Estudo comparativo entre gerações de soja transgênica e não-transgênica utilizando uma abordagem proteômica e metabolômica

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Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP

Instituto de Química

BRUNA KAUELY DE CAMPOS

Estudo comparativo entre gerações de soja

transgênica e não-transgênica utilizando uma

abordagem proteômica e metabolômica

Campinas

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BRUNA KAUELY DE CAMPOS

Estudo comparativo entre gerações de soja

transgênica e não-transgênica utilizando uma

abordagem proteômica e metabolômica

Tese de doutorado apresentada ao Instituto de Química da Universidade

Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Doutora em Ciências

Orientador: Prof. Dr. Marco Aurélio Zezzi Arruda

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA BRUNA KAUELY DE CAMPOS E ORIENTADA PELO PROF. DR. MARCO AURÉLIO ZEZZI ARRUDA

Campinas

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Ficha catalográfica

Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Química Camila Barleta Fullin - CRB 8462

Campos, Bruna Kauely de, 1989-

C157e Estudo comparativo entre gerações de soja transgênica e não-transgênica utilizando uma abordagem proteômica e metabolômica / Bruna Kauely de Campos. – Campinas, SP : [s.n.], 2017.

Orientador: Marco Aurélio Zezzi Arruda.

Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química.

1. Transgênico. 2. Proteômica. 3. Metabolômica. 4. Soja. I. Arruda, Marco Aurélio Zezzi, 1965-. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Química. III. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Comparative study between generations of transgenic and non-

transgenic soybeans seeds using a proteomic and metabolomic approach

Palavras-chave em inglês:

Transgenic Proteomics Metabolomics Soybean

Área de concentração: Química Analítica Titulação: Doutora em Ciências

Banca examinadora:

Marco Aurélio Zezzi Arruda [Orientador] Ana Rita de Araújo Nogueira

Aline Klassen

Anne Hélène Fostier Alessandra Sussulini

Data de defesa: 23-11-2017

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Prof. Dr. Marco Aurélio Zezzi Arruda (Orientador)

Profa. Dra. Ana Rita de Araújo Nogueira (EMBRAPA/São Carlos-SP)

Profa. Dra. Aline Klassen (UNIFESP-Diadema)

Profa. Dra. Alessandra Sussulini (IQ- UNICAMP)

Profa. Dra. Anne Hélène Fostier (IQ- UNICAMP)

A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do(a) aluno(a).

Este exemplar corresponde à redação final da Tese de Doutorado defendida pela aluna BRUNA KAUELY DE

CAMPOS, aprovada pela Comissão Julgadora em 23 de

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Dedico essa tese a minha mãe Elke Patricia, a ela o meu amor e gratidão por nunca medir esforços para garantir minha formação e me apoiar em minhas escolhas.

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“Não é sobre chegar no topo do mundo e saber que venceu É sobre escalar e sentir que o caminho te fortaleceu” Ana Vilela

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Agradeço a Deus por toda sua bondade em me fazer chegar até aqui.

À minha mãe, Elke Patricia, pelo apoio incondicional, por ela ser minha inspiração diária para querer sempre mais, pelo seu exemplo de coragem e perseverança, a ela todo o meu amor e gratidão.

À minha avó Mirna que na hora do choro estava sempre presente segurando minha mão, fazendo minhas comidas congeladas, a esse amor dedicado, a minha gratidão.

Ao Osmar, meu papito, que cuida da minha mãe, do meu irmão Daniel e da minha doce irmã Maria Eduarda, obrigada.

À toda família Campos, que muitas e inúmeras vezes fizeram a vez do meu pai, que torcem por mim e se sentem orgulhosos da minha caminhada. A mãe de todos, nosso exemplo Vó Maria, obrigada por sempre ter um café e um chimarrão quentinho para me receber, esse amor transborda e nos faz seguir mais forte! Tio Everaldo obrigada por ser o mais lindo da família, tia Lô obrigada por ser o meu pai quando eu não o tive, tia Quel sua pedagogia me inspira, obrigada! Tio Chico, sua Pitty agradece! Tio Juca, você foi na minha formatura do colegial, obrigada! Tio Laurici, que eu leve a vida com a sua sabedoria. Tio Leo, tenho certeza que suas orações me ajudaram muito, obrigada! Meu pai Neoraldo, sempre há tempo para mudar, obrigada por tentar! Aos meus primos amados companheiros de infância e aqueles que já são da nova geração, obrigada!

Ao grupinho da moda, Dra. Barbara, quase Dra. Daniele, Dr. João Benhur, Dr. Silvano, vocês que eu conheci na faculdade, até aqui são 10 anos juntos, na alegria e na tristeza, na saúde e na doença, obrigada! Agradeço em especial meu amoy João, nosso Skype, nossa cumplicidade, nossa parceria, não há nada igual, você me ajudou com os resultados desse trabalho, com interpretações e ensinamentos, que sua vida seja longa para que eu possa desfrutar ao seu lado tudo que há de melhor. Obrigada!

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Ao GEPAM – agradeço cada sotaque, cada cultura, cada pessoa que por lá passou. Vocês me fizeram crescer como profissional e ser humano. Aos amigos queridos e especiais Ciço (Cícero), Rodrigo, Hemissone (Jemmyson), Gustavo, Katika (Ketherine), Sra. Josi (Josiane), Alejandra, Lara (Larissa), vocês são demais, espero revê-los um dia. Meu amigo Alisson, que alegria ter conhecido um ser humano tão incrível como você, quebrando barreiras de preconceito você “mata a cobra e mostra o pau”, obrigada por tudo!! Ivanilce (nesse momento ela estava achando que eu não iria falar dela), você tem um lugar especial nesse agradecimento, minha amiga que chorou junto comigo, que dividiu angustias, que sempre me recebia com um “bom dia pra quem?”, à você o meu agradecimento por tudo. Ao Prof. Dr. Zezzi, que me recebeu como uma estranha, acreditou e apoiou os meus desejos e sonhos, obrigada. Certamente lembrarei desse grupo com muito carinho.

Ao Artur Zardin Graeff, meu gruds, parceiro e amigo, que bom ter você com a calmaria que eu precisava, que bom que você me fez sorrir e mudou a minha vida, que bom fazer planos com você, obrigada!

Ao laboratório ThoMSon da UNICAMP e ao Dr. Tiago Santana Balbuena e Msc. Bruna Santos da UNESP-Jaboticabal pela ajuda com os experimentos de espectrometria de massas.

À Hexis Cientifica (Danaher Corporation), em especial a Patricia Rodrigues, pela confiança em mim depositada para assumir o cargo de especialista de produtos e assim poder repassar os conhecimentos acadêmicos a uma empresa e vice-versa.

À fundação de amparo a pesquisa do estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro concedido nos processos - regular 2013/17514-7 e BEPE 2015/24668-6.

Por fim, agradeço a Bel da CPG que me socorreu inúmeras vezes, a todos os mestres que até aqui me guiaram e a UNICAMP pela infraestrutura.

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Este trabalho baseou-se no estudo comparativo entre sementes de soja transgênica (T) e não-transgênica (NT) no que diz respeito a suas proteínas e metabólitos em diferentes gerações da planta, pois acredita-se que o gene inserido possa alterar seu perfil em nível molecular, uma vez que seu genoma foi alterado. Para tal avaliação, foi necessário o plantio das sementes de soja em casa de vegetação sob as mesmas condições até a obtenção da terceira geração. Além disso, foram realizadas diversas extrações das proteínas das sementes de soja para posterior separação por eletroforese em gel. Os géis de eletroforese obtidos mostram um perfil bastante semelhante, mostrando que a separação foi adequada, e que existem proteínas diferentes e também diferenciais entre as mesmas. A quantificação relativa das proteínas foi realizada por meio da técnica de 2-D DIGE, revelando um total de 89 proteínas diferenciais com critério de seleção que partiu de p<0,1 e fator de regulação maior que 2,0 entre os grupos estudados. Um menor número de proteínas diferenciais foi observado nos grupos de sementes T. Após identificação por espectrometria de massas, 29,2% das proteínas corresponderam a classe de armazenamento. Com relação aos metabólitos, os resultados indicaram que o solvente composto por metanol/água (70/30% v/v) foi considerado o mais adequado para a extração dos mesmos. Com isso, as duas gerações de sementes tiveram sua análise realizada por LC-MS com analisador QTOF. Os dados obtidos foram avaliados por uma análise estatística para melhor compreensão dos resultados. Os resultados mostraram uma diferença estatística significativa entre os perfis T e NT e também entre suas gerações. Esses resultados indicam, que as sementes de soja T e NT estão sofrendo uma alteração em seu proteoma e metaboloma. A soja T se mostrou mais robusta, mas não é possível afirmar se é devido a transgenia. O fato das menores diferenças terem sido observadas entre os grupos transgênicos, com um menor número de proteínas diferenciais e menores variações estatísticas com relação aos metabólitos, nos levam a concluir que a soja transgênica se adapta melhor as mudanças que estão ocorrendo em seu metabolismo, sejam elas causadas por fatores biológicos, químicos ou físicos.

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This work was based on the comparative study between transgenic (T) and non-transgenic (NT) soybean seeds with respect to their proteins and metabolites in different generations of the plant, since it is believed that the inserted gene can change its profile at the molecular level, once their genome was altered. For this evaluation, it was necessary to plant the soybean seeds in a greenhouse under the same conditions until obtaining the third generation. In addition, several extractions of the proteins of the soybean seeds were carried out for subsequent separation by electrophoresis. The obtained electrophoresis gels show a very similar profile, showing that the separation was adequate, and that there are different proteins and also differentials between them. The relative quantification of the proteins was performed using the 2-D DIGE technique, revealing a total of 89 differential proteins with a selection criterion starting from p<0.1 and a regulation factor greater than 2.0 between the groups studied. A lower number of differential proteins was observed in the T seed groups. After identification by mass spectrometry, 29.2% of the proteins corresponded to the storage class. Regarding the metabolites, the results indicated that the solvent composed of methanol/water (30/70% v/v) was considered the most adequate. Thus, the two seed generations were analyzed by LC-MS with QTOF analyser. The obtained data were evaluated by a statistical analysis to better understand the results. The results showed a difference between the T and NT profiles and also between their generations. These results indicate that soybean seeds T and NT are undergoing a change in their proteome and metabolome. The T soybean was more robust, but it is not possible to say if it is due to transgenic. The fact that the smaller differences were observed between the transgenic groups, with a lower number of differential proteins and lower statistical variations with respect to the metabolites, lead us to conclude that transgenic soya is better adapted to the changes that are occurring in its metabolism, whether they are caused by biological, chemical or physical factors.

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USDA United States Department of Agriculture

2-D DIGE Two-Dimensional Differential Gel Electrophoreisis 2-D PAGE Two-Dimensional Poliacrylamide Gel Electrophoresis AmBic Ammonium Bicarbonate

CIBio Comissão Interna de Biosegurança CTNBio Comissão Nacional de Biosegurança

Da Daltons

DIA Differential in-gel analysis ESI Electrospray Ionization

GMO Genetically Modified Organism

HPLC High Pressure Liquid Chromatography iCAP Isotope Coded Affinity Tags

ICR Ion Ciclotron Ressonance IEF Isoeletric Focusing

IPG Immobilized pH Gradient

iTRAQ Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification LC-SRM Liquid Chromatography Selected Reaction Monitoring

m/z Massa/Carga

MALDI Matrix Assisted Laser Dessorption/Ionization

MS Mass Spectrometry

MS-Imaging Mass Spectrometry imaging

NT Não-Transgênica

PFF Peptide Fragmentation Fingerprint PHG Programa Genoma Humano pI Ponto Isoelétrico

PMF Peptide Mass Fingerprint PSMs Peptide Spectrum Match

SILAC Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture

T Transgênica

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Sumário

INTRODUÇÃO GERAL 14

Capítulo 1-

Análise proteômica de duas gerações de soja transgênica e não-transgênica 17 1.1 INTRODUÇÃO 18 1.2 OBJETIVOS 23 1.3 MATERIAIS E MÉTODOS 24 1.3.1 Reagentes e equipamentos 24

1.3.2 Cultivo das sementes de soja 25

1.3.2.1 Aspectos Éticos 26

1.3.3 Extração e separação das proteínas de Soja 26

1.3.4 Quantificação relativa das proteínas de soja por 2D-DIGE 27

1.3.5 Digestão com tripsina in gel das proteínas 29

1.3.6 Identificação das proteínas 30

1.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 31

1.4.1 Plantio e Cultivo da soja 31

1.4.2 Separação das proteínas 34

1.4.3 Quantificação relativa das proteínas diferenciais por 2-D DIGE

37

1.4.4 Identificação das proteínas diferenciais por espectrometria de massas

40

1.4.5 Conclusão Parcial 54

Capítulo 2-

Análise metabolômica de duas gerações de soja transgênica e não-transgênica 56 2.1 INTRODUÇÃO 57 2.2 OBJETIVOS 61 2.3 MATERIAIS E MÉTODOS 61 2.3.1 Reagentes e equipamentos 61

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2.4.1 Plantio e cultivo da soja 63 2.4.2 Análise de metabólitos 63 2.4.3 Conclusão Parcial 79 3. CONCLUSÃO FINAL 81 4. REFERÊNCIAS 82 ANEXO 88

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INTRODUÇÃO GERAL

A soja é uma semente que pertence à família das leguminosas (Fabaceae), sendo considerada uma importante fonte de proteínas, pois, em suas sementes, aproximadamente 40 % de sua massa seca corresponde a proteínas e 20 % a óleo, o que torna a soja um produto aplicado nos mais diversos setores industriais como alimentos para humanos e animais, e ainda, como fonte alternativa de combustível (Arruda et al., 2015; Embrapa, 2014; Kim et al., 2009; Komatsu e Ahsan, 2009; Sussulini et al., 2007). Nos últimos anos, o cultivo de soja cresceu significativamente em muitos países. O departamento de agricultura dos Estados Unidos da América (USDA, do inglês – United States Department of Agriculture) divulgou a estimativa de produção esperada para a safra de 2017/2018 em 351 milhões de toneladas. O Brasil contribuiu com uma produção de 113 milhões na safra de 2016/2017 e se destaca por ser o segundo maior produtor mundial de soja (CONAB, 2017), no entanto, é líder mundial em exportação desse grão, sendo cerca de 43% de sua produção.

Devido à reconhecida importância da soja, muitos institutos de pesquisas e empresas buscam aperfeiçoar a qualidade nutricional da planta e, ainda, aumentar o controle contra pragas de uma maneira eficiente e barata. Nesse sentido, na década de 80, foram realizados estudos iniciais baseados em modificação genética nas sementes de soja pela empresa americana Monsanto®, a qual patenteou esta tecnologia ao desenvolver a soja transgênica. Denominada Roundup Ready® (RR) por ser resistente ao herbicida Roundup® - um dos herbicidas mais empregados em todo o mundo (Barbosa, 2011; Monsanto, 2013).

A soja sofreu uma modificação genética, e por isso é chamada de transgênica, a qual foi realizada por meio da inserção do gene cp4EPSPS proveniente da bactéria Agrobacterium do tipo cp4. Esta modificação confere a esta variedade resistência ao herbicida que tem glifosato como princípio ativo (Funke et al., 2006). O glifosato inibe os processos bioquímicos (formação de compostos aromáticos) da planta nas quais a enzima EPSPS, que é produzida pelas plantas de soja não-transgênicas, participa. O gene cp4EPSPS inserido na soja é funcionalmente similar a enzima EPSPS, presente na soja

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não-transgênica, no entanto, possui uma baixa afinidade pelo glifosato. Esse processo está resumido na Figura 1 (Barbosa, 2011; Kim et al., Funke et al., 2006).

Figura 1. (A) Síntese de compostos aromáticos na soja na presença da enzima

endógena da planta EPSPS (B) na presença da enzima exógena da planta cp4EPSPS.

Entretanto, o plantio e o consumo de alimentos geneticamente modificados enfrentam numerosas críticas de consumidores e organizações ecológicas que lideram alguns países e regulam sua produção, comércio e o crescimento de GMO (do inglês - genetically modified organism) (Léon et al., 2009). No Brasil, o plantio da soja RR foi aprovado pela comissão técnica nacional de biossegurança (CTNBio) em 1998, após protestos e críticas com relação a este organismo geneticamente modificado. Isso devido às inúmeras controvérsias em relação aos riscos e benefícios que a soja transgênica poderia causar na alimentação humana e animal (Kléba, 1998).

COO -OH -2_O 3PO OH + -2_O 3PO COO -Enzima Epsps COO -OH -2_O 3PO O COO -+ Pi Inibição H N PO3 2--_OOC glifosfato

shikimato-3-fosfato fosfoenolpiruvato 5-enolpiruvil shikimato-3-fosfato

X

COO -OH -2_O 3PO OH + -2_O 3PO COO -Enzima Epsps COO -OH -2_O 3PO O COO -+ Pi Inibição H N PO3 2--_OOC glifosfato

shikimato-3-fosfato fosfoenolpiruvato 5-enolpiruvil shikimato-3-fosfato

cp4EPSPS

X

(A)

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Nos dias atuais, tal controvérsia ainda não foi esclarecida pela ciência, contudo, alguns estudos estimam que a composição química de produtos transgênicos mostrou modificações inesperadas neste tipo de organismo (Léon, et al., 2009). Dessa forma, acredita-se que essa modificação genética sofrida pela soja possa contribuir para mudanças nas características químicas e biológicas da soja denominada transgênica (Arruda et al., 2015; Barbosa, 2011).

Isso corrobora com a necessidade de desenvolvimentos analíticos mais poderosos, capazes de enfrentar a complexidade deste problema.

Sendo assim, a temática desta tese foi a de avaliar, de forma comparativa e em nível molecular, se existem diferenças entre a soja transgênica e não-transgênica cultivadas por duas gerações. No capítulo 1, uma abordagem proteômica foi utilizada por meio das técnicas de eletroforese em gel de poliacrilamida para separação das proteínas e espectrometria de massas para a identificação das mesmas. Os resultados do estudo levaram a uma avaliação metabolômica, que foi realizada por meio das técnicas de cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas, a qual é apresentada no capítulo 2.

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Capítulo 1-

Análise proteômica de duas gerações

de soja transgênica e não-transgênica

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1.1 INTRODUÇÃO

O sequenciamento dos genes humanos, por meio de um grande estudo realizado por inúmeros pesquisadores oriundos de diferentes países, ficou conhecido como Projeto Genoma Humano (PGH). Tais estudos tiveram início na década de 90 e tinham como objetivo elucidar questões que envolviam o diagnóstico e a cura para inúmeras doenças. No ano de 2001, o artigo intitulado The Sequence of the Human Genome foi publicado por Venter et al. (2001), mostrando os resultados obtidos e, ainda, que cerca de 90% do genoma humano já havia sido sequenciado com 99% de precisão. A partir de então, uma revolução nas áreas biológicas aconteceu, a chamada “era pós-genômica”.

Contudo, para entender a função de todos os genes em um organismo, se faz necessário conhecer não só quais genes são expressos, mas também quais são os produtos dessa expressão e como são sintetizados. Assim, iniciou-se o deiniciou-senvolvimento dos estudos “ômicos”, como a transcriptômica, proteômica, metabolômica, metalômica, dentre outras, com o objetivo de uma maior e melhor compreensão de todo o RNA, proteínas, metabólitos e íons metálicos, respectivamente, presentes em determinado organismo (Gomez-Cabrero et al., 2014; Lay Jr. et al., 2006).

O termo proteoma foi proposto por Wilkins e Willians em 1994 (Wilkins e Willians, 1994) como sendo todo o conteúdo de proteínas expressas por um genoma, tecido, célula ou organismo. A comunidade científica percebeu que após a euforia provocada pelo sequenciamento do genoma humano e outros organismos, eram necessários outros estudos, pois enquanto o genoma de um organismo permanece estável, o proteoma por exemplo, é extremamente variável. Sendo assim, a área cientifica de estudo do proteoma de um organismo ficou conhecida como proteômica.

A proteômica é uma área em crescente desenvolvimento que examina todas as proteínas envolvidas em uma célula ou tecido e fornece informações importantes para complementar os estudos de transcriptômica e metabolômica (Patel, 2012). A avaliação de proteínas é essencial para compreender os processos biológicos que ocorrem em organismos sadios, doentes, e/ou geneticamente modificados. A análise de um proteoma, ou seja, do conjunto de proteínas que pode ser encontrada em uma célula ou organismo, vem sendo

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realizada em diferentes áreas do conhecimento e em diferentes matrizes biológicas. Nas áreas médicas, por exemplo, os pesquisadores buscam respostas para diferentes doenças e terapias, que vão desde a neurologia (depressão, esquizofrenia, Alzheimer) até doenças como o câncer (Sussulini, 2011; Zhang et al., 2014). Já a biologia, química, ciências agronômicas, entre outras, estudam multidisciplinarmente desde o proteoma humano até o animal e vegetal (Navarrete-Perea et al., 2014).

Dependendo do objetivo geral, a análise proteômica pode ser dividida em três diferentes áreas:

 Proteômica qualitativa - que tem como objetivo caracterizar e identificar um conjunto de proteínas presentes em uma determinada amostra. As abordagens mais comuns são peptide mass fingerprint (PMF) e peptide fragmentation fingerprint (PFF), ambas as abordagens necessitam de uma digestão enzimática das proteínas em peptídeos.

 Proteômica quantitativa – que tem como objetivo quantificar as proteínas entre diferentes amostras e/ou tratamentos da amostra de forma relativa. Isso pode ser feito baseado em gel, marcação das proteínas e também livre de marcação (label-free). A proteômica quantitativa é o foco deste trabalho e será discutida com maiores detalhes na sequência desse capítulo.

 Proteômica funcional – que estuda a interação proteína-proteína ou entre proteínas e outras moléculas de uma determinada amostra. A tecnologia de MS-imaging (do inglês – Mass Spectrometry imaging) vem sendo uma ferramenta importante para esse tipo de estudo, pois permite a observação da localização de proteínas até de suas isoformas (Ortea, et al., 2006). Entretanto, mesmo nos dias atuais, a análise proteômica é considerada um desafio analítico, uma vez que são necessárias basicamente etapas de extração, separação e identificação das proteínas.

O processo de extração das proteínas é crucial para um bom resultado, uma vez que quanto maior o número de proteínas puder ser extraído, com reprodutibilidade adequada e confiança, maiores são as chances de avaliar o proteoma total do organismo em estudo. Devido à complexidade de amostras vegetais, como a soja, protocolos de extração já estão muito bem definidos e

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consistem basicamente em ruptura celular por meio de maceração, ultrassom, radiação micro-onda, ou ainda, procedimentos que aumentem a solubilidade das proteínas com uso de detergentes. As próximas etapas contemplam a preservação das proteínas com consequente depleção de interferentes para isso, meios caotrópicos como uréia e tiouréia são utilizados, os quais proporcionam a ruptura das ligações proteicas e aumentam a interação com o meio extrator. A adição de inibidores de protease (fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) e o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)) é necessária ao protocolo de extração, pois minimiza a degradação das proteínas extraídas no decorrer das etapas do preparo de amostra. Essa etapa de preservação é essencial, pois tecidos vegetais apresentam elevado conteúdo de protease (Rabilloud & Lelong, 2011).

Como mencionado, a proteômica quantitativa foi foco deste trabalho e várias abordagens analíticas para tal podem ser utilizadas, dentre elas, as técnicas mais empregadas são baseadas na separação por eletroforese em gel (utilizada neste trabalho) (Barbosa et al., 2012; Clement et al., 2013; Collier et al., 2012; Valdez et al., 2013), eletroforese capilar (Simó et al., 2010) e cromatografia (Mataveli et al., 2012) e a identificação por espectrometria de massas (utilizada neste trabalho) (Clement et al., 2013; Collier et al., 2012; Déglon et al., 2012). A proteômica tem ido além da identificação de proteínas e leva em conta a precisão e a confiabilidade em quantificar as diferenças na abundância de proteínas em um organismo. Para isso muitos métodos de análise vêm sendo utilizados a partir de diferentes técnicas.

Dentre as técnicas de separação, a eletroforese é uma das mais empregadas para a separação de proteínas (Arruda et al., 2013; Rodrigues et al., 2012; Xu et al., 2008). A eletroforese 2 D em gel de poliacrilamida (2-D PAGE - do inglês two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis) foi desenvolvida em 1975 por O’Farrel (O’Farrel, 1975). A separação é realizada em duas etapas, as quais se baseiam em propriedades distintas das proteínas. Na primeira etapa, a focalização isoelétrica (IEF, do inglês - isoelectric focusing) é empregada para separar as proteínas de acordo seu ponto isoelétrico (pI), sendo este o pH no qual a molécula apresenta carga líquida igual a zero. A separação de acordo com o pI pode ser feita em fita pré-fabricada denominada IPG (immobilized pH

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gradient). Na segunda etapa, a fita de IEF é inserida no topo do gel de SDS-PAGE, havendo a separação por massa molecular.

Outro meio de separação, juntamente com a quantificação relativa de proteínas, é obtido por meio da técnica de 2-D DIGE (do inglês, two-dimensional difference gel electrophoresis), a qual foi desenvolvida por Unlu et al. (1997). Nesta técnica, misturas complexas de proteínas provenientes de amostras distintas são marcadas com corantes fluorescentes, por meio da ligação covalente entre o corante e as proteínas. Com isso, a técnica de 2-D DIGE apresenta algumas vantagens em relação à técnica de 2-D PAGE, como, por exemplo uma maior sensibilidade, que permite a detecção de proteínas pouco abundantes, a diminuição dos problemas de reprodutibilidade, e ainda, a redução do número de géis necessários para uma análise, uma vez que duas amostras distintas são analisadas em um único gel (Arruda et al., 2011).

Em estudos proteômicos, a identificação dessas proteínas previamente separadas e/ou quantificadas por 2-D DIGE é realizada por espectrometria de massas (MS – do inglês, mass spectrometry). Na prática, após efetuar a separação e quantificação relativa dos spots proteicos, realiza-se, primeiramente, a digestão das proteínas com tripsina, afim de que estas apresentem massas moleculares dentro da faixa de relação m/z (massa/carga) detectável pelo espectrômetro de massas. O tratamento dos dados gerados é realizado por meio de uma busca em banco de dados utilizando algoritmos específicos para a identificação das proteínas.

O sucesso da MS no campo de proteômica se deve, em grande parte, aos avanços na tecnologia de fontes de ionização e dos analisadores de massas. A MS é uma técnica analítica que permite discriminar íons de acordo com a relação m/z de cada espécie analisada. É importante ressaltar, que o que é avaliado em espectrometria de massas é a relação m/z e não a massa de um íon em Da (Daltons). Apenas para íons monocarregados a relação m/z reflete a massa do íon. Além de discriminar íons, a MS é capaz de contar a quantidade de íons numa determinada razão m/z. Para usar a MS como ferramenta em proteômica é necessário gerar os íons por meio de uma fonte de ionização, como eletrospray (ESI - do inglês, electrospray ionization) ou MALDI (do inglês, Matrix Assisted Laser Dessorption/Ionization), por exemplo, e ainda, discriminá-los por meio de analisadores de massas, que dentre os mais utilizados pode-se citar os de alta

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resolução como o TOF (do inglês, Time of Flight), o ICR (do inglês, Ion Ciclotron Ressonance) e o mais recente desenvolvido por armadilha de íons - Orbitrap.

Quando se trata de quantificação de proteínas por espectrometria de massas, muitos modos são encontrados na literatura, que incluem as técnicas hifenadas de LC-MS/MS e LC-SRM (do inglês, Liquid chromatography – Selected reaction monitoring) que é um método de quantificação que tem como alvo proteínas específicas, ou seja, deve-se conhecer de antemão as proteínas que se deseja quantificar. Esses modos podem ser combinados com diferentes métodos para a quantificação, que podem incluir a marcação de peptídeos isobáricos e isotópicos (iTRAP, do inglês - isobaric tags for relative and absolute quantification ou iCAP, do inglês – isotope-coded affinity tags) ou metabólica (SILAC, do inglês - stable isotope labeling by amino acids in cell culture).

Também pode ser realizada a quantificação de proteínas sem marcação (label-free), na qual não é necessária a modificação dos peptídeos ou proteínas com padrões isotópicos, exigindo, portanto, um preparo de amostra menos trabalhoso. Assim, as proteínas podem ser quantificadas por meio da correlação com as áreas dos picos obtidos por cromatografia ou por contagem no número de espectros dos peptídeos sequenciados por espectrometria de massas. O sinal analítico obtido é comparado com a abundância relativa das mesmas. Embora a contagem espectral seja simples, um pequeno número de contagens para proteínas presentes em baixa abundância fornece medições quantitativas menos robustas, devido às limitações estatísticas e de outros fatores, tais como a necessidade de limitar a taxa de falsa descoberta de modo a não "contar" espectros de baixa qualidade. Na quantificação label-free, qualquer variação no preparo de amostras, na reprodutibilidade, na eficiência de ionização e outras variáveis do instrumento pode conduzir a erros na análise (Xie et al., 2011). Contudo, esse método de quantificação pode ser considerado preciso e menos trabalhoso, já que dispensa o uso de géis ou de reagentes com elevado custo como isótopos, porém necessita de software específico e um cuidadoso trabalho por parte do analista.

Com relação à proteômica da soja, é possível encontrar vários estudos na literatura, no entanto, estudos comparativos entre soja T e NT ainda são escassos (Arruda et al., 2015; Barbosa et al., 2012; Mataveli et al., 2012; Natarajan et al., 2007). Neste sentido, Barbosa et al., (2012), estudaram, por

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meio de comparação proteômica, as sementes de soja transgênica e não-transgênica. Os resultados deste trabalho evidenciaram quatro spots proteicos com abundância diferentes, indicando que tais proteínas apresentaram abundâncias diferentes entre as amostras, provavelmente devido a modificação genética realizada na soja transgênica. Tal fato, foi confirmado pela identificação da proteína cp4EPSPS nas sementes de soja transgênica, característica da modificação genética, e ainda, foi possível identificar um total de 192 proteínas nessas sementes de soja, por meio da separação por 2-D PAGE e identificação por espectrometria de massas do tipo MALDI-TOF.

Com relação à segurança alimentar, ainda não há relatos científicos sobre os efeitos que a alimentação a base de organismos transgênicos pode causar. Todavia, Krzyzowska et al. (2010) relataram possíveis efeitos do triticale transgênico, investigando cinco gerações consecutivas de ratos. O triticale é um cereal resultante da hibridação do trigo e do centeio. Os resultados indicam que a utilização de triticale transgênico na alimentação dos roedores aumentou a concentração de glóbulos brancos no sangue e, ainda, a expansão de células B nos órgãos linfóides secundários.

Da mesma maneira, estudos sobre os efeitos que a transgenia pode provocar em plantas de soja cultivadas com sementes provenientes de uma mesma família, ou seja, em futuras gerações, ainda são escassos ou inexistentes, bem como nas sementes por essas plantas fornecidas. Assim o presente estudo é importante do ponto de vista de segurança alimentar, uma vez que os produtores de soja costumam guardar sementes obtidas de uma safra para plantar na safra seguinte.

1.2 OBJETIVOS

O objetivo principal desse capítulo foi o de investigar, de forma comparativa, os efeitos que o cultivo consecutivo pode causar em nível proteômico entre as sojas T e NT. Como objetivos específicos têm-se:

i. Plantar e cultivar as sementes de soja T e NT, em condições idênticas, até sua terceira geração;

ii. Realizar a extração, separação e quantificação relativa das proteínas de soja T e NT através da eletroforese bidimensional em gel de

(24)

poliacrilamida e eletroforese diferencial em gel de poliacrilamida (D PAGE e 2-D 2-DIGE);

iii. Identificar e caracterizar as proteínas diferenciais por espectrometria de massas (nLC-MS);

iv. Avaliar se houve alguma alteração diferencial e ao longo das gerações de sementes;

v. Investigar quais as funções das proteínas identificadas no metabolismo das sementes.

1.3 MATERIAIS E MÉTODOS

1.3.1 Reagentes e equipamentos

Todas as soluções foram preparadas com água deionizada de alta pureza (resistividade 18,2 MΩ cm) obtida a partir de um sistema deionizador de água Milli-Q, modelo DirectQ 5 (Millipore). Na secagem das amostras de semente de soja T e NT, usou-se uma estufa de secagem à 37 °C (Quimis).

Para o preparo da solução nutritiva utilizada no cultivo da soja, os sais utilizados foram: KH2PO4 (J. T. Baker), Ca(NO3)2.4H2O (Ecibra), KNO3 (Nuclear)

e MgSO4.7H2O (Carlo Erba).

Na extração das proteínas das sementes de soja os reagentes utilizados foram: Tris-HCl (GE Healthcare), KCl (Mallinckrodt), DTT (Ditiotreitol) (GE Healthcare), PMSF (Sigma Aldrich), SDS (GE Healthcare) e éter de petróleo (Mallinckrodt). Para a precipitação das mesmas, acetato de amônio (Mallinckrodt), metanol (J. T. Baker) e acetona (Merck) foram usados.

No preparo dos géis foram utilizados acrilamida, bis-acrilamida, SDS (dodecil-sulfato de sódio), tris-HCl, agarose, persulfato de amônio e TEMED (GE Healthcare). Para os demais procedimentos de análise foram utilizados os seguintes reagentes: Uréia, tiouréia, CHAPS e anfólitos pH 4-7 (GE Healthcare), kit de quantificação de proteínas 2-D Quant (GE Healthcare), óleo mineral (GE Healthcare), Comassie Blue (J. T. Baker), etanol (Synth), ácido acético (Synth), iodoacetamida – IAA, bicarbonato de amônio - AmBic (GE Healthcare) e acetonitrila (Sigma-Aldrich).

(25)

A separação das proteínas foi realizada em sistema de eletroforese modelo EttanTM Dalt six (GE Healthcare, Suécia) e posterior tratamento das imagens em Scanner, modelo Image Scanner (Amershan, Bioscience). As análises de identificação das proteínas foram realizadas em um espectrômetro de massas do tipo LTQ-Orbitrap (Thermo Scientific), equipado com fonte de nanoESI (Thermo Scientific). Entre outros equipamentos e materiais volumétricos utilizados, destacam-se balança analítica AX 200 7 (Shimadzu), ultrasonicador (modelo Qsonica Q700, potência 700 W) e micropipetas de 20 – 200 μL; 100 – 1000 μL e 1000 – 5000 μL (Eppendorf).

1.3.2 Cultivo das sementes de soja

As sementes de soja transgênica (T - variedade M7211 RR) e não-transgênica (NT - variedade MSOY 8200) foram gentilmente cedidas pela empresa Monsanto do Brasil.

O primeiro cultivo (sementes precursoras) para obtenção da segunda geração de sementes foi realizado entre os meses de janeiro a maio de 2014. Foram preparados 19 vasos para cultivar 3 sementes de soja T e 3 NT (por vaso), denominadas ST2 e SNT2 (segunda geração), respectivamente, em casa de vegetação pertencente ao Instituto de Biologia (IB) da Unicamp e em solo apropriado, que consistiu de uma mistura 1:1 de substrato (BasaplantTM) e vermiculita (AgroTM). As plantas foram irrigadas com água deionizada todos os dias e com solução nutritiva [consistindo de uma solução composta por KH2PO4

(0,136 g L-1_{), Ca(NO}₃₎₂_.4H₂_{O (11,8 g L}-1_{), KNO}₃_{(5,05 g L}-1_{) e MgSO}₄_.7H₂_{O (4,92}

g L-1_{)] a cada 3 dias após os cotilédones dessas plantas apresentarem cor}

amarelada (aproximadamente após 18 dias de cultivo). Após o décimo quinto dia de cultivo, foi realizado o desbaste, que consistiu em retirar as duas plantas menos desenvolvidas do meio, para que apenas uma crescesse e se desenvolvesse. Esse procedimento foi necessário, para que não ocorresse competição entre as sementes com relação aos nutrientes necessários para o seu crescimento, e assim minimizasse o estresse da mesma. Depois de aproximadamente 150 dias as sementes foram coletadas. Devido à alta umidade apresentada naquele período foi necessário realizar um controle químico com

(26)

um fungicida sistêmico (SCORE® 250 EC, 200 μl L-1_{), com objetivo de prevenir}

o aparecimento de fungos nas plantas.

O segundo cultivo para obtenção da terceira geração de sementes foi realizado entre os meses de janeiro a maio de 2015 em condições idênticas ao primeiro, com as sementes coletadas provenientes da segunda geração e que foram denominadas ST3 e SNT3 (terceira geração). Novamente, após aproximadamente 150 dias de cultivo as sementes foram coletadas.

1.3.2.1 Aspectos Éticos

Como nesse trabalho foram empregadas sementes de soja geneticamente modificada, é informado o número do registro do Certificado de Qualidade em Biossegurança: 240/2007, publicado em 24/07/2007, bem como todos os experimentos foram conduzidos em laboratório apropriado para manipulação de organismos transgênicos (classe I), que está certificado pela CIBio do IQ-UNICAMP.

1.3.3 Extração e separação das proteínas de Soja

O procedimento de extração foi realizado de acordo com Barbosa (2012), com algumas modificações. As sementes das três gerações de soja foram congeladas em nitrogênio líquido e, então, maceradas com o auxílio de pistilo e almofariz. Para cada 600 mg de soja moída, adicionaram-se 6 mL de éter de petróleo, e então, o solvente foi deixado em contato com a amostra, sob agitação, durante 10 minutos. O solvente foi removido e a amostra foi novamente macerada (este procedimento foi realizado 3 vezes). As proteínas foram extraídas pela maceração da amostra em banho de gelo com 6 mL de solução extratora (Tris-HCl 50 mmol L-1_{(pH 8,8), KCl 1,5 mmol L}-1_{, DTT 10 mmol L}-1_,

PMSF 1,0 mmol L-1_{e SDS 0,1% (m∕v)).}

O extrato proteico foi centrifugado durante 5 minutos à 4°C e 5000 g, para a remoção dos materiais insolúveis. O sobrenadante contendo as proteínas foi armazenado em microtubos a -20ºC. A precipitação das proteínas foi realizada com acetato de amônio 0,1 mol L-1_{em metanol, a fim de remover possíveis}

(27)

centrifugação durante 10 min à 4°C e 5000 g, e, em seguida, lavado com solução de acetona 80% (2 vezes) e etanol 70% (2 vezes), ambos gelados. Para a obtenção dos géis de eletroforese, o precipitado proteico foi ressolubilizado em tampão de hidratação [uréia 7 mol L-1_{, tiouréia 2 mol L}-1_{, CHAPS 2% (m/v) e}

anfólitos 0,5% (m/v)] em pH de 4-7, para a obtenção da quantidade de proteínas totais extraídas, que foi obtida por meio do kit 2D-Quant, de acordo com as instruções do fabricante.

Para a primeira dimensão da eletroforese utilizou-se uma fita de 13 cm com pH de 4-7, aplicando-se sobre a mesma, 250 µL de amostra que continha 500 µg de proteínas ressolubilizadas. Esta fita foi hidratada por 12h em temperatura ambiente com óleo mineral para, então, ser levada ao sistema focalizador, o qual foi programado da seguinte maneira: (1) 500 V até 500 Vh, (2) 1000 V até 800 Vh, (3)10000 V até 11300 Vh e (4) 10000 V até 2000 Vh.

Após a focalização, a fita foi equilibrada em duas etapas de 15 min cada, sendo a redução e alquilação das proteínas, com DTT e iodoacetamida, respectivamente. Após essa etapa a fita foi, então, fixada sobre um gel de poliacrilamida 12 % para a obtenção da segunda dimensão. A corrida da segunda dimensão foi realizada em duas etapas. Na primeira foi aplicado 90 V, 25 mA gel-1_{e 100 W durante 30 min e na segunda 250 V, 25 mA gel}-1_{e 100 W}

por aproximadamente 6 h. Por fim, as proteínas fixadas no gel foram fixadas com solução contendo 40 % (v∕v) de etanol e 10 % (v∕v) de ácido acético por 1h e, em seguida, reveladas empregando o corante Comassie Blue concentrado por 45 min. A remoção do corante foi realizada a partir de lavagens sucessivas com água deionizada por aproximadamente 3 dias.

O gel obtido foi escaneado e sua imagem analisada pelo programa de imagens ImageMaster 2D Platinum versão 6.0, que permite obter uma estimativa do número de spots obtidos no gel de eletroforese.

1.3.4 Quantificação relativa das proteínas de soja por 2-D DIGE

A extração das proteínas das sementes de soja provenientes das diferentes gerações para a quantificação relativa por 2 D-DIGE foram realizadas da mesma maneira descrita no item 1.3.3.; no entanto, a partir da primeira etapa

(28)

de separação a massa utilizada e marcada com os corantes CyDyeTM_DIGE

Fluors foi de 50 µg de proteínas para cada amostra e 50 µg de padrão interno (que consiste em 25 µg de cada amostra do grupo). Os corantes Cy2, Cy3 e Cy5 foram misturados com as proteínas de cada amostra, de forma que cada amostra fosse marcada com 400 pmol do corante selecionado. A reação foi feita à 4°C durante 30 min e foi cessada com 1 µL de lisina 10 mmol L-1_{durante 10 min (no}

escuro). As amostras (padrão interno marcado com Cy2 e duas amostras marcadas com Cy3 e Cy5) foram misturadas, e em seguida, levadas a um volume de 250 µL com tampão de hidratação (descrito anteriormente, item 5.3.) juntamente com 0,002% (m/v) de azul de bromocressol. A separação eletroforética ocorreu da mesma maneira descrita no item 5.3. As imagens dos géis foram obtidas por um scanner especifico para detectar a fluorescência dos corantes utilizados na marcação das amostras e a análise das imagens realizada com o programa DeCyderTM_{2D-Differential Analysis Softwere v7.0 (GE}

Healthcare), empregando o programa DIA (do inglês, differential in-gel analysis), que permite avaliar os spots diferenciais, em termos de abundância, entre as amostras marcadas com os corantes Cy3 e Cy5, sendo seus sinais normalizados pelo corante Cy2 (utilizado como padrão interno). Um fator de variação de 2,0 (100% de variação) foi empregado para determinar as proteínas diferenciais. A Figura 2 resume esse procedimento. Cada grupo de amostra foi avaliado em duplicata de acordo com a Tabela 1.

(29)

Figura 2. Procedimento experimental para a separação e quantificação relativa das

proteínas por 2-D DIGE. Adaptado de Galazzi, 2017.

Tabela 1. Marcação das amostras de soja e seu respectivo corante

Géis Grupo Cy2 Cy3 Cy5

1-2 T1G x NT1G T1G/NT1G T1G NT1G 3-4 T2G x NT2G T2G/NT2G T2G NT2G 5-6 T3G x NT3G T3G/NT3G T3G NT3G 7-8 T1G x T2G T1G/T2G T1G T2G 9-10 T1G x T3G T1G/T3G T1G T3G 11-12 T2G x T3G T2G/T3G T2G T3G 13-14 NT1G x NT2G NT1G/NT2G NT1G NT2G 15-16 NT1G x NT3G NT1G/NT3G NT1G NT3G 17-18 NT2G x NT3G NT2G/NT3G NT2G NT3G

Onde: T = transgênica; NT = não transgênica; 1, 2 e 3G = primeira, segunda e terceira geração, respectivamente.

1.3.5 Digestão com tripsina in gel das proteínas

Cada spot considerado diferencial em termos de abundância foi recortado do gel de poliacrilamida com o auxílio de uma ponteira de polietileno e colocado

(30)

em uma placa de ELISA. O processo de lavagem consistiu em agitação constante durante 1h com 100 μL de solução de lavagem [100% ACN:100 m mol L-1_{AmBic (1:1)] por três vezes. Os pedaços de géis foram desidratados com 100}

μL de acetonitrila (ACN) e reidratados com solução redutora (10 mmol L-1_{de DTT}

em 100 mmol L-1_{de AmBic) por 30 min à 56 °C. Após essa etapa, novamente,}

os pedaços de géis foram desidratados com 100 μL de ACN e reidratados com solução de alquilação (50 mmol L-1_{de IAA em 100 mmol L}-1_{de AmBic) por 30}

min na ausência de luz e em temperatura ambiente. Após essa etapa, foi realizada a desitradatação com ACN e, em seguida, realizou-se a etapa de digestão com solução de tripsina overnight à 37 °C. Após esse período, foram adicionados 200 μL de solução de extração [5% ácido fórmico:100% ACN (1:2)] e foi deixado sob agitação por 30 min (2x). O líquido sobrenadante foi coletado em microtubos. Os peptídeos extraídos foram secos em SpeedVac e armazedados em -80 °C até sua ressuspensão em 0,1% (v/v) de ácido fórmico para posterior análise por espectrometria de massas.

1.3.6 Identificação das proteínas

As análises das proteínas digeridas em peptídeos foram realizadas em um HPLC (do inglês – High Pressure Liquid Chromatography) de nano fluxo (Easy nLC, Thermo Fisher Scientific) acoplado on-line a um espectrômetro de massas do tipo QExactive [Orbitrap (Thermo Scientific)] com fonte de ionização nanoeletrospray (Proxeon). Os peptídeos foram carregados em uma coluna de fase reversa do tipo C18 (10 cm de comprimento e 75 μm de diâmetro interno) e separados através de um gradiente linear de 5-95% da solução B (0,1 % de ácido fórmico em ACN) com vazão de 20 μL min-1_{controlado por IntelliFlow durante}

120 min configurado para operar em modo de aquisição dependente de dados (DDA), contendo uma função de MS fullscan (m/z 200 a 2000). Os peptídeos foram ionizados em modo positivo com 2.1 kV em 250 °C. O espectrômetro de massas foi controlado pelo software XCalibur 2.0 (Thermo Scientific) e os dados foram processados no Proteome Discovery 2.0.

(31)

1.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

1.4.1 Plantio e Cultivo da soja

As variedades de sementes de soja MSOY 7211RR (T) e MSOY 8200 (NT) para obtenção da segunda geração de sementes foram plantadas no período de janeiro até maio do ano de 2014. A Figura 3 apresenta algumas imagens exibindo o desenvolvimento morfológico das plantas em seus diferentes estágios.

(32)

Figura 3. Desenvolvimento morfológico da soja: (A) germinação, (B) crescimento vegetativo, (C) florescimento, (D) desenvolvimento da vagem,

(33)

Por meio da Figura 3, nota-se que o plantio se mostrou adequado para o desenvolvimento das plantas e obtenção das sementes. Neste momento, é importante ressaltar que a solução nutritiva foi adicionada depois de aproximadamente 15 dias da emergência das plantas, pois as reservas nutritivas armazenadas nos cotilédones suprem as necessidades da planta jovem depois do estágio de emergência, ou até próximo estágio onde aparece o primeiro nó, com o objetivo de melhorar a nutrição da planta (IPNI, 2015). O controle químico aplicado foi eficiente para combater alguns fungos que foram observados com aproximadamente 40 dias de cultivo nas plantas, e, assim, a planta se desenvolveu normalmente.

Na Figura 4 é observado o estágio de florescência e a formação da vagem das plantas de soja T e NT. O cultivar MSOY 7211RR apresenta uma flor roxa, enquanto o cultivar MSOY 8200 a cor da flor é branca. Esta é a descrição morfológica mais segura para a diferenciação dos cultivares T e NT dessas variedades.

Figura 4. Plantas de soja no estágio de florescência (A) transgênica e (B)

não-transgênica.

Foi possível observar que as plantas T apresentaram uma maior produtividade, ou seja, maior quantidade de sementes por planta, além da maturidade completa da planta se dar em aproximadamente 20 dias antes das plantas NT.

(34)

Quanto ao segundo plantio, que iniciou em janeiro de 2015, para obtenção das sementes de terceira geração, a colheita foi realizada em maio de 2015 e os estágios pelos quais as plantas passaram foram semelhantes aos observados na Figura 2.

1.4.2 Separação das proteínas

A separação das proteínas extraídas das sementes de soja T e NT foi realizada de acordo aos procedimentos descritos por Barbosa (2011) e Sussulini (2007). A separação ocorreu por meio da técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (2-D PAGE), pois esta permite separar as proteínas de acordo com seu ponto isoelétrico em fita pré-fabricada em pH 4-7 e massa molecular, gerando assim, um perfil de proteínas representado por spots como representa a Figura 5. A primeira dimensão foi realizada em pH 4-7, pois em trabalhos anteriores foi observado um maior número de proteínas nessa faixa para sementes de soja (Barbosa, 2011 e Brandão et al., 2010).

(35)

Figura 5. Mapa proteico obtido por meio da técnica de separação de proteínas 2-D PAGE das sementes de soja (A) T e (B) NT de primeira

geração. MM significa a massa molecular e pH variando de 4-7.

(A)

(B)

pH pH 4 ₇ ₄ ₇ 200 116 97 66 45 31 21 14 6 MM

(36)

O perfil proteômico obtido para as três gerações e variedades de sementes é semelhante aos observados na Figura 5, e também, aos apresentados por Barbosa (2011) em seu trabalho de Tese, sendo que a separação foi considerada adequada para as análises por 2-D DIGE. Apesar do perfil muito semelhante entre as gerações e variedades de soja estudadas, um indicativo de que existem proteínas diferenciais entre as mesmas pode ser observado na Figura 6, onde o spot é mais intenso na amostra não-transgênica do que na transgênica, mostrando, assim, uma diferença no perfil químico das sementes.

Figura 6. Região ampliada do mapa proteico das sementes de soja segunda geração

para (A) e (C) não transgênica e (B) e (D) transgênica. (C) e (D) são imagens obtidas no programa em 3 dimensões.

(37)

1.4.3 Quantificação relativa das proteínas diferenciais por 2-D DIGE

A técnica de 2D-DIGE foi utilizada para a quantificação relativa das proteínas entre as sementes de soja T e NT e entre as gerações. O fator de diferenciação foi considerado como sendo ≥ 2,0, ou seja, 100% de variação, conforme determinado pelo programa de análise das imagens (software Decyder 2D). Na análise estatística, foi considerado um valor de p ≤ 0,1 de acordo com teste t de Student. A Figura 7 foi obtida no programa de tratamento das imagens e representa o gel obtido por 2-D DIGE para proteínas das sementes de soja de primeira geração. Os corantes fluorescentes quais realizaram a marcação das amostras como mencionado no item 1.3.5 dessa Tese, sofrem uma reação de substituição nucleofilica com o grupo Ɛ-amido dos resíduos de lisina para formar uma amida. Os corantes são positivamente carregados para compensar a carga da lisina que é perdida na reação de marcação. Aproximadamente 1-3% da concentração de cada proteína são marcadas por esta técnica, cada uma com uma única molécula do corante. Isso faz com que esta técnica seja extremamente dinâmica permitindo que todas as proteínas visualizadas sejam quantificadas (Barbosa, 2011).

(38)

Figura 7. Análise por 2-D DIGE (pH 4-7) para sementes de soja T e NT de primeira

geração. Spots marcados em azul representam maior abundância na amostra transgênica e spots marcados em vermelho representam maior abundância na amostra não transgênica.

Na Figura 7, observam-se spots marcados em azul. Esses representam proteínas menos abundantes marcadas com CY5, ou seja, na amostra NT1G (Tabela 1) e somam 9 nesta análise. Em vermelho, são proteínas mais

(39)

abundantes, também em CY5 e somam 14, num total de 25 proteínas diferenciais para esse grupo. O contrário é verdadeiro para o CY3, ou seja, para a amostra T1G. O spot marcado em amarelo mostra a abundância relativa entre a mesma proteína em diferentes amostras, ou seja, entre T e NT, por exemplo. Os outros 8 grupos estudados, como mencionado na Tabela 1, foram analisados da mesma maneira, e foi observado um total de 91 proteínas diferenciais ao todo. As Figuras encontram-se no anexo I. A Tabela 2 mostra esses resultados, sendo a quantidade total de proteínas diferenciais foram maior que 91, pois muitas das proteínas se repetem entre os grupos.

Tabela 2. Quantidade de proteínas diferenciais por grupo estudado

Grupo Número de proteínas diferenciais

T1G x NT1G 24 T2G x NT2G 19 T3G x NT3G 36 T1G x T2G 16 T1G x T3G 17 T2G x T3G 4 NT1G x NT2G 21 NT1G x NT3G 43 NT2G x NT3G 23

Por meio da Tabela 2, é possível observar que as diferenças proteicas entre as gerações de soja T foram menores do que entre a NT. Isso pode ser justificado devido ao fato da soja T poder ser considerada mais robusta, e, sendo assim, se adaptou melhor às pequenas variações climáticas ou de cultivo. As diferenças observadas entre T x NT das diferentes gerações não apresentam uma tendência em relação ao aumento da variação ou não. No entanto, considerando que a primeira geração, ou seja, a semente precursora, é proveniente de cultivo realizado em campo, e as demais de cultivo realizado em casa de vegetação, as variações observadas podem ser consideradas proveniente da mudança de solo, temperatura e umidade, por exemplo. Entretanto, se considerarmos somente a segunda e terceira geração (que foram

(40)

obtidas em condições idênticas de cultivo), pode-se estimar um aumento de proteínas diferenciais entre as sementes T e NT. Todas as proteínas diferenciais encontradas no grupo T são mais abundantes na 3G em relação a 2G, enquanto no grupo NT apenas 5, em um total de 23, são mais abundantes.

Em comparação ao trabalho desenvolvido por Barbosa (2011), que realizou o estudo comparativo entre sementes de soja T e NT por 2D-DIGE, o mesmo encontrou apenas 4 proteínas diferenciais; no entanto, as variedades das sementes não são as mesmas das utilizadas nesse trabalho, o que justifica o fato do número de proteínas diferenciais ser maior nesse estudo.

Com esses resultados, não é possível afirmar que tais mudanças sejam causadas inerentemente pela inserção do gene da transgenia na planta, mas pode-se estimar que a planta transgênica é mais resistente às variações ambientais naturais de cultivo que as plantas não-transgênicas.

1.4.4 Identificação das proteínas diferenciais por espectrometria de massas

Das 91 proteínas diferenciais observadas de acordo com o item 1.4.3, 72 puderam ter a análise realizada (devido à resolução do gel obtido) por um espectrômetro de massas do tipo LTQ-Orbitrap (Thermo Scientific) em parceria com o Dr. Tiago S. Balbuena da UNESP de Jaboticabal-SP. A Tabela 3 apresenta os resultados obtidos. A Figura 8 apresenta os spots marcados para a identificação e a região dos mesmos. A Tabela 3 e Figura 8 são complementares para o entendimento dos dados.

(41)

Figura 8. Gel 2-D marcado com cada spot considerado diferencial (fator de diferenciação > 2,0 e p-value > 0,01) entre os grupos de sementes de soja

(42)

Tabela 3. Identificação dos spots diferenciais (vide Figura 8) das sementes de soja T e NT de diferentes gerações por espectrometria de massas

do tipo LTQ-Orbitrap. Acesso = código da proteína; PSM = peptide spectrum match (número de espectro MS2 adquiridos para cada proteína); Variação = diferença entre a abundância dos spots no gel experimental.

T1G x NT1G Acesso Nome da proteína Score Cobertura PSMs MM

[kDa]

pI Variação

1 NR

2 NR

3 Glyma.12G213600.1.p Protease inhibitor/seed storage/LTP family (Tryp_alpha_amyl)

40,43 15,48 13 17,8 6,38 -5,13 4 Glyma.11G117300.1.p RNA recognition motif. (a.k.a. RRM, RBD, or RNP

domain) (RRM_1)

21,54 21,05 7 16,6 5,63 -3,08

5 NR

6 Glyma.01G095000.1.p KUNITZ FAMILY TRYPSIN AND PROTEASE INHIBITOR PROTEIN-RELATED

28,07 13,30 10 22,4 5,01 3,69

7 NI

78,72 17,24 25 22,6 7,24 -4,21 9 Glyma.08G341500.1.p KUNITZ FAMILY TRYPSIN AND PROTEASE

INHIBITOR PROTEIN-RELATED

12,10 8,76 4 24,1 5,11 2,06 10 Glyma.03G163500.3.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 76,66 15,76 23 43,4 5,22 -2,69

11 NR

12 Glyma.03G163500.4.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 54,92 9,02 18 54,6 5,38 2,30 13 Glyma.20G164700.1.p Chitinase / Poly-beta-glucosaminidase 22,1 10,21 8 37 5,08 -5,72 14 Glyma.13G223700.2.p Protein of unknown function (DUF1264) (DUF1264) 34,24 41,74 12 27,3 6,10 2,08 15 Glyma.02G012600.1.p Legume lectin domain (Lectin_legB) 37,92 17,19 12 30,9 6,05 2,18 16 Glyma.02G012600.1.p Legume lectin domain (Lectin_legB) 7,52 12,28 3 30,9 6,05 -2,23 17 Glyma.03G163500.3.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 14,7 10,34 3 43,4 5,22 -3,93 18 Glyma.03G163500.3.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 9,25 10,34 2 43,4 5,22 -3,08 19 Glyma.03G163500.5.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 130,02 13,94 33 55,7 6,23 -2,45 20 Glyma.03G163500.5.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 56,61 16,77 16 55,7 6,23 -3,87

(43)

21 Glyma.10G155300.1.p GLUCOSE AND RIBITOL DEHYDROGENASE HOMOLOG 1-RELATED

45,64 24,57 13 31,8 7,36 2,11 22 Glyma.20G148400.2.p Cupin (Cupin_1) 14,93 11,25 4 63,2 5,05 -2,93

23 NI

24 Glyma.13G291800.1.p COLD-REGULATED PROTEIN 15B 12,14 6,69 3 67,9 6,58 3,32

T2G x NT2G Acesso Nome da proteína Score Cobertura PSMs MM

[kDa]

pI Variação

28,07 13,30 10 22,4 5,01 -3,90

7 NI

11 NR

13 Glyma.20G164700.1.p Chitinase / Poly-beta-glucosaminidase 22,1 10,21 8 37 5,08 -5,41 21 Glyma.10G155300.1.p GLUCOSE AND RIBITOL DEHYDROGENASE

HOMOLOG 1-RELATED

45,64 24,57 13 31,8 7,36 -2,42 24 Glyma.13G291800.1.p COLD-REGULATED PROTEIN 15B 12,14 6,69 3 67,9 6,58 3,96

25 NR

26 NR

27 Glyma.01G177000.1.p CUPIN FAMILY PROTEIN 11,32 5,70 3 71,7 5,49 2,20 28 Glyma.09G185500.1.p Dehydrin (Dehydrin) 14,05 28,85 5 26,6 6,8 13,96 29 Glyma.20G146200.1.p Cupin (Cupin_1) 124,97 28,93 37 50,4 6,24 3,36 30 Glyma.12G159300.1.p Malate dehydrogenase / Malic dehydrogenase 9,32 7,54 3 36,1 8,12 -2,55 31 Glyma.20G148400.2.p Cupin (Cupin_1) 111,73 14,58 31 63,2 5,05 -5,65 32 Glyma.20G146200.1.p Cupin (Cupin_1) 93,16 22,1 28 50,4 6,24 -6,21 33 Glyma.20G146200.1.p Cupin (Cupin_1) 280,52 46,92 80 50,4 6,24 2,24 34 Glyma.20G148200.1.p Cupin (Cupin_1) 402,18 46,92 120 50,4 6,24 2,79 35 Glyma.20G146200.1.p Cupin (Cupin_1) 498 46,92 148 50,4 6,24 2,12 36 Glyma.13G149000.1.p LATE EMBRYOGENESIS ABUNDANT PROTEIN

(ATECP63)-RELATED

46,88 22,68 13 50,6 6,67 2,17 37 Glyma.13G291800.1.p COLD-REGULATED PROTEIN 15B 60,06 24,57 18 67,9 6,58 2,54

(44)

T3G x NT3G Acesso Nome da proteína Score Cobertura PSMs MM [kDa]

pI Variação

78,72 17,24 25 22,6 7,24 -3,45 10 Glyma.03G163500.3.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 76,66 15,76 23 43,4 5,22 3,97 12 Glyma.03G163500.4.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 54,92 9,02 18 54,6 5,38 -3,10 13 Glyma.20G164700.1.p Chitinase / Poly-beta-glucosaminidase 22,1 10,21 8 37 5,08 -4,72 17 Glyma.03G163500.3.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 14,7 10,34 3 43,4 5,22 -7,72 18 Glyma.03G163500.3.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 9,25 10,34 2 43,4 5,22 -20,92 19 Glyma.03G163500.5.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 130,02 13,94 33 55,7 6,23 -5,45 20 Glyma.03G163500.5.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 56,61 16,77 16 55,7 6,23 -4,33 22 Glyma.20G148400.2.p Cupin (Cupin_1) 14,93 11,25 4 63,2 5,05 -4,76

23 NI

24 Glyma.13G291800.1.p COLD-REGULATED PROTEIN 15B 12,14 6,69 3 67,9 6,58 4,83

26 NR

27 Glyma.01G177000.1.p CUPIN FAMILY PROTEIN 11,32 5,70 3 71,7 5,49 -3,16 29 Glyma.20G146200.1.p Cupin (Cupin_1) 124,97 28,93 37 50,4 6,24 3,14 31 Glyma.20G148400.2.p Cupin (Cupin_1) 111,73 14,58 31 63,2 5,05 -3,45 32 Glyma.20G146200.1.p Cupin (Cupin_1) 93,16 22,1 28 50,4 6,24 -2,43 33 Glyma.20G146200.1.p Cupin (Cupin_1) 280,52 46,92 80 50,4 6,24 -9,39 34 Glyma.20G148200.1.p Cupin (Cupin_1) 402,18 46,92 120 50,4 6,24 -6,19 35 Glyma.20G146200.1.p Cupin (Cupin_1) 498 46,92 148 50,4 6,24 -5,33 37 Glyma.13G291800.1.p COLD-REGULATED PROTEIN 15B 60,06 24,57 18 67,9 6,58 5,31

38 NR

39 Glyma.11G117300.1.p RNA recognition motif. (a.k.a. RRM, RBD, or RNP domain) (RRM_1)

21,54 21,05 7 16,6 5,63 -2,30

40 NR

41 Glyma.03G163500.4.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 54,92 9,02 18 54,6 5,38 3,65

(45)

43 Glyma.10G037100.1.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 40,24 11,9 11 63,8 5,29 3,57 44 Glyma.06G170900.2.p ELONGATION FACTOR 1-BETA 5,31 9,42 2 20,7 4,6 8,31 45 Glyma.10G037100.1.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 123,95 7,64 30 63,8 5,29 -3,63 46 Glyma.10G037100.1.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 569,22 25,58 119 63,8 5,29 -4,29 47 Glyma.03G163500.3.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 18,39 10,34 4 43,4 5,22 -6,60

48 NI

49 Glyma.20G148200.1.p Cupin (Cupin_1) 175,45 36,45 57 50,4 6,24 -8,17

50 NI

51 Glyma.10G064400.1.p LATE EMBRYOGENESIS ABUNDANT PROTEIN (ATECP63)-RELATEDLinksB Pm

87,5 35,63 27 48,8 6,42 2,76

52 NI

53 Glyma.10G246300.1.p Cupin 77,49 21,1 22 72,2 5,71 6,37

T1G x T2G Acesso Nome da proteína Score Cobertura PSMs MM

[kDa]

pI Variação

21,54 21,05 7 16,6 5,63 -2,30 16 Glyma.02G012600.1.p Legume lectin domain (Lectin_legB) 7,52 12,28 3 30,9 6,05 -2,78 17 Glyma.03G163500.3.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 14,7 10,34 3 43,4 5,22 -2,55 18 Glyma.03G163500.3.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 9,25 10,34 2 43,4 5,22 -2,43 24 Glyma.13G291800.1.p COLD-REGULATED PROTEIN 15B 12,14 6,69 3 67,9 6,58 2,46

38 NR

21,54 21,05 7 16,6 5,63 -2,83 47 Glyma.03G163500.3.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 18,39 10,34 4 43,4 5,22 -2,61

50 NI

54 Glyma.03G163500.5.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 46,63 10,91 19 55,7 6,23 -3,59 55 Glyma.01G177000.1.p CUPIN FAMILY PROTEIN 11,32 5,7 3 71,7 5,49 2,48

56 NR

(46)

58 Glyma.20G148400.1.p Cupin 97,11 10,58 24 70,3 5,17 -2,33

59 NI

60 Glyma.13G149000.1.p LATE EMBRYOGENESIS ABUNDANT PROTEIN (ATECP63)-RELATED

96,85 34,99 29 50,6 6,67 2,31

[kDa]

pI Variação

21,54 21,05 7 16,6 5,63 -5,03 10 Glyma.03G163500.3.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 76,66 15,76 23 43,4 5,22 -7,99 17 Glyma.03G163500.3.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 14,7 10,34 3 43,4 5,22 -2,17 18 Glyma.03G163500.3.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 9,25 10,34 2 43,4 5,22 -2,54 19 Glyma.03G163500.5.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 130,02 13,94 33 55,7 6,23 -3,15

38 NR

50 NI

51 Glyma.10G064400.1.p LATE EMBRYOGENESIS ABUNDANT PROTEIN (ATECP63)-RELATEDLinksB Pm

87,5 35,63 27 48,8 6,42 3,35 54 Glyma.03G163500.5.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 46,63 10,91 19 55,7 6,23 -7,16

59 NI

61 Glyma.09G185500.1.p Dehydrin (Dehydrin) 22,88 28,06 7 26,6 6,8 -3,35 62 Glyma.20G148400.2.p Cupin (Cupin_1) 18,01 5,9 4 63,2 5,05 -3,24 63 Glyma.03G163500.5.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 27,12 6,06 7 55,7 6,23 -3,53 64 Glyma.20G148200.1.p Cupin (Cupin_1) 358,57 46,92 102 50,4 6,24 -4,63 65 Glyma.20G146200.1.p Cupin 161,08 45,33 44 50,4 6,24 -5,04 66 Glyma.20G148200.1.p Cupin (Cupin_1) 269,99 46,92 76 50,4 6,24 -2,69 67 Glyma.13G291800.1.p COLD-REGULATED PROTEIN 15B 176,84 34,37 49 67,9 6,58 3,17

[kDa]

pI Variação

33 Glyma.20G146200.1.p Cupin (Cupin_1) 280,52 46,92 80 50,4 6,24 2,37 34 Glyma.20G148200.1.p Cupin (Cupin_1) 402,18 46,92 120 50,4 6,24 2,01

(47)

52 NI

68 NI

NT1G x NT2G Acesso Nome da proteína Score Cobertura PSMs MM

[kDa]

pI Variação

78,72 17,24 25 22,6 7,24 2,34 12 Glyma.03G163500.4.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 54,92 9,02 18 54,6 5,38 -3,24 17 Glyma.03G163500.3.p 12S SEED STORAGE PROTEIN CRA1-RELATED 14,7 10,34 3 43,4 5,22 2,03 21 Glyma.10G155300.1.p GLUCOSE AND RIBITOL DEHYDROGENASE

HOMOLOG 1-RELATED

45,64 24,57 13 31,8 7,36 -2,15 35 Glyma.20G146200.1.p Cupin (Cupin_1) 498 46,92 148 50,4 6,24 -2,57

38 NR

57 NR

64 Glyma.20G148200.1.p Cupin (Cupin_1) 358,57 46,92 102 50,4 6,24 -4,06 65 Glyma.20G146200.1.p Cupin 161,08 45,33 44 50,4 6,24 -4,32 67 Glyma.13G291800.1.p COLD-REGULATED PROTEIN 15B 176,84 34,37 49 67,9 6,58 2,33

69 NR

70 NR

5,44 13,92 2 18,4 5,34 3,48

72 NI

9,04 15,82 3 18,4 5,34 3,08

74 NI

31,52 13,92 11 18,4 5,34 2,06

76 NR

77 NR

78 NR

79 Glyma.13G149000.1.p LATE EMBRYOGENESIS ABUNDANT PROTEIN (ATECP63)-RELATED