FA C U LD A D E D E F A R M Á C IA R ita A ze ve do T eix eir a. E stu do d e i nf usõ es e d eco cçõ es d e f olh as d e Ac tin idia a rg uta : C ara cte riza çã o q uím ica , b ioa tivid ad e e via bilid ad e c elu lar
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Estudo de infusões e decocções de
folhas de Actinidia arguta: Caracterização
química, bioatividade e viabilidade celular
Rita Azevedo Teixeira
M
2018
M
.FFUP
Estudo de infusões e decocções de
folhas de Actinidia arguta:
Caracterização química, bioatividade
e viabilidade celular
Rita Azevedo Teixeira
Dissertação do 2º Ciclo de Estudos Conducente ao Grau de Mestre
em Controlo de Qualidade
Área de especialização Águas e Alimentos
Trabalho realizado sob a orientação da Doutora Francisca Rodrigues
e da Professora Doutora Maria Beatriz Oliveira
ii De acordo com a legislação em vigor, não é permitida a reprodução de qualquer parte desta dissertação/tese.
iii
Agradecimentos
Todo o meu percurso durante este Mestrado só foi possível graças à colaboração e apoio de várias pessoas, sem elas não seria possível. Quero deixar aqui o meu reconhecimento e profundo agradecimento para todas elas.
À Professora Doutora Beatriz Oliveira pela sua disponibilidade com que me recebeu e, acima de tudo, por me ter dado a oportunidade de realizar este estudo no seu grupo de investigação.
À Doutora Francisca Rodrigues agradeço a sua constante disponibilidade, preocupação, espírito crítico e paciência que demonstrou durante estes meses. Por todos os ensinamentos que me transmitiu, pela forma incansável com que me acompanhou ao longo deste ano e, pronta colaboração em todas as minhas dúvidas. Obrigada pela confiança e encorajamento que sempre me deu.
À Diana Pinto agradeço a sua receção carinhosa, disponibilidade constante e paciência para me ajudar sempre que precisei.
Agradeço aos meus amigos, em especial à Lídia Rocha, Diana Silva e Diana Miller, por estarem sempre presentes e terem sempre uma palavra de apoio e força para levar a bom porto esta minha etapa.
Agradeço aos meus pais e ao meu irmão por todo o amor e força que me dão todos os dias, por acreditarem sempre em mim e nunca me deixarem desistir dos meus sonhos. Sou uma sortuda por os ter sempre comigo.
Às minhas colegas de trabalho por toda a compreensão e incentivo que me dão todos os dias.
iv
Resumo
A Actinidia arguta, originária do continente asiático, tornou-se mundialmente popular pelas propriedades sensoriais e nutricionais dos seus frutos, vulgarmente conhecidos por baby kiwi. Os compostos bioativos descritos nesta espécie são responsáveis por diferentes propriedades biológicas, como a atividade antioxidante, antimicrobiana e anti-inflamatória. Durante o processo de crescimento e colheita do fruto inúmeras folhas caem e permanecem no solo, podendo ser uma fonte de compostos bioativos. A valorização deste subproduto, para além de ser uma necessidade, representa também uma oportunidade para a obtenção de novos produtos com valor acrescentado e elevado impacto económico.
O objetivo deste estudo foi determinar e comparar o teor de compostos bioativos em infusões e decocções de folhas de A. arguta, através da determinação do teor de polifenóis e de flavonoides totais (TPT e TFT, respetivamente). Foi igualmente determinada a atividade antioxidante e a capacidade de captação de espécies reativas, nomeadamente do anião superóxido (O2•-), do peróxido de hidrogénio (H2O2), do ácido hipocloroso (HOCl), do radical peroxilo (ROO•) e do óxido nítrico (•NO). O perfil fenólico foi estabelecido por HPLC-DAD-MS e os efeitos da viabilidade celular foram avaliados em células intestinais (Caco-2 e HT29-MTX).
Tanto a infusão como a decocção de folhas de A. arguta apresentaram uma composição rica em compostos fenólicos e uma boa atividade antioxidante (1181 e 1332 µmol de equivalentes de sulfato ferroso (ESF)/g de extrato seco no ensaio FRAP e valores de IC50 de 229,74 e de 251,85 µg/mL no método do radical DPPH• para a infusão e decocção, respetivamente). A decocção apresentou resultados superiores de TPT e TFT (106,95 mg de equivalentes de ácido gálhico (EAG)/g de extrato seco e 84,42 mg de equivalentes de catequina (ECA)/g de extrato seco, respetivamente) e uma maior atividade antioxidante, sendo considerado o extrato mais promissor. Quanto à atividade de captação de espécies reativas, ambos os extratos mostraram-se eficazes na captação do O2•-, HOCl e •NO. No ensaio de viabilidade celular não se verificaram efeitos adversos em ambas as linhas celulares na concentração máxima testada (1000 µg/mL). O perfil fenólico obtido por HPLC-DAD-MS permitiu detetar a presença de ácidos fenólicos e derivados de flavonoides.
Em suma, os resultados obtidos demonstram que a infusão e a decocção de folhas de A. arguta são uma fonte de compostos bioativos com potencial antioxidante e futuras aplicações na indústria alimentar.
Palavras-chave: Actinidia arguta; Infusão; Decocção; Compostos bioativos; Atividade
v
Abstract
Actinidia arguta is a kiwi species from Asia that became widely famous for the sensory and nutritional properties of its fruits, commonly known as baby kiwi. The bioactive compounds present in this species may play different biological properties, including antioxidant, antimicrobial or anti-inflammatory. During the fruit harvesting process, huge amounts of leaves fall and remain in the soil. The use of this fruit by-product as a source of bioactive compounds, and their potential application in different industries, is a promising field and an opportunity to obtain new products with added value and high economic impact. The objective of this study was to determine and compare the bioactive compounds in A. arguta leaves infusion and decoction. The total phenolic and flavonoid content (TPC and TFC, respectively) and the antioxidant activity (by DPPH• and FRAP assays) were evaluated. In addition, the scavenging activity of reactive species, namely superoxide anion (O2•-), hydrogen peroxide (H2O2), hypochlorous acid (HOCl), peroxyl radical (ROO•) and nitric oxide (•NO) was analyzed. The phenolic profile was established by HPLC-DAD-MS and the cell viability effects were evaluated in intestinal cells (Caco-2 and HT29-MTX).
A. arguta leaves infusion and decoction demonstrated a good composition in phenolic compounds and a high antioxidant activity. The decoction presented the highest TPC and TFC (namely 106.95 mg of gallic acid equivalents (GAE)/g dry extract and 84.42 mg of catechin equivalents (CAE)/g dry extract) as well as antioxidant activity (namely 1332 μmol of ferrous sulfate equivalents (FSE)/g dry extract in the FRAP assay and an IC50 of 229.74 in the DPPH• radical assay). Regarding the reactive species scavenging assays, both extracts were effective in the uptake of O2•-, HOCl and •NO. Regarding cell viability, both extracts did not present adverse effects in Caco-2 and HT29-MTX until the maximum concentration tested (1000 μg/mL).
The phenolic profile obtained by HPLC-DAD-MS showed the presence of phenolic acids and flavonoid derivatives in both extracts and in similar percentages.
In summary, the obtained results demonstrated that A. arguta leaves infusion and decoction are a source of different compounds with biological potential and application. From the industrial application standpoint, these results might be useful to design novel food products with high levels of bioactive compounds.
Keywords: Actinidia arguta; Infusions; Decoctions; Bioactive compounds; Antioxidant
vi
Índice
Agradecimentos ... iii Resumo ... iv Abstract ... v Índice ... viÍndice de Figuras ... viii
Índice de Tabelas ... x
Lista de Abreviaturas ... xi
1. Introdução ... 1
1.1. Actinidia arguta ... 4
1.2. Valorização das folhas de A. arguta ... 7
1.3. Sustentabilidade de A. arguta ... 8
1.4. Composição química das folhas de A. arguta ... 11
1.4.1. Metabolitos nas plantas ... 11
1.4.2. Compostos bioativos ... 12
1.4.2.1. Compostos fenólicos ... 13
1.5. Potenciais propriedades biológicas ... 17
1.5.1. Atividade antioxidante ... 17
1.5.2. Atividade anti-inflamatória ... 20
1.5.3. Atividade antimicrobiana ... 21
2. Objetivos ... 23
3. Materiais e Métodos ... 25
3.1. Colheita das Amostras ... 26
3.2. Reagentes e Padrões ... 26
3.3. Preparação das infusões e decocções ... 27
3.4. Avaliação da cor ... 28
3.5. Determinação do pH ... 29
3.6. Determinação de Compostos Bioativos ... 30
3.6.1. Teor de Polifenóis Totais (TPT) ... 30
3.6.2. Teor de Flavonoides Totais (TFT) ... 30
3.7. Atividade antioxidante in vitro ... 31
3.7.1. Método do radical DPPH• ... 31
3.7.2. Avaliação do poder antioxidante por redução do ião férrico (FRAP) ... 31
3.8. Capacidade de captação de espécies reativas ... 32
vii
3.8.2. Determinação da capacidade de captação do O2•- ... 32
3.8.3. Determinação da capacidade de capatação do H2O2 ... 33
3.8.4. Determinação da capacidade de captação do HOCl ... 33
3.8.5. Determinação da capacidade de captação do ROO• ... 33
3.8.6. Determinação da capacidade de captação do •NO ... 34
3.9. Determinação do teor de vitamina C ... 34
3.9.1. Preparação das amostras ... 34
3.9.2. Análise cromatográfica ... 35
3.10. Análise dos compostos fenólicos por HPLC-DAD-MS ... 35
3.11. Viabilidade celular ... 36
3.11.1. Linhagens celulares ... 36
3.11.2. Cultura celular ... 36
3.11.3. Ensaio da viabilidade celular ... 37
3.12. Análise estatística ... 37 4. Resultados e Discussão ... 38 4.1. Rendimento de extração ... 39 4.2. Avaliação da cor ... 39 4.3. Determinação do pH ... 40 4.4. Compostos bioativos ... 41 4.5. Atividade antioxidante ... 45 4.5.1. Método do radical DPPH• ... 45
4.5.2. Avaliação do poder antioxidante por redução do ião férrico (FRAP) ... 46
4.5.3. Correlação entre os compostos biativos e a atividade antioxidante ... 47
4.6. Capacidade de captação de espécies reativas ... 49
4.6.1. Determinação da capacidade de captação do O2•- ... 51
4.6.2. Determinação da capacidade de capatação do H2O2 ... 51
4.6.3. Determinação da capacidade de captação do HOCl ... 52
4.6.4. Determinação da capacidade de captação do ROO• ... 53
4.6.5. Determinação da capacidade de captação do •NO ... 54
4.7. Determinação do teor de vitamina C ... 55
4.8. Análise dos compostos fenólicos por HPLC-DAD-MS ... 56
4.9. Viabilidade celular ... 60
5. Conclusão ... 64
viii
Índice de Figuras
Figura 1 – Distribuição mundial do consumo de chá em 2009 (adaptado de 14). ... 3
Figura 2 – Fruto originário da A. arguta (adaptado de 21). ... 5
Figura 3 – Actinidia arguta (adaptado de 24). ... 5
Figura 4 – Flor masculina e feminina de A. arguta (adaptado de 25). ... 6
Figura 5 – Algumas variedades de A. arguta (adaptado de 28). ... 6
Figura 6 – Interligação das áreas envolvidas no desenvolvimento sustentável (adaptado de 42). ... 8
Figura 7 – Objetivos e metas de desenvolvimento sustentável definidos pelas Nações Unidas (adaptado de 52). ... 10
Figura 8 – Principais fatores que podem afetar o teor final de metabolitos secundários nas plantas (adaptado de 54-56). ... 12
Figura 9 – Ácidos fenólicos: (A) ácidos hidroxibenzoicos; (B) ácidos hidroxicinâmicos (adaptado de 64). ... 14
Figura 10 – Estrutura genérica dos flavonoides e as principais classes de flavonoides (adaptado de 61). ... 15
Figura 11 – Reações da formação de ERO. SOD – Superóxido-dismutase; CAT – Catalase (adaptado de 86). ... 19
Figura 12 – Processo de realização da infusão. ... 27
Figura 13 – Processo de realização da decocção... 28
Figura 14 – Colorímetro (Chroma Meter CR-410, Konica Minolta, Tóquio, Japão). ... 28
Figura 15 – Espaço de cor L*a*b*, definido pela CIE (adaptado de 118). ... 29
Figura 16 – Equipamento pHmeter (Basic 20+, Crison, Barcelona, Espanha). ... 29
Figura 17 – Leitor de Microplacas Synergy HT (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA). ... 30
Figura 18 – Comparação do pH de bebidas comercializadas nos EUA (adaptado de 135). ... 41
Figura 19 – Mecanismo de reação do DPPH• com antioxidante (AH) (adaptado de 148). ... 45
Figura 20 – Perfil cromatográfico dos compostos fenólicos obtidos por HPLC-DAD-MS na (a) decocção de folhas A. arguta e (b) na infusão de folhas A. arguta. Condições cromatográficas: descritas na metodologia. A identificação e informação referente a cada pico está apresentada na Tabela 10. ... 56
ix
Figura 21 – Efeito da exposição a diferentes concentrações da infusão e decocção de folha
de A. arguta na viabilidade de HT29-MTX. Os valores são expressos como Média ± Desvio Padrão (n=3). ... 61
Figura 22 – Efeito da exposição a diferentes concentrações da infusão e decocção de folha
de A. arguta na viabilidade de Caco-2. Os valores são expressos como Média ± Desvio Padrão (n=3). ... 62
x
Índice de Tabelas
Tabela 1 – Classes de compostos fenólicos presentes nas plantas (adaptado de 59,60).
... 13
Tabela 2 – Principais subclasses dos flavonoides e algumas fontes alimentares (adaptado
de 75,76). ... 16
Tabela 3 – Gradiente de eluição utilizado na análise dos compostos fenólicos. ... 36 Tabela 4 – Rendimento de extração dos diferentes extratos preparados. ... 39 Tabela 5 – Avaliação dos diferentes parâmetros da cor (L*, a* e b*) e do pH da infusão e
decocção de folhas de A. arguta. ... 40
Tabela 6 – Teor de polifenóis (TPT) e flavonoides totais (TFT), avaliação do poder
antioxidante por redução do ião férrico e atividade antioxidante determinada pelo método DPPH• presentes nos diferentes extratos de folhas de A. arguta. ... 43
Tabela 7 – Correlação de Pearson entre os diferentes ensaios efetuados na infusão (TPT,
TFT, FRAP e DPPH). ... 47
Tabela 8 – Correlação de Pearson entre os diferentes ensaios estudados na decocção
(TPT, TFT, FRAP e DPPH). ... 48
Tabela 9 – Capacidade de captação pelas infusões e decocções das folhas de A. arguta
do radical peroxilo (ROO•), radical superóxido (O2•-), peróxido de hidrogénio (H2O2), ácido hipocloroso (HOCl) e radical óxido nítrico (•NO). ... 50
Tabela 10 – Tentativa de identificação por HPLC-DAD-MS dos compostos fenólicos na
xi
Lista de Abreviaturas
AA Ácido araquidónico
ADN Ácido desoxirribonucleico
AAPH 2-azobis (2-amidinopropano) dicloridrato
API Atmospheric Pressure Ionization (Ionização por Pressão Atmosférica)
BHA 2-terc-butil-4-hidroxianisol
BHT 2,6-di-terc-butil-4-metilfenol
CAT Catalase
CIE Comission Internationale de l’Eclairage COX Cicloxigenase
DAD Diode Array Detector (Detetor de Díodos)
DAF-2 4,5-diaminofluoresceína
DHR Dihidrorodamina 123
DMEM Meio de Eagle modificado por Dulbecco
DMSO Dimetil sulfóxido
DPPH 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo
DPPH• Radical 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo
EAG Equivalentes de ácido gálhico
ECA Equivalentes de catequina
ECG Epicatequina-3-galhato
EGC Epigalhocatequina
EGCG Epigalhocatequina-3-galhato
ERA Espécies reativas de azoto
ERO Espécies reativas de oxigénio
ESF Equivalentes de sulfato ferroso
ESI Electrospray Ionization (Ionização por Electrospray)
EUA Estados Unidos da América
FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations
FAP Fator de ativação plaquetária
FNT Fator de necrose tumoral
FRAP Ferric-Reducing Antioxidant Power (Poder antioxidante por redução do ião férrico)
HBSS Solução Balanceada de Hank’s
HPLC High Performance Liquid Chromatography (Cromatografia líquida de alta resolução)
xii
HO2• Radical hidroperoxilo
HOCl Ácido hipocloroso
IC50 Metade da concentração máxima inibitória
IL Interleucinas
LDL Low Density Lipoprotein (Lipoproteínas de Baixa Densidade)
LER Lista Europeia de Resíduos
LOX Lipoxigenase
MPO Mieloperoxidase
MS Mass Spectrometry (Espectrometria de Massa)
MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio
NADH Dinucleótido ᵦ-Nicotinamida Adenina NBT Cloreto de azul nitrotetrazólio
•NO Radical óxido nítrico
NOC-5 3-(Aminopropyl)-1-hydroxy-3-isopropyl-2-oxo-1-triazene (3- (Aminopropil)-1-hidroxi-3-isopropil-2-oxo-1-triazeno)
O2•- Anião superóxido
OH• Radical hidroxilo
ONOO- Peroxinitrito
ONOOH Ácido peroxinitroso
ORAC Oxygen Radical Absorbance Capacity (Capacidade de Absorção do Radical de Oxigénio)
PG Prostaglandinas
PMS Phenazine metossulfate (Metossulfato de fenazina)
ROO• Radical peroxilo
SOD Superóxido-dismutase
TFT Teor de flavonoides totais
TPT Teor de polifenóis totais
TPTZ 2,4,6-tris(2-piridil)-s-triazina
Tr Tempo de retenção
Trolox Ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico
1
2
Introdução
Desde há milhares de anos que a medicina recorre ao uso de plantas para prevenir e tratar doenças, de modo particular a medicina tradicional. A medicina tradicional é definida como “o conhecimento, habilidade e práticas baseadas nas teorias, crenças e experiências indígenas de diferentes culturas, utilizadas na manutenção da saúde e na prevenção, diagnóstico, melhoria ou tratamento de doenças físicas e mentais” (1). Os primeiros registos históricos da utilização de infusões de ervas para fins medicinais apareceram na primeira farmacopeia chinesa, atribuída ao imperador chinês Shennong Bencaojing (3000 a.C) (1). Cerca de 80% da população mundial depende da medicina tradicional para necessidades básicas de saúde, sendo que a maior parte dessas terapias envolve o uso de extratos de plantas e dos seus compostos bioativos (2).
As plantas representam uma fonte natural de compostos antioxidantes, como por exemplo os compostos fenólicos, os quais têm capacidade de estabilizar ou eliminar os radicais livres antes que estes ataquem alvos biológicos como as proteínas e o ácido desoxirribonucleico (ADN) (3). Os remédios à base de ervas são frequentemente consumidos na forma de infusões, usando partes de plantas secas para a sua preparação (4). Ao longo dos anos, as infusões de ervas adquiriram maior popularidade nos países ocidentais devido à sua fragrância, propriedades antioxidantes, aplicações terapêuticas e outros benefícios para a saúde, nomeadamente propriedades anti-inflamatórias, analgésicas e antimicrobianas (4,5). O termo ‘chá’ refere-se tradicionalmente a bebidas produzidas por infusão em água quente de folhas secas da planta Camelia sinensis, sendo conhecidos três tipos de chá originários desta espécie: chá verde (não fermentado), oolong (semi-fermentado) e chá preto (totalmente fermentado). Estes são categorizados por variações na colheita, processamento e grau de oxidação (fermentação) (6,7). O chá verde tem ganho uma grande atenção em relação aos outros dois tipos de chá por conter um maior teor em compostos fenólicos, uma maior atividade antioxidante e, naturalmente, apresentar mais efeitos benéficos para a saúde (8). Este chá apresenta inúmeras propriedades biológicas, entre elas, atividade antioxidante, antimicrobiana, antidiabética e anticancerígena (8–10). Em relação ao chá verde, os principais polifenóis presentes são as catequinas (6). Dentro deste grupo destacam-se a epigalhocatequina-3-galhato (EGCG), a epicatequina-3-galhato (ECG), a epigalhocatequina (EGC) e a epicatequina, sendo que o EGCG representa 80% do total das catequinas presentes (8). Dos três chás referenciados, o chá verde é o que apresenta um maior teor em catequinas (6).
Para além do chá verde, oolong e chá preto, originários de uma única espécie, existem diversos extratos preparados a partir de folhas, frutos, caules, raízes e flores de outras
3
plantas. Estes extratos são considerados uma fonte alternativa de antioxidantes (5). Os extratos podem ser preparados por infusão (processo de extração de compostos químicos de plantas através da imersão em água quente) ou por decocção (que consiste na fervura da planta previamente imersa em água) (11). A infusão é indicada quando a preparação é feita a partir de partes tenras da planta, como as folhas, as flores e os botões florais, enquanto a decocção é usada para as raízes, os caules e os frutos secos, partes mais duras da planta (12).
A nível mundial, a China é o país com maior produção de chá, seguindo-se a Índia, o Sri Lanka e o Quénia. Atualmente existem mais de 50 países que cultivam chá e mais de 160 têm hábitos de consumo desta bebida (13). Em relação ao consumo de chá, o chá preto é consumido preferencialmente na Europa, América do Norte e Norte de África (exceto Marrocos), enquanto o chá verde é consumido na Ásia e o oolong é popular na China e Taiwan (14). Por seu lado, as infusões de ervas/frutos são populares na América Latina e em alguns países da Europa (Figura 1) (1,14).
Figura 1 – Distribuição mundial do consumo de chá em 2009 (adaptado de 14).
Existe, atualmente, uma crescente necessidade de promoção da saúde e de pesquisa de estratégias para o tratamento de diversas patologias que atingem as sociedades modernas, sendo fundamental o estudo de compostos naturais com atividade antioxidante, que combatam o stress oxidativo, fortemente associado ao envelhecimento e ao desenvolvimento de diversas patologias (3).
Para além disso, a crescente necessidade de recursos alimentares a nível mundial leva a que a utilização industrial de plantas para a formulação de novos produtos se tenha revelado uma mais-valia. E, tendo em conta igualmente o uso racional de plantas, os seus
Chá preto Chá de ervas/frutos Chá verde Outros chás Chá instantâneo Não ilustrado
4
extratos podem contribuir para novos efeitos terapêuticos. Com efeito, existe cada vez mais uma elevada propensão para o uso de plantas em diversos setores, como a indústria farmacêutica, alimentar e cosmética (15).
1.1.
Actinidia arguta
O género Actinidia contém mais de 70 espécies, 15 das quais produzem frutos comestíveis, mas apenas 3 têm importância comercial, nomeadamente, Actinidia deliciosa (vulgarmente conhecida por kiwi verde), Actinidia chinensis (kiwi amarelo) e A. arguta (baby kiwi). Este género é originário da Ásia e tornou-se mundialmente popular pelas propriedades sensoriais e nutricionais dos seus frutos (16). Na realidade, esta planta crescia espontaneamente, desde os tempos remotos, nos bosques do vale do rio Yang Tzu Chiang, na China. Em 1903 verificou-se a introdução do género Actinidia na Europa, mais propriamente em Inglaterra, pelo botânico E.H. Wilson (17). Nos anos seguintes iniciou-se a cultura desta planta pelos neozelandeses, sendo que, em pouco mais de meio século, teve uma enorme difusão pelos diversos continentes. Os neozelandeses elevaram ainda o valor económico desta planta, passando de uma planta que crescia espontaneamente para uma planta cultivada em todo o mundo e com um elevado valor comercial (17,18). Durante muito tempo o fruto da Actinidia foi conhecido pelo nome de groselha chinesa, sendo mais tarde renomeado pelos neozelandeses de kiwi, nome de uma ave que é o símbolo da Nova Zelândia (18).
Recentemente uma das espécies de Actinidia, a A. arguta, passou de uma cultura com pouca expressão para uma cultura com extremo potencial económico. Esta espécie só passou a ser cultivada a partir dos anos 90, no entanto o seu cultivo era direcionado para certos nichos de mercado (19). A A. arguta pertence à família Actinidiaceae e, é vulgarmente conhecida como baby kiwi devido ao seu tamanho reduzido, quando comparado ao kiwi verde. O fruto originário desta planta apresenta a forma de uma baga com pele fina, lisa, suave, sem pêlo e cilindriforme, tendo um tamanho que varia entre 20 e 28 mm de diâmetro e um peso entre 5 e 25 g (16). A coloração pode variar entre verde e bordeaux e a polpa apresenta uma cor verde intensa, apresentando uma pequena columela branca e numerosas sementes de tamanho reduzido (Figura 2) (19,20).
5
Figura 2 – Fruto originário da A. arguta (adaptado de 21).
Uma das características mais apreciada pelos consumidores em relação a este fruto, e que difere das outras espécies acima mencionadas, é o facto de poder ser consumido inteiro, sem ser necessário eliminar a casca. Para além disso, são altamente aromáticos e com um sabor doce e intenso, sendo a maioria dos frutos consumidos crus. No entanto já começam a ser utilizados no processamento de bebidas, vinhos, geleias e gelados (22).
Em relação à planta A. arguta, esta é uma trepadeira perene, de folha caduca, que varia em tamanho, forma e cor, requerendo uma estrutura de suporte para apoio e condução. O seu desenvolvimento é rápido, podendo crescer até 6 metros por estação (19). Apresenta dois tipos de ramos, nomeadamente de madeira (onde só tem gomos foliares) e mistos (com gomos foliares e florais). A coloração dos ramos principais é acastanhada, enquanto os ramos secundários são verdes. Os frutos estão suspensos em cachos múltiplos na planta (Figura 3) (23).
Figura 3 – Actinidia arguta (adaptado de 24).
A folhagem desta trepadeira é densa, verde escura e brilhante (Figura 3). Contudo, dependendo da estação do ano, a coloração das folhas varia. No verão estas apresentam uma cor verde escura e à medida que se aproxima o Outono as folhas vão apresentando uma coloração amarelada. As flores masculinas dispõem de numerosas anteras por flor (cerca de 31), as quais são de cor preta-acinzentada, enquanto os estames são
6
esbranquiçados. As flores femininas possuem um ovário branco esverdeado, pequeno, com cerca de 20 estigmas dispostos em círculo (Figura 4) (19).
Figura 4 – Flor masculina e feminina de A. arguta (adaptado de 25).
A produtividade desta planta deve-se principalmente ao número de flores e à taxa de polinização verificada. Para a obtenção de uma produção em quantidade comercial são necessários cerca de três anos, contudo o seu período de produção é de 60 anos (19). Almeida et al. identificaram e quantificaram os principais compostos fenólicos presentes nas folhas de A. arguta, constatando que os compostos predominantes são os ácidos fenólicos (derivados do ácido hidroxicinâmico) e os flavonoides (flavan-3-ol e derivados de flavonóis) (26).
A espécie A. arguta possui diversas variedades, cada uma com diferentes cores, formas, tamanhos e sabores. As variedades mais conhecidas comercialmente são a Ananasnaja, a Jumbo e a Issai. A Figura 5 evidencia as diferenças nos frutos das diferentes variedades de A. arguta (27).
Figura 5 – Algumas variedades de A. arguta (adaptado de 28).
Adicionalmente, esta espécie é distinguida por resistir a baixas temperaturas, permitindo o seu cultivo em países cujo o clima não é favorável para o cultivo de outras espécies da
Ananasnaya Geneva Issaí Jumbo Ken’s Red Weiki Maki
7
mesma família, como por exemplo A. deliciosa. A maturação desta variedade é precoce, sendo a colheita do fruto realizada em meados de agosto. A sua produção média é de 10 - 12 toneladas por hectare. Após a colheita, o fruto deve ser colocado a uma temperatura entre os 0 e os 2 ºC e a uma humidade relativa entre 90 e 95%, caso contrário a durabilidade do fruto a uma temperatura de 24-25 ºC é de cerca de 3 dias (16,20).
A variedade e a abundância de compostos bioativos depende da localização geográfica e da variação genética (22). O fruto maduro possui entre 18 e 25% do seu teor em sólidos solúveis, sendo rico em vitamina C, cálcio, fósforo, magnésio, fibras, hidratos de carbono e compostos fenólicos (19,29).
A composição química desta espécie confere-lhe diferentes propriedades biológicas, entre as quais se destacam a atividade antioxidante, antidiabética, anti-inflamatória, imunomodeladora, antiproliferativa e antiapoptótica (23,30–33).
Os países com maior produção mundial de baby kiwi são a Nova Zelândia, os Estados Unidos da América (EUA), o Canadá, o Chile, a Rússia, a China, o Japão, a Itália, a Alemanha e a França. A produção mundial de A. arguta corresponde a 17% do total de kiwi produzidos a nível mundial (20). Na Europa, o interesse por esta planta tem aumentado ano após ano, havendo já em Portugal alguns produtores desta espécie. Contudo, mais de 90% da produção é exportada para outros países, dentro e fora da Europa (20).
1.2.
Valorização das folhas de A. arguta
A procura por produtos com compostos naturais tem vindo a aumentar, muito devido à ideia que o consumidor tem sobre os potenciais efeitos tóxicos e cancerígenos associados aos compostos sintéticos (34,35). A utilização de plantas na formulação de novos produtos revela-se assim uma mais valia, tanto para o consumidor como para as diferentes indústrias (36).
A produção de fruta gera alguns resíduos nomeadamente as folhas, que são muitas vezes destacadas para potenciar a exposição solar dos frutos, acabando por funcionar como adubo para os solos. Na realidade, existem poucos estudos sobre as folhas de A. arguta, que não são aproveitadas, embora se tenha demonstrado que são uma fonte promissora de compostos bioativos, principalmente compostos fenólicos (37).
O aproveitamento de subprodutos da produção do baby kiwi pode ser assim uma fonte de compostos naturais, com inúmeras vantagens para a saúde humana. Atualmente já são produzidos muitos produtos alimentares a partir do baby kiwi, tais como licores, bolachas e doces. Contudo, apesar do crescente interesse do consumidor por infusões e decocções, principalmente devido aos potenciais benefícios que estas possam apresentar para a saúde, até ao momento não há estudos que reportem o emprego de folhas de A. arguta
8
com esta finalidade (38). Com efeito, no presente trabalho irão ser destacadas as potencialidades das folhas de baby kiwi para a produção de infusões e decocções.
1.3.
Sustentabilidade de A. arguta
A sustentabilidade é um conceito que garante os direitos e o bem-estar humano sem esgotar ou diminuir a capacidade dos ecossistemas. Este conceito é multidimensional e abrange diferentes vertentes que devem ser consideradas, destacando-se a integridade ambiental, o bem-estar social, a resiliência económica e a boa governação (39,40).
O conceito de sustentabilidade é bastante complexo e surgiu em resposta à crise social e ambiental que o mundo vive a partir da segunda metade do século XX. Atualmente existem diversas definições para este conceito que tentam englobar não só a noção ambientalista, mas também a vertente social e económica (40,41):
“O desenvolvimento sustentável é o resultado de um desenvolvimento económico e social contínuo, sem detrimento do ambiente e dos recursos naturais.
A qualidade do desenvolvimento e da atividade humana futura é vista cada vez mais como dependente deste equilíbrio.”
(European Foundation for the Improvement of Living and Working Conditions, Agência da Comissão Europeia)
Com efeito, o desenvolvimento sustentável apela a mudanças estruturais, a médio e longo prazo, na economia e no sistema social, com o objetivo de preservar os recursos naturais do planeta, mantendo o potencial económico e a coesão social (42). Na Figura 6 está representada a interligação das diferentes áreas envolvidas no desenvolvimento sustentável.
Figura 6 – Interligação das áreas envolvidas no desenvolvimento sustentável (adaptado de 42).
Desenvolvimento Sustentável
Ambiente
Economia Sociedade
9
O crescimento demográfico exponencial, associado à escassez de recursos ambientais, constitui um problema grave para o mundo atual e para o qual a sociedade tem de, urgentemente, encontrar resposta (43). De acordo com a Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO), a produção global de alimentos deveria aumentar cerca de 60% até 2050, para atender à crescente população mundial (43). Contudo, de acordo com dados da mesma organização, 60% dos ecossistemas mundiais foram degradados, nas últimas décadas, verificando-se um aumento de 40% das emissões de carbono, bem como um aumento da escassez de água e petróleo, com um bilião de pessoas a passar fome e outro bilião a sofrer de sobrenutrição e doenças relacionadas, simultaneamente (44). O aumento brutal da população humana contribui assim para o esgotamento dos recursos naturais, uma vez que o gasto dos mesmos é superior à sua capacidade de renovação. Contudo, as necessidades atuais não devem colocar em causa as gerações futuras, devendo ser impostos limites no uso das matérias-primas (41,45). A sustentabilidade alimentar é, assim, um conceito que tem vindo a crescer de importância nos últimos anos, devido ao crescimento populacional e à intensa pressão sobre o sistema alimentar global. Desta forma, torna-se fundamental encontrar novos ingredientes alimentares (46).
As indústrias têm vindo, ao longo dos anos, a gerar toneladas de resíduos que em grande parte são desperdiçados. Para além disso, estes podem representar um grave problema ambiental. A redução destes resíduos pode ser feita no sentido de aproveitá-los para desenvolver novos produtos, com benefícios e impactos na economia e sociedade (46). A Comissão Europeia tem publicado Regulamentos que estabelecem medidas de proteção para o ambiente e para a saúde humana. O Regulamento Europeu 98/2008/EEC tem como objetivo prevenir ou reduzir os impactos adversos resultantes da geração e gestão de resíduos, dando ênfase à utilização de técnicas adequadas de gestão, valorização e reciclagem dos mesmos (47). Além disso, a Lista Europeia de Resíduos, publicada pela Decisão 2014/955/EU da Comissão de 18 de dezembro, referida no artigo 7° da Diretiva 2008/98/CE, não é mais do que uma lista harmonizada de resíduos que tem em consideração a sua origem e composição. Esta lista agrupa os resíduos em áreas específicas de atividade geradora, por exemplo, industrial, urbana e agrícola, classificando-os como perigclassificando-osclassificando-os ou não perigclassificando-osclassificando-os. A separação e classificação é crucial para que o destino dos mesmos seja o mais adequado e menos nefasto possível, quer para a saúde humana quer para o meio ambiente (48).
Todas estas alterações têm conduzido a um novo campo da ciência sustentável que procura compreender o fundamento das interações entre a natureza e a sociedade (42). O aproveitamento e valorização de produtos naturais é essencial para a qualidade de vida das gerações presentes e futuras, sendo que uma das grandes prioridades a nível mundial
10
incide na sustentabilidade dos processos (49). Existem diversas Organizações, como a FAO e as Nações Unidas, que visam a implementação de medidas para um desenvolvimento sustentável a nível mundial (50,51). A FAO tem como principal objetivo tornar a agricultura, a silvicultura e a pesca mais produtivas e mais sustentáveis, evitando o desperdício de alimentos (50). Cerca de 1,3 mil milhões de toneladas de material comestível são desperdiçados, representando 1/3 da produção mundial de alimentos. Este desperdício de alimentos nos países industrializados deve ser reduzido, apelando à consciencialização das indústrias alimentares e consumidores (49).
Por seu lado, em 2015, as Nações Unidas lançaram a agenda ‘Transforming our world: The 2030 agenda for sustainable development’ em que 193 estados membros adotaram uma ampla lista universal de desenvolvimento que é composta por um conjunto de metas que incluem compromissos para combater a pobreza, a desigualdade e os desafios ambientais (52). Esta agenda visa mudar o futuro do planeta para um caminho sustentável e resiliente. Os objetivos e metas de desenvolvimento sustentável são 17, entre os quais, a gestão sustentável da água e do saneamento, a promoção da industrialização sustentável e inovadora e a garantia de padrões sustentáveis de consumo e produção, sendo que cada país que integre este plano tentará mobilizar esforços para alcançar a Agenda de Desenvolvimento Sustentável até 2030 (52). Na Figura 7 estão representados os 17 objetivos e metas do desenvolvimento sustentável.
Figura 7 – Objetivos e metas de desenvolvimento sustentável definidos pelas Nações Unidas (adaptado de 52).
De acordo com a Figura 7, o presente trabalho enquadra-se na agenda elaborada pelas Nações Unidas, nomeadamente na meta 2, onde se pretende acabar com a fome,
11
alcançando a segurança alimentar e uma melhoria na validade dos alimentos, e simultaneamente promovendo uma agricultura sustentável. Além disso, o seu enquadramento pode igualmente ocorrer na meta 15, cujo objetivo é proteger, restaurar e promover o uso sustentável dos ecossistemas terrestres.
1.4.
Composição química das folhas de A. arguta
1.4.1. Metabolitos nas plantas
As plantas sintetizam uma vasta gama de compostos químicos necessários para o seu desenvolvimento e sobrevivência. Estes compostos orgânicos podem ser classificados em metabolitos primários e secundários (53). Os metabolitos primários têm um papel essencial em diversos processos, tais como a fotossíntese, a respiração e, o crescimento e desenvolvimento das plantas, sendo essenciais para a sobrevivência da espécie. Estes incluem hidratos de carbono, ácidos orgânicos, aminoácidos, nucleótidos, ácidos gordos e lípidos (54).
Os metabolitos primários são os grandes precursores dos metabolitos secundários, os quais não são essenciais para o desenvolvimento das espécies, mas contribuem para a interação química entre as plantas e o ambiente circundante, sendo fundamentais para a sua sobrevivência e proliferação (54). Para além disso, estão envolvidos em diversos processos, como a polinização, a resistência a microrganismos patogénicos, a pigmentação, a lignificação e a proteção contra o stress abiótico, assim como o seu teor é afetado por mudanças de temperatura, exposição à radiação ultravioleta (UV) e índice pluviométrico (54–56). Na Figura 8 é possível ver os principais fatores que podem afetar o teor dos metabolitos secundários nas plantas.
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Figura 8 – Principais fatores que podem afetar o teor final de metabolitos secundários nas plantas (adaptado de 54-56).
Os metabolitos secundários são muitas vezes restritos a determinadas espécies ou são produzidos somente sob certas condições ambientais (53).
1.4.2. Compostos bioativos
Os metabolitos secundários podem exibir propriedades bioativas no corpo humano, como a atividade antioxidante e antimicrobiana (56). Estes metabolitos pertencem a diferentes famílias de compostos, entre os quais os alcaloides, os terpenos e os fenólicos. Estima-se que existam mais de 200 000 metabolitos secundários conhecidos (57).
Apesar da grande diversidade de compostos, a sua síntese ocorre a partir de quatro vias metabólicas principais: (i) a via do ácido chiquímico, (ii) a via do ácido malónico, (iii) a via do ácido mevalónico e (iv) a via não-mevalonato. Os precursores de todas estas vias são provenientes do metabolismo primário. A síntese dos compostos fenólicos ocorre através da via do ácido chiquímico e da via do ácido malónico, embora seja a via do ácido chiquímico que participa na biossíntese da maioria dos fenóis de origem vegetal. Os flavonoides são de origem mista. A sua estrutura resulta das duas vias acima mencionadas, sendo que o anel aromático (A) deriva da via do ácido malónico e o anel aromático (C) da fenilalanina pela via do ácido chiquímico (58).
Teor de metabolitos secundários Sazonalidade Composição atmosférica Temperatura Altitude Ataques patogénicos e herbívoros Idade Radiação UV Nutrientes Ritmo circadiano Stress hídrico
13
1.4.2.1. Compostos fenólicos
Os compostos fenólicos são metabolitos secundários presentes nas plantas que se revestem de elevada importância para a saúde humana. Com mais de 8000 variantes estruturais, os fenólicos são compostos por um anel aromático, contendo um ou mais substituintes hidroxilo e podem compreender moléculas simples até compostos altamente polimerizados (59,60).
Estes compostos apresentam diferentes propriedades biológicas, tais como, atividade antioxidante, antimicrobiana e anti-inflamatória, sendo igualmente classificados como cardioprotetores (60,61). De entre o leque de propriedades que estes apresentam, a atividade antioxidante depende da estrutura, em particular dos grupos hidroxilo e da natureza das substituições nos anéis aromáticos (60). Os compostos fenólicos estão presentes em diversos alimentos e bebidas, tais como, frutas, vegetais, vinho e chá. A presença dos mesmos contribui para algumas características sensoriais dos alimentos, como o sabor, o aroma e a cor (60,62).
Os compostos fenólicos podem ser divididos em várias classes, sendo os principais os ácidos fenólicos, os flavonoides e os taninos (63). Na Tabela 1 estão sumariadas as classes de compostos fenólicos presentes nas plantas e alguns exemplos.
Tabela 1 – Classes de compostos fenólicos presentes nas plantas (adaptado de 59,60).
Classe Estrutura Exemplos
Fenólicos simples, benzoquinonas C6 Catecol
Ácidos hidroxibenzoicos C6 – C1 Ácido gálhico
Acetofenonas, Ácidos fenilacético C6 – C2 Diclofenaco
Ácidos hidroxicinâmicos,
fenipropanóides C6 – C3 Ácido ferúlico
Naftoquinonas C6 – C4 Juglona
Xantonas C6 – C1 - C6 Mangiferina
Estibenos, antraquinonas C6 – C2 - C6 Resveratrol
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Lignanas neolignanas (C6 – C3)2 Eusiderina
Biflavonoides (C6 – C3 - C6)2 Bichalcona
Ligninas (C6 – C3)n -
Taninos condensados C6 – C3 - C6)n Procianidina
Os ácidos fenólicos são compostos por duas subclasses: os ácidos hidroxibenzoicos (como o ácido gálhico e vanílico e que têm em comum a estrutura C6 – C1) e os ácidos hidroxicinâmicos (contendo ácido cafeico, ferúlico e p-cumárico e que são compostos por uma cadeia lateral de três carbonos C6 – C3) (59). Na Figura 9 estão representados alguns exemplos de ácidos fenólicos.
Figura 9 – Ácidos fenólicos: (A) ácidos hidroxibenzoicos; (B) ácidos hidroxicinâmicos (adaptado de
64).
Os flavonoides possuem uma estrutura comum C6 – C3 - C6, que consiste em dois anéis aromáticos ligados através de uma cadeia de três carbonos, geralmente na forma de um anel heterocíclico (Figura 10) (55). Estes compostos representam mais de metade dos oito mil compostos fenólicos existentes (60).
Ácido gálhico
Ácido ferúlico
Ácido cafeico Ácido p-cumárico
15
Figura 10 – Estrutura genérica dos flavonoides e as principais classes de flavonoides (adaptado
de 61).
Os flavonoides dividem-se em flavonóis, flavonas, flavanonas, flavan-3-ols, isoflavonoides e antocianidinas, os quais resultam de variações nos padrões de substituição do anel C (Figura 10). Estes compostos são capazes de resistir à oxidação e a temperaturas elevadas (65). As substituições dos anéis A e B dão origem aos diferentes compostos dentro de cada classe e podem incluir substituições por oxigenação, alquilação, glicosilação, acilação e sulfatação (54).
Para além da capacidade em ceder átomos de hidrogénio ou eletrões aos radicais livres, as isoflavonas, em particular, podem exercer efeitos através de mecanismos como a modulação das vias de sinalização celular, interações com a mitocôndria e alterações na expressão genética (66,67).
O recurso a alimentos com concentrações substanciais de flavonoides tem revelado um efeito protetor na prevenção de danos nas membranas, enzimas e genes causados por radicais livres (68). Além disso, os flavonoides, tal como os ácidos fenólicos, apresentam atividade antioxidante e propriedades antibacterianas e antivirais, podendo fazer parte da regulação da função imune do organismo (69,70). Podem ainda participar em alguns mecanismos, como a modulação de vias de sinalização e interações com componentes celulares (70). Alguns estudos descrevem os seus efeitos benéficos na prevenção de patologias como a aterosclerose, doenças neurodegenerativas e doenças cardiovasculares (71,72). De acordo com diferentes autores, os flavonoides inibem a peroxidação lipídica, a qual é responsável por danos celulares que, consequentemente, causam perturbações nos processos de transporte entre as membranas, originando desta
Catequinas
Flavonas Flavanonas
Flavonóis
16
forma uma série de efeitos secundários, como por exemplo, a ligação cruzada entre proteínas fibrosas (71,73,74). Existem mais de 6000 flavonoides identificados, comumente encontrados em frutos, vegetais e plantas (Tabela 2) (75).
Tabela 2 – Principais subclasses dos flavonoides e algumas fontes alimentares (adaptado de
75,76).
Subclasses de
flavonoides Exemplos Fontes alimentares
Flavan-3-ols Epicatequina
Catequina
Chá verde e preto Vinho tinto
Flavanonas Naringenina
Toxifolina Frutos cítricos
Flavonóis Kaempferol
Quercetina
Vegetais (ex: brócolos) Frutos Azeite Flavonas Apigenina Crisina Cereais Frutos Especiarias Antocianidinas Malvidina Cianidina Frutos vermelhos Uvas Vinho tinto Isoflavonas Daidzeína Genisteína
Leguminosas (ex: grãos de soja)
Os ácidos fenólicos e os flavonoides podem apresentar-se na forma solúvel (conjugada com açúcares) ou insolúvel. Maioritariamente, os ácidos fenólicos estão na forma insolúvel, estando conjugados com componentes estruturais, tais como a lignina, os hidratos de carbono estruturais ou as proteínas (77,78).
Por outro lado, os compostos fenólicos mostram uma considerável diversidade estrutural, o que influencia a sua biodisponibilidade. As isoflavonas, o ácido cafeico e o ácido gálhico são os compostos fenólicos melhor absorvidos, seguindo-se as catequinas, as flavanonas e os glicosídeos de quercetina, apresentando contudo cinéticas diferentes (59). A absorção e o metabolismo dos compostos fenólicos depende da sua estrutura, grau
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de glicosilação, tamanho molecular e solubilidade (60). Estas características condicionam os efeitos benéficos que têm na saúde humana.
Relativamente ao metabolismo dos compostos fenólicos e às suas vias de absorção, estes são maioritariamente absorvidos no estômago ou no intestino delgado, após modificação química pela flora microbiana (79). Os compostos que não são absorvidos seguem para o colón (60). Aí a microflora presente hidrolisa os glicosídeos, quebrando os compostos fenólicos em moléculas mais simples e eliminando os conjugados (77). O local onde estes compostos são metabolizados depende da dose. Em doses baixas são metabolizados pela mucosa intestinal e em doses mais elevadas a metabolização ocorre a nível hepático (59). Verifica-se ainda que a biodisponibilidade dos compostos fenólicos pode ser afetada pela ligação dos compostos à matriz alimentar, localização dos glicosídeos nas células e diferenças nas estruturas da parede celular (60). Após absorção no trato gastrointestinal, os compostos fenólicos sofrem reações de conjugação, ocorrendo algumas alterações na sua estrutura inicial. Com efeito, podem sofrer glucoronidação, metilação e sulfatação, causando alterações na sua bioatividade, por exemplo, diminuição da atividade antioxidante (80,81). Estas reações de conjugação representam um processo metabólico de destoxificação que visa facilitar a eliminação biliar e urinária (80).
1.5.
Potenciais propriedades biológicas
De acordo com diferentes autores, os compostos bioativos como os compostos fenólicos apresentam diferentes propriedades biológicas, nomeadamente atividade antioxidante, anti-inflamatória, antimicrobiana ou anticancerígena (8,9,82–84). Desta forma, estes compostos apresentam efeitos benéficos em diversas patologias, sendo possível a sua utilização tanto na prevenção como no tratamento da obesidade, diabetes tipo II, certos tipos de cancro e doenças cardíacas (8,9,33,82,85).
1.5.1. Atividade antioxidante
Numa situação de equilíbrio no organismo humano verifica-se um balanço entre agentes pro-oxidantes e antioxidantes, fator importante para a manutenção fisiológica (86). No entanto, a sobreprodução de radicais livres ou a diminuição das defesas antioxidantes, conduz a um desequilíbrio do estado redox, desencadeando um processo denominado stress oxidativo que se caracteriza por uma acumulação excessiva de radicais livres e que origina danos oxidativos nos tecidos celulares (87). Diferentes agentes externos, tais como o tabaco, o álcool, pesticidas, stress ou poluição ambiental, também contribuem para a sobreprodução de radicais livres (86).
18
Os radicais livres, quando presentes em equilíbrio, são responsáveis por reações importantes no organismo, participando na cascata de sinalização celular, na regulação de funções fisiológicas, na ativação da apoptose, na indução de diferenciação celular, no transporte de glicose nas células e também na eliminação de microrganismos invasores (88). No entanto, quando presentes em elevadas quantidades, tornam-se nefastos para o organismo, causando efeitos celulares destrutivos e letais pela oxidação dos lípidos das membranas celulares, proteínas, ADN e enzimas endógenas (89,90).
O stress oxidativo pode ser dividido em três etapas: (i) iniciação, onde ocorre a formação dos radicais livres; (ii) propagação, em que os radicais livres reagem com outras moléculas; e (iii) terminação, quando os radicais se transformam em outros produtos (88). As principais classes de espécies reativas são as Espécies Reativas de Oxigénio (ERO) e as Espécies Reativas de Azoto (ERA), espécies químicas de existência independente que contêm um ou mais eletrões desemparelhados e que promovem reações de oxidação e de redução. Dentro das ERO existem espécies radicalares, como o superóxido (O2•-), o hidroxilo (OH•), o hidroperoxilo (HO2•) e outras espécies, como o peróxido de hidrogénio (H2O2), que podem ser produzidas de forma exógena ou endógena (89,91). O O2•- é uma das espécies mais reativas, tendo a capacidade de eliminar os eletrões da cadeia de transporte das mitocôndrias e do citocromo P450. Contudo, também os recupera a partir dos fagócitos ativados pelo sistema imune (88). Na Figura 11 pode-se visualizar as reações de formação das ERO.
Em relação às ERA, um dos compostos mais ativos é o óxido nítrico (•NO), produzido a partir da L-arginina através da enzima óxido nítrico sintetase. O •NO, quando presente em concentrações normais, tem propriedades fisiológicas benéficas, nomeadamente na eliminação de microrganismos invasores (92,93). No entanto a produção de O2•- e de •NO durante a fagocitose pode danificar os componentes do tecido circundante e, em elevadas concentrações, formar o radical peroxinitrito (ONOO-) ou o ácido peroxinitroso (ONOOH), agentes de cloração que se ligam a aminoácidos e proteínas (94).
19
Figura 11 – Reações da formação de ERO. SOD – Superóxido-dismutase; CAT – Catalase
(adaptado de 86).
Quando estes radicais não são neutralizados a tempo, podem despoletar vários mecanismos prejudiciais para a saúde humana, levando ao aparecimento de diversas doenças, tais como a diabetes, a doença de Alzheimer e Parkinson, insuficiência cardíaca ou dislipidemia (86,88). As células protegem-se contra danos causados pelos ERO e ERA através de processos de reparação, compartimentação da produção de radicais livres, enzimas de defesa e antioxidantes endógenos e exógenos. Assim, os compostos antioxidantes têm um papel fundamental na prevenção e tratamento de patologias provocadas pelo stress oxidativo (89,91).
Os antioxidantes naturais podem ser divididos em enzimáticos ou não enzimáticos. Os antioxidantes enzimáticos incluem enzimas antioxidantes primárias (como a superóxido dismutase, a catalase ou a glutationa peroxidase) e enzimas antioxidantes secundárias (como a glutationa redutase). Por seu lado, os antioxidantes não enzimáticos referem-se a compostos fenólicos, minerais, carotenóides, vitaminas, co-fatores, compostos organossulfurados e compostos não proteicos de azoto (94). Os compostos fenólicos presentes em infusões e decocções são eficientes sequestradores in vitro de espécies reativas, podendo igualmente funcionar indiretamente como antioxidantes através dos seus efeitos sobre os fatores de transcrição e atividades enzimáticas (95).
Os antioxidantes enzimáticos são produzidos endogenamente, enquanto os não enzimáticos obtêm-se através de uma alimentação equilibrada. Na realidade, os antioxidantes enzimáticos são a primeira linha de defesa contra os radicais livres que causam danos nas células (96).
Os antioxidantes têm diferentes mecanismo de ação, entre eles o sequestro de radicais livres, a quelatação de iões metálicos, a inibição de enzimas produtoras de radicais livres, a ativação de enzimas antioxidantes endógenas, a prevenção da peroxidação lipídica, a prevenção de danos no ADN, a modificação de proteínas e a destruição de açúcares (88). A atividade antioxidante dos compostos fenólicos deve-se à sua capacidade de doar
20
átomos de hidrogénio ou eletrões, eliminar radicais livres ou quelatar o ferro (5). Além disso, retardam a oxidação de vários compostos, inibindo a iniciação e/ou a propagação de reações em cadeia e enzimas pro-oxidantes (87).
Os compostos fenólicos são excelentes candidatos para a prevenção dos efeitos nocivos que a radiação UV causa na pele, mais especificamente os flavonoides, os quais têm um efeito fotoprotetor devido à absorção de radiação UV e à capacidade de atuar como agentes antioxidantes, inflamatórios e imunomoduladores (97). Os principais sistemas de proteção contra o excesso de radicais livres na pele incluem a melanina, os antioxidantes enzimáticos e os antioxidantes não enzimáticos (97). Os antioxidantes têm a capacidade de se ligarem aos radicais livres, eliminando-os e retardando o processo de envelhecimento cutâneo (97,98).
Em relação à natureza dos antioxidantes, estes podem ser de natureza sintética, por exemplo 2,6-di-terc-butil-4-metilfenol (BHT) e o 2-terc-butil-4-hidroxianisol (BHA), ou de origem natural, como os tocoferóis e o ácido ascórbico. Os antioxidantes sintéticos ainda são muito utilizados na indústria alimentar. Contudo, as indústrias já começam a recorrer aos antioxidantes naturais devido às inúmeras desvantagens descritas em relação aos antioxidantes sintéticos (34,35,99).
A formação de radicais livres e as reações de eliminação ocorrem não só no corpo humano, mas também em todos os organismos vivos e sistemas biológicos. Nos alimentos também ocorrem processos de autoxidação, peroxidação lipídica e outros tipos de oxidação. Os antioxidantes usados na indústria alimentar desempenham uma função similar aos antioxidantes endógenos do corpo humano, protegendo os alimentos da oxidação e conservando as suas propriedades organoléticas e de textura (88).
Cyboran et al. testaram o efeito do extrato de folhas de A. arguta contra a oxidação da membrana de glóbulos vermelhos (100). De acordo com os autores, o extrato foi capaz de proteger a membrana dos glóbulos vermelhos contra a oxidação induzida pela radiação UV e o 2,2-azobis (2-amidinopropano) dicloridrato (AAPH). O efeito protetor do extrato na membrana consistiu na redução dos radicais livres responsáveis pela sua oxidação. De acordo com os autores, os compostos fenólicos presentes nas folhas podem ancorar na parte hidrofílica da membrana e, desta forma, protegê-la da difusão de radicais para o seu interior (100).
1.5.2. Atividade anti-inflamatória
O processo inflamatório é um mecanismo de defesa contra agentes patogénicos ou outros agentes externos que não sejam reconhecidos pelo organismo, o qual se caracteriza pela ocorrência de uma cascata de processos que visam restaurar os tecidos afetados e
21
repor a homeostase (101). A inflamação é um processo complexo que envolve uma grande variedade de mediadores, tais como o fator de ativação plaquetária (FAP), as prostaglandinas (PG) e os leucotrienos. A presença de mediadores químicos condiciona a intensidade da resposta. O ácido araquidónico (AA) é libertado em resposta a alguns mediadores químicos, sendo os seus metabolitos sintetizados por duas vias enzimáticas, a via das lipoxigenases (LOX) e a via das cicloxigenases (COX). As vias das LOX e COX são responsáveis por formar diferentes mediadores, respetivamente, leucotrienos e lipoxinas, prostaglandinas e tromboxanos (102). Quando se desencadeia um processo inflamatório ocorre uma sobreprodução de ERO que induzem um estado de stress oxidativo, reduzindo a capacidade antioxidante das células. No decorrer do processo inflamatório são produzidas citocinas pró-inflamatórias (Interleucinas (IL) 1,2,6 e 7, Fator de necrose tumoral (FNT)) bem como quimiocinas, pelas células imunitárias, como macrófagos e neutrófilos (91,98). No entanto, a produção exacerbada de citocinas pró-inflamatórias a partir da lesão pode desencadear instabilidade hemodinâmica ou distúrbios metabólicos (103).
A inflamação crónica caracteriza-se por uma resposta inflamatória ativa que leva à destruição tecidual, estando associada a processos de envelhecimento, diabetes, doenças auto-imunes e cancro. Os radicais livres produzidos pelo processo inflamatório crónico reagem com as proteínas da membrana celular, causando a perda de funcionalidades das células de forma permanente, levando a mutações e danos no ADN. Todos estes mecanismos despoletados pelo processo inflamatório podem estar associados às patologias mencionadas anteriormente (104). Existem algumas patologias que estão intimamente relacionadas com o processo inflamatório, deixando este de funcionar como um mecanismo de proteção e passando a desencadear mecanismos nefastos no organismo, como a sobreprodução de mediadores inflamatórios. Contudo, vários componentes da dieta, tais como flavonoides e vitamina C, podem apresentar propriedades anti-inflamatórias, revertendo alguns dos efeitos desencadeados pelas citocinas pró-inflamatórias (105).
1.5.3. Atividade antimicrobiana
Os microrganismos são responsáveis por causar doenças, quer no Homem quer nos animais, muitas vezes através de alimentos contaminados e infeções hospitalares. O uso de compostos naturais com atividade antimicrobiana poderá representar uma mais valia na prevenção dessas patologias, evitando também a contaminação dos alimentos e a sua deterioração por microrganismos (106,107). Por outro lado, a resistência aos antibióticos é um problema cada vez mais global, sendo urgente o desenvolvimento de novos agentes
22
terapêuticos e a descoberta de novas fontes de compostos com ação antimicrobiana (108,109). Nas últimas décadas o estudo de extratos vegetais e compostos químicos das plantas tem demonstrado que estes podem ter efeitos benéficos em patologias causadas por microrganismos. Os compostos presentes nas plantas, como taninos, alcaloides, flavonoides e glicosídeos, podem inibir o crescimento desses microrganismos (36,110). Almeida et al. avaliaram extratos de folhas de A. arguta em diferentes concentrações (20 - 50 mg/mL) no que toca à atividade antimicrobiana (26). Os extratos hidroalcoólico e alcoólico apresentaram atividade antimicrobiana contra S. aureus na maior concentração testada. Tendo em conta a composição química dos extratos das folhas de A. arguta mencionada anteriormente, esta atividade pode estar relacionada com a presença de ácidos fenólicos e flavonoides (26). Na realidade, os mecanismos de ação dos ácidos fenólicos podem incidir na alteração da estrutura e função da membrana citoplasmática, na inibição enzimática pelos compostos oxidados, bem como na inibição dos mecanismos de reparação, devido à capacidade de ligação à cadeia de ADN simples (111,112). Os flavonoides apresentam atividade antimicrobiana, suprimindo a virulência bacteriana devido à inibição da síntese de ácidos nucleicos e do metabolismo energético (108,113). Além disso, podem inibir a formação de biofilmes, inibindo a adesão superficial de bactérias Gram-positivas. A inibição de biofilmes é um passo muito importante para combater a patogénese bacteriana e a resistência aos antibióticos, auxiliando na prevenção das doenças (114). Por outro lado, a atividade antifúngica apresentada pelos flavonoides deve-se à capacidade de romper a parede celular, impedindo a germinação dos esporos (115).
23
2. Objetivos
24
Objetivos
O objetivo principal deste trabalho incidiu na valorização de folhas de A. arguta, tendo como objetivos específicos:
• Preparar infusões e decocções de folhas de A. arguta; • Determinar a cor e o pH das infusões e decocções;
• Quantificar o teor de polifenóis totais (TPT) e de flavonoides totais (TFT) das infusões e decocções de folhas de A. arguta;
• Avaliar a atividade antioxidante através do método do radical 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH•) e do poder antioxidante por redução do ião férrico (FRAP); • Determinar a atividade de captação de espécies reativas de oxigénio (ERO) (O2•,
H2O2, HOCl e ROO•) e espécies reativas de azoto (ERA) (•NO); • Quantificar a vitamina C por HPLC nas infusões e decocções;
• Identificar e quantificar os compostos fenólicos das infusões e decocções por HPLC-DAD-MS;
• Avaliar a viabilidade celular em células intestinais (Caco-2 e HT29-MTX) após exposição aos diferentes extratos.
25
26
3.1.
Colheita das Amostras
As folhas de A. arguta foram colhidas durante o mês de maio de 2017, em Landim, Vila Nova de Famalicão, Portugal (Mini-Kiwi Land) (N 41º22’36.393” W 8º28’11.704”). Após a colheita, as folhas foram armazenadas em frascos de amostragem e conservadas a 4 ºC até se proceder à preparação das infusões e decocções.
3.2.
Reagentes e Padrões
No decurso do trabalho experimental e para a realização das diferentes metodologias abaixo mencionadas, foram utilizados reagentes de grau analítico:
• 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH) (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemanha); • 2,4,6-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ) (Sigma Aldrich, Suíça);
• 2-Amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol (Tris) (Sigma Aldrich, St. Louis, EUA); • 3- (Aminopropil) -1-hidroxi-3-isopropil-2-oxo-1-triazeno (NOC-5) (Sigma Aldrich,
St. Louis, EUA);
• 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio (MTS) (Promega, Madison, EUA);
• 4,5-diaminofluoresceína (DAF-2) (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemanha);
• Ácido 4,5-Dihidroxi-1,3-benzenodissulfónico (Tiron) (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemanha);
• Acetato de sódio (Sigma Chemical Co., St. Louis, EUA);
• Ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico (Trolox) (Sigma Aldrich, Suíça);
• Ácido ascórbico (Sigma Aldrich, China);
• Ácido clorídrico (HCl) (Merck, Darmstadt, Alemanha); • Ácido gálhico (Sigma Aldrich, China);
• Aminoácidos não essenciais (Neaa 100x) (BioWhittaker, Verviers, Bélgica); • Carbonato de sódio (Na2CO3) (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemanha); • Catequina (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemanha);
• Cloreto de alumínio (AlCl3) (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha); • Cloreto de azul nitrotetrazolio (NBT) (Sigma Aldrich, St. Louis, EUA); • Cloreto férrico (Merck, Darmstadt, Alemanha);
• Dihidrorodamina 123 (DHR) (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemanha); • Dimetil sulfóxido (DMSO) (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha);
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• Dinucleótido ᵦ-nicotinamida adenina (NADH) (Sigma Aldrich, St. Louis, EUA); • Etanol absoluto (CARLO ERBA Reagents S.A.S, Val de Reuil, França); • GlutaMAX-I (Invitrogen, Grand Island, EUA);
• Hidróxido de sódio (NaOH) (VWR International S.A.S., Foutenay-sous-Bois, França);
• Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (BioWhittaker, Verviers, Bélgica);
• Metossulfato de fenazina (PMS) (Sigma Aldrich, St. Louis, EUA);
• N,N’-Dimetil-9,9’-biacridinio dinitrato (Lucigenina) (Cayman Chemical Company, Michigan, EUA);
• Nitrito de sódio (NaNO2) (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemanha); • Sulfato ferroso (Sigma Chemical Co., St. Louis, EUA);
• Penicilina-Streptomicina (Invitrogen, Grand Island, EUA); • Peróxido de Hidrogénio (Merck, Darmstadt, Alemanha); • Quercetina (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemanha);
• Reagente fenol de Folin-Ciocalteu’s (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha); • Solução Balanceada de Hank’s (HBSS) (BioWhittaker, Verviers, Bélgica); • Tripsina (Hyclone, Utath, EUA);
• Triton x-100 (Amresco, Ohio, EUA).
3.3.
Preparação das infusões e decocções
Para a obtenção das infusões e decocções, pesaram-se 4 g de folhas de baby kiwi grosseiramente cortadas. Seguidamente procedeu-se à preparação da infusão e da decocção. O processo de extração baseou-se em estudos anteriores (116,117). Para obtenção da infusão, adicionaram-se cerca de 200 mL de água a ferver (100 ºC) a 4 g de folhas de baby kiwi e deixou-se repousar durante 5 minutos. Seguidamente procedeu-se à filtração com papel de filtro (Whatman Nº1). Na Figura 12 está repreprocedeu-sentado o processo de preparação da infusão com folhas de baby kiwi.
