UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE ODONTOLOGIA
AVALIAÇÃO COMPARATIVA DA CINÉTICA E LIBERAÇÃO MOLECULAR DE MEMBRANAS DE FIBRINA RICA EM PLAQUETAS DE DIABÉTICOS E DE
PACIENTES SAUDÁVEIS
Niterói 2018
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE ODONTOLOGIA
AVALIAÇÃO COMPARATIVA DA CINÉTICA E LIBERAÇÃO MOLECULAR DE MEMBRANAS DE FIBRINA RICA EM PLAQUETAS DE DIABÉTICOS E DE
PACIENTES SAUDÁVEIS
JOÃO FILIPE PEREIRA COSTA
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre, pelo Programa de Pós-Graduação em Odontologia.
Área de Concentração: Clínica Odontológica
Orientador: Prof. Dr. Ronaldo Barcellos de Santana
Niterói 2018
Prof. Dr. Ronaldo Barcellos de Santana
Instituição: Faculdade de Odontologia da UFF
Decisão: _________________________Assinatura: ________________________ Prof. Dr. Luiz Antônio Pugliesi Alves de Lima
Instituição: Faculdade de Odontologia da USP
Decisão: _________________________Assinatura: ________________________
Prof. Dr. Gutemberg Gomes Alves Instituição: Instituto de Biologia da UFF
Decisão: _________________________Assinatura: ________________________
Prof. Dr. Carolina Miller Mattos de Santana Instituição: Faculdade de Odontologia da UFF
Costa JFP. Avaliação Comparativa da Cinética e Liberação Molecular de Membranas de Fibrina Rica em Plaquetas de Diabéticos e de Indivíduos Saudáveis [Dissertação]. Niterói: Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Odontologia; 2018.
Entre as consequências metabólicas bem conhecidas do diabetes, preocupações foram levantadas em relação aos seus efeitos deletérios sobre o metabolismo mineral e ósseo. Estudos experimentais demonstraram um impacto negativo significativo da diabetes na formação óssea em defeitos ósseos experimentais, bem como a regeneração óssea retardada em cavidades de extração. O objetivo do presente estudo foi avaliar a composição molecular e o perfil de liberação de citocinas das preparações de PRF de diabéticos em comparação com indivíduos sistemicamente saudáveis.
O objetivo do presente estudo foi avaliar a composição molecular e o perfil de liberação de citocinas das preparações de PRF de diabéticos em comparação com
indivíduos sistemicamente saudáveis.
Para analisar a dinâmica da liberação de citocinas e fatores de crescimento, no primeiro dia após a polimerização da fibrina, cada membrana foi incubada em placas de cultura de 6 poços. Alíquotas dos extratos foram coletadas após 7, 14 e 21 dias de cultivo, por completa remoção e substituição com igual volume de meio fresco. Para a detecção de biomoléculas, um imunoensaio multiparamétrico baseado em microesferas magnéticas marcadas com xMAP (LuminexCorp®, EUA). Níveis plasmáticos basais de MIP-1B, MCP-1, IFN-y, IL-1RA, EOTAXIN, PDGF-BB foram significativamente aumentados em amostras do grupo diabetes em comparação com controles. Entre estes, IL-1RA, Eotaxina e MCP-1 não foram detectados nos controles e detectados apenas no grupo experimental. Curiosamente, em contraste, GM-CSF, VEGF, IL-13 e IL-8 foram significativamente reduzidos em amostras de soro de diabéticos em comparação com controles. Conclui-se que a PRF promove a incorporação e liberação gradual controlável de moléculas bioativas circulantes, mantendo sua atividade por até 14 dias, sendo que, em pacientes diabéticos as concentrações de diversos analitos se encontram significativamente diferentes.
recebem membranas de PRF, a fim de melhor caracterizar sua composição molecular e o impacto potencial sobre a bioatividade e o potencial regenerativo desses materiais.
Palavras-chave: biomateriais, enxerto ósseo, regeneração óssea, preservação do rebordo
(Costa JFP.) Comparative Evaluation of Molecular Kinetics and Release of Platelet Rich Fibrin Membranes from Diabetics and Normal Individuals. [dissertation]. Niterói: Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Odontologia; 2018.
Among the well-known metabolic consequences of diabetes, concerns have been raised regarding its deleterious effects on bone and mineral metabolism. Experimental studies have demonstrated a significant negative impact of diabetes on bone formation in experimental bone defects as well as delayed bone regeneration in extraction sockets. The goal of the present study was to evaluate the molecular composition and cytokine release profile of PRF preparations from diabetics in comparison with systemically healthy individuals.
To analyze the dynamics of the release of cytokines and growth factors, on the first day after fibrin polymerization, each membrane was incubated in 6-well culture plates. Aliquots of the extracts were collected after, 7, 14, and 21 days of culture, by complete removal and substitution with an equal volume of fresh medium. For the detection of biomolecules, a multiparametric immunoassay based on xMAP-labeled magnetic microbeads (LuminexCorp®, USA). Baseline plasma levels of MIP-1B, MCP-1, IFN-y, IL-1RA, EOTAXIN, PDGF-BB were significantly increased in samples from the diabetes group in comparison with controls. Among these, IL-1RA, Eotaxin and MCP-1 were not detected on controls and detected only on the experimental group. Interestingly, in contrast, GM-CSF, VEGF, IL-13 and IL-8 were significantly reduced in serum samples of diabetics in comparison with controls. It is concluded that PRF promotes the incorporation and gradual controllable release of circulating bioactive molecules, while keeping their activity for up to 14 days, being that in diabetic patients the concentrations of several analytes are significantly different. Careful evaluation of the metabolic status of patients receiving PRF membranes is recommended in order to better characterize its molecular composition and the potential impact on the bioactivity and regenerative potential of these materials. Key words: biomaterials, bone graft, bone regeneration, ridge preservation
1. INTRODUÇÃO
No processo de cicatrização e neoformação dos tecidos, a fibrina apresenta importante função na agregação plaquetária para a formação do coágulo sanguíneo e hemostasia.20 Estudos vem apresentando fatores favoráveis no
processo de cicatrização com o uso do PRF nos procedimentos cirúrgicos, porém sem muitas evidências clínicas sobre os fatores biológicos inflamatórios deste biomaterial.15
Dentre os materiais utilizados em procedimentos regenerativos estudados na atualidade na odontologia, com o intuito de acelerar o processo cicatricial, uma nova geração de derivados sanguíneos foi relatada primeiramente na França, no início dos anos 2000, por Choukroun et al..15 Inicialmente utilizados em cirurgias orais e maxilo-faciais, o PRF apresenta vantagens em sua preparação e utilização nos procedimentos cirúrgicos se comparado aos adesivos de fibrina, ao Concentrado de Plasma Rico em Plaquetas (CPRP), entre outros aditivos cirúrgicos que requerem manipulação bioquimica, maior custo e dificuldades no processo de produção.29
A partir da descrição da técnica e uso do PRF, algumas variações foram estudadas no intuito de aprimoramento e favorecimento da sua utilização em conjunto com biomateriais em processos regenerativos.47 Surgiram dessa maneira o Coágulo Avançado de Fibrina Rica em Plaquetas ( a-PRF).29 e a Fibrina Rica em Plaquetas Injetável (i-PRF)63.
O surgimento de um ferimento no ser humano, desencadeia uma série de reações celulares e bioquímicas em cascata objetivando o processo reparatório do tecido, porém pacientes com Diabetes Melittus, que se caracteriza por um grupo de doenças metabólicas que se evidenciam pela hiperglicemia e diversas complicações, disfunções e insuficiência de vários órgãos, apresentam um retardamento desse processo cicatricial.28
Em especial, na Diabetes Tipo 1 que atinge principalmente crianças e adolescentes, na maioria dos casos as células beta são destruídas no pâncreas em uma reação autoimune, dessa maneira o organismo deixa de produzir insulina e estes pacientes se tornam dependentes da administração de insulina exógena que deve ser aplicada diariamente.53;25;93
Entre as bem conhecidas consequências metabólicas do diabetes, foram levantadas preocupações quanto aos seus efeitos deletérios no metabolismo ósseo e mineral.78 Estudos experimentais demonstraram um impacto negativo significativo do diabetes na formação óssea em defeitos ósseos experimentais80, bem como a regeneração
óssea retardada em cavidades de extração19, inibiram a integração óssea de implantes25 e maior variabilidade de desfechos e um aumento na taxa de complicações infecciosas após procedimentos de regeneração óssea guiada73 em animais com diabetes tipo 1, ilustrando assim os possíveis efeitos negativos do diabetes na consolidação óssea relacionada à terapia com implantes. Tem sido sugerido que a aplicação contínua de fatores de crescimento, como o fator de crescimento de fibroblastos 2, pode facilitar a osseointegração e a consolidação óssea em condições de osteogênese local e sistemicamente inibida, como a encontrada no diabetes.78 Assim, a entrega local controlada controlada de substâncias biologicamente ativas pode estimular a regeneração óssea e compensar os efeitos inibitórios da diabetes na cicatrização óssea.78 Terapias biologicamente melhoradas podem oferecer benefícios clínicos significativos, aumentando a capacidade de cura endógena de defeitos ósseos, aumentando a taxa e a quantidade total de formação óssea e, finalmente, resultando em regeneração óssea significativamente melhorada, especialmente em situações de cicatrização local ou sistemicamente inibida, como a observada em diabetes mellitus.79 Os concentrados de plaquetas têm sido utilizados para procedimentos regenerativos em vários campos da medicina, incluindo odontologia, cirurgia reconstrutiva, cirurgia plástica e dermatologia, para fornecer doses suprafisiológicas de fatores de crescimento autólogos diretamente aos tecidos do hospedeiro.60 Esses fatores de crescimento têm demonstrado ser quimiotáticos para vários tipos de células, incluindo monócitos, fibroblastos, células endoteliais, células-tronco e fibroblastos, criando microambientes teciduais e influenciando diretamente a proliferação e
A fibrina rica em plaquetas (PRF)20 é um concentrado de plaquetas de segunda geração, preparado a partir de sangue centrifugado. O PRF é um coágulo de fibrina rico em plaquetas sem adição de trombina durante a preparação, uma vez que a trombina pode ter efeito tóxico nas células do corpo.45 O PRF deriva de uma polimerização natural e progressiva que ocorre durante a centrifugação. Um modo de polimerização progressiva ou relativamente lenta pode aumentar a incorporação das citoquinas circulantes nas malhas de fibrina. O fator de crescimento derivado de plaquetas e o TGF-α foram identificados na PRF.20 Hipotetiza-se que o PRF tenha uma estrutura natural de fibrina e possa proteger os fatores de crescimento da proteólise56, portanto, essas moléculas solúveis podem ser aprisionadas nas malhas de fibrina da PRF e podem ser liberadas gradualmente e controláveis, mantendo sua
atividade por um período relativamente longo.41
Em procedimentos médicos, o uso de FRP tem sido combinado principalmente para o manejo bem-sucedido de úlceras difíceis de cicatrizar, incluindo as úlceras do pé diabético.55 No entanto, tem sido relatado que alterações na presença extracelular de citocinas pró-inflamatórias e fatores de crescimento em tecidos diabéticos podem retardar a proliferação e diferenciação de células progenitoras mesenquimais e osteoblastos no processo de osseointegração.16
A tecnologia dos ensaios Multiplex se mostram como uma importante ferramenta para identificação e quantificação de citocinas e fatores de crescimento em sobrenadante de meios de cultura. As análises Multiplex foram desenvolvidas a partir do método tradicional ELISA, estando disponíveis em diversos formatos com base na utilização de citometria de fluxo, quimioluminescência, e a tecnologia de matriz, apresentando diversas vantagens em relação ao método tradicional como o alto rendimento, menor requisito de volume das amostras, maior eficiência, realizar medidas repetidas dos painéis em condições semelhantes aos ensaios experimentais.69
2. PROPOSIÇÃO
Atualmente, não se sabe se o diabetes modula a composição molecular do PRF e, portanto, influencia de alguma forma o potencial regenerativo dessas preparações. O objetivo do presente estudo foi avaliar a composição molecular e o perfil de liberação de citocinas das preparações de PRF de diabéticos em comparação com indivíduos sistemicamente saudáveis.
3. MATERIAL E MÉTODOS
Esta pesquisa foi conduzida de acordo com as diretrizes da Declaração da Associação Médica Mundial de Helsinque (versão VI, 2002), após a aprovação do estudo e consentimento pelo Comitê de Ética em Pesquisa da SUPREMA- Sociedade Universitária para o Ensino Médico Assistencial LTDA (CAAE: 66912517.4.0000.5103). Foram incluídos no estudo voluntários com diagnóstico de DM1 confirmado a pelo menos 1 ano, sem ter passado por qualquer tipo de controle periodontal ambulatorial nos últimos 6 meses, sem ter passado por uso de antibióticos nos últimos 4 meses, não apresentar infecções ativas, aceitar a participação no estudo e assinar o Termo de Consentimento Informado, ausência de qualquer lesão óssea na cavidade oral, condições médicas básicas favoráveis.
Foram excluídos os voluntários com rejeição do formulário de consentimento informado a qualquer momento durante o estudo, pacientes fumantes, apresentação de hábitos parafuncionais, gravidez, radioterapia local na cavidade oral, quimioterapia; doenças renais, fígado e/ou sangue, imunossupressão, uso de corticosteroides ou bisfosfonatos, doenças mucocutâneas envolvendo a cavidade oral, o consumo excessivo de álcool ou uso diário, alergia(s) ou problema(s) sistêmico(s), tais como HIV, HPV, problemas neurológicos ou outros problemas que impedem o tratamento e má higiene oral.
Todos os pacientes assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido. Foi realizado exame clínico periodontal, em seis pontos em cada dente (Fig.1), através do qual obteve-se os seguintes parâmetros: Índice de Placa visível 1, Índice de Sangramento Sulcular24, profundidade clínica de sondagem e recessão gengival17 com uma sonda periodontal milimetrada (CP 15 University oh North Carolina PCPUNC 156, Hu-friedy. Chicago - EUA).
Figura1: Identificação de presença de placa bacteriana visível (PB) e pontos de sondagem periodontal: Disto-vestibular (DV), Vestibular (V), Mésio-vestibular (MV), Disto-lingual (DL), Lingual (L), Mésio-lingual (ML).
Os participantes foram orientados quanto aos procedimentos que seriam realizados, os riscos e benefícios da participação no estudo. Assim estes assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido e se comprometeram a realizar jejum de aproximadamente 10 horas para realização da coleta das amostras de sangue.
Coleta sanguínea:
O procedimento de coleta foi realizado com antissepsia do local de escolha para realização da punção em veia basílica mediana ou veia cefálica de acordo com a melhor disponibilidade de acesso de acordo com o protocolo de confecção do PRF, no laboratório da Faculdade de Ciências Médicas e da Saúde de Juiz de Fora FCMS/JF (SUPREMA).
Foram coletados 3 tubos (DryVacutube, Biocon, Brasil) para a realização das análises previstas. Um tubo contendo EDTA e 1 tubo siliconizado foram coletadaos para realização dos exames de rotina de avaliação do controle sistêmico (hemograma, glicose, hemoglobina glicada, proteína C-reativa, triglicérides e colesterol e frações) além da quantificação basal das interleucinas e fatores de
crescimento em soro. Em um terceiro tubo de vidro siliconizado de 9ml, foi realizada centrifugação e produção da membrana de fibrina1.
Preparação e incubação das amostras:
Após a coleta, o tubo para PRF foi levado à centrífuga com rotor de ângulo fixo 45º (Montserrat 80-2B, Brasil) respeitando o protocolo de 10 minutos de centrifugação a 3000rpm com aproximadamente 400g de força1. No tubo pós centrifugação pôde ser observada a separação do conteúdo em três porções, sendo estas: a porção superior o plasma pobre em plaquetas (PPP), a camada intermediária constituindo o PRF e a camada inferior contendo o corpúsculo de sangue residual8(Fig. 2A). Após a centrifugação o coágulo de fibrina foi recolhido e recortado com o auxilio de uma pinça clínica e uma tesoura estéril (Fig. 2B) e imediatamente colocado em um dos poços das placas de cultivo de 6 poços (TPP, EUA), em presença de 4 ml de meio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, GIBCO, EUA), sem uso de antibióticos, em atmosfera úmida a 37°C e 5% de CO2 (Fig. 3A). Esse procedimento foi repetido para as amostras dos 12 indivíduos do estudo.
Figura 2: A- Separação do PRF ainda no tubo após a centrifugação. B- Remoção do PRF com o auxílio de uma pinça clínica e tesoura.
Eluição in vitro de citocinas e fatores de crescimento:
As placas para cultura foram incubadas em atmosfera úmida 37ºC e 5% de CO2 em estufa (Fanem® 502, Brasil) (Fig. 3C). Alíquotas dos extratos foram coletadas (Fig. 3B) após 24 horas, 7 dias e 14 dias de cultura, acondicionadas em micro tubos de 1ml e armazenadas em freezer a -80°C.
Figura 3: A-Colocação de 4ml do meio de cultura em cada um dos poços com o PRF. B- Coleta do meio de cultura de um dos poços após 24hs de incubação. C- Placas em estufa regulada à 37ºC. D- Micro tubos organizados em caixa para congelamento.
Análise Luminex - Quantificação de Citocinas, Quimiocinas e Fatores de Crescimento
As concentrações de citocinas e fatores de crescimento liberados pelas membranas foram mensuradas através da análise de meios condicionados coletadas após 24 horas, 7 dias e 14 dias de cultura. Para a detecção das biomoléculas foi utilizado um imunoensaio multiparamétrico baseado em micropérolas magnéticas marcadas com a tecnologia XMap (LuminexCorp®, EUA), através de um kit comercial (27-plex panel, Biorad Inc., EUA). Vinte e cinco citocinas, fatores de crescimento e quimiocinas eluídas de membranas de PRGF foram
quantificados por meio de um kit comercial (27-plex panel, Biorad) e divididos em: citocinas pró- inflamatórias (IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-a, IFN-g, IL-2, IL-7, IL-12p70, IL-15 e IL-17A), citocinas anti-inflamatórias (IL-1Ra, IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13), quimiocinas (eotaxina, IP-10, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b e RANTES), fatores de crescimento angiogênicos (VEGF) e fatores de crescimento (bFGF, VEGF, GM-CSF e PDGF- BB).
O protocolo de preparo foi seguido de acordo com o fabricante, sendo adicionadas as micro esferas para cada poço, além dos anticorpos de primeira passagem e a placa permaneceu em agitação por um período aproximado de 24hs. Após esse intervalo, a placa é adaptada em mesa magnética própria que mantém as micro esferas para lavagem das amostras (Fig. 5). Nesse momento os anticorpos ligados às esferas, também ja se ligaram aos fatores de crescimento e citocinas, se mantendo na placa por atração magnética mesmo com a remoçao de todo o conteúdo líquido dos poços. Após a lavagem, os anticorpos de segunda passagem são adicionados e agitados por aproximadamente 2 horas, para permitirem a quantificação dos analitos encontrados.
Figura 5: Solução de lavagem sendo adicionada à placa adaptada em superfície magnética.
Com o uso de pipetas e ponteiras descartáveis, as amostras foram adicionadas à placa sendo mapeada de acordo com as identificações de linhas e colunas dos seus 96 poços (Fig. 4)
Figura 4: Placa Luminex com 96 poços
O sistema BioPLex MAGPIX (Biorad) foi utilizado para quantificar as esferas magnéticas e respectivas dosagens foram analisados com o software Xponent v. 3.0 (Luminexcorp®, EUA).
Comparação da quantidade de fatores de crescimento do Plasma Rico em Fatores de Crescimento obtidos de indivíduos sistemicamente saudáveis e diabéticos
Para esta análise, foi realizado o cálculo de Fold-change com a razão da diferença entre as concentrações de citocinas e fatores de crescimento presentes nos meios condicionados dos grupos experimental e controle, de acordo com a fórmula:
Fold-Change = (Conc. controls – Conc. test)/Conc. controls
Apenas foram consideradas como de significância estatística as diferenças que apresentavam p<0.05 (Teste T-Student).
4. RESULTADOS
A concentração média de fatores de crescimento e mediadores imunológicos em amostras de plasma sanguíneo de participantes diabéticos e de controlo antes da produção das membranas PRF está apresentadas na Tabela 2. Os níveis plasmáticos de base de MIP-1B, MCP-1, IFN- y, IL-1RA, EOTAXINA, PDGF-BB foram significativamente aumentadas em amostras do grupo diabético em comparação com controles. Entre estes, IL-1RA, Eotaxina e MCP-1 não foram detectados nos controles e detectados apenas no grupo experimental. Curiosamente, em contraste, GM-CSF, VEGF, IL-13 e IL-8 foram significativamente reduzidos em amostras de soro de diabéticos em comparação com os controles. Várias biomoléculas, como IL-6, TNF-α, IL-2, IL-1B, IL-4, MIP-1a, G-CSF e IL-15 não foram detectadas no início do estudo em amostras de soro de ambos os grupos.
Tabela 2. Concentração plasmática média dos fatores de crescimento e mediadores imunológicos nas amostras de sangue dos participantes diabéticos e controle antes da produção das membranas de PRF.
CONTROL DIABETES MIP-1B 0.58 ± 0.5 2.43 ± 0.75 * IL-6 N.D. N.D. IFN-? 62.12 ± 4.68 770.42 ± 120.12 * IL-1RA N.D. 1111.71 ± 98.16 a IL-5 0.621 ± 0.21 N.D. a GM-CSF 27.53 ± 3.64 3.97 ± 2.87 * TNF-? N.D. N.D. RANTES 390.67 ± 37.31 496.43 ± 127.31 IL-2 N.D. N.D. IL-1? N.D. N.D. EOTAXIN N.D. 188.74 ± 30.68 a FGF-2 17.45 ± 16.13 39 ± 9.81 VEGF 192.9248 ± 67.88 58.23 ± 25.98 * PDGF-BB 1256.956 ± 253.25 2349.12 ± 307.31 * IP-10 893.6885 ± 152.25 1027.12 ± 534.81 IL-13 69.82 ± 28.55 N.D. a IL-4 N.D. N.D. MCP-1 N.D. 64.58 ± 7.98 a IL-8 68.41 ± 29.11 2.26 ± 2.01 * MIP-1A N.D. N.D. IL-10 2.51 ± 2.50 14.72 ± 10.23 G-CSF N.D. N.D. IL-15 N.D. N.D. IL-7 160.61 ± 13.4 138.48 ± 21.46 IL-12 21.12 ± 1.10 50.97 ± 35.99
Resultados (pg / mL) representados como média ± D.P. (n = 6 participantes por grupo). N.D .: Não detectável. * diferença significativa entre os grupos (p <0,05). uma diferença significativa considerando N.D como zero.
Liberação de fator de crescimento e moléculas imunomoduladoras
A avaliação das citocinas e fatores de crescimento liberados pelas membranas PRF em meios de cultura ao longo de um período de 14 dias é mostrada na Figura 1. É possível observar que, nas primeiras 24 horas, o material já era capaz de liberar quantidades consideráveis de moléculas modulatórias, incluindo fatores de crescimento (VEGF, PDGF e b-FGF), citocinas pró-inflamatórias, tais como (IL-8, IL-7, IL-13, IP-10, IFNy, IL-12p70 e TNF-y), bem como como o antagonista anti-inflamatório IL1RN. Quimiocinas de relevância na reparação
tecidual (RANTES, GM-CSF, MIP-1a) também foram liberadas. Após 24 horas, as membranas de diabéticos liberaram significativamente mais IL-1RA, IFNy, IL-12p70 e Eotaxina, no entanto, níveis reduzidos de IL-7 e MIP-1a também foram detectados. Não foram detectadas diferenças nas quantidades de VEGF, PDGF-BB, FGF-2, GM-CSF, RANTES e IP-10. Após sete dias, as membranas de diabéticos liberaram significativamente mais IL-1RA, IFNy, IL-12p70, VEGF, IL-6, IL-8, IL-7 e MIP-1a e níveis semelhantes de PDGF-BB, GM-CSF, RANTES e IP-10. Após catorze dias, as membranas de diabéticos libertaram significativamente mais IL-6, IL-8, RANTES, IP-10 e 1a e níveis semelhantes de VEGF, PDGF-BB, GM-CSF. IL-8, IP-IP-10 e MIP-1a foram liberados de membranas derivadas apenas de diabéticos por 14 dias. Curiosamente, apenas a IL-1beta, a MCP-1 e a MIP-1b não puderam ser detectadas em nenhum grupo ao longo da duração do estudo. Em contraste, apenas o VEGF, PDGF-BB GM-CSF e RANTES foram libertados das membranas derivadas de ambos os grupos ao longo da duração do estudo.
Figura 1. Eluição de fatores de crescimento, quimiocinas e citocinas inflamatórias das membranas de FRP de participantes diabéticos e controles após 1, 7 e 14 dias de incubação em meio de cultura. O mapa de calor representa concentrações médias (n = 6 participantes por grupo) por intensidade de cor. Um asterisco representa diferença significativa entre os grupos controle e diabético no mesmo tempo de eluição (teste t pareado, p <0,05).
1 d a y 7 d a y s 1 4 d a y s V E G F P D G F -B B b F G F G M -C S F IL -1 R A IL -1 b e ta IL -6 IF N y IL -8 IL -1 2 p 7 0 IL -1 3 IL -7 R A N T E S E o ta x in IP -1 0 M C P -1 M IP -1 a M IP -1 b C O N T R O L p g /m L 0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 2 5 0 0 3 0 0 0 3 5 0 0 4 0 0 0 1 d a y 7 d a y s 1 4 d a y s V E G F P D G F -B B b F G F G M -C S F IL -1 r a IL -1 b IL -6 IF N y IL -8 IL -1 2 p 7 0 IL -1 3 IL -7 R A N T E S E o ta x in IP -1 0 M C P -1 M IP -1 a M IP -1 b p g /m L D IA B E T E S 0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 2 5 0 0 3 0 0 0 3 5 0 0 4 0 0 0 * * * * * * * * * * * * * * * * *
5. DISCUSSÃO
A fibrina rica em plaquetas (PRF) é um arcabouço de fibrina natural derivado de procedimentos de polimerização lenta e progressiva que aumentam a incorporação das citocinas circulantes nas malhas de fibrina e podem ser liberadas de forma gradual e controlável, mantendo sua atividade por um período relativamente longo.41 Tem sido preconizado para o aumento da cicatrização de feridas diabéticas, 55 no entanto, atualmente não se sabe se há alterações nas citocinas proinflamatórias extracelulares e fatores de crescimento nos tecidos diabéticos16; 80 podem influenciar a composição molecular destes produtos.
O presente estudo mostrou claramente que as preparações de PRF de indivíduos diabéticos apresentam distintas alterações moleculares de preparações derivadas de indivíduos saudáveis, que se manifestam como alteração na composição de citocinas e fatores de crescimento circulantes no plasma sanguíneo basal e sua cinética de liberação de membranas de PRF in vitro. Os níveis basais no plasma de IFN-γ, EOTAXIN, MCP-1, IL-1RA, MIP-1B e PDGF-BB foram significativamente aumentados em amostras do grupo de diabéticos em comparação com os do controle. Curiosamente, IL-1RA, Eotaxina e MCP-1 foram detectados apenas em preparações de PRF do grupo diabético.
O interferon-γ (IFN-γ) é produzido por células natural killer (NK), células T e células NKT, e é um poderoso modulador de respostas pró e anti-inflamatórias e, portanto, é crítico para uma resposta imunológica equilibrada.82 Níveis significativamente elevados de IFN-γ foram detectados no soro, 34, 91, 99 fluido crevicular gengival, 13, 31, 33, 34 locais de doenças ativas inflamadas, 13, 31, 33, 34 em comparação com controles periodontalmente saudáveis. É importante ressaltar que
a superexpressão local de IFN-γ tem sido associada à destruição óssea alveolar in vivo 67 e à regulação a jusante de moléculas pró-inflamatórias, como prostaglandina E2, IL-1b e TNF-a, que podem promover a quebra dos tecidos moles e duros. do periodonto.4;65 De acordo com esses achados, a melhora no estado periodontal, incluindo a inflamação gengival, está associada à diminuição significativa do IFN-y.91;99
Eotaxina e MCP-1 são membros parcialmente homólogos da família das quimiocinas CC, com 64% de identidade de aminoácidos compartilhados.9 A MCP-1 é produzida por várias células em resposta a estímulos pró-inflamatórios, 95 é quimiotática altamente específica e ativadora de monócitos para sítios de lesão37 e poderia desempenhar um papel fundamental tanto na ativação quanto no recrutamento de células inflamatórias e imunes no ambiente periodontal.22; 40 Assim, a MCP-1 é comumente encontrada na gengiva inflamada, 97 tecidos conjuntivos periodontite inflamada9 e está altamente correlacionada com o grau da inflamação gengival presente9; 96 O aumento dos níveis teciduais de MCP-1 pode resultar em aumento da inflamação mediada por monócitos e redução da cicatrização de feridas, através do aumento da quimiotaxia de células inflamatórias, explosão respiratória e rápida indução de liberação de ácido araquidônico.54; 74 Eotaxina é quimioatrativa para eosinófilos, basófilos, células mieloides e linfócitos T-helper 4;30 A eotaxina e seu receptor, CCR3, são superexpressos na aterosclerose humana, sugerindo um envolvimento na inflamação vascular.39 Níveis séricos elevados de eotaxina e MCP-1 foram detectados em indivíduos com periodontite sugestivos de potencial ligação a doenças metabólicas.9; 70 Além disso, a expressão de eotaxina foi detectada por imuno-histoquímica em fibroblastos gengivais sob condições inflamatórias e,
portanto , pode ser um biomarcador potencial para condições destrutivas, como a periodontite. 9
Em conjunto, os achados da expressão alterada de biomoléculas circulantes em diabéticos estão associados à disfunção da resposta do hospedeiro, que exacerbou a expressão e / ou ativação de moléculas de sinalização intracelular, resultando em mediadores inflamatórios sistemicamente regulados, fatores osteoclastogênicos e metaloproteases da matriz36; 77; 80 e desregulação da resposta imune e inflamatória, incluindo quimiotaxia, aderência, fagocitose e apoptose, contribuindo para a destruição tecidual.86; 87
O uso de concentrados de plaquetas, como o PRF, é defendido como um método para fornecer doses supra-fisiológicas de fatores de crescimento autólogos, como o fator de crescimento derivado de plaquetas e o TGF-20diretamente nos tecidos do hospedeiro.61; que o PRF possui um arcabouço de
fibrina natural formado através de uma polimerização progressiva e relativamente lenta que pode aumentar a incorporação de citocinas circulantes nas malhas de fibrina, assim, essas moléculas solúveis podem ser aprisionadas nas malhas de fibrina do PRF e podem ser liberadas gradualmente e controláveis , mantendo sua atividade por um período relativamente longo.41 O presente estudo confirma essa hipótese, uma vez que quantidades significativas de fatores de crescimento, incluindo VEGF e PDGF, foram incorporadas e continuamente liberadas das membranas de PRF por até 14 dias (tabela 2). O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) estimula a angiogênese e a permeabilidade vascular e desempenha um papel crítico na inflamação e cicatrização de feridas.8; 50 Níveis aumentados de VEGF poderiam induzir uma diminuição na permeabilidade vascular. O fator de crescimento derivado de plaquetas é uma molécula biológica natural que
medeia e regula os principais eventos celulares, como proliferação celular, quimiotaxia e síntese de matriz, ligando-se a receptores de superfície celular específicos.17; 42; 43 É próangiogênico por atuar em sinergia com o VEGF endógeno para estimular a neovascularização no local do defeito.10; 38; 81 Infelizmente, no entanto, as preparações de PRF também incorporaram e continuamente liberaram grandes quantidades de moduladores pró-inflamatórios (IFN, IL-6, IL-8, RANTES, IP-10 e MIP-1a), particularmente quando produzidos a partir de pacientes diabéticos.
Membranas de diabéticos liberaram níveis significativamente aumentados de IFNy por sete dias e IL-6, IL-8, RANTES, IP-10 e MIP-1a por até 14 dias. A interleucina IL-8 é uma quimiocina produzida por uma variedade de tecidos, e é um potente indutor de quimiotaxia e ativação de leucócitos polimorfonucleares, monócitos e macrófagos nos locais de infecção. 6; 12 MIP-1b (proteína inflamatória macrofágica 1- beta) é crucial para respostas imunes contra infecção e inflamação,
53 ativar granulócitos humanos (neutrófilos, eosinófilos e basófilos), induzir a síntese
e liberação de outras citocinas pró-inflamatórias,85 tais como IL-1, IL-6 e TNF-a de fibroblastos e macrófagos. A superexpressão local do IFNy tem sido associada à destruição óssea alveolar in vivo88 e à regulação a jusante de moléculas pró-inflamatórias, como prostaglandina E2, IL-1b e TNF-a, que podem promover a quebra dos tecidos moles e duros do periodonto.5; 65 Em pacientes com periodontite, os níveis de IFNy, IL ‐ 6 e IL ‐ 8 nos fluidos gengivais creviculares foram maiores nas lesões ativas profundas em comparação com gengivas sadias21; 26; 68; 71 e IFNy e IL ‐ 8 são reduzidos dos locais doentes após tratamento da periodontite.18; 28; 48; 89; 91 A presença aumentada de IL-8 pode aumentar o recrutamento de leucócitos polimorfonucleares e aumentar a permeabilidade de capilares locais e epitélio juncional, 6, 12 portanto, inibindo a cicatrização tecidual local.
A RANTES é uma quimiocina que é regulada na ativação e expressa normalmente em células T que tem um importante papel modulatório do processo inflamatório, aumentando a aderência dos monócitos às células endoteliais, 7 que, por sua vez, pode ser um potente quimioatrativo e ativador Portanto, a aplicação de membranas de PRF autógenas em pacientes diabéticos pode resultar na liberação local contínua de biomoléculas pró-inflamatórias in situ. Esse desafio inflamatório continuado por citocinas imunomoduladoras além de 7 dias poderia reduzir significativamente o potencial de proliferação de células estaminais / progenitoras gengivais, supressão de marcadores osteogênicos e comprometimento da formação de depósitos calcificados resultando em inibição tecidual inibida,98 portanto, potencialmente negando eventuais estudos adicionais necessários para melhor avaliar o impacto da liberação local desses moduladores inflamatórios na regeneração tecidual.
6. CONCLUSÕES
Conclui-se que a PRF promove a incorporação e liberação gradual controlável de moléculas bioativas circulantes, mantendo sua atividade por até 14 dias. Quantidades significativas de fatores de crescimento incluindo VEGF e PDGF foram incorporadas e libertadas continuamente das membranas de PRF. As preparações de PRF também incorporaram e continuamente liberaram grandes quantidades de moduladores pró-inflamatórios (IFNy, IL-6, IL-8, RANTES, IP-10 e MIP-1a), particularmente em pacientes diabéticos. Recomenda-se a avaliação cuidadosa do estado metabólico dos pacientes que recebem membranas de PRF, a fim de melhor caracterizar sua composição molecular e o impacto potencial sobre a bioatividade e o potencial regenerativo desses materiais.
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ANEXO 1
Título do artigo: Comparative Evaluation of the Molecular Composition and Release Kinetics of Platelet Rich Fibrin Membranes From Diabetics and Normal Individuals.
Revista para a qual será enviado: JOMI
João FilipePereiraCosta1,2
Rodrigo Guerra De Oliveira1,2
Gutemberg Gomes Alves3
Carolina Miler Mattos de Santana1
Ronaldo Barcellos de Santana1*
1. Department of Periodontology. School of Dentistry, Federal Fluminense University, Niterói, Rio de Janeiro, Brazil.
2. Department of Implantology. School of Dentistry, SUPREMA , Juiz de Fora, Minas Gerais, Brazil. 3. Department of Stomatology. School of Dentistry, Federal Fluminense University, Niterói, Rio de Janeiro, Brazil.
Key words: biomaterials, bone graft, bone regeneration, ridge preservation
ABSTRACT
Among the well-known metabolic consequences of diabetes, concerns have been raised regarding its deleterious effects on bone and mineral metabolism. Experimental studies have demonstrated a significant negative impact of diabetes on bone formation in experimental bone defects as well as delayed bone regeneration in extraction sockets. The goal of the present study was to evaluate the molecular composition and cytokine release profile of PRF preparations from diabetics in comparison with systemically healthy individuals.
To analyze the dynamics of the release of cytokines and growth factors, on the first day after fibrin polymerization, each membrane was incubated in 6-well culture plates. Aliquots of the extracts were collected after, 7, 14, and 21 days of culture, by complete removal and substitution with an equal volume of fresh medium. For the detection of biomolecules, a multiparametric immunoassay based on xMAP-labeled magnetic microbeads (LuminexCorp®, USA). Baseline plasma levels of MIP-1B, MCP-1, IFN-y, IL-1RA, EOTAXIN, PDGF-BB were significantly increased in samples from the diabetes group in comparison with controls. Among these, IL-1RA, Eotaxin and MCP-1 were not detected on controls and detected only on the experimental group. Interestingly, in contrast, GM-CSF, VEGF, IL-13 and IL-8 were significantly reduced in serum samples of diabetics in comparison with controls. It is concluded that PRF promotes the incorporation and gradual controllable release of circulating bioactive molecules, while keeping their activity for up to 14 days. Careful evaluation of the metabolic status of patients receiving PRF membranes is recommended in order to better characterize its molecular composition and the potential impact on the bioactivity and regenerative potential of these materials.
INTRODUCTION
Among the well-known metabolic consequences of diabetes, concerns have been raised regarding its deleterious effects on bone and mineral metabolism.59 Experimental studies have demonstrated a significant negative impact of diabetes on bone formation in experimental bone defects60 as well as delayed bone regeneration in extraction sockets13, inhibited osseous integration of implants17, and higher variability of outcomes and an increased rate of infectious complications following guided bone regeneration procedures54 in type 1 diabetic animals, thus illustrating the possible negative effects of diabetes on bone healing related to implant therapy.
It has been suggested that continuous application of growth factors, such as fibroblast growth factor-2, may facilitate osseointegration and bone healing in conditions of locally and systemically inhibited osteogenesis such as that found in diabetes.58 Thus, targeted controlled local delivery of biologically active substances may stimulate bone regeneration and compensate for the inhibitory effects of diabetes on bone healing.58;59 Biologically enhanced therapies may offer significant clinical benefits by enhancing the endogenous healing capacity of bone defects, increasing the rate and total amount of bone formation and ultimately resulting in significantly improved bone regeneration, especially in situations of locally or systemically inhibited healing, such as that observed in diabetes mellitus.59
Platelet concentrates have been used for regenerative procedures in various fields of medicine, including dentistry, reconstructive surgery, plastic surgery, and dermatology, to deliver supra-physiological doses of autologous growth factors directly to host tissues.46;47 These growth factors have been shown to be chemotactic for various cell types, including monocytes, fibroblasts, endothelial cells, stem cells,
and fibroblasts, creating tissue micro-environments and directly influencing the proliferation and differentiation of progenitor cells.63
Platelet-rich fibrin (PRF)14 is a second-generation platelet concentrate, prepared from centrifuged blood. PRF is a fibrin clot rich in platelets without addition of thrombin during preparation, since thrombin may have toxic effect on the body cells.35 PRF derives from a natural and progressive polymerization occurring during centrifugation. A progressive or relatively slow polymerization mode may increase incorporation of the circulating cytokines in the fibrin meshes. Platelet-derived growth factor and TGF- have been identified in PRF.14 It is hypothesized that PRF has a
natural fibrin framework and can protect growth factors from proteolysis43 thus, these soluble molecules may be trapped in the fibrin meshes of the PRF and can be gradually and controllable released, while keeping their activity for a relatively long period.31
In medical procedures, the use of PRF has been mostly combined for the successful management of hard-to-heal leg ulcers, including diabetic foot ulcers.42 However, it has been reported that alterations in the extracellular presence of proinflammatory cytokines and growth factors within diabetic tissues may delay the proliferation and differentiation of mesenchymal progenitor cells and osteoblasts in the osseointegration process.10 It is currently unknown if diabetes modulates the molecular composition of PRF, and thus, influence in any way the regenerative potential of these preparations. The goal of the present study was to evaluate the molecular composition and cytokine release profile of PRF preparations from diabetics in comparison with systemically healthy individuals.
MATERIAL AND METHODS
Study Population and Experimental Design
The study was designed as a parallel-group, controlled clinical trial. It was conducted in accordance with the guidelines of the World Medical Association Declaration of Helsinki (version VI, 2002), and with Brazilian Resolution 466/2012 of the National Health Council, concerning experimentation involving human beings after approval of the study design and consent by the Ethical Committee of Medical Research, SUPREMA (CAAE: 66912517.4.0000.5103). Quality assessment was carried out based on the CONSORT Statement’s RCT checklist.76 Written informed consent was obtained from all subjects.
We included in the study volunteers with a diagnosis of confirmed DM1 for at least 1 year, without having undergone any type of outpatient periodontal control in the last 6 months, without having undergone antibiotic use in the last 4 months, not having active infections, accepting participation in the study and signing the Informed Consent Term and absence of any bone lesion in the oral cavity,
favorable basic medical conditions.
We excluded the volunteers with rejection of the informed consent form at any time during the study, smoking patients, presentation of parafunctional habits, pregnancy, local radiotherapy in the oral cavity, chemotherapy; renal, liver, and / or blood diseases, immunosuppression, use of corticosteroids or bisphosphonates, mucocutaneous diseases involving the oral cavity, excessive alcohol consumption or daily use, allergies or systemic problem (s) such as HIV , HPV, neurological problems or other problems that prevent treatment and poor oral hygiene.
