UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
ODONTOLÓGICAS
CLARICE PEREIRA DE BRITO
EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DA p53 EM LÍQUEN PLANO DA MUCOSA ORAL
NATAL/RN
CLARICE PEREIRA DE BRITO
EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DA p53 EM LIQUEN PLANO DA MUCOSA ORAL
Dissertação de Mestrado apresentada à banca do Programa de
Pós-Graduação em Ciências
Odontológicas do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte para obtenção do título de Mestre.
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO
Patologia Oral e Estomatologia
LINHA DE PESQUISA
Epidemiologia, diagnóstico e tratamento integrado em clínicas odontológicas
PROFESSOR ORIENTADOR
Antônio de Lisboa Lopes Costa
NATAL/RN 2020
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Alberto Moreira Campos - -Departamento de Odontologia
Brito, Clarice Pereira de.
Expressão imuno-histoquímica da p53 em líquen plano da mucosa oral / Clarice Pereira de Brito. - 2020.
54f.: il.
Dissertação (Mestrado em Ciências Odontológicas) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-graduação em Ciências Odontológicas.
Orientador: Prof. Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa.
1. Líquen plano oral -Dissertação. 2. p53 - Dissertação. 3. Imuno-histoquímica - Dissertação. I. Costa, Antônio de Lisboa Lopes. II. Título.
RN/UF/BSO BLACK D64
A defesa deste trabalho foi realizada no dia 28 de fevereiro de 2020, em Natal/RN, obteve o conceito “APROVADO”.
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Maria de Lourdes Silva de Arruda Morais Universidade Estadual do Rio Grande do Norte
1° Examinador
Prof. Dr. Pedro Paulo de Andrade Santos Universidade Federal do Rio Grande do Norte
2° Examinador
Prof. Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa Universidade Federal do Rio Grande do Norte
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ter estado ao meu lado em todos os momentos, por me dar capacidade intelectual para desenvolver tudo que me propus nesses 24 meses, e por nunca ter me abandonado nos momentos difíceis.
À minha Mãe Alcina, por todo o suporte, não só no período do Mestrado, mas durante toda a minha vida escolar, acadêmica e pessoal nesses quase 29 anos: desde o primeiro trabalho que me ajudou a fazer na cartolina, quando me ensinou a formatar trabalhos no Word, desde os primeiros CDs internacionais que me comprava com tanto gosto para que eu pudesse ter acesso à letra e aprender inglês, por todo o sacrifício em pagar meus estudos sempre nas melhores escolas, por sempre me disciplinar ressaltando a importância da pontualidade e frequência no estudo - se cheguei onde estou, foi por um conjunto de todos os valores e meios que me proporcionou! Quanto de você há em mim! Obrigada por me acolher em seu lar sempre que precisei, fazendo um almoço com carinho pra mim, sabendo de todas as dificuldades de tempo e financeiras pelas quais eu passava; por me ceder seu computador recém-comprado quando o meu foi roubado para que eu pudesse dar continuidade a este sonho.
Ao meu Pai Antônio, que muitas vezes me encontrou no Nordestão no meu intervalo e me mostrou luz quando tudo parecia escuro! Obrigada por ter me dado palavras de força, por me estimulado a ser resistente, resiliente, focar em tudo de bom que eu tinha construído até então, sendo uma injeção de ânimo e me botando sempre pra cima, além de ressaltar o meu valor como mulher, profissional, ser humano, mãe e filha. Sem o senhor, eu poderia até ter conseguido, mas seria mais difícil.
Ao meu filho Rafael, que muitas vezes presenciou meus momentos de cansaço e preocupação com as demandas que este curso trazia em minha vida, mas sempre me apoiou e foi extremamente compreensivo, acreditou em mim quando muitas vezes eu desacreditei, entendeu meus momentos ausentes quando assim precisei estar, e vibrou comigo a cada desafio vencido. Muito amor por você e pelo significado que você tem na minha vida.
À minha psicóloga, Ruana de Queiroz Raposo, a melhor profissional e uma das pessoas que mais fez diferença em minha vida desde que nela entrou... semanalmente me ajudou a enxergar toda a força e potencial que eu tinha, me fez
acreditar que sou um ser de possibilidades e que eu era e sou capaz de realizar tudo aquilo que me proponho; me guiou para que eu suportasse e ressignificasse todas as provações que existiram na minha vida pessoal e acadêmica durante esse período, tornando minha caminhada bem mais leve cada vez que me acolhia naquele consultório, dizendo exatamente o que eu precisava escutar com palavras firmes e doces.
A cada um dos meus amigos e familiares, que me estimularam e me ajudaram a seguir sempre, desde o primeiro dia em que souberam que eu havia sido aprovada.
À minha turma de Mestrado, que posso afirmar sem dúvidas que foi a melhor turma que pude conviver em toda a minha vida. Vocês reforçaram mais ainda o meu conceito de união e amizade, por toda a ajuda que me deram principalmente nesse período final da dissertação, cada um com suas contribuições, com suas palavras de força, de “vai dar certo”, podem ter certeza de que vocês fizeram a diferença. Vou levar cada um de vocês no meu coração para sempre, e me sinto privilegiada por ter estudado com vocês nesses 2 anos.
A Rodrigo Porfino Mafra, pela disponibilidade e ajuda indispensável na minha análise estatística.
Ao meu Professor e Orientador Antônio de Lisboa Lopes Costa, que tanto me ensinou e me ajudou, revelando-se para mim não apenas um excelente profissional como também um ser humano incrível, tamanha sua compreensão diante de todos os percalços que atravessei durante esta trajetória.
A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas, em especial aos que tive mais convívio na área de concentração de Estomatologia e Patologia Oral: Dra. Ana Miryam Costa de Medeiros, Dra. Éricka Janine Dantas da Silveira, Dra. Hébel Cavalcanti Galvão, Dr. Leão Pereira Pinto, Dra. Lélia Batista de Souza, Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz, Dra. Márcia Cristina da Costa Miguel, Dra. Patrícia Teixeira de Oliveira, Dr. Pedro Paulo de Andrade Santos, e Dra. Roseana de Almeida Freitas, pela dedicação que todos têm a este programa e por todos os aprendizados e contribuições tão importantes para minha formação durante as disciplinas.
Aos funcionários, Gracinha, Sandrinha, Ricardo, Hévio, Beth, Lourdinha, Talita e Cláudia, por sempre se mostrarem abertos a me atender quando precisei.
“Sempre é bom lembrar que, por mais escura e tenebrosa que seja a madrugada, o sol sempre virá trazer a luz e um novo dia!” Antônio Alves de Brito
RESUMO
O líquen plano (LP) é uma doença crônica imunologicamente mediada relativamente comum, de origem desconhecida, que afeta pele e frequentemente a mucosa oral, entre outras mucosas. Quando ocorre em cavidade oral, é denominado líquen plano oral (LPO), e apresenta-se como uma doença de início espontâneo, de caráter recidivante. O objetivo dessa pesquisa foi analisar a expressão imuno-histoquímica da p53 em líquen plano oral reticular, erosivo e hiperplasia fibrosa, de modo a realizar uma análise comparativa entre os grupos. O estudo realizado foi do tipo transversal e retrospectivo, descritivo e semiquantitativo da expressão imuno-histoquímica de p53, em 20 espécimes de líquen plano oral reticular, 20 de líquen plano oral erosivo e ainda 20 de hiperplasia fibrosa (controle). Na análise estatística, foram aplicados os testes não-paramétricos de Kruskall-Wallis (KW) e Mann-Whitney (U). O nível de significância foi estabelecido em 5% (p<0,05). Foi observado que houve marcação presente em todos os casos de LPO erosivo (100%), em 17 casos de LPO reticular (85%), e em 15 casos de HF (78,9%). Os casos de LPO erosivo mostraram uma maior imunoexpressão nuclear do p53, em comparação aos casos de LPO reticular, sendo esta diferença estatisticamente significativa (p<0,001). Da mesma forma, os casos de LPO erosivo, quando comparados às HFs, apresentaram maior imunoexpressão nuclear de p53, com diferença estatiscamente significativa (p= 0,002). Entretanto, houve ausência de diferenças estatisticamente significativas (p= 0,423) entre os LPO reticulares e as HFs, no que concerne à imunoexpressão nuclear do p53. Pode-se sugerir que os casos de líquen plano oral do tipo erosivo têm uma maior probabilidade de transformação maligna em comparação ao tipo reticular e hiperplasia fibrosa, uma vez que há maior imunoexpressão dessa proteína que é conhecidamente relacionada com diversos tumores do corpo humano.
ABSTRACT
Lichen planus (LP) is a common immunologically mediated chronic disease, of unknown origin, which affects the skin and often the oral mucosa, among other mucous membranes. When it occurs in mouth, it is called oral lichen planus (OLP), and it is presented as a spontaneous onset disease, with a recurrent character. The objective of this research was to analyze the immunohistochemical expression of p53 in reticular and erosive oral lichen planus and fibrous hyperplasia, in order to perform a comparative analysis between the groups. The cross-sectional and retrospective, descriptive and semi-quantitative study of the immunohistochemical expression of p53, in 20 samples of reticular fluid, oral, 20 of oral erosive fluid and 20 of fibrous hyperplasia (control). In the statistical analysis, Kruskall-Wallis (KW) and Mann-Whitney (U) non-parametric tests were applied. The level of significance was set at 5% (p <0.05). It was observed that marking was present in all cases of erosive OLP (100%), in 17 cases of reticular OLP (85%) and in 15 cases of HF (78.9%). The cases of erosive OLP showed a higher nuclear immunoexpression of p53, compared to cases of reticular OLP, this difference being statistically significant (p <0.001). Likewise, cases of erosive OLP, when compared to HFs, showed higher nuclear immunoexpression of p53, with a statistically significant difference (p = 0.002). However, there was no statistically significant difference (p = 0.423) between reticular OLP and HFs, regarding to nuclear immunoexpression of p53. It can be concluded that cases of erosive oral lichen planus are more likely to malignant transformation compared to the reticular type and normal oral mucosa, since there is higher immunoexpression of this protein, which is clinically associated with several tumors of the human body.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Página
Figura 1
(A) Fotomicrografia corada por hematoxilina e eosina (H&E) de líquen plano oral reticular (aumento 10x), exibindo epitélio pavimentoso estratificado hiperparaceratinizado e infiltrado inflamatório subepitelial em banda. (B) Fotomicrografia corada por hematoxilina e eosina (H&E) de líquen plano oral erosivo, evidenciando atrofia epitelial. (aumento 10x). (C): Fotomicrografia corada por hematoxilina e eosina (H&E) de hiperplasia fibrosa, revelando lesão com hiperplasia epitelial e hiperceratose associada.
27
Figura 2
A) Fotomicrografia evidenciando imunoexpressão nuclear de p53 nas camadas basal e parabasal de líquen plano oral reticular (aumento 100x). (B) Fotomicrografia revelando imunoexpressão nuclear de p53 de líquen plano oral erosivo nas camadas basal e parabasal (aumento 100x). (C) Fotomicrografia evidenciando imunoexpressão nuclear de p53 principalmente na camada basal em hiperplasia fibrosa (aumento 100x).
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Página
Quadro 1
Clone, especificidade, diluição, fabricante, recuperação antigênica e tempo de incubação dos anticorpos que
foram utilizados no estudo.
25
Tabela 1 Distribuição absoluta e relativa dos casos de LPO de
acordo com características clínicas. 26
Tabela 2
Distribuição absoluta e relativa dos casos de LPO reticular, LPO erosivo e HF, de acordo com os escores de
imunopositividade nuclear para p53.
29
Tabela 3
Análise dos escores de imunopositividade nuclear para p53 e suas diferenças entre LPO reticular, LPO erosivo e
HF.
30
Tabela 4
Análise dos escores de imunopositividade nuclear para p53 e suas diferenças de acordo com os grupos de
lesões estudadas.
30
Tabela 5
Análise dos escores de imunopositividade nuclear para p53 e suas diferenças de acordo com o sexo e idade dos
pacientes portadores de LPO.
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
LP Líquen plano
LPO Líquen plano oral
CD8+ Grupo de diferenciação 8 (Cluster of Differenciation 8)
CD4+ Grupo de diferenciação 4 (Cluster of Differenciation 4)
MHC Complexo principal de histocompatibilidade (Major histocompatibility
complex)
IL-2 Interleucina-2
IL-12 Interleucina-12
IFN-γ Interferon-gama
TNF-α Fator de necrose tumoral-alfa (Tumor necrosis fator-alpha)
ICAM-1 Molécula de adesão intercelular-1 (Intercellular Adhesion Molecule 1)
VCAM-1 Molécula de adesão vascular-1 (Vascular Cell Adhesion Molecule 1)
HCV Vírus da Hepatite C
RNA Ácido ribonucleico (Ribonucleic acid)
IFD Imunofluorescência direta
RL Reação liquenoide
HSP Proteína do choque térmico (Heat shock protein)
OMS Organização Mundial de Saúde
DNA Ácido desoxirribonucleico (Deoxyribonucleic acid)
CCE Carcinoma de células escamosas
WT Tipo selvagem (Wild Type)
PUMA Modulador de apoptose regulada de p53 (P53 upregulated modulator of
apoptosis)
BAX Proteína X associada ao Bcl-2 (Bcl-2 associated X protein)
APAF-1 Fator 1 de protease apoptóitca ativada (Apoptotic protease activating
factor-1)
Bcl-2 Proteína 2 do linfoma de células B(B-cell lymphoma protein 2)
Bcl-X Proteína extra-grande do linfoma de células B (B-cell lymphoma-extra
large
Mcl-1 Proteína de diferenciação celular de leucemia mielóide induzida (Myeloid cell leukemia-1)
MDM-2 Proteína Murine double minute 2
SUMÁRIO PÁG.
1 INTRODUÇÃO 12
2 REVISÃO DE LITERATURA 13
2.1 EPIDEMIOLOGIA E CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS DO LÍQUEN PLANO ORAL
13
2.2 ETIOPATOGÊNESE DO LÍQUEN PLANO ORAL 14
2.3 CARACTERÍSTICAS HISTOPATOLÓGICAS DO LÍQUEN PLANO ORAL
16
2.4 RELAÇÃO ENTRE O LÍQUEN PLANO ORAL E A CARCINOGÊNESE 17 2.5 P53 18 3 OBJETIVOS 21 3.1 OBJETIVO GERAL 21 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 21 4 METODOLOGIA 22 4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS 22 4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO 22 4.3 POPULAÇÃO 22 4.4 AMOSTRA 22 4.5 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO 23 4.6 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO 23 4.7 ANÁLISE MORFOLÓGICA 23 4.8 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO 23
4.9 ANÁLISE DO PERFIL IMUNO-HISTOQUÍMICO 25
4.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA 25 5 RESULTADOS 26 5.1 ANÁLISE MORFOLÓGICA 27 5.2 ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA 28 5.3 ANÁLISE SEMI-QUANTITATIVA 29 5.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA 29 6 DISCUSSÃO 32 7 CONCLUSÕES 35 REFERÊNCIAS 37 APÊNDICE A 44
1 INTRODUÇÃO
O líquen plano (LP) é uma doença crônica imunologicamente mediada relativamente comum, de origem desconhecida, que afeta a pele e frequentemente a mucosa oral. Ocorre predominantemente em mulheres, na faixa etária compreendida entre 30 e 60 anos (Olson, Rogers, Bruce, 2016). Quando ocorre na cavidade oral, é denominado líquen plano oral (LPO), podendo acometer mucosa jugal, gengiva, dorso de língua e vermelhão do lábio; as lesões são em sua maioria bilaterais e simétricas. Apresenta-se como uma doença de início espontâneo, sendo de difícil tratamento. (Agha-Hosseini, 2013). De acordo com o aspecto da lesão, podemos classificar o LPO em cinco tipos: reticular/papular, erosivo/ ulcerativo, atrófico/eritematoso, tipo placa, e bolhoso (Cheng et al., 2016; Chiang et al., 2018), sendo os dois primeiros os mais prevalentes.
Embora menos comum que o reticular, o LPO erosivo apresenta significância clínica importante, uma vez que o paciente relata sintomatologia dolorosa, principalmente em lesões persistentes e de difícil cicatrização. Além disso, têm sido relatados na literatura casos de transformação maligna em carcinoma de células escamosas, fazendo com que esta lesão se enquadre como uma desordem potencialmente maligna (El-Naggar, 2017).
Para tentar esclarecer os mecanismos que levam a essa transformação, diversos autores, tais como Wawryk-Gawda, (2014); Hadzi-Mihailovic, (2017); Shiva et al., (2018) estudaram o papel da proteína p53 na carcinogênese desta lesão, visto que há uma relação comprovada entre o elevado índice de mutações de seu gene e tumores malignos de diferentes tecidos do organismo. Mesmo com vários estudos a respeito, ainda não há um consenso do porquê desta transformação, motivo pelo qual há necessidade de novas pesquisas visando a uma melhor compreensão sobre a imunopatogênese do LPO, uma vez que a alta expressão desse marcador é útil para a identificação de lesão com maior tendência à malignidade (Aghbari et al., 2017).
Baseado nos anseios científicos de analisar e desenvolver novos parâmetros que determinem ocorrência ou não de malignização dessa doença, esta pesquisa buscou analisar a expressão imuno-histoquímica de p53 no LPO.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 EPIDEMIOLOGIA E CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS DO LPO
O líquen plano (LP) é uma doença mucocutânea inflamatória, presente em aproximadamente 0,5 a 2% da população (Safadi et al., 2010; Payeras et al., 2013), que pode afetar a pele, couro cabeludo, unhas e superfícies mucosas. Os locais de envolvimento mucoso incluem superfícies oral, genital, ocular, periorbitária, esofágica e, menos comumente, nasal, laríngea e anal. (Gupta, Jawanda, 2015). A designação e a descrição desta lesão foram apresentadas pelo médico inglês Erasmus Wilson em 1866. (Do Canto et al., 2010). Louis-Frédéric Wickham acrescentou à descrição da lesão “stries et punctuations grisatres” (estrias e pontos acinzentados), denominados, posteriormente, estrias de Wickham, em 1895. (Charles, Lcdr Margaret L, 2004).
O líquen plano oral (LPO) é uma variante mucosa do LP, que tende a afetar mais as mulheres do que os homens, com um curso tipicamente mais crônico e com potencial para morbidade significativa. (Olson, Rogers, Bruce, 2016; Aghbari, 2017). O LP também pode se apresentar em crianças, embora seja raro (Agel et al., 2018). Estima-se que pacientes com LP cutâneo exibem expressão da doença oral em até 60% dos casos. Entretanto, apenas uma minoria de pacientes com LPO (aproximadamente 15%) desenvolve lesões cutâneas (Cheng et al., 2016).
As formas de apresentação clínica citadas na literatura são cinco: reticular/papular, erosivo/ ulcerativo, atrófico/eritematoso, tipo placa e bolhoso. Podem co-existir algumas formas de apresentação num mesmo paciente. (Cheng et al., 2016; Patil et al., 2016; Larsen et al., 2017). O curso do LPO é geralmente crônico, uma vez que os sinais e os sintomas podem durar várias semanas ou até meses. As variantes hiperceratóticas ou “brancas” (reticular e em placa) são comumente assintomáticas, enquanto as variantes “vermelhas” (atrófica, erosiva e bolhosa) podem apresentar sintomas; estes variam entre uma sensação leve de aspereza da mucosa afetada a prurido e dor, principalmente ao comer alimentos condimentados (Robledo-Sierra, 2018).
os locais mais comumente envolvidos são mucosa oral, língua, gengiva, lábios, assoalho da boca, palato. Em caso de envolvimento gengival, o sangramento durante a escovação pode ser a principal queixa. No caso de eritema visível e ardor gengival, as queixas estéticas são comuns. (Lauritano et al., 2016; Cascone et al., 2017; Robledo-Sierra, 2018).
Dentre as formas de apresentação do LPO, a reticular é reconhecidamente a mais comum. (Brant et al., 2012; Werneck, Miranda, Silva Júnior, 2016; Li, Zhang e Yang, 2019). Apresenta-se como lesões assintomáticas finas, brancas, lineares e semelhantes a rendas da mucosa oral e da gengiva, as já mencionadas estrias de Wickham (Maymone et al., 2019).
O LPO erosivo, o segundo tipo mais comum, é frequentemente associado à dor significativa e desconforto do paciente, afetando negativamente a qualidade de vida. Possui um potencial significativo de transformação maligna, com um risco estimado entre 0,5% a 2%. Pode-se apresentar com eritema central causado por inflamação ou atrofia epitelial, bem como formação de ulceração/pseudomembrana, com a periferia da lesão circundada por estrias ceratóticas reticulares. (Alrashdan, Cirilo, McCullough, 2016; Lajevardi et al., 2016). Muitas vezes, há um padrão conhecido como uma gengivite descamativa, caracterizando-se por atrofia e ulceração da mucosa gengival. Nestes casos, um espécime de biópsia deve ser obtido para estudos de microscopia de luz e de imunofluorescência do tecido perilesional, pois o penfigoide das membranas mucosas e pênfigo vulgar podem ter características semelhantes (Neville et al., 2016).
O diagnóstico pode ser feito através de análise histopatológica proveniente de biópsia; a imunoflorescência direta (IFD) é uma técnica diagnóstica avançada que detecta tanto a presença, como a localização dos autoanticorpos nos espécimes de biópsia (Buajeeb et al., 2015). Entretanto, a maioria dos clínicos prefere lançar mão dessa ferramenta apenas para pacientes que não apresentam características clínicas clássicas do LPO, as quais não se pode diferenciar de outras doenças mucocutâneas (Patel et al., 2016).
Em meio às desordens que podem se assemelhar tanto clínica quanto histopatologicamente às lesões de LPO, podemos destacar as reações liquenoides (RL), porém estas reações possuem uma etiologia identificável (Dudhia et al., 2015; Kamath, Setlur, Yerlagudda, 2015). Várias terminologias, como reação oral
liquenoide, reação oral de tecido liquenoide, estomatite de contato liquenoide e lesões semelhantes a LP foram usadas para descrever essa reação (Juneja et al., 2006). Normalmente, as RL ocorrem próximas a locais que possuem restaurações de amálgama, bem como após a ingestão de medicamentos específicos, além de história de doença crônica do enxerto versus hospedeiro ou doenças sistêmicas. (Cobos-Fuentes et al., 2009; Mravak-Stipetić, 2014).
O LPO envolve o epitélio escamoso estratificado e a lâmina própria subjacente da mucosa oral. As causas que o iniciam e/ou perpetuam são, em grande parte, incertas. (Kurago, 2016). Com relação à etiologia, acredita-se que diferentes agentes externos, especialmente alguns vírus, e a expressão do antígeno da proteína de choque térmico (HSP), podem desencadear a doença. O LPO também pode ser exacerbado por fatores mecânicos, incluindo hábitos de morder/mastigar, procedimentos dentários e fricção de aparelhos dentários mal posicionados ou mal ajustados (como próteses e protetores bucais). Calor e substâncias irritantes do tabagismo também podem agravar lesões (Dudhia et al., 2015).
Fatores psicológicos estão fortemente associados ao LPO, em particular altos níveis de estresse, ansiedade e depressão. Embora essa associação seja conhecida há décadas, as dificuldades em medir objetivamente essas variáveis fizeram com que apenas recentemente a importância da ansiedade e do estresse fosse amplamente reconhecida; esses fatores agora são alvo de inúmeros estudos (Agha Hosseini et al., 2016; Karthikeyan, Aswath, 2016; Cerqueira et al., 2018; Manczyk et al., 2019;)
2.2 ETIOPATOGÊNESE DO LÍQUEN PLANO ORAL
O LPO, descrito como uma doença imunologicamente mediada, possui hipóteses acerca da sua etiopatogênese. As teorias predominantes relatam ativação de células T CD8+ por linfócitos T CD4+, que causam imunorreações pelo Complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I presente nos ceratinócitos, resultando em apoptose destas células. (Aghbari et al., 2017; Cox, Woodhead, Nelson, 2018; Enomoto et al., 2018).
A apoptose ocorre porque os linfócitos T CD4+ auxiliares, que são ativados pelo MHC classe II, promovem a citotoxicidade dos linfócitos T CD8 + através de
várias citocinas, incluindo IL -2, IL-12 e IFN-γ. O IFN-γ induz ceratinócitos a produzir linfotoxina-α e TNF‐α e aumentar o MHC classe II, aumentando mais ainda a interação com as células T CD4+ auxiliares. Além disso, aumenta a expressão da molécula de adesão intercelular 1 (ICAM ‐ 1) e da molécula de adesão celular 1 (VCAM ‐ 1) pelos ceratinócitos, facilitando a adesão linfocitária a estas células, culminando em morte celular pela via das cascatas das caspases (Shirasuna, 2014; Nogueira, Carneiro, Ramos-e-Silva, 2015; Wang et al., 2016).
Mastócitos e células de Langerhans que apresentam antígenos também estão envolvidos na resposta local. A liberação de substâncias como quimases, triptases e TNF-α através da degranulação dos mastócitos irá atuar degradando a matriz extracelular da membrana basal e contribuindo para a migração de linfócitos para os tecidos conjuntivos abaixo da camada epitelial do LPO. (Kapoor et al., 2013; Shirasuna, 2014, Lu et al., 2015)
Os antígenos que desencadeiam a resposta inflamatória permanecem desconhecidos, mas alguns autores citam resposta a autoantígenos ou antígenos exógenos, como o vírus causador da Hepatite C (HCV) (Lodi, Pelicano, Carrozo, 2010; Petti et al., 2011; Nogueira, Carneiro, Ramos-e-Silva, 2015). Entretanto, o RNA do vírus da hepatite C foi detectado em biópsias da mucosa oral de pacientes com hepatite C, independentemente de serem ou não portadores de LPO. Esta descoberta sugere que o HCV não é por si só um agente causador no desenvolvimento do LPO, e que os fatores relacionados ao hospedeiro desempenham um papel importante na patogênese do HCV associada ao LPO.
2.3 CARACTERÍSTICAS HISTOPATOLÓGICAS DO LÍQUEN PLANO ORAL
As características histopatológicas do líquen plano são típicas, porém não específicas, porque outras condições, como a reação liquenoide a medicamentos, a reação liquenoide ao amálgama, a doença do enxerto versus hospedeiro bucal, o lúpus eritematoso, a estomatite ulcerativa crônica e a reação da mucosa bucal à canela, também podem exibir um padrão histopatológico semelhante (Sousa, Rosa, 2008).
proposto por Van der Meij e Van der Waal (2003) são amplamente seguidos por clínicos e pesquisadores. Esses critérios incluem degeneração hidrópica da camada basal, seguida por um infiltrado linfocítico em camadas acentuado imediatamente subjacente ao epitélio; a presença de numerosos corpos coloides eosinofílicos ao longo do epitélio-conjuntivo (corpos de Civatte); as cristas interpapilares podem ser ausentes, hiperplásicas ou, mais frequentemente, em forma de dente de serra; espessura variável da camada espinhosa; e graus variáveis de orto ou paraceratose. (Neville et al., 2016; Aghbari et al., 2017; Cox, Woodhead, Nelson, 2018; Enomoto et al., 2018).
2.4 RELAÇÃO ENTRE O LPO E A CARCINOGÊNESE
Apesar de o LPO ter sido considerado pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como uma condição cancerizável, esse assunto ainda permanece controverso na literatura, uma vez que não se sabe, por exemplo, se a lesão foi diagnosticada erroneamente em sua fase inicial, ou se essa transformação foi encontrada graças à análise de um grupo muito selecionado (por exemplo, pacientes encaminhados para especialistas) (Gonzalez-Moles, 2008). A possível transformação maligna é discutida em estudos prospectivos (Holmstrup et al., 1988; Silverman et al., 1991) e retrospectivos (Mignogna et al., 2001; Bardellini et al., 2013; Casparis et al., 2015). Esses estudos relataram taxas de transformação de até 2,3%.
Embora a maioria dos estudos não tenha conseguido identificar fatores de risco para a transformação maligna do LPO, González-Moles et al., (2009) propuseram que isso poderia ser uma conseqüência de alterações no mecanismo de controle do ciclo celular que afetam amplas áreas da mucosa oral, enquanto outro autor sugere que a presença de carcinógenos (tais como o tabaco e álcool) numa área mais susceptível da mucosa oral possa aumentar essa predisposição. (Idress et al., 2020)
Em um estudo sobre LPO em 2015, Shailaja e colaboradores relataram a super expressão de proteínas importantes, como a p53, em relação aos mecanismos regulatórios da apoptose na LPO, sugerindo que houve um favorecimento para transformação maligna.
Alguns autores sugerem que as “formas vermelhas” devem ser consideradas como fatores de risco para a transformação do LPO, mostrando que apresentação
clínica da doença parece ser relevante para o potencial de malignidade, uma vez que há um maior número de casos de carcinoma de células escamosas (CCE) em lesões erosivas (Eisen et al., 2005; Giuliani et al., 2019; Laniosz et al., 2019).
Apesar da p53 ser um importante preditor positivo do prognóstico da LPO, não há na literatura um estudo avaliando e comparando a imunomarcação da expressão de p53 em LPO erosivo e reticular, em comparação com um grupo controle (hiperplasia fibrosa).
2.5 p53
A p53 é uma fosfoproteína nuclear constituída por 375 aminoácidos, e atua como uma supressora de tumor. Desempenha um papel importante no controle do ciclo celular, uma vez que pode desencadear uma parada do ciclo celular nas fases G1 ou G2, ou até mesmo induzir a apoptose. A p53 com defeito pode permitir que células anormais venham a proliferar, resultando em câncer. Nas células normais, o nível de proteína p53 é baixo. Danos no DNA, hipóxia, oncogenes e outros sinais de estresse podem desencadear o aumento da expressão da proteína p53 (Alves et al., 2013; Hadzi-Mihailovic et al., 2017).
Devido ao seu papel estabelecido como “guardiã do genoma”, a proteína p53 foi ligada a potencial de transformação maligna em células de LPO. A forma funcionalmente ativa, chamada de tipo selvagem ou wild type (WT) responde a vários tipos de estresse celular, e tem vida média muito curta (em torno de 6 minutos), devido a sua rápida degradação, o que torna extremamente difícil a sua detecção. Em contrapartida, foi recentemente demonstrado que o gene TP53 humano codifica pelo menos 9 isoformas diferentes, sendo estas formas mutadas ou inativas, que tendem a acumular-se no núcleo das células, podendo ser facilmente detectadas por métodos imunológicos como a imunocitoquímica, imuno-histoquímica, Western blot ou citometria de fluxo (Junior, Klumb, Maia, 2002; Arreaza, 2015).
A mutação da p53 é considerada uma etapa crítica no processo de transformação maligna e mais de 50% dos casos de câncer apresentam mutações no gene TP53, codificando o p53. A maioria dessas mutações é pontual, normalmente ocorrendo troca de um aminoácido em alguma de suas subunidades.
(Tal et al., 2016). A alteração mais comum da p53 é uma mutação pontual confinada principalmente aos éxons 5 a 8. As alterações da p53 prejudicam a capacidade das células de reparar e sofrer apoptose em resposta a danos no DNA, o que levará ao crescimento descontrolado das células. (Humayun, Prasad, 2011).
A superexpressão de p53 constitui uma forma de resposta celular ao estado hiperproliferativo frequentemente observado na LPO. É possível que mutações na p53 possam constituir um evento oncogênico importante em transformações malignas de LPO. (Leyva-Huerta et al., 2012). Também foi demonstrado que a proteína p53, como resultado de fatores de estresse, atravessa as mitocôndrias e ativa a expressão de genes pró-apoptóticos, como Puma, Bax, Apaf-1, Noxa, além de inibir a expressão de genes anti-apoptóticos, como os da família 2 (2, Bcl-X, Bcl-in, Mcl-1) (Wawryk-Gawda, 2014).
Alterações no p53 são frequentes em tumores. A existência de mutações somáticas na p53 que acarretam disfunção na proteína p53 é um dos mecanismos mais universais pelos quais a via da p53 é danificada durante a carcinogênese. Essas mutações são principalmente substituições de base única que resultam na substituição de aminoácidos. Os níveis de p53 na célula normal são rigidamente controlados. Sob condições normais, o Murine double minute 2 (MDM2), um importante regulador negativo da p53, se liga ao seu domínio de transativação e ubiquidade, e a leva à degradação. Como a p53 ativa a transcrição do MDM2, os níveis de expressão da p53 e do MDM2 são equilibrados por meio de um loop negativo de feedback. Esse equilíbrio é alterado em estresses, como danos no DNA, que levam ao aumento dos níveis de p53 (Patel, 2008).
Um estudo realizado por Meek e Knippschild (2003) analisou a expressão da proteína MDM2, que promove a degradação da forma selvagem e mutante da proteína p53. Foi visto que a expressão do MDM2 no LPO era mais expressiva na camada basal e parabasal; nos casos de CCE, foi observada forte coloração em toda a lesão (Berglund et al, 2008). Além disso, o dano ao DNA pode causar mutações no MDM2, que resultam na perda de ubiquitinação dessa proteína, e consequente maior potencial para uma transformação maligna (Alves et al., 2013).
Safadi e colaboradores (2010) enfatizam o significado do infiltrado inflamatório com uma ampla gama de citocinas que podem estabilizar as proteínas p21 e p53 no LPO. Eles acreditam que o efeito dessas citocinas pode contribuir para a
predisposição maligna de LPO, como é o caso em outras doenças inflamatórias crônicas.
Valente e colaboradores (2001) avaliaram a expressão de p53 em 28 pacientes diagnosticado com LPO. Desses, 15 não apresentaram grau de displasia, 7 apresentaram simultaneamente LPO e CCE, e 6 progrediram para o CCE. Uma expressão aumentada da proteína p53 foi observada em pacientes com LPO e CCE e em aqueles que progrediram para CCE, em comparação com aqueles com LPO sem displasias. Eles levantaram a hipótese que mutações no gene p53 podem estar envolvidas na transformação maligna e sugeriram que a superexpressão de p53 pode ser um indicador de malignidade.
Um estudo realizado por Shirasuna em 2014 mostra que a taxa de transformação maligna geral do LPO é estimada em 1–2%, e taxas mais altas de transformação em italianos podem ser devidas a uma alta prevalência de infecção pelo HCV, demonstrando que populações com alta incidência deste vírus.
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Analisar a expressão imuno-histoquímica da p53 em líquen plano oral reticular, erosivo e hiperplasia fibrosa, de modo a realizar uma análise comparativa entre os grupos.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Correlacionar a expressão imuno-histoquímica da p53 com o sexo dos pacientes; - Correlacionar a expressão imuno-histoquímica da p53 com a idade dos pacientes.
4 METODOLOGIA
4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
Os procedimentos para a realização desta pesquisa respeitaram as diretrizes e normas que regulamentam as pesquisas envolvendo seres humanos, aprovadas pela Resolução 466/2012 do Conselho Nacional de Saúde. O mesmo foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa de Seres Humanos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEP/UFRN) e encontra-se aprovado com parecer nº 387.912 (anexo A).
4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO
O presente estudo é do tipo transversal e retrospectivo, descritivo e semiquantitativo da expressão imuno-histoquímica de p53.
4.3 POPULAÇÃO
A população do estudo foi composta por todos os casos de LPO registrados e diagnosticados no Disciplina de Patologia Oral Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).
4.4 AMOSTRA
A amostra do estudo foi do tipo intencional não probabilística por conveniência, composta por 60 casos, sendo 20 casos de líquen plano reticular, 20 casos de líquen plano erosivo, e 20 de hiperplasia fibrosa (HF), sendo este último o grupo controle, dos arquivos da Disciplina de Patologia Oral Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).
4.5 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO
Foram incluídos na amostra apenas os casos de LPO e HF (controle) cujos blocos em parafina apresentem quantidade suficiente de material para realização do estudo imuno-histoquímico, bem como prontuários com todos os dados clínicos necessários.
4.6 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO
Foram excluídos da amostra espécimes que apresentaram falhas ou problemas durante o corte e processamento, assim como quantidade insuficiente de material, inviabilizando o estudo morfológico e imuno-histoquímico, bem como pacientes fumantes e etilistas crônicos.
4.7 ANÁLISE MORFOLÓGICA
Para o estudo morfológico, foram analisadas sob microscopia de luz as lâminas arquivadas no Laboratório de Anatomia Patológica e Citopatologia da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da UFRN, com cortes de 5μm de espessura do espécime tecidual, coradas pela técnica de rotina da hematoxilina e eosina (HE). Esta análise teve como objetivo a descrição dos aspectos histopatológicos das lesões que compõem a amostra do presente estudo.
4.8 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO
Do material emblocado em parafina foram obtidos cortes de 3μm de espessura e distendidos em lâminas de vidro previamente limpas e preparadas com adesivo à base de organosilano (3-aminopropyltriethoxi-silano, Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA). O material foi posteriormente submetido ao anticorpo monoclonal p53, clone DO 7. O método empregado foi o HiDef HRP (Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA). Na realização do controle positivo foram obedecidas as especificações dos fabricantes para o anticorpo utilizado na pesquisa. O controle negativo consistiu na substituição do anticorpo primário por albumina de soro bovino a
1% (BSA – Bovine Serum Albumin) em solução tampão. A técnica utilizada foi realizada conforme os passos a seguir:
1) Em um recipiente, todas as amostras foram imersas em solução preparada contendo Trilogy®, seguindo, então, as amostras teciduais para panela pascal
para desparafinização, reidratação e recuperação dos sítios antigênicos (Quadro 1);
2) Lavagem do material em água corrente por 3 minutos e duas passagens por água destilada (1 minuto cada);
3) Duas incubações dos cortes, pelo período de 15 minutos, em solução de peróxido de hidrogênio 10 volumes (3%) para o bloqueio da peroxidase endógena tecidual;
4) Lavagem em água destilada;
5) Imersão em solução de Tween20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 durante 5 minutos cada;
6) Incubação com a proteína Background Block (Cell Marque, Rocklin, Califórnia, EUA) por 10 minutos;
7) Lavagem em solução de Tween20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 por 5 minutos; 8) Incubação dos cortes com anticorpos primários diluídos (Envision Flex Antibody
Diluent – DM830). Para ING1, tempo de incubação de 60 minutos; para ING2, tempo de incubação de 18 horas - overnight;
9) Imersão em solução de Tween20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 durante 5 minutos cada;
10) Incubação com anticorpo secundário com Sistema HiDef Detection (Cell Marque; Rocklin, Califórnia, EUA) com aplicação de solução amplificadora por 20 minutos; 11) Imersão em solução de Tween20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 durante 5 minutos; 12) Aplicação do polímero HRP do Sistema HiDef por 20 minutos
13) Duas passagens em solução de Tween20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 por 5 minutos cada;
14) Aplicação do agente cromógeno DAB (diaminobenzidina; Scytek Laboratories; Logan, Utah, USA), durante 5 minutos à temperatura ambiente;
15) Duas incubações em TRIS-HCl por 5 minutos cada; 16) Aplicação do agente cromógeno DAB durante 5 minutos;
18) Contracoloração com hematoxilina de Mayer, à temperatura ambiente, durante 5 minutos;
19) Passagens rápidas em água destilada (3 trocas); 20) Desidratação em cadeia ascendente de etanóis.
Quadro 1. Clone, especificidade, diluição, fabricante, recuperação antigênica e
tempo de incubação dos anticorpos que foram utilizados no estudo
.
Natal, RN/ 2020. Clone Especificidade Diluição Fabricante Recuperação antigênica IncubaçãoMonoclonal p53 (D07) 1:500 Cell Marque
Trilogy em panela Pascal (99ºC) por
30min
60 minutos
4.9 ANÁLISE DO PERFIL IMUNO-HISTOQUÍMICO
As lâminas submetidas à técnica imuno-histoquímica foram examinadas por um avaliador, previamente calibrado, em dois momentos distintos sem acesso aos dados clínicos. Eventuais discrepâncias na atribuição dos escores foram resolvidas em conjunto com um patologista oral experiente. A imunoexpressão da p53 foi analisada em todo o epitélio de acordo com o método adaptado de Shiva et al. (2018), em que a porcentagem de células positivas na camada basal e suprabasal é classificada de acordo com o percentual de marcação nuclear: se houver 0% de células marcadas é categorizada como 0; se <10%, 1; 10-25%, 2; 26-50%,3; e se mais de 50% de células, 4.
4.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados obtidos com a avaliação imuno-histoquímica foram submetidos ao teste de Kolmogorov-Smirnov, que indicou ausência de distribuição normal. Portanto, visando detectar possíveis diferenças na imunoexpressão da p53 de acordo com variáveis clínicas, foram aplicados os testes não-paramétricos de Kruskall-Wallis (KW) e Mann-Whitney (U). O nível de significância foi de 5% (p<0,05).
5 RESULTADOS
Após a análise dos dados, foi observado que, com relação à variável sexo, o feminino foi predominante no LPO, sendo a relação homem:mulher de 1:3. A média de idade dos pacientes para os casos foi de 48,9, variando entre 21 e 83 anos. Quanto à localização anatômica, a região de mucosa jugal foi a mais frequentemente afetada. O perfil clínico e epidemiológico referente a cada uma destas lesões encontra-se detalhado na Tabela 1.
Tabela 1. Distribuição absoluta e relativa dos casos de líquen plano oral de acordo com
características clínicas. Natal-RN, 2020.
Variáveis N % Sexo Masculino 10 25,0 Feminino 30 75,0 Idade 21-30 anos 3 7,5 31-40 anos 8 20,0 41-50 anos 12 30,0 51-60 anos 11 27,5 61-70 anos 5 12,5 71-80 anos 0 0,0 81-90 anos 1 2,5 Localização anatômica Mucosa jugal 28 70,0 Língua 4 10,0 Gengiva 2 5,0 Palato duro 2 5,0 Lábio superior 1 2,5 Lábio inferior 3 7,5 Aspecto clínico Reticular 20 50,0 Erosivo 20 50,0 Total 40 100,0
5.1 ANÁLISE MORFOLÓGICA
Líquen plano reticular
A análise morfológica revelou características típicas da lesão, sendo todos os casos constituídos de revestimento epitelial do tipo pavimentoso estratificado com espessuras variadas, apresentando hiperceratose e cristas epiteliais em formato de dente de serra em alguns casos. A lâmina própria apresentou infiltrado inflamatório mononuclear predominante linfocítico, disposto em faixa, na região subepitelial.
Líquen plano erosivo
A análise morfológica revelou as características anteriormente citadas, entretanto, em alguns casos o epitélio apresentou-se atrófico (com poucas camadas de células), achado histopatológico comum em lesões erosivas.
Figura 1. (A) Fotomicrografia corada por hematoxilina e eosina (H&E) de líquen plano oral reticular (aumento 100x), exibindo epitélio pavimentoso estratificado hiperparaceratinizado e infiltrado inflamatório subepitelial em banda. (B) Fotomicrografia corada por H&E de líquen plano oral erosivo, evidenciando atrofia epitelial. (aumento 100x). (C): Fotomicrografia corada por H&E de hiperplasia fibrosa (aumento 100x), revelando lesão com hiperplasia epitelial e hiperceratose associada. FONTE: Programa de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas /UFRN.
A B
5.2 ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA
As reações imuno-histoquímicas para a proteína p53 foram realizadas em toda a amostra, sendo considerados positivos os casos com células apresentando núcleos com coloração acastanhada, independente da sua intensidade de marcação. Na presente pesquisa, a análise foi realizada apenas no epitélio das lesões estudadas (LPO reticular, LPO erosivo e HF).
Figura 2: (A) Fotomicrografia evidenciando imunoexpressão nuclear de p53 nas camadas basal e parabasal de líquen plano oral reticular (aumento 100x). (B) Fotomicrografia revelando imunoexpressão nuclear de p53 de líquen plano oral erosivo nas camadas basal e parabasal (aumento 100x). (C) Fotomicrografia evidenciando imunoexpressão nuclear de p53 principalmente na camada basal em hiperplasia fibrosa (aumento 100x). FONTE: Programa de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas/UFRN.
A B
5.3 ANÁLISE SEMI-QUANTITATIVA DA PROTEÍNA P53
Na amostra analisada, houve uma marcação da p53 mais pronunciada nas camadas basal/parabasal do epitélio. Essa marcação foi presente em todos os casos de LPO erosivo (100%), em 17 casos de LPO reticular (85%), e em 15 casos de HF (78,9%).
Em relação aos escores da expressão nuclear da p53 no LPO reticular, o 1 foi o mais frequente (n=17, 85%), seguido de 0 (n=3, 15%). No LPO erosivo, o escore 2 foi o mais frequente (n=10, 50%), seguido de 1 (n=7, 35%) e 3 (n=3, 15%). No controle, o escore mais encontrado foi 1 (n=11, 57,8%), seguido de 0 e 2 igualmente (n=4, 21,1%) para ambos os últimos escores. Os resultados referentes à análise semi-quantitativa das proteínas analisadas encontram-se detalhados na Tabela 2. Tabela 2. Distribuição absoluta e relativa dos casos de LPO reticular, LPO erosivo e
controle, de acordo com os escores de imunomarcação nuclear para p53. Natal-RN, 2020.
Escores de imunopositividade Grupo LPO reticular n (%) LPO erosivo n (%) Controle n (%) 0 (0%) 3 (15,0) 0 (0,0) 4 (21,1) 1 (1-10%) 17 (85,0) 7 (35,0) 11 (57,8) 2 (11-25%) 0 (0,0) 10 (50,0) 4 (21,1) 3 (26-50%) 0 (0,0) 3 (15,0) 0 (0,0) 4 (>50%) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) Total 20 (100,0) 20 (100,0) 19 (100,0)
Fonte: Dados da pesquisa. Legenda: LPO, líquen plano oral.
5.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
O teste não-paramétrico de Kruskall-Wallis (KW) revelou haver diferença estatisticamente significativa entre os grupos de lesões em relação às medianas dos escores de positividade para a expressão nuclear de p53 (p <0,001), conforme exposto na tabela 3.
Tabela 3. Análise dos escores de imunorreatividade nuclear para p53 e suas diferenças
entre LPO reticular, LPO erosivo e controle. Natal-RN, 2020.
Grupo n Mediana Q25–Q75 Média dos postos KW p* LPO reticular 20 1,00 1,00-1,00 21,85 20,307 <0,001 LPO erosivo 20 2,00 1,00-2,00 42,20 Controle 19 1,00 1,00-1,00 25,74
Fonte: Dados da pesquisa.
Legenda: *Teste de Kruskall-Wallis. LPO, líquen plano oral; HF, hiperplasia fibrosa.
Uma vez que foi encontrada diferença entre os grupos, estes foram comparados em pares no teste de Mann-Whitney. Os casos de LPO erosivo, em comparação aos casos de LPO reticular, demonstraram maior imunoexpressão nuclear do p53. Os casos de LPO erosivo, quando comparados ao controle, apresentaram maior imunoexpressão nuclear de p53. Entretanto, houve ausência de diferenças estatisticamente significativas (p= 0,423) entre os LPO reticulares e o controle, no que concerne à imunoexpressão nuclear do p53, assim como elucidado na Tabela 4.
Tabela 4. Análise dos escores de imunopositividade nuclear para p53 e suas diferenças de
acordo com os grupos de lesões estudadas. Natal-RN, 2020.
Grupo n Mediana Q25–Q75 Média dos
postos U p* LPO reticular 20 1,00 1,00-1,00 13,48 59,50 <0,001 LPO erosivo 20 2,00 1,00-2,00 27,53 LPO reticular 20 1,00 1,00-1,00 18,88 167,50 0,423 Controle 19 1,00 1,00-1,00 21,18 LPO erosivo 20 2,00 1,00-2,00 25,18 86,50 0,002 Controle 19 1,00 1,00-1,00 14,55
Fonte: Dados da pesquisa.
Legenda: *Teste de Mann-Whitney. LPO, líquen plano oral.
O teste de Mann-Whitney foi novamente aplicado para testar diferenças entre ao sexo e idade. De acordo com os resultados, mulheres apresentaram maior imunoexpressão nuclear do p53 em comparação aos homens (p<0,05). Com base nas médias dos postos e no valor de p, houve tendência à maior expressão nuclear do p53 em pacientes com idade superior a 40 anos. Entretanto, não foi encontrada significância estatística na relação entre estas variáveis, de acordo com o que pode ser observado na Tabela 5 (p>0,05).
Tabela 5. Análise dos escores de imunopositividade nuclear para p53 e suas diferenças de
acordo com o sexo e idade dos pacientes portadores de LPO. Natal-RN, 2020.
Grupo n Mediana Q25–Q75 Média dos
postos U p* Sexo Masculino 10 1,00 1,00-1,00 14,15 86,50 0,024 Feminino 30 1,00 1,00-2,00 22,62 Idade ≤ 40 anos 11 1,00 1,00-1,00 15,82 108,00 0,075 > 40 anos 29 1,00 1,00-2,00 22,28
Fonte: Dados da pesquisa.
6 DISCUSSÃO
O líquen plano é uma doença mucocutânea imunomediada, de natureza crônica inflamatória, sendo a cavidade oral um dos locais mais comumente afetados. A etiologia do LPO é desconhecida, embora diversos estudos demonstrem o envolvimento do sistema imunológico mediado por células T na patogênese das lesões (Leite et al., 2019).
Os resultados epidemiológicos desse estudo concluíram que a idade média dos pacientes foi de 48,9 anos, e a maioria dos pacientes é do sexo feminino (75%), o que corrobora os achados em outros estudos (Lore et al., 2016; Mutafchieva et al., 2018; Ghelani, Desai e Goswami, 2019). Uma possível razão para este achado pode ser o fato de que as mulheres tenham maior predisposição genética, neuronal e psicológica para o desenvolvimento de episódios depressivos ou ansiosos (Ramsey et al., 2016), bem como uma predisposição hormonal comum na faixa etária citada, devido à menopausa (Mohan et al., 2017), o que em conjunto culminaria no desenvolvimento do LPO. Isso sugere que as mulheres são mais susceptíveis ao LPO.
Na pesquisa realizada por Bardellini et al. (2013) e Carrozzo et al. (2019), foi visto que, em pacientes com LPO, o local mais comumente afetado é a mucosa jugal, seguidos de língua, gengiva e palato duro, assim como no presente estudo. González-Moles e colaboradores (2016) verificaram que o risco de transformação maligna é aumentado pela localização na língua e presença de áreas erosivas e/ou atróficas, corroborando os achados encontrados nesse estudo.
A p53 é uma proteína supressora de tumor, com papel importante no controle do ciclo celular e apoptose, sendo um biomarcador importante presente em desordens orais potencialmente malignas. Desde que foi diagnosticado o primeiro caso de carcinoma de células escamosas desenvolvido a partir de um líquen plano da mucosa (Hallopeau, 1910) o odds ratio dessa transformação é motivo de pesquisas e a mutação desta proteína tem sido alvo de discussões (Al–Azzawi, 2014; Calenic et al., 2014; Hadzi-Mihailovic et al., 2017) como uma das prováveis razões para as transformações malignas encontradas.
O método de análise da marcação imuno-histoquímica de p53 por nós utilizado é uma adaptação do método de Shiva (2018). Este método foi empregado por ser de fácil e relativamente rápida execução. Entretanto, como todo método de análise
histopatplógica, pode estar sujeito a variações entre observadores e pode ser prejudicado em pequenas biópsias, uma vez que, por exemplo, o patologista pode ser induzido a atribuir um escore maior em um tecido que se apresenta atrófico. Para minimizar este viés, buscamos utilizar biópsias com boa quantidade de tecido, bem como analisar duas vezes as mesmas.
Na análise imuno-histoquímica realizada na presente pesquisa, foi visto que a expressão de p53 obteve um escore maior (3) no grupo do subtipo clínico erosivo, assim como no estudo realizado por Shiva et al., (2018). Da mesma forma, outros estudos (Georgakopoulou et al., 2012; Alves et al., 2013) observaram também uma imunoexpressão maior de p53 em LPO erosivo em comparação com hiperplasia fibrosa, corroborando os resultados encontrados. Isso provavelmente se deve ao fato de a expressão de p53 estar aumentada em situações de inflamação crônica. Agha Rossein et al. (2009), estimam que a superexpressão de p53 constitui uma forma de resposta celular ao estado hiperproliferativo freqüentemente visto nesta lesão. Ao nosso ver, isso provavelmente pode ser a causa da p53 se expressar com mais frequência nos casos erosivos, resultado de uma forma de recuperação do epitélio muitas vezes atrófico.
Um estudo realizado por Humayun e Prasad em 2011 enfatizou o uso potencial da proteína p53 como marcador de transformação maligna e carcinogênese em lesões pré-malignas orais, uma vez que esta proteína se encontrava em maior expressão no epitélio de tais lesões, assim como foi evidenciado no presente estudo.
Huang WY et al. (1994) observaram que há uma predileção significativa pelo padrão de marcação basal e supra-basal com a progressão da lesão em direção à malignidade em comparação com a coloração estritamente basal da camada na mucosa normal. Logo, pode-se sugerir que a expressão de p53 acima da camada basal pode ser um indicador de potencial maligno. Este tipo de padrão também foi encontrado em nosso estudo.
Assim como este estudo, diversos autores (Fan et al., 2015; Dolka, Król, Sapierzyński, 2016; Song et al., 2016; Viveka et al., 2016) utilizaram p53 para prever o prognóstico de tumores em boca e em outras localizações, encontrando uma maior imunoexpressão dessa proteína em estágios mais graves das lesões, sugerindo que esta proteína pode estar relacionada com a progressão e maior agressividade tumoral.
Um estudo realizado por González-Moles e colaboradores (2008) também verificou a imunoexpressão do anticorpo monoclonal anti p53 DO7 (tipo selvagem) em líquen plano oral, porém relacionando com a imunoexpressão de pAb240 (tipo mutado). Foi visto que o tipo DO7 apresenta uma maior expressão nas lesões de LPO em comparação com o tipo mutado, representando um mecanismo eficaz de vigilância do genoma, motivo pelo qual provavelmente há uma taxa baixa de transformação maligna.
Guido et al. (2001) relatou que a proteína p53 selvagem normalmente se encontra numa posição basal em ceratinócitos presentes nas lesões de LPO; em contraste, na presente pesquisa, os casos de LPO erosivo mostraram várias células positivas para p53 além da camada basal, o que não é comum de ser observado na forma selvagem de p53.
Nasser e colaboradores (2011) avaliaram a expressão de p53, entre outros marcadores, com o intuito de identificar chances para uma provável transformação maligna em leucoplasias sem displasia. Foi encontrado uma porcentagem de 45,9% de imunoexpressão desta proteína na amostra, o que difere dos resultados encontrados no nosso estudo, em que houve marcação em 92,5% dos casos de LPO.
Aghahosseini e Mirzaii (2013) demonstraram que os valores de p53 salivar não estimulados em pacientes com LPO reticular eram significativamente maiores do que em indivíduos saudáveis e em formas erosivas. Eles concluíram que a placa presente na forma reticular de LPO era importante em termos de potencial de malignidade, indo de encontro aos resultados encontrados no presente estudo, em que o LPO erosivo revelou uma maior marcação do p53 comparado com o tipo reticular.
Com base nos resultados atuais, o painel imuno-histoquímico composto por p53 pode ajudar a predizer alterações malignas potenciais no LPO. O aumento observado na expressão do marcador entre os três grupos analisados indicou a diferença de comportamento biológico entre o LPO erosivo e o reticular, mostrando que este pode ser útil para avaliação de casos com um maior potencial de agressividade. Além disso, reforça o quão necessário e importante é o acompanhamento dos pacientes que são portadores desta doença, de modo a diagnosticar o mais cedo possível uma transformação maligna, caso venha a acontecer.
8 CONCLUSÕES
- Observou-se uma maior imunoexpressão de p53 em casos de líquen plano oral erosivo, quando comparado ao reticular e ao grupo controle, sugerindo que a expressão desta proteína estaria relacionada com um aumento do risco de transformação maligna no subtipo erosivo da lesão.
- Notou-se uma maior imunoexpressão de p53 em mulheres com idade acima de 40 anos, sugerindo que este pode ser um grupo de risco dentre os pacientes portadores de líquen plano oral.
REFERÊNCIAS
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of Iran, v. 28, n. 2, p. 78-85, 2016.
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