látex do caule de Umbaúba LD Limite de Detecção LP Comprimento da coluna semi-preparativa LQ Limite de Quantificação m Mutipleto MeOH Metanol MHz Mega Hertz NO Óxido nítrico OMS Organização Mundial da Saúde PF Porcentagem final PI Porcentagem inicial ppm Partes por milhão q Quadrupleto quintl Quintupleto largo RA Diâmetro da coluna analítica RMN 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono - 13 RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio.

(21) XI. RMN Ressonância Magnética Nuclear RP Diâmetro da coluna semi-preparativa S Fator de escalonamento s Simpleto t Tripleto THF Tetrahidrofurano tl Tripleto largo TPA Tissue Plasminogen Activator (Ativador de Plasminogênio) tR Tempo de retenção UFS Universidade Federal de Sergipe UV Ultravioleta Vinj. Volume de injeção WHA World Health Assembly (Assembleia Mundial da Saúde) δ Deslocamento Químico λ Comprimento de onda.

(22) XII. RESUMO O presente trabalho apresenta o desenvolvimento e aplicação de métodos analíticos para o controle de qualidade do látex do fruto e do caule de H. speciosa Gomes utilizando cromatografia líquida de alta eficiência com os detectores de arranjo de diodos e evaporativo por espalhamento de luz (HPLC-DAD-ELSD). No primeiro momento, um método analítico para a obtenção do perfil cromatográfico foi desenvolvido e validado para a análise de uma amostra autêntica do látex do caule de H. speciosa; em seguida foi utilizado o método otimizado para a análise de amostras do látex do caule comercializadas em feiras livres do Estado de Sergipe. A comparação visual dos perfis cromatográficos das diferentes amostras do látex do caule permitiu averiguar a autenticidade e as dissimilaridades dos perfis químicos dessas amostras. Utilizando uma coluna semi-preparativa, sete marcadores químicos foram purificados a partir do látex do caule de H. speciosa; a caracterização por RMN 1H,. 13. C. possibilitou a identificação das seguintes substâncias: ciclohexiletanóide glicosilado cornosídeo,. ciclohexiletanóide. tetrahidroxi-3,3’-dimetoxi-. glicosilado. dihidrocornosídeo. e. (7,8)-treo-4,7,9,9’-. 8-O-4’-neolignana-7-O-β-D-glicopiranosídeo.. No. segundo. momento, um método cromatográfico para análise qualitativa dos marcadores químicos lupeol, α-amirina, β-amirina e ésteres 3- β-O-acil lupeol no látex dos frutos de H. speciosa e em polpa comercial de mangaba foi desenvolvido. Por fim, um método analítico para a quantificação do teor de ésteres de lupeol em látex dos frutos de H. speciosa e em polpa comercial foi desenvolvido e validado utilizando HPLC-DAD-ELSD. No estudo da validação foram avaliadas as figuras de mérito seletividade, linearidade, limite de quantificação e detecção, precisão, exatidão, estabilidade e robustez conforme as normas descritas na RE nº 899/03 (ANVISA). A quantificação do teor de ésteres de lupeol por ambos os detectores se mostraram significativamente similares (259,44 µg/mg para o DAD e 269,58 µg/mg para o ELSD) com coeficiente de variação de 2,7 %. Este trabalho apresenta uma contribuição ao controle de qualidade de amostras de H. speciosa. Palavras-chave: Hancornia speciosa Gomes, látex, perfil cromatográfico, marcadores químicos, quantificação, HPLC-DAD-ELSD, mangaba..

(23) XIII. ABSTRACT This work describes the development and application of analytical methods to establish parameters to the quality control of fruit and trunk latex of H. speciosa using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) with diode array detect and evaporative light scattering detector (ELSD). As a first step chromatographic profile analytical method was developed and validated for the analysis of authentic sample of trunk latex of H. speciosa, and then the optimized method was used for the analysis of commercial samples of trunk latex sold in open markets from Sergipe, Brazil. The visual comparison of the chromatographic profiles of different samples of trunk latex allowed checking the authenticity and dissimilarities of chemical profiles of these samples. Seven chemical markers were purified by semi-preparative HPLC-DAD from the trunk latex of H. speciosa, the characterization by 1. H,. 13. C NMR allowed the identification of the following substances cyclohexylethanoid. glucoside cornoside, cyclohexylethanoid glucoside dihydrocornoside and (7,8)-treo-4,7,9,9’tetrahydroxy-3,3’-dimethoxy-8-O-4’-neolignan-7-O-β-D-glucopyranoside. As a second step of our work chromatographic method for qualitative analysis of chemical markers lupeol, αamyrin, β-amyrin e 3- β-O-acyl lupeol esters in the fruit latex of H. speciosa and in the mangaba commercial pulp was developed, the optimized method showed itself appropriate to the identification of such substances with adequate separation. In the end one analytical method for the quantification of the lupeol ester content in fruit latex and commercial pulp was developed and validated using the HPLC-DAD-ELSD. In the validation study were evaluated the figures of merit selectivity, linearity, limit of quantification and detection, precision, accuracy, stability and robustness according to the standards described in RE nº 899/03 (ANVISA). The quantification of lupeol ester by both detectors was significantly similar (259.44 µg/mg DAD and 269.58 µg/mg ELSD) with one coefficient of variation of 2.7%. This paper presents a contribution to the quality control of H. speciosa samples.. Keywords: Hancornia speciosa Gomes, latex, chromatographic profile, chemical markers, quantification,. HPLC-DAD-ELSD,. mangaba..

(24) Introdução. 1.

(25) 1 – INTRODUÇÃO O consumo mundial de frutas tem aumentado em decorrência das evidências científicas sobre os seus efeitos benéficos para a saúde humana.. [1-3]. Juntamente com. outras partes dos vegetais, as frutas são uma excelente fonte de nutrientes vitais e de compostos que são biologicamente ativos, tais como aqueles que são capazes de agir como antioxidante celular ou como agente anti-inflamatório.[3-6] Dentro desse contexto, as plantas em geral podem ser consideradas um laboratório biossintético não só ao que se refere aos compostos químicos utilizados como alimentos pelos seres humanos e pelos animais, mas também no que se refere a uma infinidade de compostos que exercem os mais diversos efeitos fisiológicos.[7,8] Os compostos bioativos que não estão relacionados às funções básicas das plantas são chamados de metabólitos secundários, os quais ocorrem com fantástica variedade e complexidade e são biossintetizadas como mecanismo de defesa dos vegetais às condições ambientes.[8,9] Alguns metabólitos secundários são responsáveis pelos efeitos benéficos e toxicológicos encontrados em plantas medicinais. Portanto, o uso seguro destas espécies requer estudos que avaliem os seus aspectos químicos, farmacológico e toxicológico. [10] A utilização da maioria das plantas medicinais cultivadas em nosso país está fundamentada somente no seu uso popular sem nenhuma comprovação pré-clínica nem clínica.[11] As razões para falta de pesquisa nesta área são, em parte, pela escassez de políticas de saúde pública, mas também pela ausência de metodologias de pesquisas adequadas ou aceitas para a avaliação do uso da medicina tradicional. Mediante a importância do tema, um processo coordenado de todos os atores (fitoquímicos, químicos sintéticos, farmacólogos, farmacêuticos, médicos etc.) precisa ser realizado a fim de descobrir metodologias efetivas para o controle de qualidade. [12,13]. 2.

(26) Entre as metodologias disponíveis para o controle de qualidade de amostras vegetais, o uso de perfis cromatográficos (fingerprint) tem ganhado bastante atenção. Como uma ferramenta analítica, o fingerprint cromatográfico representa as características químicas da planta. Em uma abordagem tradicional deste conceito, o cromatograma padrão é construído a partir da relação entre os múltiplos compostos presentes na amostra da planta. Nesse contexto, o perfil cromatográfico tem potencial para determinar a identidade, autenticidade das plantas medicinais partindo-se do princípio de que amostras com fingerprint similares têm propriedades similares.[14-15] A cromatografia, com destaque para a cromatografia líquida de alta eficiência (sigla HPLC, do inglês, high performance liquid chromatography) e cromatografia a gás (sigla GC, do inglês, gás chromatography), é a técnica mais utilizada na obtenção de fingerprints. Com rápida separação, o HPLC apresenta eficiência e sensibilidade similar a GC. No entanto, sua aplicação é mais abrangente visto que é capaz de analisar a maior parte dos compostos presentes em plantas, uma vez que não está limitada a volatilidade ou estabilidade térmica das substâncias na amostra.[13,16] Normalmente, a análise química de amostras de origem vegetal é realizada por meio da investigação qualitativa e quantitativa dos padrões de referência (marcadores químicos). A quantificação de substâncias marcadoras em plantas medicinais comumente apresenta os seguintes desafios: teor desconhecido das moléculas de interesse na amostra, alta variabilidade do teor o que demanda métodos que cubram um grande faixa e pequeno número de substâncias padrão disponível no mercado. Faz-se necessário considerar que dificilmente os compostos quantificados sejam, isoladamente, responsáveis pela atividade biológica ou pela eficácia terapêutica, uma vez que plantas constituem matrizes complexas onde a sua totalidade química pode ser considerada o “princípio ativo”.[13,17-19] No Brasil pode ser encontrada uma grande variedade de fruteiras com potencial para o mercado agroindustrial e que podem tornar-se uma fonte de renda para a população local.[7] Nesse contexto, a biodiversidade brasileira constitui um fascinante tema de pesquisa acadêmica, visto que muitas espécies utilizadas na medicina tradicional (entre elas as fruteiras) não têm sido devidamente estudadas quanto a suas. 3.

(27) propriedades e atividades benéficas à saúde. Neste cenário, encontra-se a mangabeira (Hancornia speciosa Gomes), uma fruteira de expressão regional e o objeto de estudo deste trabalho. A mangabeira é uma planta tipicamente tropical, nativa do Brasil, que possui grande potencial para exploração econômica. O mercado para esta fruta encontra-se, principalmente, nas regiões Norte e Nordeste do Brasil. Em Sergipe, a mangaba é uma das frutas mais abundantes e procuradas nas feiras livres, atingindo um preço superior ao da uva e de outras frutas nobres. Além do consumo in natura, o maior aproveitamento da mangaba se dá na forma de sucos, doces e sorvetes, sendo esse processamento feito, na maioria das vezes, por pequenas empresas produtoras de sorvete da região Nordeste. Segundo dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) referentes ao ano de 2009 o valor da produção sergipana da mangaba, que corresponde a 55,3% da produção nacional, foi de R$ 705 mil, quase 65% do R$ 1,09 milhão produzidos nacionalmente pela extração do fruto.[20-22] A mangabeira, como outras espécies pertencentes à família Apocynaceae é produtora de látex.. Quimicamente, o látex em geral é uma mistura complexa de. proteínas, carboidratos, óleo, metabólitos secundários e borracha tendo a função de proteger a planta contra herbivoria, microorganismos e também selar ferimentos. Na H. speciosa, o látex pode ser encontrado em diversas partes principalmente no tronco e nos frutos. Apesar de seu potencial comercial devido algumas propriedades similares ao látex da seringueira (Hevea brasiliensis), o látex da mangabeira encontra maior utilização na medicina popular contra tuberculose, úlcera, fungos e certos tipos de inflamações.[23-27] Uma das principais preocupações dos produtores de frutas da região Nordeste do Brasil é a agregação de valor às fruteiras regionais, as quais são geralmente produzidas em regime extrativista. Dessa forma, o conhecimento químico da H. speciosa e seu emprego como insumo para as indústrias farmacêutica, de alimentos e/ou cosméticos poderia ser uma alternativa para agregar valor ao fruto, melhorar a renda dos produtores da região e contribuir para diminuição da devastação desta espécie.. 4.

(28) 1.1– Látex O látex ocorre no reino das plantas em mais de 12.000 espécies pertencentes a 900 gêneros.[28] As estruturas vegetais denominadas de laticíferos são responsáveis pela produção do “leite vegetal” podendo ser localizados em todos os tecidos epiteliais da planta, sendo a ocorrência mais frequente na casca do tronco. Quando seccionados, os vegetais laticíferos deixam fluir o látex, que coagula e veda o corte feito na planta por reações enzimáticas.[. 29,30]. Do ponto de vista funcional, não há conhecimento de. qualquer influência do látex no metabolismo primário, por outro lado, sua função tem sido frequentemente relacionada a defesa contra herbívoros.[31] De forma geral, o látex natural apresenta-se com um sistema bifásico, no qual a fase polimérica está na forma de emulsão. O látex é normalmente composto por uma complexa mistura de diferentes componentes, incluindo macromoléculas. O poliisopreno está presente em todas as espécies laticíferas e é um dos componentes majoritários podendo ser encontrado na forma cis e/ou trans. Outros constituintes presentes em látex e relatados em estudos fitoquímicos são: polissacarídeos, flavonóides, lipídeos, fosfolipídios, proteínas, alcanos, triterpenóides, alcalóides, taninos.[29,30,32] Alguns destes compostos fornecem resistência contra herbívoros por meio de efeitos antinutritivos e tóxicos, enquanto que outros estão envolvidos na viscosidade que podem capturar diferentes insetos. Em geral os compostos encontrados no látex estão diretamente relacionados com o metabolismo, defesa e interações ecológicas das plantas.[32] No contexto humano, o látex pode ser ingerido a partir do consumo das frutas frescas (e seus derivados) ou como bebida.[33] A ingestão de látex deve ser bem avaliada, uma vez que propriedades corrosivas e queratolíticas são conhecidas nesse tipo de matriz.[31-32]Por outro lado, o reconhecimento do efeito benéfico das substâncias presentes em látex na saúde humana tem sido relatado.[34-36] Nesse sentido, a caracterização química de látices de diferentes espécies vegetais tem sido realizada permitindo o conhecimento de diferentes substâncias que por sua vez viabiliza o entendimento da funcionalidade do látex para plantas, bem como assegura o emprego do mesmo na medicina popular. A cromatografia líquida de alta. 5.

(29) eficiência é uma das técnicas empregadas para o isolamento e identificação de compostos nesse tipo de matriz.[37-39]. 1.2– Controle de qualidade de amostras vegetais A Organização Mundial da Saúde (OMS) através das resoluções WHA 31.33 (1978) e 40.33 (1987) afirmou a importância do uso de plantas medicinais nos cuidados da saúde e a necessidade da criação de programas globais para a identificação, validação, preparação, cultivo e conservação das plantas medicinais utilizadas na medicina tradicional, bem como certificar o controle de qualidade delas.[40] Assegurar a qualidade do material vegetal é um dos fatores que contribui para o uso eficaz e seguro do produto. A eficácia é dada pela comprovação, por meio de ensaios farmacológicos pré-clínicos e clínicos, dos efeitos biológicos preconizados para esses recursos terapêuticos, e a segurança é determinada pelos ensaios que comprovam a ausência de efeitos tóxicos. [40-41] A avaliação da qualidade dos produtos de origem vegetal pode ser feita através de procedimentos de análises químicas, físicas, físicoquímicas e microbiológicas.[42] O controle de qualidade químico de plantas torna-se uma tarefa difícil devido a variabilidade e a complexidade dos compostos presente nos vegetais. Em muitos casos os princípios ativos não estão suficientemente estabelecidos ou ainda a atividade biológica é atribuída aos efeitos sinérgicos das substâncias. Esses fatores tornam as metodologias para o controle de qualidade laboriosas e limitadas.[13,43] Convencionalmente, um dos primeiros e imprescindíveis passos para o controle de qualidade é a verificação da autenticidade da matéria-prima vegetal, que pode ser feita através da identificação botânica (análise macro e microscópica) e através de métodos químicos, baseados na presença de substâncias que, preferencialmente, possuam relação com a atividade terapêutica e/ou com a identificação das espécies, os chamados marcadores químicos e/ou quimiotaxonômicos.[17]. 6.

(30) Marcadores químicos são substâncias de referência que podem ser considerados a base para estabelecer a qualidade de medidas analíticas e, consequentemente, do material vegetal. Qualquer substância química com estrutura conhecida pode ser usada como um padrão para teste de identidade (análise qualitativa).[44] Com o avanço das técnicas cromatográficas, os métodos químicos clássicos de caracterização baseados na presença de grupos funcionais têm caído em desuso, uma vez que são pouco sensíveis e inespecíficos. Paralelo a esse fato, a cromatografia líquida de alta eficiência tem possibilitado a caracterização de amostras vegetais a partir de análises qualitativas de padrões conhecidos na matriz e do isolamento em escala semi ou preparativa de substâncias, de forma rápida, eficaz e economicamente viável.[45-47]. 1.3 – Arranjo de diodos (DAD) e Evaporativo por espalhamento de luz (ELSD) como detectores para análise de amostras vegetais por HPLC Para a detecção dos compostos presente em extratos brutos de planta, eficientes métodos de separação são requeridos. Nesse sentido, a cromatografia líquida de alta eficiência tem sido reconhecida como a mais versátil técnica, dispensando, em muitos casos, métodos complexos de preparação da amostra. O HPLC tem se desenvolvido ao longo dos anos em termos de conveniência, velocidade, opções de fase estacionária, alta sensibilidade, aplicabilidade e habilidade para hifenação com detectores espectrométricos e espectroscópicos.[48] A diversidade estrutural das substâncias presentes nos produtos naturais resulta na alta variabilidade das propriedades físico-químicas destes compostos, o que torna a detecção universal um desafio. Nenhum dos detectores disponíveis para o HPLC é capaz de detectar todas as substâncias, em um dado extrato, dentro de uma única análise. Nesse contexto, a escolha apropriada do detector é de grande relevância e conduz para a obtenção dos dados químicos apropriados, tendo em vista a classe de metabólitos secundários que será analisada.[17,48]. 7.

(31) Na tentativa de se ter uma visão mais ampla da composição química das plantas, métodos cromatográficos têm sido desenvolvidos com o uso de diferentes detectores o que possibilita a determinação simultânea de compostos com propriedades diferentes. Por exemplo, o detector de arranjo de diodos (DAD – do inglês, diode array detector) juntamente com o detector evaporativo por espalhamento de luz (ELSD – do inglês, evaporative light scattering detector) podem ser empregados para determinar simultaneamente compostos que apresentam pouca ou nenhum absorção na região do ultravioleta (UV).[16,49-51] Entre os detectores utilizados no HPLC o mais simples e largamente empregado é o UV. Três tipos de detectores de UV estão disponíveis: os fotômetros de comprimento de onda fixo, os espectrofotômetros e os detectores por arranjo de fotodiodos. O detector de comprimento de onda fixo é o mais barato e apresenta alta sensibilidade visto que a luz é emitida em um específico comprimento de onda através de uma dada lâmpada. No entanto, o detector de múltiplos comprimentos de onda é mais versátil, através da escolha de um comprimento de onda adequado para o analito, a baixa sensibilidade do mesmo pode ser compensada. Já o detector de arranjo de diodos oferece completo espectro de UV o que permite verificar a pureza dos picos resultantes da separação.[48,52] Embora tenha algumas limitações, particularmente para compostos que não possuem grupos cromóforos, a detecção por UV possui a melhor combinação de sensibilidade, linearidade, versatilidade e confiabilidade. A maior parte dos compostos encontrados em plantas absorve no UV (200-400) devido à presença de substâncias com uma ou mais ligações duplas ou elétrons desemparelhados. Esse fato torna o DAD o detector espectrofotométrico mais frequentemente usado para análise de vegetais. [48,52] O ELSD é considerado um detector quasi-universal, com ele pode ser detectado qualquer analito menos volátil que a fase móvel, independente de qualquer outro tipo de propriedade (ótica, eletroquímica etc.). Uma vantagem particular desse tipo de detecção é a possibilidade de se usar a eluição no modo isocrático ou gradiente. Estima-se que 1,5 % dos trabalhos que envolvem o HPLC na análise de produtos naturais empregam o detector evaporativo por espalhamento de luz.[48,52]. 8.

(32) O detector evaporativo por espalhamento de luz tem como princípio a nebulização da fase móvel com um gás inerte e evaporação do solvente para produzir pequenas partículas que serão detectadas em uma cela de espalhamento de luz. A intensidade da luz espalhada depende do tamanho, da forma e das propriedades superficiais das partículas formadas durante o processo de nebulização. Os principais parâmetros que afetam a resposta do ELSD são o fluxo do gás nebulizador e a temperatura utilizada no tubo.[48] Diferente do DAD, a resposta gerada pelo ELSD depende da massa do analito, ou seja, não tem nenhuma relação com as propriedades espectrais ou físicoquímicas da substância de interesse. Em teoria, isso significa que o ELSD gera uma resposta similar para quantidades iguais de massa gerando assim um fator de resposta universal. Contudo, a resposta do ELSD depende também da volatilidade do composto e da composição da fase móvel o que faz com que tais procedimentos de quantificação sejam experimentalmente inacessíveis. A soma desses fatores leva a uma resposta não linear do ELSD, em outras palavras, a relação entre a concentração do analito e o sinal produzido pelo detector de espalhamento de luz não obedece a Lei de Beer, mas sim uma equação exponencial, I = kmb, onde I é a intensidade da luz, m a massa da partícula espalhada, k e b são constantes determinadas principalmente pela natureza da fase móvel e parâmetros do detector. Para facilitar o uso do detector, a equação torna-se linear na forma logarítmica: log I = log k + b x log m.[48,53-55] Várias são as aplicações, incluindo a determinação de resinas, polímeros, polietilenoglicóis, carboidratos, lipídios, triglicerídeos, fosfolipídeos, esteróides, adoçantes, aditivos de petróleo, agentes surfactantes, entre outras com o uso deste.[56]. 9.

(33) 1.4 – Perfil Cromatográfico e Quantificação de marcadores químicos para controle de qualidade de amostras vegetais. As abordagens qualitativas (perfis cromatográficos) e quantitativas (quantificação de marcadores químicos) têm sido utilizadas para estabelecer parâmetros de autenticidade e qualidade de amostras vegetais.[17,57,58] Os perfis cromatográficos (ou fingerprints) possibilitam a formação de um padrão de reconhecimento específico dos múltiplos compostos presentes na amostra, permitindo o reconhecimento de semelhanças e diferenças entre extratos submetidos às mesmas condições de análise. Dessa forma, a qualidade química é avaliada baseada na complexidade característica das plantas, uma vez que considera a ausência e presença de marcadores químicos e a proporcionalidade existente entre os analitos detectados. O conceito de fingerprint tem sido empregado em diferentes aplicações: (1) determinação de autenticidade e identificação de espécies, (2) avaliação da qualidade química e da fitoequivalência, (3) análise de estabilidade entre diferentes extratos, (4) análise de consistência (variação lote-a-lote) de matérias-primas e de fitoterápicos e (5) estudos de variabilidade sazonal e acompanhamento de cultivares.[15-17] Embora a quantificação de marcadores químicos não seja suficiente para assegurar a qualidade de uma amostra vegetal devido à presença metabólitos secundários comuns a diferentes espécies, esta abordagem é bastante utilizada pela pesquisa acadêmica e pela indústria.[17] Na literatura, estão disponíveis diversos exemplos de métodos cromatográficos por HPLC para a quantificação de substâncias de referência em amostras vegetais.[59-61] Nesse contexto, o presente trabalho apresenta o desenvolvimento, validação e aplicação de métodos analíticos para estabelecer parâmetros para o controle de qualidade do látex do fruto e do caule de H. speciosa Gomes utilizando cromatografia líquida de alta eficiência com os detectores de arranjo de diodos e evaporativo por espalhamento de luz (HPLC-DAD-ELSD).. 10.

(34) Revisão Bibliográfica. 11.

(35) 2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 – Aspectos botânicos Apocynaceae é uma das maiores e mais representativas famílias de Angiospermas, contendo em seus limites cerca de 400-480 gêneros e 4.300-4.800 espécies com variados hábitos, como árvores, arbustos, subarbustos, lianas e ervas. Dentre estas espécies algumas se destacam pelo grande potencial econômico (como por exemplo, a Funtumia elastica Stapf. usada para produção de borracha); outras apresentam grande importância medicinal (a citar: Catharantus roseus L. e Vincetoxicum officinale Moench); outras ainda são cultivadas como ornamentais devido ao seu valor paisagístico, como Mandevilla Lindl. e Nerium oleander L. Além destas existem diversas espécies como o amapazeiro (Parahancornia amapa (Huber) Ducke), a sorva (Couma utilis (Mart.) Müll. Arg.) e a mangaba (Hancornia speciosa Gomes), cujos frutos são comestíveis e usados na fabricação de sucos, compotas e licores.[62] Hancornia speciosa Gomes, a mangabeira, pertence à classe Equisetopsida C. Agardh, subclasse Magnoliidae Novák ex Takht, superordem Asteranea Takht., ordem Gentianales Juss. Ex Bercht. & J. Presl., família Apocynaceae Juss., subfamília Rauvolfioideae, tribo Willughbeieae. Hancornia é um gênero de única espécie possuindo 11 sinônimos, compreendendo duas variedades que se diferenciam por algumas características morfológicas, principalmente da folha e da flor: H. speciosa var. speciosa e H. speciosa var. pubescens (Nees & Mart.) Mull. Arg.[63] A mangabeira é uma planta arbórea de porte médio, possuindo de 2 a 10 m de altura, podendo chegar a até 15 m, dotada de copa irregular, tronco tortuoso, bastante ramificado e áspero; ramos lisos e avermelhados, exsudando látex em toda a sua extensão (Figura 1). A casca da árvore é escura e fendilhada. Suas folhas são elípticas de 5 a 6 cm de comprimento e 2 cm de largura. Sua inflorescência possui de 1 a 7 flores perfumadas e de coloração branca. O fruto é uma baga ovóide e globosa, verde amarelada ou verde rosada. Alguns autores classificam os frutos como baga piriforme, que apresenta na sua superfície manchas encarnadas e encerram sementes comprimidas e de forma triangular. As sementes são do tipo recalcitrante, isto é, não suportam ressecamento, perdendo rapidamente o poder germinativo assim que são retiradas do fruto.[64-66] 12.

(36) (1). (2). Figura 1: Foto de um espécime (1) e do fruto (2) de Hancornia speciosa Gomes. Fonte: (1) NOGUEIRA, P. C. L. (2009) e (2) SANTOS, A. D. C. (2011).. Embora a mangabeira também seja produtora de látex, o fruto, denominado “mangaba” é o seu principal produto; este nome tem origem na língua tupi-guarani e significa “coisa boa de comer”. A mangaba apresenta ótimo sabor e aroma o que leva a ter uma excelente aceitação no mercado; com teor de proteína de 1,3 a 3,0%, podendo ser indicada para alimentação de pessoas doentes e convalescentes, em função da sua alta digestibilidade, valor nutricional e propriedades medicinais.[66,67] No cenário atual, tem-se verificado uma crescente valorização da mangaba pelos consumidores, o que tem estimulado a demanda, porém, paralelamente, tem-se observado uma grande ameaça de diminuição da oferta, tendo em vista a crescente devastação da vegetação nativa na qual a espécie está inserida, motivada pelo crescimento das zonas urbanas, pela implantação da monocultura e pela falta de conhecimento dos agricultores dos poucos saberes técnico disponível a respeito do cultivo de mangaba. [66,68]. 13.

(37) Neste sentido, há estudos promissores visando gerar conhecimentos e tecnologias sobre a cultura da mangabeira, bem como o desenvolvimento dessa fruteira em bases sustentáveis e competitivas, tornando a sua exploração sistemática e superando as barreiras do extrativismo. Entre os aspectos agronômicos pesquisados podemos citar: influência de substrato[69], organogênese[70], germinação in vitro[71], influência da profundidade de semeadura e luminosidade[72], irrigação. [73,74]. , avaliação. dos frutos pós-colheita[75,76] e parâmetros genéticos em progênies.[77].. 2.2 – Aspectos químicos. Embora possam ser encontrados diversos trabalhos de isolamento e identificação de metabólitos secundários em outros gêneros de Apocynaceae, existem poucos trabalhos a respeito dos aspectos químicos (isolamento e identificação de substâncias) da H. speciosa.[78] O nosso grupo de pesquisa (LABORGANICS) tem sido o pioneiro no isolamento e identificação das substâncias presentes na mangabeira. O estudo fitoquímico do látex dos frutos realizado por Sampaio (2008) permitiu o isolamento de doze substâncias, sendo elas sete ésteres 3-β-O-acil lupeol : 3-β-O-hexadecanoato de lupeoíla (2), 3-β-O-9-octadecenoato de lupeoíla (3), 3-β-O-octadecanoato de lupeoíla (4), 3-β-O-3’-hidroxihexadecanoato de lupeoíla (8), 3-β-O-3’-hidroxioctadecanoato de lupeoíla (9), 3-β-O-3’-hidroxiicosanoato de lupeoíla (10), 3-β-O-3’- hidroxidocosanoato de lupeoíla (11), uma mistura contendo os triterpenos α-amirina (12), β-amirina (13), lupeol (14), um 3-β-O-3’,5’-diidroxiicosanoato de lupeolíla (15), além da sacarose na sua forma peracetilada (16).[86] Esses triterpenos pentacíclicos são uma classe de substâncias caracterizada por apresentar uma grande variedade de atividade biológica.[79-82]. 14.

(38) +. 29. 29. 30 20 18 25 26 1 9 14 R1 3'. O. 10. 3. ( )n. 4. 1' O 23. 8. 19 28. 30. 17. 1 O. 27. ( ). 5. 9'. 4. 1' O. 5. 7. 23. 24. 26. 17. 14. 9 8. 10. 3. ( ). 25. 20 19 28 18. 27. 5 24. (3) R1= H,. n= 10 (1), 12 (2), 14 (4), 16 (5), 18 (6), 20 (7). R1=OH, n= 12 (8), 14 (9), 16 (10), 18 (11). 30 19. 29. 20. 20. 28. 28 12 25. 25. 17. 3. 27. 4. 5. 23. 23. 24. 8 27. 4. HO. 17 14. 9 10. 8. 13 18. 26. 1. 14. 9 10. HO. 12. 18. 26. 1 3. 13. 5 24. (12). (13). 29. 30. 20 19. 29. 30. 28. 13 18 25 1 10 3 HO 23. 25 1. 14. 9. OH. 8. OH. O. 5. 14. 1'. 3'. 4 23. 24. (14). 17 28. 14. 9 10. O. 18. 26. 3. 5'. 27. 4. 20 19 13. 17. 26. 30. 29. 8 27. 5 24. (15). 6 CH2OAc 4 AcO AcO. O 5 3. 2. 1'. OAc CH2OAc O 2' 5'. 1. AcO O. 3'. 4'. 6' CH2OAc. AcO. (16). 15.