Análise do hipocampo durante a gênese e diferenciação neural em ratos programados pela restrição proteica in útero   : estudo molecular dos subcampos isolados por microdissecção a laser  

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Ciências Médicas

AGNES DA SILVA LOPES OLIVEIRA

ANÁLISE DO HIPOCAMPO DURANTE A GÊNESE E DIFERENCIAÇÃO NEURAL EM RATOS PROGRAMADOS PELA RESTRIÇÃO PROTEICA IN ÚTERO: ESTUDO

MOLECULAR DOS SUBCAMPOS ISOLADOS POR MICRODISSECÇÃO A LASER

CAMPINAS 2017

AGNES DA SILVA LOPES OLIVEIRA

ANÁLISE DO HIPOCAMPO DURANTE A GÊNESE E DIFERENCIAÇÃO NEURAL EM RATOS PROGRAMADOS PELA RESTRIÇÃO PROTEICA IN ÚTERO: ESTUDO

MOLECULAR DOS SUBCAMPOS ISOLADOS POR MICRODISSECÇÃO A LASER .

Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências.

Orientador: Prof. Dr. José Antônio Rocha Gontijo Co-orientadora: Profa. Dra. Patrícia Aline Boer

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO

FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA: AGNES DA SILVA LOPES OLIVEIRA, E ORIENTADO PELO PROF. DR. JOSÉ ANTÔNIO ROCHA GONTIJO.

CAMPINAS 2017

BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO

ORIENTADOR: José Antônio Rocha Gontijo COORIENTADOR: Patrícia Aline Boer

MEMBROS:

1. PROF. DR. José Antônio Rocha Gontijo

2. PROF. DR. Rovena Clara Galvão Januário Engelberth

3. PROF. DR. Cleiton Lopes Aguiar

4. PROF. DR. Amilton dos Santos Júnior

5. PROF. DR. Paulo Dalgalarrondo

Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

Dedicatória: Á minha família:

Pai, Mãe e irmão, por todo o apoio, carinho e ajuda, por me encorajar nos momentos mais difíceis e sempre me incentivar.

Ao meu esposo, por todo amor e cuidado, por ser meu companheiro e parceiro em todos os momentos, meu grande amor e incentivador!

Ao meu filho Arthur, que mesmo ainda não entendendo a dimensão deste trabalho, foi e sempre será a minha grande motivação.

Agradecimentos

Ao meu Deus, por todo cuidado, por ter me permitido chegar até aqui e ter me sustendo durante esta jornada.

Aos meus orientadores, Drª Patrícia Aline Boer e Dr. José Antonio Rocha Gontijo. Vocês são espetaculares! Obrigada pela amizade, carinho e compreensão em todos os momentos.

Ao Dr. André Vieira pela enorme contribuição neste trabalho ensinando a técnica de microdissecção a laser e PCR.

A todos os alunos do Laboratório de Metabolismo Hidrossalino – UNICAMP, pela pareceria de trabalho neste período. A Ize, que sempre esteve pronta a ajudar.

A Helô, por toda atenção e prontidão em ajudar em todas as minhas dúvidas teóricas e práticas. A Thaís, além de cunhada foi também minha companheira de viagens nestes últimos dois anos, obrigada pela parceria!

A Dani, minha amiga que a pós-graduação trouxe. Já são quase 10 anos... e agora mesmo a muitos km de distância ainda continua sendo parceira! Obrigada por todo apoio na parte prática, intelectual e principalmente emocional...Levarei sua amizade pela vida toda!

Ao Marco e Rosângela, que me adotaram como filha, obrigada pelo apoio e por sempre me encorajar nos momentos mais difíceis.

Ás minhas cunhadas e cunhados, que são como irmãos, muito obrigada pelo carinho.

Aos meus maravilhosos sobrinhos: Yasmin, Pedro Henrique, João Guilherme e Maria Heloísa vocês são as pedrinhas preciosas em minha vida.

A CAPES e FAPESP pelo auxílio financeiro.

Á todos os demais amigos, colegas e parentes aqui não mencionados, mas que foram de grande importância ao me apoiarem nesta jornada.

RESUMO

Há diversas razões pelas quais têm se buscado o melhor entendimento de alterações causadas pela programação fetal. Entre estas emerge o fato de que estas alterações têm apresentado repercussões evidentes sobre a saúde de populações. Isto se deve a manifestação de alterações no desenvolvimento ontogenético, vinculadas à manifestação programada do desenvolvimento morfológico e funcional de órgãos e sistemas. Considerando o fato de que o desenvolvimento estrutural do cérebro se inicia nos primeiros dias do período embrionário e se estende durante os anos iniciais de vida extrauterina, alterações durante períodos críticos do desenvolvimento pré- e pós-natal podem ser altamente prejudiciais para o desenvolvimento desta estrutura. O hipocampo é uma estrutura alvo para diversas alterações provenientes do ambiente materno. Estudos têm mostrado que alterações durante o período pré-natal tiveram influência sobre a neurogênese no hipocampo imaturo, bem como sobre a remodelação de dendritos da região CA3, com possíveis repercussões neurocognitivas. Adicionalmente, diferentes sistemas de neurotransmissores, bem como alterações epigenéticas de moduladores do desenvolvimento neural, podem estar implicados na causa ou consequência desta programação. Para tanto, é importante conhecer quais períodos exatos nos quais o cérebro é susceptível a estas influencias e qual a repercussão destes fatores sobre a estrutura hipocampal. Assim, este trabalho teve como objetivo, avaliar os efeitos da restrição proteica materna sobre a expressão de genes envolvidos no processo de diferenciação das sub-regiões hipocampais bem como o número de células totais e neurônios em hipocampo de ratos machos com 14 e 40 dias pós-natal. Ratas Wistar foram submetidas a dieta hipoproteica durante toda a gestação. A prole de machos com 14 e 40 dias de vida foram estudadas analisando-se as expressões de genes nos subcampos hipocampais (CA1, CA3 e GD) associando possíveis alterações nestas áreas á respostas encontradas nos modelos de restrição proteica gestacional comparadas àquelas observadas em um grupo controle de mesma idade. Nossos resultados mostraram que animais com 14 dias de vida, submetidos à restrição proteica gestacional mostraram uma diminuição significativa na expressão de DCX no GD e em CA3, 5HT1A no GD e em CA1 e, aumento significativo de MR em CA3; além disso, diminuição destes receptores no GD, associado a uma elevação de CDKN1C em CA1, bem como de AT4 em CA1 e AT1 em CA3. Já com 40 dias observamos elevação

significativa da DCX no GD associada a diminuição de SOX nesta mesma região. Tais resultados sugerem que o desenvolvimento de circuitos neuronais no hipocampo está associado com a expressão distinta de genes nas diferentes regiões anatómicas do hipocampo. Também, que a sequência de eventos incluindo proliferação celular, migração e diferenciação estão associadas a esta expressão genica distinta. Além disso, os danos morfológicos e funcionais hipocampais precoces, provenientes da restrição proteica gestacional, podem estar relacionados a danos estruturais temporários. Estes, entretanto, parecem ser revertidos por modificações na expressão gênica que modulam a produção de proteínas e neurotransmissores envolvidos na recuperação celular destas áreas cognitivas do hipocampo.

ABSTRACT

There are several reasons why the best understanding of the changes caused by fetal programming has been sought. Among these emerges the fact that these changes have had evident repercussions on the health of populations. This is due to the manifestation of changes in ontogenetic development, linked to the programmed manifestation of the morphological and functional development of organs and systems. Considering the fact that the brain structural development begins early during the embryonic period and extends during the first years of extrauterine life, changes during critical periods of pre- and postnatal development can be highly detrimental to the brain development. The hippocampus is a target structure for several changes due maternal environment. Studies have shown that changes during the prenatal period had influence on neurogenesis in the immature hippocampus, as well as on the CA3 region dendrites remodeling, with possible neurocognitive repercussions. In addition, different neurotransmitter systems, as well as epigenetic alterations of neural development modulators, may be implicated in the cause or consequence of this programming. Therefore, it is important to know the exact periods in which the brain is susceptible to these influences and the possible repercussions of these factors on the hippocampal structure. Therefore, the aim of this study was to evaluate the effects of maternal protein restriction on the expression of genes involved in hippocampal sub regions’ differentiation process and on the number of total cells and neurons in hippocampus of male rats at 14 and 40 days postnatal. Female Wistar rats were submitted to a low-protein diet during the entire pregnancy. We evaluated the gene expression in the hippocampal sub-regions (CA1, CA3, and DG) on male offspring with 14 and 40 days of age, associating the alterations in these areas to the responses found in the gestational protein restriction model compared to those observed in the matched control group. Our results showed that 14-days-old animals submitted to gestational protein restriction had significant decreased expression of DCX gene on DG and CA3 regions, decreased expression of 5HT1A on DG and CA1 regions and had a significant increased expression of MR on CA3 region. Also, these animals had decreased expression of 5HT1A and MR on DG and increased expression of CDKN1C on CA1 region, increased expression of AT4 on CA1 regions and increased expression of AT1

on CA3 region. 40-days-old animals had increased expression of DCX and decreased expression of SOX on DG region. These results suggest that the hippocampal neuronal circuits’ development is associated with the distinct genes expression in each hippocampus anatomical regions. The sequence of events including cell proliferation, migration and differentiation are also associated with these distinct genes expression. Furthermore, early morphological and functional hippocampal damage due gestational protein restriction may be related to temporary structural damage. However, these temporary structural damages appear to be reversed by modifications in expression of genes that modulate proteins and neurotransmitters synthesis involved in cellular recovery of these hippocampal cognitive areas.

Lista de Abreviaturas

ACTH- Hormônio adrenocorticotrófico AT1R- Receptor de angiotensina II AT2R- Receptor de angiotensina II AT4- Receptor de angiotensina IV Angio II- Angiotensina II

CRF- Fator liberador de corticotrofina CA3- Corno de Amon 3

CA1- Corno de Amon 1

CDK- Ciclina dependente kinase CA- Corno de Amon

DOHaD- Origem desenvolvimentista da saúde e da doença DCX- Doublecortina

GR- Receptores de glicocorticóides GD- Giro denteado

GC- Glicocorticóides

HHPA- Eixo hipocampo-hipotálamo-pituitária-adrenal MR- Receptores de mineralocorticóides

MCL- Microdissecção e Captura a laser MAP- Proteína associada a Microtúbulos NP- Normal protein

NPCs- Células tronco neuronais LTP- Potenciação de longa duração LP- Low protein

SNC- Sistema Nervoso Central SGZ- Zona Subventricular

SRA- Sistema Renina Angiotensina 5-HT- Serotonina

5-HT1A- Receptor de Serotonina 1A

Lista de Figuras

Figura 1 Esquema representativo da função da 11ΒHSD2 placentária... 15

Figura 2 Curva de desenvolvimento do SNC. ... 18

Figura 3 Divisão funcional do hipocampo. ... 19

Figura 4 Análise da evolução do peso ... 34

Figura 5 Distância ano-genital dos machos. ... 34

Figura 6 Peso dos animais com 14 e 40 dias. ... 35

Figura 7 Análise da massa do cérebro/massa corporal 14 e 40 dias ... 35

Figura 8 Análise da massa do hipocampo 14 e 40 dias ... 36

Figura 9 Análise da massa do hipocampo/massa do cérebro 14 e 40 dias... 36

Figura 10 Análise da massa do hipocampo/animal 14 e 40 dias ... 36

Figura 11 Análise da expressão gênica em CA1 ... 37

Figura 12 Análise da expressão gênica em CA3 ... 38

Figura 13 Análise da expressão gênica no GD ... 39

Figura 14 Imunoístoquimica de GR – CA1 (14 DIAS) ... 41

Figura 15 Imunoístoquimica de MR – CA3 e GD (14 DIAS) ... 42

Figura 16 Imunoístoquimica de DCX – CA3 e GD (14 DIAS) ... 42

Figura 17 Imunoístoquimica de DCX – GD, CA1 e CA3 (40 DIAS) ... 43

Figura 18 Porcentagem de neurônios e outros tipos celulares 14 dias ... 44

Figura 19 Porcentagem de neurônios e outros tipos celulares 40 dias ... 44

Figura 20 Hipótese sobre a determinação das células hipocampais ... 47

Sumário

1.Introdução ... 15

1.1 Mecanismos envolvidos na gênese da programação fetal ... 15

1.2 Corticosteróides e seus receptores neurais ... 16

1.3 Formação hipocampal e programação fetal ... 18

1.4 Neurogênese hipocampal ... 21

1.5 Angiotensina e seus receptores neurais ... 23

2. Justificativa e Objetivos ... 25

3. Materiais e Métodos ... 27

2.1 Acasalamento e divisão dos grupos experimentais ... 27

3.2 Microdissecções a Laser ... 28

3.3 Extrações de RNA total para análises de expressão gênica ... 29

3.4 Análises da quantidade, qualidade e integridade do RNA total ... 30

3.5 Sínteses de cDNA para avaliação de expressão de mRNAs ... 30

3.6 RT-qPCR para avaliação da expressão dos mRNAs ... 31

3.7 Imunoistoquimica ... 31 3.8 Fracionamento Isotrópico ... 32 3.9 Análise Estatística ... 33 4. Resultados ... 34 5. Discussão ... 45 6. Conclusão ... 53 7. Referências Bibliográficas ... 56 8. Anexos ... 73

1. INTRODUÇÃO

Nos últimos anos, um conjunto crescente de evidências tem sustentado a hipótese de que distúrbios ocorridos em períodos críticos do desenvolvimento fetal podem determinar alterações permanentes ou em longo prazo na fisiologia ou morfologia de um determinado órgão (Ashton, 2000). Estas alterações caracterizam o conceito conhecido como programação fetal, através do qual o feto pode ser programado durante o desenvolvimento intrauterino para sobreviver a um ambiente adverso, entretanto, exposto a circunstâncias pós-natais diversas, acabam por desenvolver doenças na idade adulta (Barker, 1995). A exposição à desnutrição materna tem sido o modelo mais extensamente estudado de programação fetal e, é utilizado para entender a origem de algumas doenças na idade adulta (Langley-Evans, 1997; Edwards et al., 2001). De acordo com essa teoria, alterações no estado nutricional das mães promovem uma significativa redução da massa corporal fetal ao nascer, elevando o risco de diabetes, doença cardiovascular e obesidade na vida adulta (Langley-Evans, 1997). Autores têm demonstrado que a desnutrição durante a gestação e/ou lactação promove o desenvolvimento de um fenótipo econômico na prole adulta (Budge et al., 2005; Halles, 2001).

Sabe-se que o desenvolvimento estrutural do cérebro não é concluído no período intrauterino, se estendendo para as primeiras fases da vida. Assim, alterações na composição dietética durante períodos críticos do desenvolvimento pré- e pós-natal podem modificar o desenvolvimento cerebral. Tais efeitos podem ser mediados por alterações estruturais e funcionais, podendo promover diversos danos na idade adulta, entre os quais, alterações metabólicas, cardiovasculares, distúrbios neuropsiquiátricos e déficits cognitivos (Pistell et al., 2010).

Diversos agentes como fatores de crescimento, de transcrição e nutrientes podem afetar permanentemente o desenvolvimento neural (Welberg e Seckl, 2001). Particularmente os esteroides têm propriedades poderosas na programação neural (Matsumoto e Arai, 1997).

1.1 Mecanismos envolvidos na gênese da programação fetal

Dentre os mecanismos envolvidos aquele mais estudado envolve a superexposição fetal a elevadas concentrações de glicocorticoides maternos (Dodic

et al, 2002, Seckl, 1997, 2001). Em situação fisiológica, a concentração de glicocorticoides fetal é menor que a materna. Isso ocorre devido a ação de uma enzima placentária 11-β hidróxiesteroide desidrogenase tipo 2 (11β-HSD-2). Esta enzima é responsável por catalisar a conversão do esteroide bioativo (corticosterona) em seu metabólito inativo, 11-deidrocorticosterona, evitando assim que o feto fique exposto aos níveis plasmáticos de corticoides maternos. Estudos demonstram que animais expostos à restrição proteica pré-natal apresentam uma significativa redução na atividade desta enzima no período final da gestação levando ao aumento da transferência dos glicocorticoides maternos para o feto (Edwards et al, 1993, Seckl, 1994). Assim, a atividade da 11-βHSD-2 tem sido relacionada com a massa ponderal fetal em ratos e em humanos.

Figura 1. Esquema representativo da função da 11-βHSD-2 placentária inativando os glicocorticoides provenientes da circulação materna, garantindo a proteção do feto dos altos níveis de glicocorticoides (adaptado de Drake et al, 2007)

Em humanos, a elevação dos níveis séricos de cortisol durante a gestação, está relacionada ao aumento da incidência de desordens comportamentais durante a infância. (King e Laplante, 2005; Laplante et al., 2004). Além disso, o baixo peso ao nascer está associado à elevação dos níveis de cortisol no adulto, contribuindo para o aumento do risco de desenvolvimento de doenças cardiovasculares bem como hipertensão na vida adulta. (Kajantie et al., 2005; Syddall et al., 2005).

1.2 Corticosteroides e seus receptores neurais

A glândula adrenal é a principal fonte de produção de corticosteroides isto é: cortisol, corticosterona e aldosterona. Como todos os hormônios esteroides, estas

moléculas de pequeno peso molecular (~300Da) são derivadas do colesterol e da pregnolona após uma série de conversões enzimáticas (Appelezweig, 1969). A síntese e secreção de cortisol (em humanos) e corticosterona (em roedores) é modulada pela secreção do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH), liberado pela hipófise anterior, e cuja síntese e secreção são controladas pelo fator liberador de corticotrofina (CRF) hipotalâmico (Whitnall, 1993). O controle da liberação de corticosteroide pelo córtex da adrenal é complementado pelo mecanismo de retroalimentação (feedback) negativo via receptores hipofisários, hipotalâmicos (Whitnall, 1993) e hipocampais (Jacobson e Sapolsky, 1991; Knigge e Hays, 1963).

Os corticosteroides acessam facilmente o cérebro (McEwen et al, 1986). Sua ação é mediada por receptores mineralo- (MR) e glicocorticoides (GR). Estes receptores são membros da família de receptores nucleares de esteroides. Quando dissociados de seus ligantes podem ser encontrados tanto no citosol quanto no núcleo celular e, quando associados aos seus ligantes são transportados para o núcleo onde se associam a proteínas co-ativadoras e liga-se a elementos de resposta a hormônio (HRE), reprimindo ou ativando promotores da transcrição gênica (Galigniana et al, 2010). A afinidade do GR por cortisol e corticosterona é aproximadamente um décimo da afinidade de MR para estes esteroides. Dessa forma, os MR são predominantemente ocupados em períodos de baixa concentração de corticosteroides, enquanto os GR só são ocupados quando ocorre aumento na concentração deste hormônio (p.e., durante estresse ou condições patológicas) (de Kloet, 1999; Joels e de Kloet, 1994; Joels et al, 1995; Reul e de Kloet, 1985).

Embora os GRs estejam presentes em diversas estruturas neurais existem, em maior concentração no hipocampo, hipotálamo e tronco cerebral (Ahima e Harlan, 1991; Cintra et al, 1994; Fuxe et al, 1985). Já os MRs ocorrem somente no hipocampo e em outras estruturas límbicas como amígdala medial, núcleos olfatórios e alguns núcleos hipotalâmicos (Ahima et al, 1991; Van Eekelen, 1988).

O EGR-1 (Early growth response protein 1), é um fator de transcrição também conhecido como Zif268 (zinc finger protein 225) ou NGFI-A (nerve growth factor-induced protein A) é uma proteína nuclear codificada pelo gene EGR1. Fundamental para a diferenciação, proliferação, plasticidade neuronal e exocitose sináptica, esta

proteína é expressa de forma heterogênea em diferentes regiões do cérebro, incluindo hipocampo (Knapska e Kaczmarek, 2004).

1.3 Formação hipocampal e programação fetal

A formação hipocampal é um componente essencial do sistema límbico, exercendo papel crucial nos processos de aprendizagem e memória, e apresentando grande capacidade de plasticidade sináptica (Kim & Diamond, 2002).

Em seres humanos, o período de maior vulnerabilidade do SNC ocorre a partir do segundo trimestre de gestação estendendo-se até o segundo ano de vida (Dobbing & Sands, 1971). Em roedores, esta fase compreende do nascimento até a terceira semana de vida, quando ocorre o desenvolvimento do hipocampo e cerebelo (Morgane et al., 1993). No entanto, entre os dias 17 a 22 do período embrionário, durante a ontogênese, já ocorre formação e organização de neurônios hipocampais específicos (Bayer, 1980). Apenas 20% das células granulares hipocampais estão presentes no rato ao nascer sendo que a neurogênese do GD (giro denteado) continua até a fase adulta, porém com uma taxa cada vez menor ao longo do tempo (Altman & Das, 1965).

Figura 2. Curvas de desenvolvimento do SNC em humanos e ratos (extraído de Morgane et al, 2002)

Anatomicamente, o hipocampo de mamíferos é composto de sub-regiões distintas, com diversidade de forma e tamanho celular, conectividade, propriedades eletrofisiológicas e susceptibilidade a insultos (Amaral, 1990; Storm-Mathisen et al 1990): o giro denteado (GD) e o Corno Ammonis (CA) (Scharfman, 2007). Ambas regiões são estruturadas em camadas. A principal camada do GD é a camada granular e do CA é a camada piramidal (Altman & Bayer, 1963)

Funcionalmente, o hipocampo pode ser dividido em duas regiões diferentes: o hipocampo ventral e o dorsal. Enquanto a porção ventral está implicada primariamente ao processamento emocional, a dorsal está ligada principalmente à memória e ao

Figura 3. Divisão funcional do hipocampo (a) dorsal e (b) ventral (adaptado de Van den Hove et al, 2006)

Experimentos em roedores tem constituído a base para numerosas teorias sobre o processamento da memória no hipocampo devido a notável similaridade estrutural e funcional entre o hipocampo de humanos e roedores. (Nissinem et al, 2000)

Como já citado acima se trata de uma região que é alvo preferencial da ação dos hormônios envolvidos na resposta ao estresse, e através da sua ação, esta área cerebral é parte integrante do mecanismo de retroalimentação negativa no eixo HHPA. (McEwen, 1999)

Tanto o estresse como a exposição aos glicocorticoides em uma fase inicial da vida, têm sido associados a danos na aprendizagem e na memória (Huot et al., 2002), bem como à atrofia do hipocampo. A plasticidade dos circuitos do hipocampo, necessária para as suas funções na aprendizagem e memória, pode aumentar a sua vulnerabilidade a várias agressões ambientais, incluindo situações de estresse (Aisa et al., 2006).

Diversos estudos demonstram que perturbações ocorridas durante o desenvolvimento do SNC causam graves alterações neurais fisiológicas e morfológicas (Huang et al., 2003; Hoffmann et al., 2004, Hermel et al, 2001; Feoli et al, 2006), além de alterações comportamentais (de Oliveira, 1985; Riul et al, 1999) e atrasos em funções intelectuais e cognitivas (Barnes, 1976; Brozek, 1978, 1983; Wainwright e Colombo, 2006).

Alterações nutricionais durante o período pré-natal têm influência sobre a neo-neurogênese no hipocampo imaturo. Além disso, foram observados no hipocampo atrofia de corpos neuronais, remodelamento dendrítico, além de morte neuronal e gliose, especialmente nos dendritos apicais de CA3. Adicionalmente estes animais

apresentaram elevação do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) e de corticosterona circulante (Kehoe et al, 2001).

Tem sido sugerido que estes efeitos observados no hipocampo são dependentes da ação de GC e da expressão de seus receptores, o que desencadearia efeito em cascata alterando a produção de aminoácidos neuromoduladores que participam da mediação neural à jusante do remodelamento dendrítico (Radley et al., 2005).

Estudos recentes em nosso laboratório demonstraram que animais submetidos somente a restrição proteica gestacional tiveram atrofia dos dendritos da região CA3 hipocampal (Lopes et al, 2013).

Adicionalmente, a exposição pré-natal a glicocorticoides influencia, permanentemente, o desenvolvimento de sistemas de monoaminas e de outros neurotransmissores (Muneoka Et Al., 1997; Slotkin et al., 1996), aumentando o risco para alterações neurocomportamentais, bem como metabólicas e cardiovasculares associadas a anormalidades de áreas específicas do sistema nervoso central (SNC). Estas alterações centrais durante a ontogênese neural ainda são mal compreendidas. 1.4 Neurogênese Hipocampal

Em ratos, todos os principais neurônios das regiões CA são gerados no período pré-natal (entre os dias 17 a 19). Os neurônios piramidais em CA1 e CA3 do hipocampo tornam-se pós-mitóticos durante o desenvolvimento pós-natal precoce, enquanto que as células granulares no giro dentado (DG) sofrem auto-renovação ao longo da vida (Bayer, 1980a,b).

Após o nascimento, a neurogênese hipocampal (desde o nascimento até o desmame, aproximadamente 21 dias) é necessária para o desenvolvimento total do hipocampo (Altman & Bayer, 1990). Após este período de desenvolvimento, a matriz estrutural do GD é formada, mas a zona subgranular (ZSG) do GD continua a gerar novos neurônios ao longo da vida. A Doublecortina (DCX) é uma proteína endógena, associada aos microtúbulos, importante para a migração neuronal (Plumpe et al, 2006), altamente expressa no início do desenvolvimento neuronal e diminui gradualmente ao longo do desenvolvimento e na idade adulta. Adversidades durante

o período embrionário e inicio da vida pós-natal pode interromper esse padrão de expressão ao longo da vida.

A ZSG do GD é uma região onde ocorre neurogênese ativa na idade adulta (Gage, 2000). Os novos neurônios no adulto são originários de uma população de células-tronco neuronais (NPCs) com características das células gliais, possuindo corpos celulares na ZSG e processos radiais que se estendem para a camada celular granular (CG) (Van Praag et al, 2002). Os neurônios gerados a partir de células progenitoras neurais no hipocampo desempenham papel fundamental nos processos de aprendizado e memória. O fator de transcrição SOX2 é um regulador de genes ativados no início da diferenciação neuronal. Trata-se de um marcador de células-tronco neural e sua função está associada com a pluripotência e auto-renovação das células neurais (Alejandro et al, 2014). A superexpressão de SOX2 reprime a diferenciação neuronal (Bani-Yaghoub M, et al. 2006) enquanto a baixa expressão induz a saída do ciclo celular e a expressão de marcadores de diferenciação (Graham et al, 2003).

Alguns estudos tem reportado o papel da serotonina como mediadora de efeitos estruturais no cérebro durante o desenvolvimento e na idade adulta (Mazer et al. 1997; Yan et al. 1997; Watanabe et al. 1992). Jacobs et al. (1998) verificaram que a neurogênese no GD de mamíferos adultos é estimulada pela ativação de receptores serotoninérgicos. A serotonina tem sido reconhecida por estimular a proliferação celular (Fanburg e Lee 1997; Takuwa et al. 1989). O GD é uma região rica em receptores 5HT1A (Azmitia et al. 1996). Um número considerável de evidências sugere que 5HT pode estimular a produção de neurônios no GD. As condições associadas à diminuição da produção das células granulares, como a desnutrição (Debassio et al. 1996), envelhecimento (Kuhn et al., 1996; Gould et al.1999), altas concentrações de corticosterona (Cameron e Gould, 1994), estresse (Gould et al., 1997, 1998) e ativação do receptor NMDA (Cameron et al., 1995), também diminuem a densidade de receptores 5HT1A, ou inibem a liberação de 5HT no GD (Blatt et al. 1994; Chalmers Et al. 1993; McKittrick et al. 1995; Nishimura et al. 1995). Experimentos que estimulam a neurogenese, também levam ao aumento da densidade de receptores 5HT1A ou a liberação de 5HT no GD (Hayakawa et al. 1994; Burnet et al. 1995; Whitton et al. 1994; Kuroda et Al. 1994).

No desenvolvimento do SNC, existe uma variedade de mecanismos que controlam a saída do ciclo celular encaminhando-se para o processo de diferenciação durante a neurogênese. O inibidor de ciclina quinase independente (CDK) p57Kip2 controla a transição da proliferação para a diferenciação em muitos tecidos, inclusive na região hipocampal. No sistema nervoso em desenvolvimento, a saída do ciclo celular é acoplada à diferenciação neuronal (Ye et al, 2009). A proteína p57kip2 é expressa em todo o eixo neural durante a neurogênese e exibe padrões especificos de expressão de acordo com a região e com a idade (Smith, 2007).

Como demonstrado por Ji et al., (2005) em culturas de neurônios, o BDNF apresenta uma ação modulatória sobre a diferenciação da arborização dendrítica hipocampal evidenciada pelo aumento do número e espiculas dendríticas primárias (Ji et al., 2005). Tem sido demonstrado que os níveis de BDNF no hipocampo eleva-se progressivamente entre os dias 20 e 120 pós-natal, decrescendo gradualmente até a idade adulta.

1.5 Angiotensina e seus receptores neurais

Um dos sistemas que pode ser alterado pela programação fetal é o sistema renina-angiotensina (SRA). Componentes funcionais do SRA (angiotensinogênio, peptidases, angiotensinas e proteínas receptoras específicas) foram descritos e têm sido cada vez mais estudados expandindo o elenco das possíveis funções desse sistema, onde a Ang II também pode ser considerada como neurotransmissor ou neuromodulador ativando receptores AT1 e receptores AT2 em várias regiões do encéfalo (Wright e Harding, 2013). Nesse contexto, estudos clínicos têm evidenciado o envolvimento do SRA nas doenças relacionadas ao estresse (Yang et al., 1996).

Além disso, vem sendo proposto que o uso de bloqueadores de Ang II (antagonistas de receptor AT1) tem efeitos neuroprotetores, não só por evitar os efeitos neurotóxicos provocados pela Ang II, mas também pela sua interação com os seus receptores de membrana e os mecanismos de transdução de sinal (Saavedra, 2011). O papel da Ang II no aprendizado e memória também tem sido investigado. Alguns autores mostraram que a Ang II melhora a cognição (Belcheva et al., 2000; Braszko, 2002) enquanto que outros pesquisadores mostraram que pode ter efeitos amnésicos possivelmente associados à inibição da potenciação de longa duração

(LTP) no hipocampo (Denny et al., 1991) via receptor AT1 (Wayner et al., 1993). No entanto, o efeito primeiramente atribuído à Ang II, em melhorar a memória, ocorreria devido a sua metabolização e conversão em Ang IV (Braszko et al., 2006) já que a ativação de receptores AT4, no hipocampo, aumentam a transmissão sináptica e a LTP (Kramár et al., 39 2001). Além disso, a angiotensina II estimula a atividade neuronal vasopressinérgica, que está associada à síntese de dopamina e noradrenalina, e a processos comportamentais incluindo cognição (Gard, 2002).

2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS

Como citado anteriormente, a formação hipocampal é uma estrutura complexa formada por diferentes subcampos: CA1, CA2, CA3, CA4 e GD (Duvernoy et al., 2005; Insausti e Amaral, 2012). Embora ainda pouco conhecidas, tais regiões são distintas quanto à função e composição celular, além de que as divisões anteroposteriores ao longo do eixo horizontal do hipocampo, também diferem em relação as suas funções relacionadas a aspectos emocionais, memória e aprendizagem. Tendo isto em conta, este trabalho procurou definir de modo minucioso, a composição celular em hipocampo total bem como a expressão gênica de diferentes sub-regiões. Com este objetivo utilizamos a técnica de Microdissecção e Captura a Laser (MCL). Trata-se de uma técnica desenvolvida em 1996, por pesquisadores do National Cancer Institute dos EUA (Emmert-Buck et al, 1996) que tornou-se amplamente utilizada como uma ferramenta na pesquisa biomédica, potencializando o uso de técnicas morfométricas já existentes. A MCL permite a aquisição de populações puras de células ou tecidos de determinadas regiões microscópicas. Possui reduzida probabilidade de contaminação, por possuir baixo índice de manipulação o que evita problemas relacionados à heterogeneidade do tecido (Emmert-Buck et al, 1996, Murray e Curran, 2005, Pietersen et al, 2011). As análises foram feitas em três diferentes regiões do hipocampo: CA1, CA3 e GD no hipocampo dorsal.

Considerando o fato de que o desenvolvimento estrutural do cérebro começa nos primeiros dias do período embrionário e se estende até as primeiras semanas e os primeiros anos de vida, respectivamente, em roedores e seres humanos, as mudanças no desenvolvimento perinatal (pré-natal e pós-natal precoce) podem ser altamente adversos ao neurodesenvolvimento morfológico e funcional. Em ratos, todos os principais neurônios das regiões CA tem origem no período pré-natal (entre os dias 17 a 19 pré-natal). Os neurônios piramidais em CA1 e CA3 do hipocampo tornam-se pós-mitóticos durante o desenvolvimento pós-natal precoce, enquanto que as células granulares no giro dentado (DG) sofrem auto-renovação ao longo da vida (Bayer, 1980a,b), pela presença local de células tronco. Desta forma, em decorrência das possíveis alterações que podem advir de fatores adversos perinatais, é extremamente importante elucidar os efeitos e modificações ocorridas durante o período fetal e embrionário, no sentido de prenunciar doenças na infância, juventude

e idade adulta ou abrir a possibilidade de intervenções durante esta fase crítica como forma preventiva.

Objetivo Geral

Desta forma, o objetivo geral deste trabalho foi estudar em ratos machos com 14 e 40 dias de vida provenientes de mães submetidas ou não a restrição proteica gestacional, a expressão de genes envolvidos no processo de diferenciação das sub-regiões hipocampais bem como o número de células totais e neurônios em hipocampo total.

Objetivos Específicos

Em hipocampos microdissecados, avaliar e expressão diferencial em cada uma das subregiões (CA1, CA3 e GD) dos seguintes genes: BDNF – Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro; SOX2 – Fator de Transcrição SRY (sex determining region

Y)-box 2; NR3C1 (GR-Receptor de Glicocorticoide); NR3C2 (MR-Receptor de Mineralocorticóide); AGTR1 (AT1– Receptor de Angiotensina II); LNPEP (AT4 -Receptor de Angiotensina IV); DCX – Doublecortina; Egr-1 – Regulador de Transcrição - Early Growth Response I; HTR1 (5HT1A – Receptor de Serotonina 1A); CDKN1C (p57) – Inibidor de Kinases dependente da Ciclina;

Avaliar a expressão proteica dos genes que tiveram a expressão alterada;

Avaliar através da técnica de fracionamento isotrópico a quantidade de neurônios e células totais na região hipocampal.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Acasalamento e divisão dos grupos experimentais

Ratos Wistar fêmeas, após o período de adaptação às condições ambientais de Biotério, foram submetidas ao acasalamento e, após constatação da presença de espermatozoides no lavado vaginal, passaram a ser alimentadas com ração padrão para roedores (NP - normal protein, 17% de proteína, dieta basal) ou com ração hipoprotéica (LP – low protein, 6% de proteína) (veja a composição das rações na Tabela1). Imediatamente após o nascimento, retornou-se a ração padrão e os animais foram pesados e aferidas as distâncias ano-genitais. Todas as proles foram reduzidas de forma a ser constituídas somente por 8 filhotes/ninhada e, posteriormente foram divididos em dois grupos experimentais:

Grupo 1 - Com 14 dias de vida apenas os machos da prole foram eutanasiados e os cérebros coletados e imersos em PFA 4% por 24 horas e posteriormente armazenados em álcool 70% para a técnica de imunoistoquimica. Para a técnica de microdissecção, os mesmos foram imediatamente imersos em N-Hexano, congelados em gelo seco e armazenados em -80ºC.

Grupo 2 - Com 40 dias de vida apenas os machos da prole foram eutanasiados e os cérebros coletados e imersos em PFA 4% por 24 horas e posteriormente armazenados em álcool 70% para a técnica de imunoistoquimica. Para a técnica de microdissecção, os mesmos foram imediatamente imersos em N-Hexano, congelados em gelo seco e armazenados em -80ºC.

INGREDIENTES NORMAL PROTEIN 17% LOW PROTEIN 6% Amido de milho 410,10 484,80 Caseína 188,90 66,70 Amido dextrinizado 130,50 159,00 Sacarose 100,00 121,00 Óleo de soja 70,00 70,00 Celulose microcristalina 50,00 50,00

Mix mineral AIN 93 35,00 35,00

Tabela 1. Itens que compõe a dieta. Quantidade para 1kg

3.2 Microdissecções a laser

Para a técnica de microdissecção, o material foi coletado e imediatamente congelado em gelo seco imerso em N-Hexano. Foram realizadas secções de 60µm em criostato e os cortes aderidos em lâminas (Arcturus PEN Membrane Glass Slides) os quais foram desidratados sobre refrigeração, corados com cresyl e então submetidos à microdissecção a laser. As lâminas foram então colocadas no microscópio e com a utilização da objetiva de 5x foi selecionada a região a ser microdissecada para posterior corte através do laser. Foram microdissecadas as regiões CA1, CA3 e Giro Denteado de todas as amostras de hipocampo (n=5) de cada grupo experimental. Totalizando aproximadamente 10 lâminas por animal. Após a realização do corte, com o auxílio de uma lupa, a região microdissecada foi transferida para tubos estéril para processamento para RT-qPCR.

L cistina 3,0 3,0

Bi tartarato de colina 2,5 2,5

Foto 1. Equipamento de microdissecção a laser

Foto 2. Delineamento da região a ser cortada

Foto 3. Região selecionada sendo cortada pelo laser

3.3 Extrações de RNA total para análises de expressão gênica

O RNA total foi extraído das amostras das regiões hipocampais microdissecadas (CA1, CA3 e GD) através do método de extração com Trizol, baseado no protocolo desenvolvido e revisado por Chomczynski & Sacchi (Chomczynski & Sacchi, 2006).

O Trizol é uma mistura de fenol, guanidina-isotiocianato e corante vermelho que permite a identificação da fase orgânica, que não interage com os ácidos nucléicos. Durante a homogeneização das amostras, o Trizol preserva a integridade do RNA enquanto favorece a lise celular e a dissolução dos componentes celulares. A adição

de clorofórmio, seguida de centrifugação, promove aumento na eficiência na desnaturação das proteínas. Após a centrifugação ocorre separação da solução em três fases distintas: a fase superior, aquosa e límpida, a fase intermediária e a fase inferior, orgânica de cor avermelhada. O RNA permanece exclusivamente na fase aquosa. Após transferir a fase aquosa, o RNA é recuperado pela precipitação com sucessivos ciclos de lavagem com álcool isopropílico e centrifugação. O RNA extraído por este método é livre de contaminação com DNA e proteínas.

3.4 Análises da quantidade, qualidade e integridade do RNA total

A quantidade e a qualidade do RNA total obtido após a extração foram avaliadas por espectrofotometria utilizando a placa para microvolumes Take3 e o equipamento Epoch (BioTek®), através de medidas de absorbância em 230 nm (A230), 260 nm (A260) e em 280 nm (A280). A medida de absorbância em 230 nm permite inferir a respeito de possíveis contaminantes da amostra. A medida de absorbância em 260 nm é específica para ácidos nucléicos e, portanto, é possível medir a concentração de RNA extraído. A medida de absorbância em 280 nm permite inferir a respeito de possível contaminação com proteínas. Assim, a partir da relação entre as absorbâncias A260/A280 e A260/A230 a qualidade e a pureza da amostra podem ser avaliadas. Para RNAs puros, a razão entre A260/A280 deve ser maior que 1,8 e a razão entre A260/A230 deve ser estar ente 2,0 e 2,2 (Sambrook et al., 1989; Manchester, 1996).

3.5 Sínteses de cDNA para avaliação da expressão de mRNAs

A síntese de cDNA para a avaliação da expressão de mRNAS foi realizada utilizando o SuperScript VILO Master Mix – Thermo Scientific.

Foram utilizadas amostras de CA1, CA3 e GD de cinco animais de cada grupo experimental (NP e LP – 14 dias e NP e LP – 40 dias) provenientes de diferentes progenitoras.

Para cada amostra de RNA total foram utilizados 4μl de Master Mix, 500ng de amostra de RNA e completou-se com água até o volume do 20μl.

A solução final resultante foi rapidamente centrifugada e então incubada, utilizando o equipamento Veriti® Thermal Cycler (Life Technologies, EUA), nas seguintes condições: 25°C por 10 minutos, 37°C por 120 minutos, seguido da

inativação da transcriptase reversa a 85°C por 5 minutos e do resfriamento das amostras a 4°C.

3.6 RT-qPCR para avaliação da expressão dos mRNAs

Cada amostra de cDNA obtida na etapa anterior foi analisada com ensaios de PCR em tempo real contendo primers Exxtend específicos e o PowerUp SYBR Green Master Mix A25742.

Os ciclos da PCR foram realizados no equipamento StepOne Plus (Life Technologies, EUA) sob as seguintes condições: 50°C por 2 minutos, 95°C por 20 segundos, seguidos de 40 ciclos de 95°C por 1 segundo e 60°C por 20 segundos.

Os valores de Ct foram calculados utilizando a configuração automática de baseline e de threshold. Para a análise da expressão dos mRNAs, a expressão gênica foi normalizada por controle endógeno (LSM1 e SSR2. Cada amostra foi analisada em triplicata e quantificada pelo método do ΔΔCt (Livak & Schmittgen, 2001). O ΔCt foi calculado pela subtração do valor de Ct de cada amostra pelo respectivo valor de Ct do controle endógeno. Cada ΔCt foi então subtraído pela média aritmética dos valores de Ct do grupo controle (ΔΔCt). A expressão relativa foi então calculada pela equação 2(-ΔΔCt). O resultado final foi representado como proporção do grupo controle. Todos os experimentos de RT-qPCR foram realizados seguindo as orientações do MIQE: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments (Bustin et al., 2009).

3.7 Imunoistoquimica

Os animais (NP, n=5 e LP, n=5) foram anestesiados com Isofluorano e o nível de anestesia controlado pelo monitoramento do reflexo corneal. A perfusão foi realizada com o auxílio de uma bomba de perfusão mantendo-se a pressão média de 120 mmHg, sendo cada animal perfundido 15 minutos com solução salina heparinizada a 5% em temperatura ambiente e 20 minutos com solução de paraformaldeído a 4%em tampão fosfato 0,1M pH 7,4.

Após perfusão, os encéfalos foram fixados por imersão na mesma solução por 24 horas. O material foi incluído em paraplast e posteriormente, os cérebros foram então cortados em micrótomo obtendo-se cortes com 5 µm de espessura. Selecionaram-se as regiões que continham o hipocampo e nestas lâminas foi realizada a desparafinização, seguido pela inibição da peroxidase endógena e

bloqueio com solução bloqueadora (leite em pó desnatado 5% em PBS). Os cortes foram, então, incubados com os anticorpos primários, os quais foram diluídos em BSA 1%. Os cortes permaneceram incubados nesta solução overnight, sob refrigeração. Posteriormente, foram lavados com PBS (3 vezes com intervalos de 5 minutos) e expostos ao anticorpo secundário específico, conjugado com peroxidase, durante 2 horas à temperatura ambiente. Após lavagens sucessivas com PBS, a revelação foi feita com DAB, os cortes montados em lâminas silanizadas, contra corados com hematoxilina e, após secarem, foi realizada desidratação e montagem com lamínula. A análise das lâminas foi realizada em microscópio óptico e foto-documentados com auxílio de câmera CCD-IRIS (Sony).

3.8 Fracionamentos Isotrópico

Estimativa do número total de núcleos de neurônios

Para estimar o número total de neurônios os animais foram anestesiados no 14º ou 40º dia de vida com Isofluorano e perfundidos com solução salina 0,9% e paraformoldeído (PFA) a 4%. Depois os cérebros foram removidos e os hipocampos foram macrodissecados, pesados e imersos em álcool 70%.

Após esta etapa homogenizou-se manualmente 20 vezes a solução por tombamento, imediatamente uma alíquota de 1,5 ml foi retirada e centrifugada por 3’ a 6000 rpm o sobrenadante foi descartado e o pellet foi suspendido para 1ml com PBS. Esta lavagem (processo de centrifugação e re-suspenção do pellet) foi realizada 3x.

Após a última lavagem o pellet foi suspendido e incubado a temperatura ambiente por 2h com anti-NeuN igG (1:200 EM pbs; Chemicon, Temeluca, CA). Posteriormente, a alíquota foi lavada 3x e os núcleos foram incubados com anticorpo secundário, Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG 3 (y3) (1:200 em 40% PBS, 10 ngs (Normal Goat Serum) e 50% DAPI) por 2h, novamente os núcleos de neurônios foram lavados e suspendidos em 200ul de PBS para contagem dos núcleos de neurônios em microscópio de fluorescência.

Após homogenização mecânica uma alíquota de 10ul foi lançada na câmara de Neubauer aguardou-se por 5’ e então fez-se a leitura, contando-se primeiramente os núcleos marcados com DAPI, pois este reagente marca todos os núcleos indiscriminadamente (endotélio, células da glia, neurônios), em seguida trocou-se o

filtro azul do microscópio pelo filtro verde e realizou-se a contagem dos núcleos marcados com Alexa 555 que marca apenas núcleos de neurônios. A contagem do núcleo de neurônio só foi considerada valida para aquelas marcações (DAPI e Alexa 555) que se sobrepunham.

3.9 Análise Estatística

Os dados foram submetidos ao teste t de Student. Os resultados foram expressos como média ± Desvio Padrão e considerado significativo quando p<0,05

4. RESULTADOS

Em relação à evolução do peso das mães durante a gestação, nós observamos que as fêmeas que consumiram ração hipoproteica apresentaram redução significativa do peso corporal na 2ª e 3ª semana gestacional. Ao nascimento os animais do grupo LP apresentaram redução significativa no peso dos machos (Figura 4).

Figura 4. Análise da evolução do peso das mães durante a gestação (n=8 p<0,0001, ANOVA Two-Way) e peso ao nascer dos filhotes machos (NP, n=106; LP, n=105) Teste t.

Nos neonatos da prole de machos observamos aumento significativo da distancia ano-genital nos animais do grupo LP (Figura 5).

A massa dos machos da prole LP foi recuperada no 14º dia de vida e se manteve semelhante aos animais do grupo NP até o 40º dia de vida (Figura 6). As massas do cérebro e do hipocampo dos animais LP não foram alteradas mesmo quando corrigidas pela massa do animal (figuras 7 e 8) ou pela do cérebro, no caso do hipocampo (Figura 9).

Figura 6. Análise do peso dos machos com 14 (A - NP, n=12; LP, n=7) e 40 dias (B – n=12; LP, n=11) Teste t.

Figura 7. Análise da massa do cérebro normalizada pela massa corporal com 14 dias e 40 dias de vida. (n=5) Teste t.

Figura 8. Análise da massa do hipocampo com 14 e 40 dias de vida. (n=5) Teste t.

Figura 9. Análise da massa do hipocampo normalizada pela massa do cérebro com 14 e 40 dias de vida. (n=5) Teste t.

Figura 10. Análise da massa do hipocampo normalizada pela massa do animal com 14 e 40 dias de vida. (n=5) Teste t

A análise da expressão gênica em subcampos microdissecados do hipocampo dorsal de animais com 14 dias de vida, revelou aumento dos RNAm para GR e AT4, em CA1 de animais do grupo LP, comparativamente aos NP (Figura 11). Também em CA1 observamos em LP redução significativa do RNAm de 5-HT1A no 14º dia de vida (Figura 11). No 40º dia de vida a expressão gênica da maioria das proteínas estudadas foi reduzida na região CA1 dos animais NP e LP, comparativamente àquela observada no 14º dia de vida (Figura 11). Quando comparamos NP e LP quanto a expressão dos RNAm estudados no 40º dia de vida, não observamos alterações significativas em CA1 (Figura 11).

Figura 11. Análise da expressão gênica na região CA1 do hipocampo dorsal de ratos dos grupos NP e LP com 14 e 40 dias de vida (Teste t).

Em CA3 de animais do grupo LP, comparativamente aos NP, no 14º dia de vida observamos aumento significativo dos RNAm de MR e AT1 e redução significativa de DCX (figura 12). Assim como observado em CA1, no 40º dia de vida a expressão gênica da maioria das proteínas estudadas foi reduzida na região CA3 dos animais NP e LP, comparativamente àquela observada no 14º dia de vida (Figura 12). Entretanto, tanto em NP quanto em LP a expressão de BDNF e SOX2 é significativamente aumentada em CA3 no 40º dia comparativamente ao 14º (Figura 12). Quando comparamos NP e LP quanto a expressão dos RNAm estudados no 40º dia de vida, também em CA3 não observamos alterações significativas (Figura 12).

Figura 12. Análise da expressão gênica na região CA3 no hipocampo dorsal de ratos dos grupos NP e LP com 14 e 40 dias de vida (Teste t).

Já no GD dos animais do grupo LP, comparativamente aos NP, no 14º dia de vida observamos redução significativa dos RNAm que codificam MR, DCX e 5-HT1A (figura 13). Contrariamente ao que foi observado em CA1 e em CA3, no 40º dia de vida a expressão gênica das proteínas estudadas foi aumentada no GD dos animais NP e LP, comparativamente àquela observada no 14º dia de vida (Figura 13). Assim como observado em CA1 e CA3, quando comparamos NP e LP quanto a expressão dos RNAm estudados no 40º dia de vida, no GD não observamos alterações significativas na maioria das proteínas estudadas entretanto, a expressão de SOX2 foi significativamente reduzida e de DCX significativamente aumentada (Figura 13).

Figura 13. Análise da expressão gênica na região GD no hipocampo dorsal de ratos dos grupos NP e LP com 14 e 40 dias de vida (Teste t).

Tabela 2. Porcentagens das alterações encontradas nos RNAm estudados, com setas representando aumento ou diminuição da expressão nas regiões CA1, CA3 e GD do hipocampo dorsal. Em negrito temos as alterações observadas em LP comparativamente a NP. Os valores que não estão em negrito correspondem à variação de expressão entre o 14º e 40º dia de vida nos animais NP e nos LP. As células verdes representam alterações estatisticamente significativas quando usado o Teste t. CA1 CA3 GD NP/LP NP LP NP/LP NP LP NP/LP NP LP 14D 40D 14/40 14/40 14D 40D 14/40 14/40 14 D 40D 14/40 14/40 BDNF 31% 68% 48% 49% 48% 31% 8.210% 10.938 % 3% 36% 350% 492% SOX2 1% 58% 74% 89% 62% 13% 1.279% 3.048% 16% 68% 6.732% 2.475% GR 27% 72% 25% 1% 37% 7% 95% 91% 6% 15% 347% 381% MR 53% 44% 93% 92% 81% 12% 94% 97% 87% 7% 133% 1.593% AT4 36% 35% 69% 85% 5% 3% 94% 94% 27% 54% 65% 249% DCX 1% 67% 73% 91% 29% 9% 94% 92% 50% 462% 221% 3.511% 5HT1A 30% 38% 62% 24% 17% 24% 93% 92% 58% 5% 16% 160% EGR1 13% 38% 76% 87% 0,70% 9% 94% 94% 37% 63% 256% 325% CDK1NC 57% 22% 78% 83% 7% 18% 12% 182% 288% AT1 109% 74% 94% 95% 22%

Com relação às proteínas, cujos genes apresentaram alterações significativas de expressão, nós avaliamos as variações quanto à localização e conteúdo de algumas em CA1, CA3 e GD do hipocampo dorsal dos animais NP e LP. Os resultados demonstram não ter havido regulação pós-transcricionais revertendo as alterações observadas na avaliação da expressão gênica.

Desta forma, no 14º dia de vida a imunoreatividade para GR em CA1, apresentou-se significativamente aumentada em LP comparativamente àquela obtida em NP (Figura 14).

Figura 14. As micrografias mostram a imunomarcação de GR na região CA1 do hipocampo dorsal de animais NP e LP com 14 dias de vida. Observe a localização preferencialmente nuclear deste receptor, característica de receptores de esteróides. A Análise quantitativa da área marcada revela aumento significativo desta proteína em LP (Teste t, n=5).

Em relação à imunomarcação de MR observamos aumento em CA3 e diminuição no GD (Figura 15). Já em relação à expressão de DCX, observamos que

tanto no GD quanto em CA3, a expressão foi significativamente menor nos animais do grupo LP (Figura 16).

Figura 15. As micrografias mostram a imunomarcação de MR nas regiões CA3 e GD do hipocampo dorsal de animais NP e LP com 14 dias de vida. A Análise quantitativa da área marcada revela aumento significativo desta proteína em CA3 e redução significativa no GD em LP, comparativamente a NP (Teste t, n=5).

Figura 16. As micrografias mostram a imunomarcação de DCX nas regiões CA3 e GD do hipocampo dorsal de animais NP e LP com 14 dias de vida. A análise quantitativa

da área marcada revela redução significativa desta proteína em LP, comparativamente a NP (Teste t, n=5).

No hipocampo dorsal dos animais LP com 40 dias de vida observamos aumento significativo na expressão de DCX em todas as sub-regiões (Figura 17).

Figura 17. Imunolocalização de DCX no hipocampo dorsal de animais NP e LP com 40 dias de vida. A análise quantitativa da área marcada revela aumento significativo desta proteína em LP, comparativamente a NP (Teste t, n=5).

Através da técnica de fracionamento isotrópico observamos que não houve diferença significativa no número de células totais nem de neurônios nos hipocampos dos animais estudados, independentemente do grupo experimental. No entanto, observamos que os animais do grupo LP com 14 dias de vida, apresentam 61% de neurônios enquanto que o grupo NP apresentou apenas 23% de neurônios (Figura 18).

Os resultados obtidos pela quantificação do número total de células e neurônios demonstraram que os animais do grupo LP com 14 dias de vida apresentam maior quantidade de neurônios em relação às células da glia e endoteliais e em relação aos animais do grupo NP.

Figura 18. Porcentagem de neurônios e outros tipos celulares hipocampais em animais NP e LP com 14 dias de vida (Teste T, n=3).

Já no 40º dia de vida não observamos diferenças na proporção de tipos celulares quando comparamos os resultados obtidos para NP e LP (Figura 19). Adicionalmente, observamos que nos dois grupos estudados há menor quantidade de neurônios que a observada para outros tipos celulares do hipocampo.

Figura 19. Porcentagem de neurônios e outros tipos celulares hipocampais em animais NP e LP com 40 dias de vida (Teste T, n=3).

NP

LP

5. DISCUSSÃO

Como já exposto, a nutrição fetal exerce papel fundamental no desenvolvimento cerebral, particularmente no período final da gestação (Nyaradi at al, 2013). Além disso, existem evidencias que as alterações nutricionais durante o período gestacional podem levar a graves consequências no desenvolvimento neural bem como na regulação da expressão gênica, na plasticidade, na arborização dendrítica, na sinaptogênese e no processo de mielinização neuronal (Black, 2008). Inúmeros trabalhos experimentais têm demonstrado que a desnutrição proteica, quando imposta em estágios iniciais da vida, produz diversas alterações morfológicas e neuroquímicas no SNC (Lopes et al, 2013, Lewis et al, 1979, Wiggins et al, 1984, Almeida, 1987, Morgane, 2002) que, habitualmente, vem acompanhadas por modificações na massa corporal dos animais ao nascimento (Mesquita et al, 2010).

A formação hipocampal tem sido alvo de estudos em face à sua conhecida característica de intensa plasticidade que efetivamente, repercute em sua função de regulação de processos cognitivos. Dessa forma, o presente estudo buscou avaliar os efeitos da restrição proteica gestacional bem como da incompatibilidade com o ambiente pós-natal, com o retorno ao aporte normoproteico, no desenvolvimento do hipocampo.

Os resultados do presente estudo confirmam a significativa redução da massa corporal dos animais do grupo LP ao nascer e a recuperação do peso no 14º dia de vida caracterizando a ocorrência de catch-up growth como previamente descrito pelo nosso grupo, neste modelo de restrição proteica gestacional (Mesquita et al, 2010, Lopes et al, 2013). Além disso, nós também observamos aumento na distância ano-genital nos machos da prole que sofreu restrição proteica gestacional. Zambrano et al (2005) já haviam observado este aumento da distância ano-genital na prole de fêmeas que sofreram restrição proteica gestacional. Neste estudo, fêmeas com 19 dias de gestação apresentaram aumento significativo na concentração plasmática de progesterona, corticosterona, estradiol e testosterona. Tanto estes quanto outros autores aventam a possibilidade de que a exposição aos esteroides maternos possa ser um fator determinante, dentre outros, para este aumento da distância ano-genital nestes modelos (Hotchkiss et al., 2007).

O desenvolvimento de circuitos neuronais requer uma sequência de eventos incluindo proliferação celular, migração, diferenciação e sinaptogênese. O hipocampo

é uma estrutura, em camadas, que se desenvolve seguindo estes passos (Forster et al, 2006). Em ratos, esse padrão é induzido a partir da embriogênese, e os novos neurônios possuem propriedades intrínsecas que permitem definir e estabelecer fenótipos na idade adulta (Deguchi et al, 2011). Assim, tanto o momento quanto a forma dos neurônios do hipocampo têm origem e exercerá influências nas suas propriedades e funções durante a infância, a juventude, na maturidade e no envelhecimento.

Bayer (1980) descreveu que na fase pós-natal de roedores, células precursoras se acumulam em uma matriz de proliferação no hilo do GD e o pico de proliferação nesta matriz ocorre entre o 3º e 10º dia pós-natal. Entretanto, alguns consideram que a proliferação cessa em roedores, no 7º dia pós-natal (Vadodaria e Gage, 2014). Entre o 21º e o 28º dia pós-natal esta matriz desaparece e o nicho neurogênico permanece confinado à ZSG (Altman e Bayer, 1990b).

Durante a neurogênese as células precursoras passam por diferentes estágios até se diferenciarem em neurônios e expressam proteínas diferentes, o que torna possível distingui-las. Inicialmente, as células tronco tipo 1 e tipo 2a e 2b expressam SOX2, sendo que o tipo 2b passa a expressar também DCX. As células tronco do tipo 3 não expressam mais SOX2 sendo distinguido pela expressão apenas de DCX até o estágio de neurônio imaturo que, por sua vez, passa a expressar também NEuN. No neurônio maduro já não encontramos DCX, mas sim a expressão de NEuN (Figura 20).

SOX 2 é um fator de transcrição essencial para manter a auto-renovação ou pluripotência de células-tronco. Relatos na literatura mostram que a regulação negativa de SOX2 induz saída de neurônios do ciclo celular (fase proliferativa) e a expressão de marcadores de diferenciação (Graham et al, 2003) enquanto que a superexpressão de SOX2 reprime a diferenciação neuronal (Bani-Yaghoub, 2006). Dessa forma, a inibição da sinalização pela SOX2 resulta na delaminação de células progenitoras neurais da ZSG estando associada com perda de marcadores de células progenitoras (células tronco) e o aparecimento de marcadores de diferenciação neuronal precoce (Graham et al, 2003).

Figura 20. Esquema representando a maturação neuronal na ZSG (modificado de http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/44047/title/Neurogenesis-in-the-Mammalian-Brain/. Baseada em VARELA-NALLAR e INESTROSA, 2013).

DCX é uma proteína associada a microtúbulos (MAP), importante para a migração e diferenciação de neurônios (Kappeler et al, 2006; Koizumi et al, 2006; Francis et al, 1999; Glesson et al, 1999). É amplamente expressa no SNC de mamíferos e, em ratos, sua expressão se inicia no 10,5º dia embrionário. O início da expressão de DCX corresponde, portanto, aos estágios iniciais da neurogênese, quando os neurônios neocorticais destinados ao córtex em desenvolvimento tem origem e iniciam seu processo de migração (Caviness et al., 1997). No entanto, a expressão de DCX não se limita a este período, ela também é expressa em neurônios em diferenciação em outras fases do desenvolvimento (Francis et al, 1999).

Nossos resultados demonstram que no 14º dia de vida não ocorreram alterações significativas na expressão de SOX2 nas regiões hipocampais estudades em LP comparativamente a prole NP. Já a expressão de DCX é reduzida significativamente (~50%), no GD de animais do grupo LP no 14º dia de vida. Entretanto, embora não tenhamos observado diferença significativa no número de células do hipocampo entre os grupos NP e LP, o número de neurônios maduros em

Neurônio maduro Neurônio imaturo Neuroblásto tipo 2b Precursor neural tipo 2a Célula tronco neural tipo 1 Neurônio hipocampal Zona subgranular (ZSG) Camada granular CA1 GD CA3

LP foi 38% maior que o observado em NP no 14º dia de vida. Desta forma, podemos supor que em animais da prole LP, os processos de proliferação e diferenciação foram estimulados pelo aumento do aporte proteico pós-natal (retorno á dieta normoprotéica no pós-natal), resultando na elevação do número de neurônios no 14º dia de vida (Figura 21). Esta aceleração no crescimento corresponde ao período de catch-up growth observado em nosso modelo.

Figura 21. Hipótese sobre as diferenças encontradas em LP comparativamente a NP. Em azul temos o time course dos processos de diferenciação no hipocampo de animais NP. Primeiro ocorre proliferação das células tronco, seguido pelo período de determinação. O período de determinação indica que a potência da célula foi restrita ao seu destino. A partir de então, estas células migram até o 21º dia de vida e desenvolvem suas ramificações dendríticas e integrações sinápticas. Representado em vermelho temos as alterações supostas em LP frente aos nossos resultados (Baseado em Vadodaria e Gage, 2014).

No 40º dia pós-natal os animais LP, apresentam redução significativa (68%) do RNAm para SOX2 no GD do hipocampo dorsal indicando redução de células tronco. Paralelamente, observa-se aumento significativamente exacerbado (462%) no RNAm de DCX no GD indicando intensificação dos processos de migração e diferenciação. Podemos supor que após o 40º dia de vida, há uma redução de células tronco seguida por uma elevação no número de neurônios no GD. Devemos salientar que esta acentuada diferenciação de neurônios pode ser o fator determinante da redução de células tronco na ZSG do GD. Como dito acima, a ZSG é a principal fonte de células granulares produzidas no início da vida e na idade adulta, devendo ser mantido o número apropriado de células precursoras para a neurogênese ao longo da vida.

Assim, podemos reiterar a hipotese de que o observado aumento da expressão de DCX em animais com 40 dias de idade decorra de mecanismos compensatórios induzidos pela expressiva redução na formação de novos neurônios em um período

Dias após

nascimento 0 7 14 21 28 40 Proliferação Integração Sináptica

Determinação Migração Migração Integração Sináptica Proliferação Determinação NP LP catch-up growth

pré-natal, adjunto a exposição da prole a restrição nutricional. Este fato deve ser considerado, uma vez que encontramos número aumentado de neurônios nos animais com 14 dias de vida.

O BDNF é um fator de crescimento que é dinamicamente expresso no cérebro durante todo o período de desenvolvimento perinatal, regulando a diferenciação neuronal e a plasticidade sináptica; estudos prévios têm demonstrado que a expressão de BDNF aumenta a partir do 10º dia pós-natal atingindo seu pico no 30º dia e um platô no 45º dia pós-natal (Dincheva et al, 2016). No presente estudo, foi evidenciado que na região CA3 e no GD do hipocampo dorsal, os animais LP apresentam aumento na expressão de RNAm para BNDF, sendo que em CA3 esta elevação foi 2.728% maior que aquele observado em animais NP. Entretanto, na idade adulta (16 semanas de vida) estes animais apresentam redução no comprimento dendrítico dos neurônios da região CA3 (Lopes et al., 2013) indicando que este estímulo não interferiu favoravelmente prevenindo danos às conexões neurais futuras.

Nos ratos, durante as duas primeiras semanas pós-natal, ocorre quiescencia adrenocortical sendo este denominado de “período não responsivo ao estresse”, no qual os níveis de esteróides adrenais estão fisiologicamente baixos permitindo a elevação da taxa de produção de células granulares característica neste período (Sapolsky e Meaney 1986; Schlessinger et al. 1975).

No final da primeira semana de vida o número de MR chega ao mesmo padrão encontrado em adultos. Já a quantidade de GR nas primeiras semanas de vida é de ~30% daquela encontrada em adultos (Bohn et al., 1994; Vazquez et al., 1998). Tanto GR quanto MR são altamente expressos apresentando ontogênese complexa que acompanha o desenvolvimento intrincado do cérebro.

Munier et al. (2012) estudaram a expressão de MR bem como seu papel na sobrevivência de células tronco embrionárias diferenciadas in vitro em neurônios. Durante a diferenciação a expressão de MR aumentou cinco vezes e foi mantida elevada nos neurônios derivados destas células (Munier et al., 2010). Tanto as células tronco quanto os neurônios diferenciados também expressam GR, fato importante, já que GR tem papel indispensável na transcrição dependente de MR e que são formados heterocomplexos GR-MR necessários para o tráfego nuclear eficiente de MR (Tsugita et al., 2009). A deleção global de MR, mas não de GR, em camundongos provoca redução no número de células granulares hipocampais (Gass et al., 2000). Munier et