3.1 – Geral
Desenvolver e validar métodos analíticos em cromatografia líquida de alta eficiência com os detectores de arranjo de diodos e evaporativo por espalhamento de luz (HPLC-DAD-ELSD) para controle de qualidade do látex do caule e dos frutos de Hancornia speciosa Gomes.
3.2 – Específicos
Desenvolver e validar métodos analíticos utilizando HPLC-DAD-ELSD para a caracterização química do látex do caule e dos frutos de H. speciosa;
Aplicar o método analítico para determinar a autenticidade de amostras comerciais do látex do caule da mangabeira;
Isolar marcadores químicos a partir do látex do caule de H. speciosa e caracterizar quimicamente sua estrutura por RMN de 1H e de 13C em uma e duas dimensões;
Desenvolver e validar método por HPLC-DAD-ELSD para a quantificação de marcadores químicos em amostras de látex dos frutos de H. speciosa Gomes.
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4 – PARTE EXPERIMENTAL
4.1 – Materiais e equipamentos
As análises por cromatografia líquida foram realizadas em equipamento da marca SHIMADZU (Kyoto, Japão), modelo Prominence, constituídos pelos seguintes módulos: duas bombas LC-6A, desgaseificador DGU-20A3, auto-injetor SIL-10A,
detector de UV com arranjo de diodos SPD-M20Avp, detector evaporativo de espalhamento de luz (ELSD-LT II); ambos os detectores conectado a uma interface CBM 20A. O equipamento foi gerenciado pelo software LC solution. Diferentes colunas analíticas foram utilizadas na otimização das condições cromatográficas, sendo elas:coluna C18 (5µm; 25,0 x 1,0 cm, Varian), coluna Hexil-fenil LUNA® (10 µm, 15,0
x 0,46 cm, Phenomenex) e coluna C18 LUNA® (5 µm, 25,0 x 0,46 cm, Phenomenex).
Os solventes grau HPLC utilizados nas análises cromatográficas foram adquiridos da JT BAKER (Phillipsburg, NJ, USA) e TEDIA (Fairfield, OH, USA). Antes do uso, os solventes foram filtrados através de uma membrana filtrante de Nylon de 47 mm (diâmetro da membrana) e 0,45 μm (diâmetro dos poros) da marca MFS.
A água desionizada utilizada na composição da fase móvel e no preparo das amostras foi obtida em um sistema MILLI-Q (Millipore, São Paulo, Brasil). A retirada do solvente das diferentes amostras foi realizada em evaporador rotatório da marca HEIDOLPH®.
Os extratos comerciais do látex do caule da mangabeira foram secos em um liofilizador LIOTOP® modelo L101 (Liobrás, São Carlos-SP, Brasil) e em concentrador e centrifugador CENTRIVAP (LABCONCO®). As pesagens foram realizadas em balança analítica (DENVER INSTRUMENT®) com precisão de 0,1 mg. As amostras foram homogeneizadas em agitador do tipo Vortex (QL-901) da BIOMIXER®. No preparo das soluções, usaram-se micropipetas de marca LAB MATE - HIGH TECH LAB®.
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4.2 – Limpeza do material
As vidrarias utilizadas durante o trabalho foram enxaguadas com água corrente por várias vezes, ensaboadas com detergente, enxaguadas novamente, sonicadas por 30 min em uma solução de água destilada e isopropanol (50:50 v/v) e por fim levadas a estufa a 120 ˚C. As vidrarias volumétricas foram secas a temperatura ambiente . Em seguida, o material foi coberto com papel filme e guardado em armário fechado.
4.3 – Material Vegetal
4.3.1 – Obtenção do látex do caule da mangabeira
Uma amostra do látex do caule da H. speciosa foi adquirida no povoado de Pontal, município de Indiaroba-SE (LCP). A extração foi realizada no dia 13 de janeiro de 2011 às 5h e 45min com auxílio da Sra. Ednalva Tavares dos Santos, uma das participantes do projeto “Catadoras de Mangaba”. Neste processo, pequenas incisões foram feitas no caule da mangabeira e a seiva branca e leitosa oriunda de vários táxons foi coletada em recipientes de plástico (Figura 2). O látex obtido (~100 mL) foi diluído com 700 mL de água destilada e filtrado com auxílio de um pano fino. O volume utilizado para a diluição está de acordo com aquele empregado no uso popular daquela região. Um frasco âmbar revestido com papel alumínio foi utilizado para armazenar esse material vegetal (“leite de mangabeira”), o qual foi mantido sob refrigeração durante o transporte e em freezer até as análises por cromatografia líquida. Para a identificação taxonômica da espécie, uma exsicata (#20.585) do material botânico foi depositada no Herbário da Universidade Federal de Sergipe (ASE/UFS).
O estudo do látex do caule consistiu também na análise de amostras comercializadas em feiras livres de diferentes cidades do Estado de Sergipe: Aracaju (LCA), Itabaiana (LCI), Umbaúba (LCU) e Boquim (LCB). Tais amostras foram adquiridas ao longo do desenvolvimento da pesquisa.
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Figura 2: Extração do látex do caule Harcornia speciosa Gomes Fonte: SANTOS, A. D. C. (2011)
4.3.2 – Obtenção do látex dos frutos da mangabeira
O látex da mangaba foi obtido a partir dos frutos verdes adquiridos na feira livre de Pedrinhas-SE. A extração do látex foi feita por meio de diversos cortes nos frutos (229 g), seguida da coleta do líquido branco em um béquer, o qual foi diluído em água e, em seguida, extraído com diclorometano (6 x 50 mL). Após a remoção do solvente em evaporador rotatório, obteve-se 480 mg do extrato diclorometânico.[86]
Um segundo extrato do látex dos frutos verdes foi preparado usando frutos da mangabeira coletados no Bairro Augusto Franco, Aracaju-SE. Para a obtenção desse extrato foram feitos diversos cortes nos frutos coletando-se o suco leitoso, o qual em seguida foi liofilizado até completa remoção da água.
4.3.3 – Polpa comercial do fruto da mangabeira
As polpas de mangaba da marca VIP® (100 g) foram adquiridas em supermercado da cidade de Aracaju-SE e posteriormente liofilizadas para a remoção da água.
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4.4 – Preparo das amostras do látex de Hancornia speciosa e dos
marcadores químicos
4.4.1 – Látex do caule
Para a análise cromatográfica, 3 mL das amostras do látex do caule foram liofilizados. Após a completa retirada da água, foram adicionados 3 mL de metanol e sonicados por 20 min. Em seguida, a parte insolúvel (borracha) foi retirada, a solução resultante foi seca e a massa residual determinada. Sete miligramas desta amostra foi pesada e dissolvida em 1 mL da solução aquosa de acetonitrila a 5% em volume; a qual foi filtrada em uma membrana de nylon 0,45µm antes da análise por HPLC.
4.4.2 – Látex dos frutos
O látex dos frutos e a polpa comercial ambos liofilizados foram solubilizados em uma mistura de hexano:metanol (7:1 v/v). Após filtração simples, o sobrenadante foi secado e diluído em uma solução de 10% tetrahidrofurano:isopropanol. Já para a análise do extrato diclorometano do látex dos frutos foi realizada a dissolução direta em isopropanol. As amostras foram filtradas em uma membrana de nylon 0,45 µm e então analisadas por cromatografia líquida.
4.4.3 – Marcadores químicos do látex dos frutos
Os padrões utilizados nesse trabalho foram dissolvidos em isopropanol, filtrados em membrana de nylon 0,45 µm e analisados por cromatografia líquida. Uma amostra do triterpeno lupeol foi gentilmente cedida pela Profa. Dra. Valéria Regina de Souza Moraes (DQI/UFS). Os demais marcadores químicos: uma mistura contendo os triterpenos α-amirina, β-amirina e lupeol; uma mistura contendo sete (07) ésteres 3-β-O- acil lupeol; e um éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol foram isolados do extrato clorofórmio do látex dos frutos previamente pela MSc. Taís Santos Sampaio.[86]
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4.5 – Condições cromatográficas de análise
4.5.1 – Método qualitativo para o látex do caule da mangabeira
Para as análises cromatográficas do látex do caule foi empregada uma coluna analítica C18 LUNA® (5 μm, 250 x 4,6 mm, Phenomenex) adaptada a uma coluna de guarda C18 (4,0 x 3,0 mm, Phenomenex). A separação dos compostos se deu por meio da eluição gradiente no modo reverso, com fase móvel constituída por água (A) e acetonitrila (B) na seguinte proporção: 5-40% de (B) em 50 min; 40-100% de (B) em 5 min; 100% de (B) por 5 min. Ao término da corrida empregou-se um gradiente de retorno de 100-5% por 5 min com tempo de espera para o recondicionamento da coluna de 10 min. Nos experimentos, utilizou- se vazão de 1,0 mL/min e volume de injeção de 20 µL. Os cromatogramas foram monitorados pelo DAD (λ= 220 nm) e pelo ELSD (temperatura do tubo mantido em 70˚C e fluxo de N2
pressurizado em 353 KPa).
4.5.2 – Método qualitativo para o látex dos frutos da mangabeira
As amostras obtidas conforme os itens 4.3.2 e 4.3.3 e preparadas conforme procedimentos descritos nos itens 4.4.2 e 4.4.3 foram analisadas empregando-se uma coluna analítica Hexil-fenil LUNA® (10 μm, 150 x 4,6 mm, Phenomenex). Uma vazão de 0,8 mL/min foi utilizada e volume de injeção foi de 20 µL.
As análises cromatográficas foram realizadas em eluição gradiente no modo reverso, com fase móvel constituída por água (A) e acetonitrila (B), seguindo a programação: 86-90% (B) por 10 min; 90-100% (B) por 30 min; 100-86% (B) por 5 min para o retorno do gradiente, finalizando com 86% (B) por 15 min.
Os cromatogramas foram registrados com detector de arranjo de diodos em varredura de 190-450 nm, sendo 200 nm o comprimento de onda escolhido para a obtenção dos cromatogramas.
Depois do DAD, o efluente da coluna cromatográfica foi submetido ao detector ELSD. A nebulização foi proporcionada por um fluxo de N2 pressurizado (351
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4.6 – Validação de métodos cromatográficos analíticos
4.6.1 – Validação do método analítico para o perfil cromatográfico do
látex do caule de Hancornia speciosaPara a validação do método analítico utilizou-se o látex do caule coletado em Indiaroba. O tempo de retenção juntamente com a área e a altura foram utilizados como parâmetros no processo de validação.
4.6.1.1 – Teste da precisão de injeção
A precisão na injeção dos extratos foi determinada pela análise da amostra do látex ao longo de um dia de trabalho. As amostras foram preparadas independentemente em triplicata e analisadas em quintuplicata. A precisão foi avaliada através do desvio padrão relativo (DPR), utilizando a Equação 1.
Onde:
S = Desvio padrão experimental X = Média das medições
4.6.1.2 – Teste da repetibilidade
A repetibilidade foi avaliada pela análise das amostras do látex do caule preparadas por três vezes independentemente em três dias diferentes e analisadas em quintuplicata. O DPR foi tomado como parâmetro para a avaliação da repetibilidade.
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4.6.1.3 – Estabilidade da amostra do látex do caule
A estabilidade foi avaliada em duas formas: após ciclos de congelamento e descongelamento e a estabilidade de curta duração.
4.6.1.3.1 – Estabilidade de curta duração
As amostras do látex do caule permaneceram no autoinjetor do cromatógrafo um período total de 48h, sendo analisadas ao completar períodos de 24 e 48 h. Os resultados foram comparados com aqueles obtidos nas análises das amostras recém-preparadas.
4.6.1.3.2– Estabilidade após ciclos de descongelamento e congelamento
As amostras foram congeladas por 24h em freezer, sendo então submetidas ao descongelamento à temperatura ambiente. Quando completamente descongeladas, as amostras foram congeladas novamente por 12h e assim sucessivamente até completar os três ciclos. Os resultados foram comparados com aqueles obtidos da análise das amostras recém-preparadas.
4.6.1.4 – Robustez
Para avaliar a robustez do método foram feitas as seguintes alterações:
Fluxo da fase móvel: 0,8 - 1,2 mL/min;
Proporção da fase móvel inicial: 3 - 7% de ACN:H2O; Proporção da fase móvel final: 38 - 42% de ACN:H2O; Lote da coluna C18 (Phenomenex) : 423579-1 e 416537-1.
A avaliação das diferentes condições se deu em triplicata e separadamente, ou seja, para averiguar um parâmetro, mantiveram-se os demais fixos.
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4.6.2 – Validação do método cromatográfico para a quantificação do éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol em látex do fruto de H. speciosa e na polpa comercial
4.6.2.1 – Condições analíticas do método quantitativo
A separação cromatográfica foi realizada utilizando coluna analítica Hexil- fenil LUNA® (10 μm, 150 x 4,6 mm, Phenomenex) e fase móvel constituída de água (A) e acetonitrila (B). As análises foram feitas em eluição isocrática no modo reverso utilizando 95% de B por 40 min. Uma vazão de0,8 mL/min foi utilizado e volume de injeção de 20 µL. Os cromatogramas foram registrados com detector de arranjo de diodos em 200 nm e com ELSD usando as mesmas condições descritas em 4.5.2. O pico cromatográfico referente ao éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol foi determinado na amostra real pela comparação do tempo de retenção do pico gerado pela análise da solução padrão. A pureza do éster diidroxilado foi verificada por normalização utilizando o ELSD o que resultou em uma pureza de 97,13%.
4.6.2.2 – Preparo da solução estoque, padrões de calibração e amostras controle de qualidade
A solução estoque do éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol foi preparada em isopropanol na concentração de 2 mg/mL. A partir desta foram preparadas soluções de trabalho nas concentrações: 19,4; 38,8; 77,7; 155,4; 310,8 e 466,2 µg/mL.
Da solução estoque foram preparadas soluções de controle de qualidade nas seguintes concentrações: CQB - Controle de Qualidade Baixo: 43,7 µg/mL; CQM - Controle de Qualidade Médio: 207,9 µg/mL e CQA – Controle de Qualidade Alta: 372,9 µg/mL. Tais soluções foram utilizadas nos experimentos de precisão (item 4.6.2.6) e exatidão (item 4.6.2.7). Os valores de concentração dos controles de qualidade do método foram definidos baseados na ANVISA. Segundo esta agência o controle de qualidade de baixa concentração deve ser menor ou igual três vezes o limite inferior de quantificação, já o controle de qualidade de média concentração deve ser aproximadamente a média entre CQB e CQA, enquanto que o controle de qualidade de alta concentração deve corresponder de 75 a 90% da maior concentração usada na curva
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de calibração.As soluções estoque, de calibração e de controle de qualidade foram mantidas em refrigerador a zero graus Celsius.
4.6.2.3 – Linearidade
A faixa de linearidade foi avaliada de acordo com os níveis de éster diidroxilado esperados nas matrizes (polpa comercial e látex liofilizado). O estudo da linearidade se deu pelo método do padrão externo e por adição de padrão.
No método do padrão externo os seis níveis de concentração (mostrados no item 4.6.2.2) foram avaliados em triplicata. Para o método da adição de padrão duzentos microlitros das soluções de calibração foram pipetados. Após a completa evaporação do isopropanol, duzentos microlitros da polpa (preparado conforme o item 4.4.2) foi adicionado e misturados por 30 segundos usando agitador tipo vortex. Da mesma forma que no método do padrão externo, as soluções de calibração da adição de padrão foram avaliadas em triplicata. As curvas de calibração foram obtidas por regressão linear, a partir da relação entre as áreas dos picos e as concentrações das amostras para ambos os métodos.
4.6.2.4 – Seletividade
A seletividade do método foi avaliada de duas formas: adicionando o éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol na polpa comercial de mangaba e comparando-se o espectro de UV do padrão com o pico correspondente obtido na análise do extrato da matriz. Além disso, a pureza do pico cromatográfico referente ao analito foi avaliada usando o DAD.
4.6.2.5 – Limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ)
O limite de detecção (LD) e o limite de quantificação (LQ) foram estimados com base na relação de três vezes o ruído da linha de base e dez vezes a relação sinal- ruído, respectivamente.
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4.6.2.6 – Precisão
A repetibilidade e precisão intermediária foram determinadas pela análise das soluções de controle de qualidade em três diferentes dias. Para cada uma das três concentrações, as amostras foram preparadas independentemente por três vezes e analisadas em quintuplicata. O DPR foi tomado como medida de precisão.
4.6.2.7 – Exatidão
A exatidão foi determinada pelo teste de recuperação. A amostra da polpa comercial de mangaba preparada conforme o item 4.4.2 foi fortificada com o composto de referência em três níveis de concentração (as mesmas usadas no estudo da precisão). Duzentos microlitros da amostra da polpa foram pipetados e colocados em tubos de ensaio; após a retirada do solvente foram adicionados 200 µL da solução de controle de qualidade, por fim a amostra foi homogeneizada usando agitador tipo vortex por 30 segundos. Para cada concentração, as amostras foram independentemente preparadas e fortificadas em triplicata. As amostras foram analisadas em quintuplicata em três dias diferentes. A exatidão foi determinada através da concentração média experimental em relação à concentração teórica, em valores percentuais (Equação 2).
Equação 2:
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4.6.2.8 – Robustez
A robustez do método foi avaliada por meio das seguintes alterações:
Fluxo da fase móvel: 1,0 – 0,6 mL/min.
Proporção da fase móvel: 93 – 97% ACN:H2O.
Lote da coluna Hexil-fenil LUNA®: 423579-1 e 416537-1.
A análise cromatográfica das diferentes condições analíticas foi analisada em triplicata e separadamente, ou seja, para avaliação de um parâmetro, mantiveram-se os demais fixos.
4.6.2.9 – Estabilidade
A estabilidade foi avaliada de duas formas: após ciclos de congelamento e descongelamento e a estabilidade de curta duração.
4.6.2.9.1 – Estabilidade de curta duração
Os resultados das amostras de controle de qualidade recém-preparadas foram comparados com aqueles obtidos na análise de tais amostras após permanecerem no autoinjetor por 24h.
4.6.2.9.2– Estabilidade após ciclos de descongelamento e congelamento
As amostras do controle de qualidade foram congeladas por um período de 24 h no freezer, sendo então submetida ao descongelamento à temperatura ambiente. Quando completamente descongeladas, as amostras foram congeladas novamente por 12h e assim sucessivamente até completar os três ciclos. Os resultados foram comparados com aqueles obtidos na análise das amostras recém-preparadas.
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4.7 – Isolamento dos marcadores químicos do látex do caule de
Hancornia speciosa Gomes
O látex do caule, preparado conforme o item 4.4.1, foi utilizado para o isolamento dos marcadores químicos por HPLC em escala semi-preparativa. Para tanto empregou-se uma coluna Hexil-fenil LUNA® (250 x 10 mm; Phenomenex), vazão de 4,5 mL/min e detecção em 220 nm. A fase móvel constituída por H2O (A) e ACN (B)
variou na seguinte proporção: 5-40% de (B) em 50 min. Antes de uma nova injeção, foi feita a limpeza da coluna com 100% de ACN seguida do recondicionamento em 5% de (B) por 10 min. As bandas cromatográficas coletadas em erlenmeyer foram centrifugadas. Em seguida, os compostos isolados foram transferidos para frascos âmbar, identificados e pesados.
4.8 – Identificação dos marcadores químicos por RMN de
1H e de
13C
Os espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) foram adquiridos utilizando aparelho Bruker Avance DRX-400 (9,4 Tesla) operando a 400 MHz para RMN 1H e 100 MHz para RMN 13C. As amostras foram solubilizadas em metanol deuterado (CD3OD) e os deslocamentos químicos estão expressos em ppm (δ) e asmultiplicidades dos sinais estão indicadas conforme convenção: s (simpleto), sl (simpleto largo), d (dupleto), dd (duplo dupleto), ddd (duplo duplo dupleto), ddl (duplo dupleto largo), t (tripleto), tl (tripleto largo), dt (duplo tripleto), dtd (duplo tripleto duplo) e td (tripleto duplo), q (quadrupleto), quintl (quintupleto largo). As constantes de acoplamento (J) foram registradas em Hertz (Hz). Estes experimentos foram realizados no Laboratório de Ressonância Magnética Nuclear do Departamento de Química da Universidade Federal de São Carlos (DQ/UFSCar) sob a responsabilidade do Prof. Dr. Antonio Gilberto Ferreira.
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Resultados e
discussão
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