Caracterização de exames complementares e

A avaliação complementar básica realizada no SUS foi concluída em apenas um terço dos 73 casos (Tabelas 2 e 3). Analisando-se por tipo de exame, observa-se que a frequência de realização de ecocardiograma transtorácico e ultrassonografia abdominal foi superior a 60%. Os menores índices de realização desses exames foram observados em dois centros (PE e PR). Este resultado possivelmente está relacionado a mudanças no quadro de geneticistas que, naquele momento, estavam se desligando dos dois centros participantes, de forma que a sequência das avaliações ficou comprometida.

A baixa frequência geral de realização de RNM do encéfalo pode estar relacionada à complexidade do exame que não se encontra disponível na maioria dos serviços, exceto aqueles localizados em unidades de alta complexidade no SUS.

Em relação ao exame de cariótipo, as maiores taxas de realização foram encontradas nos serviços que dispõem de laboratórios de citogenética próprios (AL, SP1, SP2, RS). Para os demais, o PCFB disponibilizava a realização do cariótipo e minimizou o problema. Mesmo assim, como esperado, essa situação se refletiu em baixas frequências de realização de cariótipo nos centros sem laboratório de citogenética.

Outras circunstâncias, como abandono do acompanhamento, dificuldades socioeconômicas relacionadas ao deslocamento para as unidades hospitalares, além da presença de co-morbidades, são fatores potencialmente relacionados. Estes devem ser considerados quando da interpretação dos resultados quanto ao cumprimento da avaliação complementar básica proposta neste estudo.

Como descrito na literatura, a quantidade de procedimentos, clínicos e laboratoriais, não realizada na rede pública em decorrência do não comparecimento dos usuários constitui um problema recorrente em todo o País, com taxas em geral acima de 25%. A diversidade de fatores envolvidos é grande, apresenta cenários regionais distintos e variações relacionadas ao

padrão socioeconomicocultural, às especialidades e procedimentos, além da faixa etária dos pacientes (140, 141, 142, 143, 144).

Paralelamente a isso, em algumas circunstâncias houve dificuldade de acesso e longo período de tempo para a realização dos exames complementares subsidiários. É possível que os limites (ou quotas) definidos pelo SUS para realização desses procedimentos, particularmente para os de média e alta complexidade, apesar de importantes variações regionais, tenham contribuído para o alto percentual observado de casos inelegíveis para triagem com aGH neste estudo (10, 32, 33, 35, 37).

Os exames complementares que determinam a presença de anomalias associadas em diferentes órgãos e sistemas são indispensáveis para a correlação genótipo-fenótipo. A caracterização clínica incompleta dificulta sobremaneira essa correlação e, em muitas circunstâncias, a definição sobre a patogenicidade das CNVs envolvidas. Assim, a aGH deve ser considerada um novo recurso diagnóstico, mas não pode preterir outras abordagens preliminares, necessárias inclusive à instituição de cuidados de saúdede acordo com as necessidades específicas de saúde de cada sujeito.

Os exames complementares tiveram impacto decisivo no tamanho amostral e no estabelecimento da correlação genótipo-fenótipo, um dos seus objetivos desse estudo. Atente-se também para o fato de que, mesmo em uma abordagem rotineira de prática de saúde, a ausência desses exames pode comprometer a compreensão do fenótipo e, desse modo, interferir na conclusão diagnóstica, no planejamento do tratamento e na avaliação do prognóstico.

Embora a utilização de aGH possa ser considerada exame de triagem, em muitas situações esta se revela técnica diagnóstica (47, 48). Assim, a realização de exames complementares para rastreio de malformações, entre os quais ultrassonografia, ecocardiograma e ressonância nuclear magnética permitiriam correlação genótipo-fenótipo.

O exame de cariótipo é a atual possibilidade de investigação cromossômica no SUS e pode ser conclusivo, dependendo do tipo de

aberração cromossômica e da resolução do exame. Ainda, o cariótipo é a alternativa mais amplamente disponível na atualidade para a identificação de translocações aparentemente equilibradas e pode ser a técnica necessária para confirmação de achados citogenômicos (47, 48). Neste estudo, baseado no cenário atual e visando otimização de recursos, o exame de cariótipo foi considerado critério de inclusão para realização de aGH.

A concepção de políticas públicas dirigidas à investigação diagnóstica de defeitos congênitos, especialmente para aqueles sem hipótese diagnóstica específica, necessita ser bem fundamentada. Por exemplo, nos casos em que existe diagnóstico suspeito, é possível que a escolha de testes de menor custo que a aGH seja mais apropriada. As síndromes de microdeleção, como a S. Del 22q11.2, retratam essa possibilidade. Estudos sobre custo-efetividade corroboram que a técnica de FISH é apropriada para utilização em larga escala nesses casos (39, 145). Este fato e a própria suspeita clínica de um caso de S Williams levou a não realização de aGH no caso 58.

Nesse contexto, a caracterização fenotípica criteriosa é indispensável para a formulação de hipóteses diagnósticas sindrômica e nosológica consistentes. Para tanto, é imprescindível investir na formação de médicos geneticistas e ampliar sua inserção nos serviços públicos de saúde (10).

Também merece destaque a necessidade de capacitação de outros profissionais constituintes de equipes básicas de saúde para o reconhecimento de fatores relacionados à etiologia e manejo dos defeitos congênitos (10, 146). Estudos desenvolvidos no âmbito do PCFB, realizado com médicos, enfermeiros e dentistas vinculados à atenção básica do SUS, que atendem pessoas com FOT, demostraram que grande parte desses profissionais não atende às necessidades na área. Os resultados corroboram a literatura tornando evidente a necessidade de qualificação em genética desses profissionais e a importância da adoção de estratégias voltadas à instituição de programas de educação continuada, além de reforçar os vínculos entre a atenção básica e as equipes especializadas (147, 148).

A adoção conjunta dessas medidas, aliadas à ampliação do acesso a exames complementares e à implantação de centros de referência para realização de testes diagnósticos específicos, aperfeiçoariam e otimizariamos recursos humanos e a infraestrutura para diagnóstico e, certamente trariam impacto positivo na melhoria da prevenção dos defeitos congênitos no SUS (10).

A investigação por meio da citogenética convencional apresenta limitações para triagem de anormalidades cromossômicas em pacientes com defeitos congênitos e/ou déficits cognitivos (26, 42, 44), contudo nesta casuística foi relevante em um paciente (caso 72).

O caso 72, inicialmente investigado por exame de cariótipo, revelou uma aberração cromossômica de novo, (46,XX,add(22)(q13)). Esta só pôde ser completamente esclarecida após a realização de aGH, o resultado foi definido como: 46,XX,ins(22;16)(q13;p13.2p13.3).ish ins(22;16)(RP11-35P16+, RP11- 27M24+). arr16p13.2p13.3(85,880-9,413,353)×3 dn, 22q13.33(51,140,789- 51,197,838)×1 dn. A utilização da aGH nesse caso foi essencial para revelar a natureza do material adicional, reforçando sua utilidade na investigação de pessoas com anomalias congênitas (26, 42, 44). O exame de cariótipo dos genitores foi fundamental para o aconselhamento genético, já que a técnica de aGH não diagnostica translocações equilibradas.

6.3. Caracterização genômica 6.3.1. Análise das CNVs 6.3.1.1. CNVs Benignas

Apenas três CNVs classificadas como benignas continham genes do OMIM (caso 53, Figura 7 e caso 72, Figura 8). A análise dos dois casos pelo ChAS revelou parâmetros Log2 Ratio e Smooth Signal inconclusivos para as variações detectadas. Além disso, após análise dos genes utilizando as bases do DECIPHER, Ensembl e OMIM, não se verificou correlação com os fenótipos

dos indivíduos. Além disso, nos dois casos os parâmetros Log2 Ratio e Smooth Signal também não foram conclusivos para as variações detectadas.

6.3.1.2. CNVs de Relevância Incerta

A investigação de genitores é fundamental na abordagem das CNVs e deve ser prevista, no contexto de averiguação diagnóstica visando à classificação entre variações herdadas e variações de novo. Essa investigação é essencial nos casos em que a relevância clínica das CNVs é incerta (45, 46, 48).

Neste estudo, parte da estratégia adotada baseou-se no contexto assistencial, na qual os pacientes foram convidados para participar da pesquisa no momento em que suas consultas médicas, agendadas conforme a rotina do serviço, eram realizadas. Assim, apesar de estar prevista, a coleta de material biológico dos genitores não foi efetuada em muitos serviços, visto que nem sempre o casal estava disponível na ocasião. Por esse motivo, em seis casos, as estratégias confirmatórias aguardam a presença dos genitores.

A investigação de genitores é mais um fator a ser levado em consideração ao planejar a inclusão da técnica de microarray no SUS, já que o custo diagnóstico em casos onde forem identificados CNV de significado incerto deve ser considerado.

Os parâmetros que permitem aferir as propriedades das CNVs individualmente, gerados pelo ChAS, como Allele Peaks, Log2 ratio e SmoothSignal, além do número de marcadores (sondas) da região, também são considerados nas análises.

O caso 14 apresentava suspeita de Síndrome de Simpson-Golabi- Behmel. O paciente apresentava FP associada a luxação congênita do quadril, hipertelorismo, macrocefalia relativa, agenesia do corpo caloso, mamilo

extranumerário, anormalidades das mãos que simulam uma forma leve de ectrodactilia e RDNPM.

Duas CNVs foram detectadas por meio da técnica de aGH: uma duplicação de 349 kb em 1p12 contendo três genes do OMIM (Figura 8) e uma deleção de 163 kb em 8p11.22 com poucas sondas na região e nenhum gene do OMIM. Após pesquisa nos bancos de dados do Ensembl, Decipher e OMIM, nenhuma associação entre os genes presentes na referida duplicação (HAO2, HSD3B1 e HSD3B2) e FOT foi encontrada. O gene HAO2 é expresso predominantemente no fígado e rins e relaciona-se com atividade da oxidase de2-hidroxiácido. Os genes HSD3B1 e HSD3B2, expressos principalmente nas suprarrenais e gônadas, estão envolvidos na biossíntese de todas as classes dos hormônios esteróides. Mutações em HSD3B1 e HSD3B2 estão associadas à deficiência da 3-beta-hidroxiesteróide desidrogenase tipo II, cujo fenótipo é de distúrbio da diferenciação do sexo.

Além disso, o conjunto de defeitos congênitos apresentado pelo paciente não se enquadra nos fenótipos OMIM exibidos pelo ChAS para essa CNV. A investigação dos genitores por aGH é necessária para determinação se este achado seria herdado ou de novo, assim como a reavaliação futura visando nova correlação genótipo-fenótipo.

O caso 23 apresentou uma duplicação 2q13 (476 kb) envolvendo três genes do OMIM (Figura 10). O paciente apresenta microcefalia, exoftalmia, hipertelorismo ocular, fenda palpebral oblíqua superior, assimetria craniana, nariz plano, fenda palatina e orelhas baixo-implantadas. A RNM revelou assimetria dos globos oculares. Os genes presentes (RGPD6, MALL e NPHP1) e os fenótipos OMIM não revelaram similaridades com o fenótipo do paciente. O gene RGPD6, em associação com outros genes da mesma família, está implicado com a patogênese da neuroretinopatias. O MALL está relacionado com transporte de membrana endotelial e o NPHP1 codifica umaproteína envolvida com o controle da divisão celular. Mutações em NPHP1 estão

implicadas com Nefronofitise Juvenil Familiar tipo 1, Síndrome Senior-Loken tipo 1 e com Síndrome de Joubert tipo 4 (OMIM).

Após pesquisa nos bancos de dados (UCSC e DECIPHER) foram encontrados dois pacientes (275093 e 248451) com CNV nessa localização genômica, de tamanhos 4,3 Mb e 3,9 Mb, respectivamente, que compartilham hipertelorismo ocular e orelhas baixo-implantadas. Em ambos, a patogenicidade dessas CNV também é desconhecida. Aguarda-se a investigação de genitores.

O caso 24, paciente do sexo feminino, apresenta microcefalia, FLP bilateral associada a cardiopatia complexa envolvendo comunicação interatrial e interventricular além de dupla via de saída do ventrículo direito. O ChAS detectou duas CNVs: duplicação 16q24.3 (347 kb) com sete genes do OMIM e deleção Xq27.2 (201 kb) com dois genes do OMIM. A região da referida duplicação é coberta por apenas 94 sondas, além de que os parâmetros do Allele Peaks e Smooth Signal também não foram conclusivos (Figura 11).

Apenas a segunda CNV apresentou alguma analogia com o quadro da paciente. Embora os dois genes presentes nessa deleção Xq27.2 (SPANXA1 e SPANXA2), estejam expressos no testículo e desenvolvam funções relacionadas à espermatogênese, três fenótipos OMIM revelados pelo ChAS (Síndrome Tóracoabdominal [313850] e dois loci relacionados a Microftalmia [309800 e 301590]) cursam com FOT. A Síndrome Tóracoabdominal por sua vez está relacionada principalmente a malformações graves envolvendo a parede abdominal e o aparelho cardiovascular caracterizando a pentalogia de Cantrell. Aguarda-se a investigação dos genitores.

O caso 39 apresenta hipertelorismo ocular, pálpebras com fendas de inclinação superior, FP, micrognatia, comunicação interatrial e defeito de redução de membros do tipo intercalar longitudinal, com a presença de quatro

dedos em cada uma das extremidades. Foi detectada uma duplicação 22q11.1 (658 Kb) com um único gene do OMIM (Figura 12). Este gene (XKR3) está envolvido com o transporte de membrana em um dos vários grupos sanguíneos (complexo XK/Kell).

No entanto, um dos fenótipos OMIM relacionados a essa região genômica envolve a Síndrome Cat Eye (CES) (OMIM 115470), síndrome polimalformativa, com grande variabilidade clínica, caracterizada por dismorfismo craniofacial associado a colobomas oculares e atresia anal, além de outras malformações como FL/P e aplasia radial. Geralmente está relacionada à presença de um cromossomo marcador supranumerário, em geral com dois centrômeros e bi satélite, representando uma dup inv (22)(q11). Sua região crítica, localizada próxima à região crítica da Síndrome Velocardiofacial (Sdel22q11), contém um gene candidato provisório, não codificador proteico (CECR7), que está duplicado na síndrome (OMIM). Esse gene também está presente na CNV do paciente.

Estudos complementares, com MLPA ou FISH direcionados a região crítica da CES estão indicadas para análise dessa região crítica estão sendo programados.

O caso 44 apresenta fronte proeminente, fendas palpebrais de inclinação inferior, lábios finos, FP e graus variados de sindactilia dos dedos das mãos e dos pés. O ChAS revelou uma duplicação 16q24.3 (347 kb) com sete genes do OMIM (Figura 13). Da mesma forma descrita para o caso 24 esta região tem apenas 94 marcadores e os parâmetros do Allele Peaks, Log2 Ratio e Smooth Signal também foram inconclusivos. As análises não evidenciaram correlação entre os genes e os fenótipos OMIM com o quadro clínico do paciente e, embora haja similaridade entre o quadro clínico do paciente e a Sindactilia do tipo Cenani-Lenz, síndrome relacionada a mutações no gene LRP4, localizado em 11p11.2, o presente caso não revelou nenhuma variante nesta região. Investigações complementares, clínicas e moleculares, inclusive radiográficas, estão previstas.

O caso 70 apresenta RDNMP, microcefalia, fronte levemente hirsuta, dismorfismo craniofacial com sobrancelhas arqueadas, cílios longos, fendas palpebrais com inclinação superior com epicanto e hipertelorismo ocular, FLP bilateral, micrognatia, orelhas dismórficas e baixo-implantadas com fosseta pré-auricular bilateral. Apresenta ainda pescoço curto, mamilos extranumerários, comunicação interatrial, hipoplasia de pequenos lábios, mancha mongólica sacral e clinodactilia de quintos dedos. Os achados da ultrassonografia abdominal sugerem atresia de vias biliares.

No sentido de concluir a investigação foi realizada avaliação neurológica com indicação de exame de imagem do encéfalo sob sedação e avaliação com hepatologista que sugeriu biópsia hepática para avaliar possibilidade de cirrose hepática. No entanto, a paciente não retornou para complementação diagnóstica e seguimento clínico.

A análise por meio do ChAS revelou três CNVs: duas deleções em 9q34.3: (246 kb) com 8 genes OMIM (NOTCH1, EGFL7, MIR126, AGPAT2, FAM69B, LCN10, LCN6, LCN68) e (162 kb) com 9 genes OMIM (ABC1, ABCA2, FUT7, NPDC1, ENTPD2, SAPCD2, MAN1B1, DPP7, GRIN1, LRRC26), além de uma deleção em 17q25.3 (165 kb) com 4 genes OMIM (BAIAP2, AATK, MIR338, CEP131). Os parâmetros Allele Peaks, Log2 Ratio e Smooth Signal revelados pelo ChAS não se revelaram completamente conclusivos) (Figura 14). Apesar dos parâmetros, pesquisas nos sites DECIPHER, Ensembl e OMIM não revelaram variantes semelhantes, nem similaridades com os genes envolvidos, além de que nenhum fenótipo OMIM foi compatível com o fenótipo da paciente. Tentativas de contato estão sendo realizadas com a família a fim de retomar o seguimento clínico.

6.3.1.3. CNVs patogênicas

O estudo por meio de aGH na presentecasuística revelou desequilíbrios genômicos potencialmente patogênicos em 4/22 (18,2 %) dos pacientes estudados. A correlação genótipo-fenótipo utilizando os resultados de microarray possibilitou o diagnóstico em dois indivíduos (casos 53 e 72). Os

(casos 12 e 61) aguardam validação das CNVs. Esse fato corrobora a eficácia dessas técnicas para triagem de defeitos congênitos e retardo do desenvolvimento neuropsicomotor/déficit intelectual. Essa frequência é semelhante àquelas descritas por Park et al. (2013), Anh et al. (2013), Hillman et al. (2013) e Dorfman e cols. (2015) (43, 44, 49, 149). Os dados também reforçam que exames complementares para identificação de defeitos congênitos associados são fundamentais para a interpretação apropriada dos achados citogenômicos.

Caso 12: primeiro filho de casal não consanguíneo com suspeita prévia de Síndrome da Lisencefalia Ligada ao X (Figura 14). O cariótipo desse paciente revelou uma inversão pericêntrica do cromossomo 9 com pontos de quebra em p12q12. No entanto, a análise com microarray desse caso não detectou nenhum desequilíbrio genômico nessa região.

A duplicação detectada em Xq24-Xq26.1 (Figura 16) abrange 38 genes OMIM (RHOXF2, RHOXF1, ZBTB33, LAMP2, CUL4B, MCTS1, C1GALT1C1, CT47B1, CT47A11, CT47A1, CT47A2, CT47A3, CT47A4, CT47A8, CT47A9, CT47A6, CT47A7, GLUD2, GRIA3, THOC2, XIAP, STAG2, SH2D1A, TENM1, ACTRT1, SMARCA1, OCRL, APLN, XPNPEP2, SASH3, ZDHHC9, UTP14A, BCORL1, ELF4, AIFM1, RAB33A, SLC25A14, GPR119) e 34 fenótipos relacionados descritos no OMIM. Entre esses, apenas as Síndromes Tóracoabdominal (OMIM 313850) e Cranioesquelética (OMIM 300712) cursam com fenda orofacial.

A revisão da literatura e as consultas às bases do DECIPHER, UCSC e do Ensembl permitiram identificar alguns casos relacionados: pacientes 283869 e 256234 do DECIPHER, além dos relatos de Di Benedetto et al. (2014) (150).

O paciente 283869 exibe heterotopia periventricular associada à hipoplasia do vermis cerebelar, déficit cognitivo e dislexia. Apresenta duplicação de novo de 209 kb nessa região ([hg19]123,388,516-123,598,378), provavelmente patogênica, com 3 genes OMIM (STAG2, SH2D1A, TENM1), também presentes no caso 12, e um pseudogene (NPM1P34). Mutações em

SH2D1A estão relacionadas a uma rara síndrome de imunodeficiência (Doença de Duncan ou Síndrome Linfoproliferativa ligada ao X – OMIM 308240). O gene STAG2 codifica uma proteína que participa do complexo de coesinas, envolvido com o processo de regulação na separação das cromátides durante a divisão celular e em outros processos como replicação, controle da expressão de genes, formação de heterocromatina e reparo do DNA. Sua inativação está relacionada a casos de aneuploidia e cânceres. TENM1 é expresso em neurônios e relacionado à sinalização celular (OMIM).

O paciente 256234, sexo feminino, apresenta apenas duplicação em Xq24-Xq26.1 ([hg19]120424371-129053642) com 8,6 Mb, de novo constitutiva, com patogenicidade desconhecida e fenótipo caracterizado por comportamento agressivo, hiperatividade e déficit cognitivo, sem dismorfismos e defeitos congênitos associados. Esta CNV comporta 14 genes descritos no OMIM, todos presentes na duplicação do caso 12: glutamate receptor, ionotropic, AMPA 3 (GRIA3), THO complex 2 (THOC2), X-linked inhibitor of apoptosis, E3 ubiquitin protein ligase (XIAP), stromal antigen 2 (STAG2), SH2 domain containing 1A(SH2D1A), teneurin transmembrane protein 1 (TENM1), actin- related protein T1 (ACTRT1), SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily a, member 1 (SMARCA1), oculocerebrorenal syndrome of Lowe (OCRL), apelin (APLN), X-prolyl aminopeptidase (aminopeptidase P) 2, membrane-bound (XPNPEP2), SAM and SH3 domain containing 3 (SASH3), zinc finger, DHHC-type containing 9 (ZDHHC9), UTP14A small subunit (SSU) processome component (UTP14A).

Duplicações descritas em Xq25 são geralmente grandes e associadas a fenótipos heterogêneos. No entanto, casos com pequenas duplicações nessa região, envolvendo os genes GRIA3 e STAG2, foram descritos em associação com um fenótipo caracterizado por deficiência intelectual e dismorfismo facial específico, que consiste em face hipotônica com hipoplasia malar, lábio superior volumoso e prognatismo, além de atraso na aquisição da linguagem (Síndrome da Microduplicação Xq25). A maioria apresenta déficit cognitivo de grau leve a moderado. Dois casos apresentaram hipoplasia da região posterior do corpo caloso e vermis cerebelar pequeno (150, 151, 153).

Di Benedetto et al. (2014) descrevem duas famílias, com microduplicações em Xq25 que variam entre 556 e 630 kb, com evidente padrão de transmissão ligado ao X. Em comum, esses rearranjos cromossômicos envolvem os genes THOC2 (THO complex 2), implicado em processamento e transporte do mRNA, XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis), inibidor da apoptose e STAG2 (stromal antigen 2), relacionado o complexo de proteínas coesinas. Embora os dois últimos sejam expressos no SNC, não há descrições de sua associação com distúrbios neurológicos (150).

Existem relatos do envolvimento de THOC2 com dismorfismos faciais, distúrbios do comportamento e psicomotores, atraso na aquisição da fala e hipoplasia cerebelar, além de associações com a Síndrome do X frágil. Por sua vez, mutações de XIAP estão relacionadas a ocorrência de um raro distúrbio linfoproliferativo ligado ao X (OMIM: 300635) e com apoptose neuronal. O aumento da sua expressão está associado a anormalidades neurológicas relacionadas a autismo e déficit intelectual. Anormalidades do XIAP e em outros genes relacionados com as coesinas têm sido também associadas a anomalias craniofaciais e à Síndrome de Cornélia de Lange (OMIM 122470) (150).

Embora o caso 12 não apresente grande semelhança fenotípica com nenhum dos pacientes 283869 e 256234 do DECIPHER e com os relatos de Di Benedetto et al. (2014), eles compartilham regiões genômicas sobrepostas (150). Nesse contexto, é possível que genes duplicados no caso 12 tenham contribuído, total ou parcialmente, para as alterações observadas em seu fenótipo.

Estes achados serão complementados com a realização de estudos moleculares, inclusive de inativação do X, e da avaliação dos genitores, e interprestados à luz de novos conhecimentos dos genes nesta região e suas respectivas funções.

Caso 53: a deleção encontrada em 17p13.3 (Figura 18) se traduz emhaploinsuficiênciade 30 genes do OMIM, entre eles YWHAE e CRK. Este

achado foi confirmado por aCGH (Figura 19). Microdeleções nesta região cromossômica são reconhecidamente associadas a distúrbios de migração neuronal e o gene PAFAB1H1 é o principal envolvido.