UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
Marshall Italo Barros Fontes
CONTRIBUIÇÕES PARA A FORMULAÇÃO DE
ESTRATÉGIAS PARA INVESTIGAÇÃO GENÉTICA DE
FENDAS OROFACIAIS TÍPICAS SINDRÔMICAS
Campinas 2016
Marshall Italo Barros Fontes
CONTRIBUIÇÕES PARA A FORMULAÇÃO DE
ESTRATÉGIAS PARA INVESTIGAÇÃO GENÉTICA DE
FENDAS OROFACIAIS TÍPICAS SINDRÔMICAS
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Ciências Médicas na área de concentração em Genética Médica.
ORIENTADORA: Profa. Dra. Vera Lúcia Gil da Silva Lopes
CO-ORIENTADORA: Profa. Dra. Isabella Lopes Monlleó
Campinas 2016
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
MARSHALL ITALO BARROS FONTES
ORIENTADORA: PROFA. DRA. VERA LÚCIA GIL DA SILVA LOPES COORIENTADORA: PROFA. DRA. ISABELLA LOPES MONLLEÓ
MEMBROS:
1. PROFA. DRA. VERA LÚCIA GIL DA SILVA LOPES
2. PROFA. DRA. LESLIE DOMENICI KULIKOWSKI
3. PROFA. DRA. MARIA ISABEL DE SOUZA ARANHA MELARAGNO
4. PROFA. DRA. ANDRÉA TREVAS MACIEL GUERRA
5.PROFA. DRA. CLÁUDIA VIANNA MAURER MORELLI
Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedicatória
... Lá atrás, havia um grupo...
Ao Guilherme e à Isabella, pela satisfação em construir uma trajetória pessoal e profissional compartilhada com vocês, tendo como enredo e pano de fundo uma singular e lúdica genética. ... Ao Grupo de Estudo de Genética Médica!
... “Existe o certo, o errado e todo o resto”... A todo o resto!
Agradecimentos
À minha orientadora, Profa. Dra. Vera Lúcia Gil da Silva Lopes por tornar possível a concretização de mais este „produto‟, por sua amabilidade, confiança e amizade.
À minha co-orientadora Profa. Dra. Isabella Lopes Monlléo pela incondicional subvençãoe zêlo a este „projeto‟, desde sua concepção.
Em nome da Vera e da Isabella, a todos os que fazem, direta e indiretamente, o Projeto Crânio-Face Brasil. É uma satisfação integrar esse Grupo.
Ao Fernando, Guilherme, Bella, Pablo e Miguellita por permitirem que eu seja o que sou. Camaradas, esse espelho não reflete Narciso!
À Tânia Kawasaki... Miriam, Ana Paula, Ilária, Nilma, Társis, Milena, Roberta, Elaine, Maria Fernanda, Luciana, Stephanie, Roby, Matheus, Simone, Fábio, Marilza, Jair, Henry & Cia. Cada um de vocês, de maneira singular, moldou essa parcela de minha vida. Compartilhados de forma intensa, os momentos de aprendizado – e claro, os de inquietação e de amenidades, tantas vezes presentes e necessários – serão inesquecíveis. Cada um a seu modo, em sua precisa proporção, me transformou. “Se tivesse uma alma para dar, eu daria!”.
Aos demais colegas do Laboratório de Genética Molecular da Unicamp, pela atenção, afabilidade e ensinamentos a mim disponibilizados durante todo o tempo.
Às funcionárias do Departamento de Genética Médica da Unicamp, Rosana e Maria Claudia, por toda prestimosidade.
Ao Giuliano Riedo e Simone, ao Lucas Vernier, Laura Vergo e Luís Paulo, ao Luís Guilherme... Alegres descobertas.
Aos Barros-Fontes por tudo o que nos assemelha, nos une, nos desassossega e nos identifica.
Ao Ítalo Marshall, mais que à „imagem-espelho‟, à nossa natural, espontânea e irrestrita cumplicidade!
À Zodja por partilhar a construção de um caminho cujas pedras nem sempre são preciosas...
Às famílias e pacientes que integram este projeto, aos quais muito lhes é devido.
À Banca Examinadora, pela rica e singular contribuição na elaboração final dessa tese.
RESUMO
Este estudo descreve características clínicas e genéticas de indivíduos com formas sindrômicas de fendas orais típicas (FOT) oriundos de seis serviços integrantes do Projeto Crânio-face Brasil (PCFB). A amostra foi constituída de 73 casos registrados na Base Brasileira de Anomalias Craniofaciais sendo 66 indivíduos com FOT associada a outros defeitos major sem etiologia reconhecida e 7 casos informativos com supeita de síndromes. Informações demográficas e clínicas foram obtidas por meio de protocolo padronizado, aplicado nos serviços participantes (http://www.fcm.unicamp.br/fcm/cranio-face-brasil/projeto-cranio-face-brasil). Exames complementares incluíram ecocardiografia, ultrassonografia abdominal e ressonância magnética do encéfalo, utilizando a estrutura do Sistema Único de Saúde (SUS) do serviço de origem, e cariótipo com bandas G, efetuado em quatro serviços participantes do estudo. O conjunto desses dados compuseram os critérios de seleção do caso para hibridização genômica em array (aGH) utilizando a plataforma Affymetrix® (GeneChip System CytoScan 750K e HD). Os resultados foram confirmados, individualmente, por meio das técnicas de Hibridação Genômica Comparativa em array (aCGH) (plataforma Human Genome CGH Microarray Kit 4x180K, Agilent Technologies®), Single Nucleotide Polymorphism Array (SNP-array)(plataforma SNP-array 850K, Illumina®) e Hibridização in situ fluorescente (FISH) (sondas de clones BAC: RP11-35P16, RP11-27M24). Quanto à procedência, 31 (42,5%) sujeitos eram do Nordeste, 25 (34,2%) do Sul e 17 (23,3%) do Sudeste; 34 (46%) apresentavam idade inferior a um ano, sem diferenças quanto ao gênero. Recorrência familial e consanguinidade parental ocorreram em 18% e 5,6% dos casos, respectivamente. A investigação complementar foi concluída em 28 (38,4%) indivíduos, 22 dos quais foram investigados por aGH, tendo sido identificados 4 (18,24%) com CNVs patogênicas. Os resultados corroboram a eficácia da técnica de aGH na investigação etiológica em FOT sindrômica e explicitam dificuldades para realizar a investigação complementar por meio de exames básicos no SUS. Sendo estes essenciais para a correlação genótipo-fenótipo, espera-se que este estudo forneça subsídios para a formulação de estratégias de abordagem genética de indivíduos com de FOT sindrômicas no Brasil.
Palavras-chave: Fenda palatina. Fenda labial. Citogenética. Análise em microsséries. Genética médica. Sistema Único de Saúde (SUS).
ABSTRACT
This study describes clinical and genetic characteristics of individuals with syndromic forms of typical oral clefts (TOC) from six service members of Project skull-face Brazil (PCFB). The sample consisted of 73 cases recorded in the Brazilian Database on Craniofacial Anomalies with 66 individuals with TOC associated with other major defects without known etiology and 7 informative cases with suspicion of syndromes. Demographic and clinical information was obtained through a standardized protocol applied in the participating services (http://www.fcm.unicamp.br/fcm/cranio-face-brasil/projeto-cranio-face-brasil). Additional tests include echocardiography, abdominal ultrasound and MRI of the skull, using Unifyed System of Health (SUS) structure of the original service, and karyotyping with G bands, made in four study participants services. These data composed the case selection criteria for genomic hybridization array (aGH)by GeneChip System CytoScan 750K e HD (Affymetrix®). The results were confirmed individually by array Comparative Genomic Hibridization (aCGH)(Human Genome CGH Microarray Kit 4x180K, Agilent Technologies®), Single Nucleotide Polymorphism Array (SNP-array)(SNP-array 850K, Illumina®) andFluorescent in situHibridization (FISH)(BAC clons: RP11-35P16, RP11-27M24). Considerering the referral origin, 31 (42.5%) subjects were in the Northeast, 25 (34.2%) South and 17 (23.3%) of the Southeast; 34 (46%) were younger than one year, there was no difference according to gender. Parental consanguinity and familial recurrence occurred in 18% and 5.6% of cases, respectively. A further investigation was completed in 28 (38.4%) patients, 22 of whom were investigated by aGH, 4 have been identified (18.2%) with pathogenic CNVs. The results support the effectiveness of aGH technique in the etiological investigation in syndromic TOC and explicit difficulties in carrying out further investigation through basic tests in SUS. These being essential for genotype-phenotype correlation, it is expected that this study supplies subsidies for the development of genetic approach strategies of individuals with syndromic TOC in Brazil.
Key words: Cleft palate. Cleft lip. Cytogenetic. Microarray analysis. Medical Genetics. Unified Health System.
Lista de Ilustrações
Pág. Figura 1. Fluxograma adotado pelo PCFB para investigação dos
casos de FOT ... 44 Figura 2. Padrão de bandas dos produtos amplificados da PCR em
gel de agarose a 2%... 47 Figura 3. Padrão de bandas dos produtos amplificados da PCR em
gel de agarose a 4%... 49 Figura 4. Padrão adequado de hibridização observado no
programa GCOS (Affymetrix®) ... 51 Figura 5. Fluxograma utilizado para análise das CNVs ... 56 Figura 6. Percentural de exames complementares realizados por
região ... 62
Figura 7. Perfil de hibridização das CNVs benignas detectadas no
caso 53 ... 75 Figura 8. Perfil de hibridização da CNV benigna detectada no caso
72 ... 76 Figura 9. Perfil de hibridização da CNV de relevância incerta
detectada no caso 14 ... 77 Figura 10. Perfil de hibridização da CNV de relevância incerta
detectada no caso 23 ... 77 Figura 11. Perfil de hibridização da CNV de relevância incerta
detectada no caso 24 ... 78 Figura 12. Perfil de hibridização da CNV de relevância incerta
detectada no caso 39 ... 78 Figura 13. Perfil de hibridização da CNV de relevância incerta
detectada no caso 44 ... 79 Figura 14. Perfil de hibridização das CNVs de relevância incerta
detectadas no caso 70 ... 80 Figura 15. Características fenotípicas do caso 12 ... 81 Figura 16. Perfil de hibridização da CNV de relevância incerta
detectada no caso 12 ... 83 Figura 17. Características fenotípicas do caso 53 ... 84
Figura 18. Perfil de hibridização da CNV patogênica detectada no
caso 53 ... 85 Figura 19. Perfil da hibridização com aCGH do caso 53 ... 85 Figura 20. Características fenotípicas do caso 61 ... 86 Figura 21. Perfil de hibridização da CNV patogênica detectada no
caso 61 ... 87 Figura 22. Características fenotípicas do caso 72 ... 89 Figura 23. Resultado do cariótipo convencional e da FISH do caso
72 ... 90 Figura 24. Perfil de hibridização da CNV patogênica detectada no
caso 72 ... 91 Figura 25. Perfil de número de cópias e genotipagem por SNP do
caso 72 ... 91 Figura 26. Fluxograma proposto para investigação genética dirigida
Lista de Tabelas
Pág. Tabela 1. Distribuição dos pacientes de acordo com o tipo de fenda
em relação às características demográficas e clínicas na
presente amostra ... 60 Tabela 2. Total de exames complementares realizados de acordo
com a Unidade Federativa (UF) ... 62 Tabela 3. Total de exames complementares realizados de acordo
com a região geográfica, Unidade Federativa (UF) e tipo
de exame ... 63 Tabela 4. Características genômicas dos 22casos submetidos a
Lista de Quadros
Pág. Quadro 1. Distribuição dos defeitos congênitos associados à FOT
por região anatômica na presente amostra ... 60 Quadro 2. Distribuição dos 73 casos por tipo de FOT, resultado dos
Lista de Abreviaturas e Siglas
aCGH: array Comparative Genomic Hybridization (Hibridização genômica comparativa em microarranjos)
aGH: array Genomic Hybridization (Hibridação genômica em array)
BACs: Bacterial Artificial Chromosome (Cromossomo artificial bacteriano) BBAC: Base Brasileira de Anomalias Craniofaciais
BBAC-FO: módulo de Fendas Orais da Base Brasileira de Anomalias Craniofaciais BDOC: Base Brasileira de Dados Clínicos e Familiais de Fendas Orofaciais CBHPM/AMB: classificação brasileira hierarquizada de procedimentos médicos da
Associação Médica Brasileira
CGH: Comparative Genomic Hybridization (Hibridização genômica comparativa)
CNPq: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
CNVs: Copy Number Variations (Variações no número de cópias do DNA) CONEP: Comissão Nacional de Ética em Pesquisa
COSAÚDE: Comitê Permanente de Regulação da Atenção à Saúde
CranFlow: versão eletrônica da Base Brasileira de Dados Clínicos e Familiais de
Fendas Orofaciais
CRISPLD2: cysteine-rich secretory protein LCCL domain containing 2 CRK: v-crk avian sarcoma virus CT10 oncogene homolog DATASUS: Departamento de Informática do SUS
DCM: defeitos congênitos múltiplos DGM: Departamento de Genética Médica
DNA: Deoxyribonucleic Acid (Ácido desoxirribonucleico) DNV: Declaração de Nascido Vivo
FCM: Faculdade de Ciências Médicas
FGFR1: fibroblast growth factor receptor 1
FGF8: fibroblast growth factor 8 androgen-induced
FGFR2: fibroblast growth factor receptor 2
FISH: Fluorescence In Situ Hybridization (Hibridação fluorescente in situ) FL/P: Fenda de lábio com ou sem fenda de palato
FLP: Fenda de lábio e palato FOT: Fenda orofacial típica
FOXE1: forkhead box E1
FP: Fenda de palato isolada
ECLAMC: Estudo Colaborativo Latino-Americano de Malformações Congênitas
GABRB3: gamma-aminobutyric acid (GABA) A receptor, beta 3
GLI2: GLI-Kruppel family member GLI2
GWAS: Genomic-Wide Association studies (estudos de associação de todo o genoma)
HAO2: hydroxyacid oxidase 2 (long chain)
HIC1: hypermethylated in cancer 1
HIC1: hypermethylated in cancer 1
HSD3B1: hydroxy-5-steroid dehydrogenase, 3 beta- and steroid delta-isomerase 1
HSD3B2: hydroxy-5-steroid dehydrogenase, 3 beta- and steroid delta-isomerase 2
IPDTOC: International Perinatal Database of Typical Oral Clefts
IRF6: interferon regulatory factor 6
JAG2: jagged 2
Kb: kilobases
LCRs: Low Copy Repeats (Repetições de baixo número de cópias)
LHX8: LIM homeobox 8
Mb: Megabases
MCT: Ministério de Ciências e Tecnologia
Microarray: microarranjos genômicos
MIM: Mendelian Inheritance in Man
MLPA: Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (Amplificação de múltiplas sondas dependente de ligação)
MS/SCTIE/DECIT: Ministério da Saúde/Secretaria de Ciência, Tecnologia e Insumos Estratégicos/ Departamento de Ciência e Tecnologia
MSX1: msh homeobox 1
MSX2: msh homeobox 2
MTHFR: methylenetetrahydrofolate reductase (NAD(P)H) NATS: Núcleos de Avaliação de Tecnologia em Saúde
OMIM: Online Mendelian Inheritance in Man OMS: Organização Mundial de Saúde PCFB: Projeto Crânio-Face-Brasil
PCR: Polymerase Chain Reaction (Reação em cadeia da polimerase)
PDGFC: platelet derived growth factor C
PVRL1: poliovirus receptor-related 1 (herpesvirus entry mediator C
RARA: retinoic acid receptor, alpha
Rebrats: Rede Brasileira de Avaliação de Tecnologias em Saúde RDNPM/DI: Retardo do desenvolvimento/deficiência intelectual
RFLPs: Restriction Fragment Length Polymorphisms (Polimorfismos de Comprimento de Fragmento de Restrição)
RRTDCF: Rede de Referência no Tratamento de Deformidades Craniofaciais SAS/MS: Secretaria de Atenção à Saúde/Ministério da Saúde
SATB2: SATB homeobox 2
SINASC: Sistema de Informações sobre Nascidos Vivos S. Del. 22q11.2: Síndrome de Deleção 22q11.2
SGC/HUPAA/Ufal: Serviço de Genética Clínica / Hospital Universitário Prof. Alberto Antunes / Universidade Federal da Alagoas
SHH: sonic hedgehog
SIX3: SIX homeobox 3
SKI: SKI proto-oncogene
SNC: Sistema Nervoso Central
SNP-arrays: Single Nucleotide Polymorphism arrays
SNPs: Single Nucleotide Polymorphisms (polimorfismos de nucleotídeo único) SPRY2: sprouty RTK signaling antagonist 2
SUS: Sistema Único de Saúde SVCF: Síndrome Velocardiofacial
TBX10: T-box 10
TBX22: T-box 22
TGFB3: transforming growth factor, beta 3
TGIF1: TGFB-induced factor homeobox 1
UNCISAL: Universidade Estadual de Ciências da Saúde de Alagoas Unicamp: Universidade de Campinas
YWHAE: tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein, epsilon
SUMÁRIO
Pág.
1. Introdução... 22 2. Revisão da literatura...
2.1. Caracterização geral das fendas orofaciais típicas ... 2.2. Evolução tecnológica na investigação etiológica das fendas orofaciais típicas ... 2.3. Avaliação genética das fendas orofaciais típicas ...
28 28 31 37 3. Objetivos... 3.1. Objetivo geral ... 3.2. Objetivos específicos ... 40 40 40 4. Casuística e Métodos... 4.1. Aspectos éticos ... 4.2. Casuística ... 4.2.1. População-alvo ... 4.2.2. Amostra ... 4.2.3. Critérios de inclusão ... 4.2.4. Critérios de exclusão ... 4.3. Métodos ... 4.3.1. Avaliação clínica ... 4.3.2. Coleta das amostras ...
4.3.2.1. Extração de DNA genômico ... 4.3.2.2. Hibridização Genômica em array
(aGH)... 4.3.3. Qualidade dos experimentos da aGH... 4.3.4. Análise dos dados ... 4.3.5. Estratégia de análise das CNVs... 4.3.6. Investigação dos genitores ... 4.3.7. Confirmação dos resultados ...
41 41 41 41 41 41 42 42 42 44 44 45 52 53 54 56 56 5. Resultados...
5.1. Caracterização demográfica e clínica ... 5.2. Caracterização de exames complementares e
59 59
citogenética ... 5.3. Caracterização genômica ... 5.3.1. Análise das CNVs ... 5.3.1.1. CNVs Benignas ... 5.3.1.2. CNVs de Relevância Incerta ... 5.3.1.3. CNVs Patogênicas ... 61 71 71 74 76 81 6. Discussão...
6.1. Caracterização demográfica e clínica ... 6.2. Caracterização de exames complementares e
citogenética ... 6.3. Caracterização genômica ... 6.3.1. Análise das CNVs ... 6.3.1.1. CNVs Benignas ... 6.3.1.2. CNVs de Relevância Incerta ... 6.3.1.3. CNVs patogênicas ... 93 94 95 98 98 98 99 104 7. Conclusões... 110 8. Considerações finais ... 111 9. Referências bibliográficas... 113 10. Apêndices... Apêndice 1 ... Apêndice 2... 129 129 146 11. Anexos... Anexo 1 ... Anexo 2 ... Anexo 3 ... Anexo 4 ... Anexo 5 ... Anexo 6 ... Anexo 7 ... Anexo 8 ... 159 159 160 161 165 170 182 183 184
Apresentação
O Projeto Crânio-face Brasil (PCFB), criado em 2003 e sediado no Departamento de Genética Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp (DGM/FCM/Unicamp), representa uma iniciativa não governamental, de caráter interinstitucional e multidisciplinar, fundamentado nas diretrizes da OMS para anomalias craniofaciais. Seu objetivo geral é contribuir para a melhoria da atenção à saúde de portadores de Fendas Orofaciais Típicas (FOT) no Brasil. Desenvolve pesquisas relacionadas a aspectos de saúde pública, caracterização clínica e laboratorial, além de propostas de educação continuada em saúde na área de anomalias craniofaciais.
Minha participação no PCFB teve início em 2006 com o convite para integrar o projeto de pesquisa intitulado “Proposta para a Inserção da Genética Clínica na Atenção a Indivíduos com Anomalias Craniofaciais no Sistema Único de Saúde”, contemplado pelo edital nacional (MCT/CNPq/MS-SCTIE-DECIT 021/2006).
Como membro da equipe executora desta proposta, realizei estágio em citogenética humana no Laboratório de Citogenética Humana do DGM/FCM/Unicamp e assumi a responsabilidade de participar da implantação e coordenação do Laboratório de Citogenética Humana na instituição onde trabalho - Universidade Estadual de Ciências da Saúde de Alagoas (Uncisal).
Este laboratório público, pioneiro e único em citogenética humana no estado, dá suporte ao grupo local de geneticistas nas atividades de ensino, pesquisa e assistenciais da Uncisal e do Serviço de Genética Clínica do Hospital Universitário da Universidade Federal da Alagoas (SGC/HUPAA/Ufal). Habilitado a realizar técnicas convencionais de citogenética, encontra-se em fase de implantação da técnica de FISH.
Atualmente a Uncisal, universidade na qual sou professor de genética dos cursos da área de saúde, é também um dos centros associados ao PCFB. Como médico geneticista, realizo atendimento de pacientes com defeitos congênitos e doenças genéticas há mais de 15 anos. A partir da adesão ao PCFB, intensifiquei o atendimento a pessoas com fendas orofaciais, participando sistematicamente de sua investigação diagnóstica.
Minha dissertação de mestrado, desenvolvida na FCM/UNICAMP no período de 2009 a 2011, traduziu-se em mais um produto concretizado junto ao PCFB. Na oportunidade foi realizada a caracterização genético-clínica de mais de uma centena de famílias com FOT procedentes de Alagoas e o reconhecimento de fatores relacionados à qualidade da atenção à saúde de sujeitos com esses defeitos congênitos no estado.
A presente tese de doutorado permitiuminha participação na investigação genética de FOT por meio dastécnicas de microarray. Esse aprendizado teórico-prático, agregado à minha formação clínica em genética, possibilitou o aprimoramento de minhas habilidades para colaborar com as abordagens diagnósticas propostas pelo PCFB para caracterização clínica e correlação genótipo-fenótipo das FOT.
Profissionalmente, no retorno à minha instituição, vislumbro a perspectiva de aplicar os conhecimentos adquiridos na consolidação dessa linha de pesquisa, no incremento da densidade tecnológica do Laboratório de Citogenética Humana e na inclusão nos programas de pós-graduação, além de fortalecer as parcerias estabelecidas com a Universidade Estadual de Campinas e com a Universidade Federal de Alagoas, através do PCFB e do SGC/HUPAA/Ufal, respectivamente.
1. Introdução
Desde os anos 1990 medidas governamentais isoladas têm sido implantadas para apoio ao diagnóstico e tratamento de doenças genéticas no Brasil. Entre elas, pode-se destacar o Programa de Diagnóstico Precoce do Hipotiroidismo (1), normatizada com a instituição do Programa de Triagem Neonatal (2) e a inclusão de exames de cariótipo na Tabela Unificada de Procedimentos, Medicamentos, Órteses, Próteses e Materiais Especiais do Sistema Único de Saúde (SUS) (3).
Ao lado dessas ações, diversas outras diretrizes e portarias foram promulgadas no sentido de atender às peculiaridades de vários subgrupos de doenças genéticas, entre elas a normatização para credenciamento de serviços para tratamento de Fendas Orofaciais Típicas (FOT) (4) e implante dentário ósseo-integrado (1994) (5) e Implante Coclear (1999) (6); a assistência ventilatória para Distrofia Muscular, tratamento para Osteogênese Imperfeita e Doença de Gaucher, juntamente com a concepção do Programa Nacional de Triagem Neonatal (2001) (2); procedimentos terapêuticos para Deficiência Intelectual e Autismo, fortificação da farinha de trigo com ácido fólico (2002) (7); além da campanha de vacinação de mulheres contra rubéola em 2008 (8, 9, 10, 11, 12).
Recentemente, o Transplante de Medula Óssea foi incorporado pelo MS entre as possibilidades de tratamento da anemia falciforme (13). Estes exemplos evidenciam a preocupação governamental com a incorporação de novas tecnologias para os cuidados de saúde.
Em contexto mais abrangente, a OMS destaca a necessidade de preparar os profissionais da saúde para o desafio de lidar com as doenças crônicas, incluindo um capítulo especial sobre defeitos congênitos (14, 15, 16, 17). De fato, os números são impactantes. Há mais de uma década o grupo de malformações congênitas e anomalias cromossômicas ocupa o segundo lugar entre as causas de mortalidade infantil no Brasil (10).
Esses números adquirem uma dimensão ainda maior quando levado em consideração que inexiste um programa nacional de vigilância epidemiológica de defeitos congênitos no Brasil. Apesar da existência de instrumentos governamentais de coleta de informações sobre defeitos congênitos, como a DNV e o SINASC, os dados obtidos no DATASUS são insatisfatórios quando comparados a parâmetros globais, revelando altas taxas de subnotificação e falta de confiabilidade na
codificação dos defeitos reportados (10). Informações adicionais são provenientes de fontes não-governamentais ou representam ainda esforços específicos de grupos de pesquisa na área epidemiológica, como o Estudo Colaborativo Latino Americano de Malformações Congênitas – ECLAMC (http://www.eclamc.org/) (18, 19).
Nesse grupo, as doenças raras também implicam em um relevante problema de saúde pública. Constituem um grupo heterogêneo, em geral de etiologia genética, com acometimento multisistêmico, muitas vezes incapacitantee negligenciado, cuja importância de seu diagnóstico e tratamento tem sido mundialmente destacada (10, 20, 21). No Brasil, esta problemática ganhou importância, culminando com a publicação da Portaria 199 em 30/01/2014 que institui a Política Nacional de Atenção Integral às Pessoas com Doenças Raras (12).
A incorporação de uma nova tecnologia em saúde é costumeiramente precedida de estudos de seu impacto no incremento à saúde e nos custos (18). No Brasil, existem os Núcleos de Avaliação de Tecnologia em Saúde (NATS) como parte da estratégia de fortalecimento do Grupo de Trabalho de Formação Profissional e Educação Continuada da Rede Brasileira de Avaliação de Tecnologias em Saúde - Rebrats. Os NATS, existentes em mais de 24 instituições hospitalares de ensino no País, auxiliam os gestores na tomada de decisões quanto ao desenvolvimento de ações de capacitação profissional permanente, além de incentivo à produção de estudos e pesquisas voltados à incorporação e avaliação de novas tecnologias em saúde (22).
A prevalência de FOT varia de 1:600 a 1.000 recém-nascidos (23, 24, 25). Além da considerável prevalência, a presença de co-morbidades e a necessidade de tratamento multiprofissional prolongado levou a Organização Mundial de Saúde (OMS) a considerar as FOTs um problema de saúde pública, publicando o documento Global Strategies to Reduce the Health-care Burden of Craniofacial Anomalies (15). Embora frequentes enquanto grupo, as FOT englobam numerosas doenças raras, as quais exigem abordagem genética específica.
As FOT ocorrem como um defeito isolado ou como componente de quadros sindrômicos (25, 26). De modo geral, os casos de fenda palatal (FP) são mais associados a outras anomalias que os casos de fenda labiopalatal (FLP), assumindo-se que as frequências sejam de aproximadamente 50% e 30%, respectivamente. Entre os casos não isolados, aproximadamente 50% são de anomalias congênitas múltiplas sem diagnóstico específico, enquanto o restante
corresponde a casos sindrômicos, de etiologia cromossômica, gênica ou teratogênica (23, 24, 25, 27, 28).
A Síndrome de deleção 22q11.2 (S. Del 22q11.2), também conhecida como Síndrome Velocardiofacial (SVCF), é a síndrome mais comumumente associada à FP, com incidência estimada entre 1:2.000-1:7.000 nascimentos (29, 30). Os principais acometimentos clínicos, além da FOT, incluem cardiopatias congênitas, deficiência cognitivae imunodeficiências. Esta condição reveste-se de importância especial nas políticas públicas brasileiras em doenças raras, já que está incluída no diagnóstico diferencial pré-transplante cardíaco e de imunodeficiências (11, 31).
A investigação etiológica de doenças genéticas no Brasil ainda é dificultada pelo escasso número de centros (10, 32). No caso das FOT o acesso à geneticista em centros especializados e de genética é restrito (33, 34, 35). Entretanto, existem ações governamentais para o tratamento corretivo de fendas orais desde 1993. Naquele ano, foram incluídos na Tabela do Sistema de Informações Hospitalares procedimentos de correção de fissuras labiopalatais e implantes dentários osseointegrados. Em 1994, foram estabelecidas normas para credenciamento de serviços nestas áreas. Estas iniciativas culminaram, em 1998, na criação da Rede de Referência no Tratamento de Deformidades Craniofaciais (RRTDCF) (4, 5, 33, 34).
Em 2003, foi constituído o Projeto Crânio-face Brasil. Este é um grupo interinstitucional e multiprofissional de pesquisadores e profissionais da saúde que atua na investigação de aspectos de saúde na área de anomalias craniofaciais (AC). O principal objetivo do PCFB é subsidiar propostas de incremento à atenção à saúde de indivíduos com AC. Este projeto conta, atualmente, com a participação ativa e regular de treze centros colaboradores nas suas três linhas de atuação: saúde pública, investigação de doenças específicas e educação (http://www.fcm.unicamp.br/fcm/cranio-face-brasil/).
Entre as ações, está a proposição de protocolo clínico padronizado, critérios para a suspeição de S Del 22q11.2 e de uma base de dados de pacientes com FOT e S Del 22q11.2. (36, 37, 38).
O PCFB realizou, também, o estudo abordandoa possibilidade de se estabelecer um centro de referência para diagnóstico de S. Del 22q11.2, por meio da investigação diagnóstica centralizada de indivíduos procedentes de 11 centros
associados ao PCFB. Os resultados revelaram importantes diferenças regionais relacionadas à infraestrutura para seguimento clínico dos pacientes, disponibilidade para realização dos procedimentos diagnósticos, como para envio de amostras biológicas, indicando ser esta uma estratégia plausível para acolhimento dos diferentes centros. Além disso, identificou-se que a técnica FISH mostrou ser uma alternativa custo-efetiva viável (39).
Em 2008 o PCFB desenvolveu, de maneira pioneira, uma base dados clínicos e familiais de indivíduos com FOT que fundamentou a hoje constituída Base Brasileira de Anomalias Craniofaciais (BBAC). De âmbito nacional, hospitalar e de caráter voluntário, a BBAC concentra atualmente informações de treze serviços associados. Foi idealizada para reunir informações sobre as características clínicas e genéticas de portadores de FOT da população brasileira e para ser integrada à rotina dos profissionais de saúde envolvidos com a atenção à saúde de pessoas com FOT. Seu principal objetivo é servir como alicerce para a construção de políticas de saúde e estudos de correlação genótipo-fenótipo no Brasil (http://www.fcm.unicamp.br/fcm/cranio-face-brasil/).
O banco de dados da BBAC agora gerencia dois módulos: um com informações de casos de fendas orais (BBAC-FO) e outro sobre Síndrome de Deleção 22q11.2 (BBAC- Del22q11), constituídos por informações individuais e familiares padronizadas. A idealização completa da BBAC inclui, além da base de dados central, cinco bancos de dados satélites com informações sobre: (1) genética (biorrepositório de DNA de trios: pacientes e genitores), (2) morbidade e mortalidade, (3) estrutura e dinâmica dos serviços (4) características de educação profissional e protocolos e (5) satisfação individual e dos pais. Desses, já estão implantados os módulos 1 e 2. Em 2014, já com a versão eletrônica desenvolvida (CranFlow) contabiliza mais de 1400 registros (http://www.fcm.unicamp.br/fcm/cranio-face-brasil/projeto-cranio-face-brasil).
A proposta da BBAC permite que as estratégias a ela incorporadas sigam um fluxo contínuo e flexível, de forma que novos objetivos e ferramentas possam ser agregados de acordo com a experiência adquirida. Para isso, são realizadas reuniões semestrais, com a participação de representantes de todos os serviços, para atualização, discussão de casos sem diagnóstico, troca de experiências inerentes à situação atual de cada serviço no que se refere às dificuldades de completar a investigação diagnóstica. Essa estratégia prioriza o reconhecimento das
características e necessidades da população brasileira portadora de FOT, o que pode contribuir para a elaboração de uma política mais específica de saúde nesta área (http://www.fcm.unicamp.br/fcm/cranio-face-brasil/projeto-cranio-face-brasil).
Dados obtidos em estudos do PCFB corroboram que o acesso limitado ao atendimento do especialista em genética clínica e a realização de exames complementares especializados é, de modo geral, aquém do necessário (33, 40). Alguns autores sugerem que para a constituição de uma rede de atenção clínica e laboratorial em genética, funcional e economicamente viável, as análises laboratoriais especializadas poderiam ser oferecidas por alguns centros de excelência. Entre as medidas que seriam importantes para a melhoria do atendimento em genética no país, incluir-se-ia uma rede laboratorial básica e de suporte, assim como a formalização da referência em genética (10, 32).
De fato, incorporar os avanços de conhecimento e tecnologia para a prática de saúde é um dos grandes desafios em Genética, especialmente em países em que o sistema de saúde é de financiamento eminentemente público, como o Brasil (10).
Por exemplo, a técnica de microarray é considerada a primeira escolha para investigação de defeitos congênitos múltiplos (41, 42, 43, 44). Para serem considerados causativos, seus resultados devem ser avaliados em associação com bases de dados clínico-moleculares, a fim de firmar a correlação genótipo-fenótipo, e confirmados por uma técnica independente (45, 46, 47, 48, 49). Os custos de equipamentos, insumos, recursos humanos especializados são, ainda, altamente limitantes para a aplicação desta técnica diagnóstica em larga escala. Entretanto, não são os únicos.
Até recentemente, na rede pública de saúde nacional, apenas o exame de cariótipo de sangue periférico com bandamento G era disponibilizado (tabela SUS), os demais exames genéticos não, embora constassem da Classificação Brasileira Hierarquizada de Procedimentos Médicos da Associação Médica Brasileira (CBHPM/AMB) (50). Com a revisão 2015 do Rol de Procedimentos da ANS, no âmbito do Comitê Permanente de Regulação da Atenção à Saúde (COSAÚDE), foram incluídos 21 novos procedimentos, entre os quais testes para diagnóstico de mais de uma dezena de doenças genéticas (51).
Os exames complementares são fundamentais para a efetiva caracterização clínica – que, por sua vez, é necessária para a correlação
genótipo-fenótipo. Contudo, a realização desses exames, muitos já incorporados nas práticas públicas de saúde, não é simples. Existe grandedificuldade de acesso para realização desses procedimentos na rede pública, particularmente os de média e alta complexidade, como tomografia computadorizada e ressonância nuclear magnética. Apesar das diferenças regionais existentes quanto à organização e infraestrutura dos serviços, em geral o tempo exigido é longo e em algumas situações os procedimentos estão indisponíveis (10, 52).
Além do diagnóstico e aconselhamento individualizados, os resultados de microarray e a respectiva correlação genótipo-fenótipo permitem incremento científico, como a caracterização de novos genes e suas funções no contexto das FOT (46, 47, 48, 52).
Considerando a prevalência de FOT e sua importância em saúde pública, a inexistência de diretrizes internacionais que suportem o uso de novas tecnologias diagnósticas neste grupo populacional, assim como de estudos nacionais sobre o tema, o presente trabalho, idealizado no contexto do PCFB, pretende contribuir para a discussão sobre a incorporação de estratégias diagnósticas em genética para FOT no Brasil.
2. Revisão da literatura
2.1 . Caracterização geral das fendas orofaciais típicas
As anormalidades craniofaciais consistem em defeitos do desenvolvimento das estruturas do crânio e da face. São decorrentes de interrrupções em várias etapas da formação do embrião que podem ocasionar, ao nascimento, fendas na região oromandibular, do nariz, dos olhos, e até mesmo fendas que se estendem até a região frontal. Alterações que acometem a diferenciação celular, a fusão e/ou oposicionamento das estruturas que separam a cavidade nasal e orofaringe, assim como dos processos faciais e/ou palatinos estão relacionadas ao aparecimento das Fendas Orofaciais Típicas (FOT) (25, 27, 28, 54).
No grupo das anormalidades craniofaciais as FOT representam o subtipo de maior prevalência e com considerável ônus individual, familiar e coletivo (23, 27, 28, 54). Compreendem um amplo espectro fenotípico e são caracterizadas pelo comprometimento parcial ou completo do lábio, do palato ou de ambos, de forma uni ou bilateral (23, 27, 28, 54).
Por definição as FOT apresentam acometimento paramediano, direito e/ou esquerdo, envolvendo o lábio e/ou o palato. Até meados dos anos 2000, eram tradicionalmente agrupadas em dois grupos distintos: fendas que afetam o lábio com ou sem o envolvimento do palato (FL/P) e as fendas que afetam apenas o palato (FP) (27, 55, 56). Estudos mais recentes sobreos mecanismos etiológicos e embriológicos subjacentes, além das diferentes taxas de prevalência e dos riscos de ocorrência e recorrência observados nos diferentes grupos populacionais estudados, sugerem que as FOT devem ser reagrupadas em três classes: a) fendas que afetam conjuntamente o lábio e o palato – duro ou mole (FLP); b) fendas que afetam unicamente o lábio (FL) e, c) as que afetam apenas o palato (FP) (25, 28, 54, 55, 56).
Além da topografia, observa-se variabilidade quanto à gravidade da FOT. A forma clínica mais sutil da FL corresponde à presença de discretas bandas de tecido conjuntivo, semelhante a uma cicatriz na região labial direita ou esquerda. Formas incompletas acometem o lábio e/ou o alvéolo. A FL, uni ou bilateral, é considerada completa quando se estende por todo o lábio superior alcançando a
narina. As FLP podem afetar um ou ambos os lados simultaneamente, acometendo o palato duro e/ou o palato mole. A apresentação mais grave das FLP é a ocorrência bilateral e completa, abrangendo todo o lábio superior, o alvéolo, além dos palatos duro e mole (28, 57, 58).
Contudo, além das formas tipicamente manifestas é observada grande variabilidade clínicanas FOT. Desde algumas décadas a necessidade de uma caracterização fenotípica precisa vem sendo considerada de extrema importância nos estudos de genética humana, de forma que programas informatizados e outras ferramentas de bioinformática foram desenvolvidos com a finalidade de „fenotipagem‟, alguns deles direcionados especificamente para anomalias craniofaciais. De todo modo, a obtenção e a análise fenotípica aprofundada das FOT continuam sendo indispensáveis para se estabelecer correlações com os diversos mecanismos genéticos (28).
Nesse contexto, existem evidências que várias características subclínicasedefeitos menores (minor), também chamadas „microformas‟ estejam associadosao „fenótipo expandido das fendas orais‟. Entre elas se destacam defeitos subepiteliais do músculo orbicular oral superior (diagnosticados por meio de ulttrassonografia ou eletroneuromiografia), as fendas submucosas do palato, o acometimento mínimo, compatível com discreta cicatriz ou sulco na região labial, além de anomalias dentárias (hipodontia, microdontia e dentes supranumerários), da morfologia craniofacial e mesmo insuficiência velofaríngea (28, 59).
Os resultados dos estudos epidemiológicos sobre defeitos congênitos, incluindo FOT, apresentam variações decorrentes de múltiplos fatores (14, 23, 24, 60). Em geral as FOT acometem aproximadamente de 1:600 – 1:1000 nascidos vivos, sendo que as maiores prevalências são observadas em populações de asiáticos e índios americanos, índices intermediários são encontrados em países europeus e as menores taxas no continente africano (14, 15, 24, 25, 26, 27, 28).
As informações relativas às taxas de prevalência no Brasil também revelam diferenças decorrentes de questões relacionadas às fontes de obtenção dos dados, se governamentais ou não, e ao tipo de estudo, se de base populacional ou hospitalar. Índices elevados de subregistro dos defeitos congênitos são
habitualmente observados (19, 40, 61, 62, 63, 64). Mais recentemente, a taxa de nascimentos com FOT estimada por ano no Brasil foi de 2.900 a 4.400, com incidência global de 1,0 a 1,5/1000 nascimentos (64, 65).
A maioria dos casos de FOT são classificados como não sindrômicos em decorrência de sua apresentação clínica isolada. Contudo, são definidos como sindrômicos, quando existe associação com outros defeitos morfológicos (23, 24, 25, 27, 58, 66, 67, 68). A pesquisa através das palavras-chave “fenda de lábio” e ”fenda de palato” no On-line Mendelian Inheritance in Man (OMIM) fornece mais de 500 citações relacionadas com formas sindrômicas e não sindrômicas de FOT (24, 26).
Estes defeitos podem incluir aqueles classificados como major ou minor. Defeitos major têm impacto relevante sobre a saúde e podem levar à morte, incapacidade permanente ou grave dano cosmético. Requerem, portanto, intervenção clínica ou cirúrgica. A relevância do reconhecimento dos defeitos minor reside no fato de que há uma correlação positiva entre o número desses defeitos e o risco de coexistência de defeitos major em órgãos internos (23, 24, 25, 58, 66, 67, 68).
Os índices de associação de FOT a outras anomalias estruturais são variáveis de acordo com o tipo de estudo e a população estudada. Coletivamente apresentam prevalência que varia de 3% até 63%. Justificam essas diferenças fatores relacionados aos critérios de composição da amostra e dos recursos diagnósticos utilizados, da classificação do tipo de defeito (major ou minor), além da origem de coleta de dados (23, 24, 25, 58, 67,68, 69).
Embora as frequências de anomalias estruturais associadas às FOT revelem diferenças, pesquisas realizadas com grupos populacionais distintos corroboram que as regiões mais acometidas são o sistema músculo-esquelético, o sistema cardiovascular, a cabeça, incluindo as regiões dos olhos, ouvidos e garganta, além do sistema nervoso central (SNC) (24, 57, 68, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82). Outros defeitos congênitos como os pulmonares, urogenitais e gastrintestinais são citados em menor extensão (23, 24, 25, 68, 72, 82, 83, 84).
Uma etapa indispensável para o adequado entendimento das bases genéticas das FOT é a realização de avaliação clínica meticulosa, com descrição pormenorizada do tipo de fenda e dos defeitos associados, que possibilite a comparação dos resultados entre os diversos estudos. Desse modo, o emprego de uma terminologia e nomenclatura não uniformizadas para a descrição dos casos, particularmente as FOT sindrômicas, dificulta a análise conjunta dessas informações, visto que as definições utilizadas são frequentemente variáveis (37, 58, 66, 70, 82, 85, 86).
Ainvestigação etiológica das FOT baseada na anamnese e na caracterização clínica, determinará a classificação do fenótipo como sendo isolado ou sindrômico, esporádico ou familial. Essa caracterização orienta para a necessidade e o tipo de investigação laboratorial a ser realizado individualmente (40). Neste sentido, a adoção de um fluxograma de apoio pode se revelar um instrumento importante nesse processo (37).
A avaliação genético-clínica especializada é fundamental no processo diagnóstico de FOT. O sistema público de saúde é principal local de investigação e tratamento deste grupo de defeitos congênitos no Brasil (10). Entretanto, como mencionado, existem obstáculos ao acesso da população com FOT à avaliação genética (33).
2.2 . Evolução tecnológica na investigação etiológica das fendas orofaciais típicas
Pela diversidade etiológica, FOT determinam diferentes possibilidades de investigação, tanto na forma sindrômica quanto na isolada (23, 25, 28, 54). Esses modelos de estudo são também relacionados às diferentes ferramentas tecnológicas que foram sendo desenvolvidas ao longo dos tempos.
Até as duas últimas décadas o estudo das doenças genéticas era fundamentado com o suporte de técnicas citogenéticas, como o cariótipo com bandamento G, a Hibridação in situ por Fluorescência (FISH) e os estudos moleculares.
Estudos baseados em citogenética clássica mostram que aberrações cromossômicas são frequentemente observadas em casos de FOT associados a defeitos congênitos e/ou déficit intelectual, com prevalência entre 10 a 30% (87). As principais anormalidades cromossômicas descritas são trissomias, translocações e inversões, duplicações, deleções e microdeleções. Entre estas, destacam-se as trissomias do 13 (Síndrome de Patau) e do 18 (Síndrome de Edwards), deleção 4p (Síndrome de Wolf-Hirschhorn – OMIM 194190), deleção 18q (Síndrome de deleção 18q – OMIM 601808) e microdeleção 22q11 (Síndrome Velocardiofacial – OMIM 192430, Síndrome de DiGeorge – OMIM 188400) (24, 25, 28, 68, 69).
A técnica de Hibridação Genômica Comparativa em arrays (aCGH) trouxe importante avanço na investigação etiológica de defeitos congênitos em geral (54). Esta permitiu maior aprofundamento na investigação etiológica dos defeitos congênitos, possibilitando a detecção de deleções, duplicações e perda de heterozigose. Entretanto, ela não permite a identificação de alterações genômicas, eventos tecido-específico, além de pequenas aberrações cromossômicas equilibradas (88, 89, 90, 91, 92).
As análises de CNVs por meio de microarrays, os estudos de associação de todo o genoma (GWAS) e as novas modalidades de sequenciamento (do exoma e do genoma completo) representam as mais avançadas técnicas para investigação de doenças genéticas e distúrbios congênitos. Estas possibilitam a identificação de anormalidades em nível de resolução de um único nucleotídeo além de rupturas intragênicas (25, 54).
A técnica de microarray permitiu a análise de milhares de regiões simultâneas para localização de ganhos e perdas de material genético em nível genômico, ou seja, alterações no número de cópias do DNA (88, 89, 90, 91). Lâminas de microarray contendo SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) e regiões de CNVs (copy number variation), os chamados SNP arrays, também foram desenvolvidos (88). Estas técnicas têm sido cada vez mais utilizadas com sucesso para detecção de regiões genômicas em indivíduos com FOT (25, 28, 54, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99).
Com taxas de detecção estimada em dez a vinte por cento maiores que as obtidas com citogenética convencional, as técnicas de microarray passaram a ser utilizadas rotineiramente em países desenvolvidos como ferramenta diagnóstica de primeira linha na triagem de indivíduos com defeitos congênitos e retardo do desenvolvimento neuropsicomotor/deficiência intelectual (RDNPM/DI) (41, 42, 43, 44).
Estudos com microarray tem demonstrado que cerca de 20% de indivíduos fenotipicamente anormais com translocações aparentemente balanceadas identificadas à citogenética convencional, herdadas ou não, apresentam perda ou ganho de material genético (42).
O advento de plataformas mais robustas de microarray e a utilização conjunta de novas ferramentas de análise molecular permitiram ampliar o conhecimento sobre a etiologia, história natural e fatores de risco relacionados às FOT. Este conhecimento teórico é fundamental para a concepção e a proposição de ações terapêuticas e preventivas custo-efetivas (23, 24, 25, 26, 28, 54).
Dessa forma, a identificação de anormalidades cromossômicas submicroscópicas - microduplicações e microdeleções - em diversas regiões do genoma, contribuiu para a compreensão dos mecanismos genéticos e o delineamento de novas síndromes em nível genômico (46, 100, 102). Um exemplo disso é a recente caracterização da síndrome de microduplicação 16p13.3 que apresenta fenótipo distinto daquele observado na Síndrome de Rubinstein-Taybi, que por sua vez é reconhecidamente decorrente de microdeleções (e mutações) nessa mesma região cromossômica. Ocorrências como essa são definidas como síndromes de microduplicações e microdeleções recíprocas (101).
Várias outras correlações semelhantes foram publicadas, mencionando a existência de fenótipos distintos conforme a ocorrência de microdeleções ou microduplicações na mesma localização genômica. Outros exemplos incluem a região 7q11.23 e a Síndrome de Williams-Beuren; 15q11.2 e as Síndromes de Prader-Willi e de Angelman; 17p11.2 e Síndromes de Potocki-Lupski e de Smith-Magenis; 17p13.3 e Síndrome de Miller-Dicker; 22q11.2 e a Síndrome Velocardiofacial, além de Xq28 e Síndrome de Rett (101).
Ainda, a aplicação das técnicas de microarraytem apresentado novas evidências da interferência de fatores externos na gênese das FOT. Pezzetti (2009) estudou as implicações da difenil-hidantoína na expressão de genes relacionados ao citoesqueleto e à adesão celular em fibroblastos da matriz celular do palato em humanos. As análises bioquímicas mostraram que a difenil-hidantoína reduz a síntese de colágeno e de glicosaminoglicanos da matriz celular e, por meio de análises da expressão gênica com microarray, altera a expressão de vários genes envolvidos com a síntese de proteínas do citoesqueleto e adesão nas membranas celulares. Houve redução dos níveis de caderina, caveolina, RTK e da alfa-actina, com aumento dos níveis de nectina, vinculina, FRG, ITGA, ITGB e EDG2. Observou-se também alteração da expressão de genes de ligação ao DNA que têm participação nos processos de crescimento celular (103).
Rot (2013), utilizando modelos de ratos, estudou a função da musculatura esquelética no desenvolvimento do palato sugerindo que fisiologicamente a fusão do palato é dependente, além da ação mecânica direta da musculatura contígua, deoutracontribuiçãodesse músculo (ação parácrina). Os resultados das análises de microarrayrevelaram expressões gênicas diferentes (TGFBR2, BMP7, Trim71, E2f5, DDX5, GFAP e Sema3f), cuja função na palatogênese, provavelmente, está relacionada à sinalização parácrina que influencia a dinâmica da musculatura subdjacente (104).
Outra pesquisa com camundongos apresentou evidências da associação dos efeitos da exposição à nicotina durante a gravidez com anormalidades da fusão da linha média do palato. Foram realizadas análises morfológicas e moleculares, além da criação de um perfil de transcrição usando microarrays. Estes últimos revelaram redução na expressão de mais de 6000 genes e aumento em outros 6000. Além disso, 46% dos genes reconhecidamente implicados com FP demonstraram ser sensíveis aos efeitos da nicotina (104).
Na maioria dos casos não sindrômicos (isolados) de FOT, a etiologia implicada segue o modelo de herança complexa com limiar multifatorial, resultante da interação entre genes e outros fatores como tabagismo e deficiências nutricionais específicas. Este mecanismo, amparado pelos estudos com pares de gêmeose deagregação familiar, é o responsável por cerca 70% dos casos de FL/P e 50% dos
casos de FP não sindrômicos. Outras etiologias, entre as quais as aberrações cromossômicas, as mutações gênicas e os agentes teratogênicos podem estar envolvidos em casos de FOT (23, 24, 25, 28, 54, 68, 87).
Sobre estes mecanismos incidem fatores de risco que podem aumentar a prevalência do defeito em determinadas populações. Esses fatores compreendem consanguinidade parental, história familial positiva e idade dos genitores superior a 40 anos (40, 106, 107, 108, 109).
Embora estudos relacionados à contribuição dos fatores externos na gênese das FOT revelem resultados heterogêneos decorrentes dos instrumentos metodológicos utilizados, o papel potencialmente lesivo de diversos fatores ambientais é evidente. Entre os vários agentes ambientais reconhecidamente envolvidos com a interferência em estágios críticos do desenvolvimento do embrião destacam-se a exposição materna a fármacos e substâncias químicas como anticonvulsivantes (ácido valproico e fenitoína) e corticosteroides, álcool etílico, ácido retinoico e tabaco (23, 24, 25, 56, 68).
Condições inerentes à saúde da gestante como carência de folato e outros componentes do complexo B, diabetes, obesidade e hipertermia, além da interferência ocupacional em determinadas situações laborais e baixo padrão socioeconômico também estão implicados (23, 24, 25, 56, 68).
Ao longo dos últimos 25 anos dezenas de loci e regiões cromossômicas têm sido associadas com FOT, dentre os principais genes candidatos descritos estão: IRF6 (1q32), MSX1 (4p16.3-p16.1), TGFA (2p13), TGFB3 (6p23-25; 14q24), FOXE1 (9q22), FGFR1 (8p12), FGFR2 (10q26.13), FGF8 (10q24.32), PDGFC (4q32), CRISPLD2 e PVRL1 (11q23), GABRB3, MSX2 (5q34-35), SATB2, TBX10 (11q13.1), TBX22 (Xq21.1), GLI2, JAG2, MTHFR, RARA (17q21), LHX8, SKI e SPRY2 (25, 28, 59, 110, 111, 112, 113).
Esses genes desempenham funções fundamentais em inúmeras etapas do desenvolvimento morfológico das estruturas craniofaciais. Essas etapas incluem sinalização de fatores extracelulares, fator de crescimento de fibroblasto, fator de crescimento derivado de plaquetas, proteínas Sonic Hedgehog, moléculas WNT, fatores de transcrição, fatores de transcrição T-box, proteína tumoral TP63, adesão
celular e modificação de proteínas (24, 25, 27, 54, 59, 91, 110, 111, 112, 113, 114, 115).
Entre as FOT sindrômicas, cerca de 270 estão relacionadas a síndromes catalogadas no OMIM para as quais são identificadasmutações em loci isolados, aberrações cromossômicas ou teratógenos. Em cerca de três quartos, uma causa genética é reconhecida e relacionada a um determinado locus e padrão monogênico de transmissão (25).
Além da correlação entre genes reconhecidamente implicados com FOT, como IRF6 e a Síndrome de Van der Woude, novas correlações vem sendo estabelecidas. Como observado na Síndrome Oro-facio-digital e o gene GLI3, a Síndrome de Kabuki e os genes MLL2 e KDM6A, a Síndrome de Miller e o gene DHODH e a Síndrome de Bartsocas-Papas e o gene RIPK4 (24, 25, 113, 116).
A utilização da microarray tem contribuído também com a elucidação dedesequilíbrios genômicos relacionados com síndromes malformativas anteriormente descritas, nas quais FOT integram o fenótipo. Muitas dessas síndromes são raras, apresentam ampla variabilidade clínica e suas bases moleculares até então não são inteiramente compreendidas. Entre os exemplos estão as interrelações do gene CHD7 (8q12.2) com Síndrome de CHARGE, do gene TFAP2A (6p24.3) com Síndrome Branquio-Oculo-Facial, do gene RUNX2 (6p21.1) com Displasia Cleido-Craniana e do gene EFTUD2 (17q21.3) com Disostose Mandibulofacial com microcefalia (113, 117, 118).
Aliada a diferentes abordagens metodológicas, microarray, tem tornado contínua a descoberta de novas evidências da participação de regiões cromossômicas na etiopatogênese das FOT (24, 25, 53, 113). Estudos com abordagens do tipo meta-análise, microarray e estudos de associação de todo o genoma (GWAS), em diferentes populações, têm revelado associação significativa entre vários loci e FOT. Entre elas se destacam novas evidências sobre regiões previamente descritas (1p22, 1q32.2, 2p13, 8q24.21, 10q25.3, 17q22 e 20q12), além da identificação de novos lociptencialmente envolvidos (1p36, 2p21, 2p24.2–24.1, 3p11.1, 8q21.3, 13q14.1q31.2,13q31.1,15q22.2, 19q13.1-q13.2 e 22q13.1q13.2) (25, 53, 113, 119, 120, 121).
Por meio da triagem de CNVs por microarray e genotipagem de SNPs, estudos realizados na população brasileira pelo grupo de pesquisadores do Projeto Crânio-face Brasil (PCFB), revelaram raras variações em sequência (de novo) potencialmente patogênicas nos genes Gli2, MSX1, e FGF8. Também foram identificados mais de vinte SNPs em 16 genes (MSX1, SPRY1, MSX2, PRSS35, TFAP2A, SHH, VAX1, TBX10, WNT11, PAX9, BMP4, JAG2, AXIN2, DVL2, KIF7 e TCBE3) que evidenciaram associação significativa com FOT não sindrômica e evidências da participação de dois novos genes (TCEB3 e KIF7) na etiopatogênese das FOT (52, 122).
Embora muito já se tenha avançado, ainda persistem lacunas importantes tanto em relação ao número e contribuição de genes específicos, quanto às interações gene-gene e gene-ambiente e às correlações genótipo-fenótipo (24, 28, 109, 123). Apesar do conhecimento do papel de vários genes, inúmeros mecanismos celulares envolvidos no desenvolvimento do lábio e do palato apontam para um complexo, e ainda não completamente esclarecido, mecanismo genético na determinação das fendas orais (114), de modo que vários casos permanecem sem um diagnóstico etiológico.
2.3. Avaliação genética das fendas orofaciais típicas
A ocorrência de FOT acarreta um considerável ônus que ultrapassa as repercussões individuais de saúde, uma vez que abrange o contexto familiar e social, motivando a promoção de ações efetivas em saúde dirigidas à redução da elevada morbimortalidade e que contribuam para uma maior adaptação dos indivíduos em um contexto social, laboral e reprodutivo (15, 23, 60, 76, 124).
As consequências individuais da FOT se estendem a problemas alimentares e nutricionais, articulação dafala, audição, além daintegração social. Esses agravos exigem a intervenção individualizada e oportuna de equipe multiprofissional para tratamento efetivo nos diferentes níveis de abordagens necessárias: médico-cirúrgicas, odontológicas, nutricionais, fonoaudiológicas epsicossociais (15, 23, 60, 76, 124, 125).
Diante da complexidade clínica e etiológica das FOT, o especialista em genética é integrante da equipe multiprofissional recomendada pela OMS (16, 40). A avaliação genético-clínica é fundamental para obtenção de diagnósticos consistentes e acurados. No plano individual, o diagnóstico é base para o planejamento do tratamento, a estimativa do prognóstico, a adoção de condutas antecipatórias e o aconselhamento genético (37, 66, 85, 86). Em perspectiva populacional, permite o reconhecimento e a descrição do perfil de morbidade e de fatores de risco específicos de determinada população e que podem ser alvo de ações preventivas (15, 23, 37).
Em qualquer das abordagens, é previsível a necessidade de aparato tecnológico para investigação etiológica ou mesmo para identificação de fatores predisponentes nas diferentes populações, podendo assim contribuir para incrementar o conhecimento científico na área.
À medida que as técnicas de microarrays aumentaram de forma significativa as taxas de detecção de anormalidades cromossômicas em sujeitos com defeitos congênitos, RDNPM/DI e distúrbios neurológicos, novos questionamentos surgiram. Entre eles, a necessidade de normatização para implantação e processamento nos laboratórios, além da elaboração de diretrizes para auxílio aos geneticistas clínicos em relação à validação e interpretação dos desequilíbrios genômicos e CNVs gerados (45, 46, 47, 48, 49).
Elas possibilitaram também a descoberta de uma importante fonte de variação genética presente em abundância no genoma de indivíduos normais, apesar de que seu significado clínico não seja ainda totalmente compreendido (46). Alguns estudos estimam em cerca de 800, o número médio de CNVs benignas encontradas idividualmente (42). Aliada à presença de fatores intrínsecos da expressão fenotípica, como penetrância e variabilidade clínica, a análise e interpretação desse grande volume de informações revela-se mais complexa, dificultando a classificação de uma CNV como sendo benigna ou patogênica (46).
Rojnuengnit et al. (2014) (26) analisaram características clínicas e familiares de pacientes com FL/P sindrômica para avaliação de sinais preditores de resultados anormais de exames de triagem utilizando metodologia de microarrays. Segundo o estudo a presença de RDNPM/DI, dismorfismo facial, defeitos congênitos
graves (major) e história familial de RDNPM/DI se revelaram fortes preditores de resultados anormais de aCGH em pacientes com FL/P. A probabilidade de encontrar CNVs patogênicas é particularmente maior na presença de RDNPM/DI.
As modernas tecnologias contribuíram para o incremento das taxas de diagnóstico de forma que, atualmente existem centenas de citações no OMIM relacionadas com FOT (25,26). Ainda assim, a compreensão das complexas relações gene-gene e gene-ambiente, e suas repercussões sobre o fenótipo constituem um importante desafio e apesar dos avanços importantes sobre a gênese da FOT, em cerca de 50% dos pacientes com quadros sindrômicos nenhum fator etiológico subjacente é identificado, permanecendo sob a definição de defeitos congênitos múltiplos (DCM) (37, 69, 114).
Entretanto, ainda não foram estabelecidos critérios consensuais para utilização dessas tecnologias na triagem de diferentes defeitos congênitos, o que é fundamental para sua incorporação nas rotinas diagnósticas (126, 127, 128, 129, 130, 131).
De modo geral, ainda não existe padronização de critérios para indicação de exames genéticos moleculares em diferentes situações clínicas, incluindo as FOT, no Sistema Único de Saúde (SUS). Sua implantação em larga escala no SUS requer a aplicação racional de recursos considerando custos e disponibilidade de infraestrutura, equipamentos, insumos e recursos humanos nas diferentes regiões do País (39).
Sob a perspectiva da instituição de testes genéticos diagnósticos determinados na Política Nacional de Atenção Integral às Pessoas com Doenças Raras, há a necessidade de se refletir como constituir uma rede diagnóstica que suporte a avaliação clínica e os exames subsidiários com tecnologia moderna, de maneira a otimizar os recursos financeiros.
3. Ojetivos
3.1 . Objetivo geral
Contribuir com a formulação de estratégias para abordagem genética de indivíduos com formas sindrômicas de Fendas Orofaciais Típicas (FOT) no Brasil.
3.2 . Objetivos específicos
3.2.1. Descrever as características clínicas dos indivíduos com FOT sindrômicas registrados na Base Brasileira de Anomalias Craniofaciais – módulo de Fendas Orais (BBAC-FO);
3.2.2. Correlacionar os aspectos clínicos e os resultados da aplicação da técnica de microarray na amostra;
3.2.3. Identificar as dificuldades para a implantação de investigação laboratorial em genética por meio da técnica de aGH neste grupo populacional.
4. Casuística e Métodos 4.1. Aspectos éticos
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da FCM/Unicamp (processos 668/2007 e 059/2008) além do parecer do CONEP (parecer nº 709/2008) (Anexos 1, 2 e 3). Após a anuência do participante ou de seu responsável, foi solicitada a assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido (Anexo 4).
4.2. Casuística
4.2.1. População-alvo: indivíduos com fenda orofacial sindrômica registrados na BBAC-FO.
4.2.2. Amostra: pacientes com fenda orofacial típica sindrômica.
4.2.3. Critérios de inclusão: pacientes com pelo menos um defeito congênito maior (major) associado à FOT sem hipótese nosológica identificados por meio da revisão do quadro clínico e casos informativos com suspeita clínica de síndromes reconhecidas;
A classificação adotada no presente estudo utiliza as definições, descritores e codificação do International Perinatal Database of Typical Oral Clefts - IPDTOC (132) conforme os seguintes grupos:
(1) Defeito isolado: quando o único defeito major é a fenda orofacial ou a Sequência de Pierre Robin;
(2) Síndrome reconhecida: quando existe um conjunto de defeitos (major, minor ou uma combinação entre eles) devido a um fator etiológico único já demonstrado (ex.: anomalia cromossômica, mutação gênica, ação teratogênica) ou fortemente suspeito com base em sua recorrência em determinado número de casos. A fenda orofacial é obrigatoriamente um dos defeitos major.
(3) Defeitos congênitos múltiplos: quando existe uma combinação de dois ou mais defeitos major (independente do número de defeitos minor) para os quais
