A influência da emissão sonora nos constituintes da lâmina própria da prega ventricular

Texto

(1)UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO. ANDRÉ ARMANI. A influência da emissão sonora nos constituintes da lâmina própria da prega ventricular. RIBEIRÃO PRETO 2015.

(2) ANDRÉ ARMANI. A influência da emissão sonora nos constituintes da lâmina própria da prega ventricular. Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências Médicas. Área de Concentração: Morfofisiologia de Estruturas Faciais.. Orientador: Prof. Dr. Rui Celso Martins Mamede. RIBEIRÃO PRETO 2015.

(3) Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial desta Tese, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.. FICHA CATALOGRÁFICA Armani, André A influência da emissão sonora nos constituintes da lâmina própria da prega ventricular / André Armani - Orientador: Rui Celso Martins Mamede. Ribeirão Preto, 2015. 65p.: 9il. Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Área de Concentração: Morfofisiologia de Estruturas Faciais.. 1. Prega ventricular; 2. Lâmina própria; 3. Colágeno; 4. Fibras elásticas..

(4) FOLHA DE APROVAÇÃO. Aluno: André Armani Título: A influência da emissão sonora nos constituintes da lâmina própria da prega ventricular.. Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências Médicas. Área de Concentração: Morfofisiologia de Estruturas Faciais.. Aprovado em: Banca Examinadora. Prof. Dr. ________________________________________________________ Instituição: ______________________________________________________ Assinatura ______________________________________________________ Prof. Dr. ________________________________________________________ Instituição: ______________________________________________________ Assinatura ______________________________________________________ Prof. Dr. ________________________________________________________ Instituição: ______________________________________________________ Assinatura ______________________________________________________ Prof. Dr. ________________________________________________________ Instituição: ______________________________________________________ Assinatura ______________________________________________________ Prof. Dr. ________________________________________________________ Instituição: ______________________________________________________ Assinatura ______________________________________________________.

(5) Dedicatória. Dedico esta tese à minha esposa, Alessandra, com amor e carinho, por sua infinita paciência e compreensão, pela ajuda e sabedoria nesses anos da realização da tese. Dedico também aos meus filhos, Pedro e Manuela, que fazem valer cada novo dia. Por fim, também dedico esta tese aos meus pais, que, com grande esforço, me fizeram chegar até aqui..

(6) Agradecimentos. Aos meus irmãos Gustavo, Juliana e Guilherme, aos meus cunhados, Ana, Fabiana, Alécia, Gustavo e Patrícia, e aos meus sogros Rubens e Louris, que juntos formamos uma família. Que sempre está presente nos momentos alegres e tristes, fáceis e difíceis, bons e ruins. Agradeço por fazer parte desta maravilhosa família. Agradeço, de forma especial, ao meu orientador, Prof. Dr. Rui Celso Martins Mamede, grande mestre e exemplo, com o qual convivi durante anos e aprendi a admirar. Obrigado pela dedicação em toda esta minha jornada de aluno de graduação a residente e doutorando. À Profa. Dra. Maria Celia Jamur, que com muita dedicação me guiou na execução das lâminas e análises desta tese. Agradeço aos Professores Francisco Veríssimo de Mello-Filho e Hilton Marcos Alves Ricz, pelos ensinamentos e pela maestria na condução da minha formação como médico e cirurgião. Ao grande amigo Prof. Dr. André Márcio Vieira Messias, pelas valiosas aulas na pós-graduação e na sua inestimável ajuda com a estatística. Agradeço a todos os médicos assistentes da Disciplina de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, pelos anos de ensinamentos. Agradeço a todos os colegas de residência médica, pelos anos compartilhados, tenham todos a certeza de que a amizade construída em todo este tempo será eterna. Muito obrigado! Agradeço à técnica Vani, pela habilidade e pelo carinho, sem ela esta tese jamais seria concluída. Agradeço a todos os funcionários do Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, que tanto se esforçam, diariamente, para o funcionamento das disciplinas. Agradeço, em especial, às secretárias Lilian e Cecilia. Muito obrigado!.

(7) Resumo.

(8) Resumo. ARMANI, A. A influência da emissão sonora nos constituintes da lâmina própria da prega ventricular. 2015. 65f. Tese (Doutorado), Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Ribeirão Preto. 2015. As pregas vocais (PV) são estruturas únicas, altamente especializadas na vibração para a produção sonora. Em grande parte, decorrente da estruturação em camadas da lâmina própria (LP). Essa estruturação não está presente ao nascimento, somente após anos de uso vibratório e fonatório da PV é que a LP está finalmente estruturada. As pregas ventriculares (PVT) não são, habitualmente, estruturas vibratórias na produção sonora, e possuem a LP menos organizada em estratos, sendo menos especializadas para a vibração. Até o presente momento, não se tem conhecimento do que ocorre com os constituintes da LP de PVTs de pessoas que as utilizam como fonte produtora de voz. No presente estudo, foram comparados os constituintes colágenos e as fibras elásticas da LP de PVTs de indivíduos que as utilizam como principal fonte vibratória na produção de voz com o grupo controle. Foram selecionados seis indivíduos que utilizavam pelo menos uma das PVTs como fonte de vibração para a produção sonora por ao menos seis anos. Delas, colheu-se pequeno fragmento (0,5 cm2), que após processamento histológico, as fibras colágenas foram coradas com Picrosirus Red e as fibras elásticas com Weigert resorcina-fucsina. Foram obtidas 54 imagens da camada mais superficial da LP de cada PVT para cada coloração. Após a aquisição das imagens, as fibras colágenas tipo I e tipo III, colágenas totais e fibras elásticas foram quantificadas utilizando-se o software Image-Pro Plus, e comparadas com as PVTs dos controles. A análise estatística foi realizada por meio do teste T de Student para amostras não pareadas. A porcentagem de colágeno total na camada mais superficial da LP de PVT utilizada como fonte vibratória para a produção de som foi significativamente maior em relação aos controles. O mesmo ocorreu com a quantidade de colágeno tipo I. Não houve diferenças na quantidade de colágeno tipo III e de fibras elásticas. Como conclusão, pode-se afirmar que a utilização da PVT como fonte vibratória produtora de som leva ao aumento da quantidade de fibras colágenas totais e do tipo I na camada mais superficial da sua LP. Palavras-chave: Prega ventricular, Lâmina própria, Colágeno, Fibras elásticas..

(9) Abstract.

(10) Abstract. ARMANI, A. The influence of the sound emission on the lamina propria of the ventricular fold. 2015. 65f. Tese (Doutorado), Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Ribeirão Preto. 2015. The vocal folds (VF) are unique structures, highly specialized in vibrating for sound production. This specialization is mainly due to a layered structure of the lamina propria (LP). This layered structure is not present at birth, and develops only after a several years of phonation. The LP of the mature vocal fold consists of three layers. The ventricular folds (VTF) are not originally vibrating structures for sound production, and in its LP the layers are poorly organized. It is not known what happens to the constituents of the LP in the VTF in subjects that use VTF vibration as a source of voice production. In the present study, the distribution and quantity of collagen and elastic fibers of the lamina propria from VTF of patients that use it as the main source of vibration for voice production were compared with the VTF from control subjects. Six individuals that used at least one of the VTF as source of vibration for sound production for minimum of six years were selected. A small fragment of VTF (0.5 cm2) used as vibration source of sound production was collected from each subject. The samples were processed for histological analysis. Collagen fibers were stained with Picrosirus Red and elastic fibers were stained with Weigert's Resorcin-Fuchsin. A total of 54 images were obtained from the superficial layer of the LP from each VTF for each stain. After image acquisition, collagen type I, III, total collagen and elastic fibers were quantified and compared with the VTF from the control group. Quantification was done using Image-Pro Plus software. Statistics were performed using an unpaired Student T test. The amount of total collagen in the most superficial layer of LP when the VTF was used as the source of vibration for the production of sound was significantly higher when compared to controls. The same result was seen for the amount of type I collagen in both groups. There was no difference in the quantity of type III collagen and elastic fibers between the two groups. Vibration of the VTF as a source of sound, for at least six years, leads to an increase in the amount of total collagen fibers and an increase in type I collagen, but does not increase the amount of type III collagen and elastic fibers in the most superficial layer of LP. These results may help elucidate the unique development of the lamina propria of the vocal fold. Keywords: Ventricular fold, lamina propria, collagen, elastic fibres..

(11) Lista de Figuras.

(12) Lista de Figuras. Figura 1- Imagens representativas de videolaringoscopia de paciente portador de disfonia ventricular espontânea ...................................... 28 Figura 2- Imagens representativas de videolaringoscopia de paciente submetido à laringectomia parcial vertical ......................................... 28 Figura 3- Imagem representativa do software Image-Pro Plus para a quantificação de colágeno total em uma área de 100 μm2 ................ 31 Figura 4- Imagem representativa do software Image-Pro Plus para a quantificação de fibras elásticas em uma área de 100 μm 2 .............. 32 Figura 5-. Imagens representativas dos cortes histológicos .............................. 35. Figura 6 - Representação gráfica da porcentagem de colágeno total, em área total de 300 μm2, dos grupos controle e paciente ..................... 37 Figura 7 - Representação gráfica da porcentagem de colágeno tipo I, em área total de 300 μm2, dos grupos controle e paciente ..................... 38 Figura 8 - Representação gráfica da porcentagem de colágeno tipo III, em área total de 300 μm2, dos grupos controle e paciente ..................... 39 Figura 9 - Representação gráfica da porcentagem de fibras elásticas, em área total de 300 μm2, dos grupos controle e paciente ..................... 40.

(13) Lista de Tabelas.

(14) Lista de Tabelas. Tabela 1 -. Características dos pacientes incluídos no estudo ........................... 36. Tabela 2 -. Características dos indivíduos controles ........................................... 36. Tabela 3 -. Média ± DP da quantificação de cada tipo de fibra, em %, da área total em 300 μm2, para pacientes que utilizavam a PVT como fonte sonora por até seis anos ou por mais de seis anos ....... 41. Tabela 4 -. Média ± DP das quantificações de cada tipo de fibra entre os grupos de pacientes que possuíam como mecanismo de indução da utilização da PVT, como fonte sonora, uma cirurgia (LPV) e o grupo sem cirurgia (disfonia ventricular espontânea) ....................... 41.

(15) Lista de Abreviaturas.

(16) Lista de Abreviaturas. cm2-. Centímetros Quadrados. COX-2-. Ciclooxigenase-2. DP-. Desvio Padrão. HCFMRP-USP- Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo HE-. Hematoxilina e Eosina. Hz-. Hertz. IL-1β-. Interleucina 1β. LP-. Lâmina própria. LPI-. Camada Intermediária da Lâmina Própria. LPP-. Camada Profunda da Lâmina Própria. LPS-. Camada Superficial da Lâmina Própria. LPV-. Laringectomia Parcial Vertical. mRNA-. RNA Mensageiro. MV-. Músculo Vocal. PV-. Pregas Vocais. PVT-. Pregas Ventriculares. RNA-. Ribonucleic acid. TB-. Tuberculose. TGF-β1-. Transforming growth factor β-1. μm-. Micrômetros. μm2-. Micrômetros Quadrados.

(17) SUMÁRIO. 1. INTRODUÇÃO .............................................................................................. 17. 2. OBJETIVO .................................................................................................... 24. 3. CASUÍSTICA E MÉTODOS .......................................................................... 26. 4. RESULTADOS ............................................................................................. 33 4.1. Características dos indivíduos estudados......................................................... 36 4.2. Quantificação de fibras colágenas .................................................................... 37 4.3. Quantificação de fibras elásticas ...................................................................... 39 4.4. Análise entre grupos específicos ...................................................................... 40 4.4.1. Quanto ao tempo de uso da PVT na fonação ......................................... 40 4.4.2. Quanto ao posicionamento da PVT na laringe ....................................... 41. 5. DISCUSSÃO ................................................................................................. 42. 6. CONCLUSÃO ............................................................................................... 51. 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 53. 8. ANEXOS ....................................................................................................... 62. ANEXO DE PUBLICAÇÃO.

(18) 1. Introdução.

(19) Introdução. | 18. A laringe é um órgão cilíndrico, situado na porção média e anterior do pescoço, contendo um esqueleto cartilaginoso e tecidos moles, sempre revestidos por mucosa do tipo respiratória ou fonatória, com funções principais na respiração, circulação, deglutição, fonação e proteção da via aérea. Estende-se da epiglote e das pregas ariepiglóticas, cranialmente, até a borda inferior da cartilagem cricoide, na sua porção mais caudal. Comunica-se com a hipofaringe pelo ádito da laringe e com a traqueia. Na parede medial, de cada lado, encontram-se duas pregas mucosas internas, que se projetam para a luz, as pregas ventriculares (PVTs), também chamadas de pregas vestibulares ou falsas cordas vocais, situadas mais superiormente; e as pregas vocais (PVs), mais inferiormente. O espaço entre as PVTs é chamado de rima vestibular e o espaço entre as PVs, de rima glótica. A área da laringe entre o ádito e a rima vestibular é chamada de vestíbulo laríngeo, enquanto a área entre a rima vestibular e a rima glótica, de ventrículo; e a área abaixo da rima glótica é a cavidade subglótica (Sasaki; Kim, 2003; Dhillo, 2008; Mor; Blitzer, 2015). O ventrículo tem um prolongamento lateral e ascendente, entre a PVT e a cartilagem tireoide, denominado sáculo laríngeo (Dhillo, 2008). O tamanho do sáculo laríngeo é bem variável, mas raramente ultrapassa a membrana tireohioidea (Sasaki; Kim, 2003). O esqueleto cartilaginoso é composto pelas cartilagens epiglote, tireoide e cricoide, que são únicas, e pelos pares das cartilagens aritenoides, corniculadas e cuneiformes. Os tecidos fibroelásticos da laringe estão concentrados em duas principais estruturas: o cone elástico e a membrana quadrangular. O cone elástico ocupa a glote e a infraglote, sendo mais espesso e rígido ao nível da glote, onde termina formando o ligamento vocal. Na supraglote situa-se a membrana quadrangular, que se insere na margem lateral da epiglote e estende-se, posteriormente, até as cartilagens corniculadas e aritenoides. É na porção inferior da membrana quadrangular que se encontra o tecido conjuntivo das PVTs. O tecido que recobre a laringe é quase todo formado por um epitélio do tipo colunar ciliado respiratório, com exceção da cobertura das PVs, em que o epitélio é do tipo escamoso estratificado (Noordzij; Ossoff, 2006). Segundo Lucas et al. (2015), uma pequena porção da borda livre medial das PVTs é também recoberta por um epitélio escamoso estratificado, semelhante ao encontrado nas PVs. A mucosa.

(20) Introdução. | 19. que reveste as PVs não contém glândulas secretoras, ao passo que a mucosa das PVTs possui grande quantidade de glândulas mucosas (Nassar; Bridger, 1971); muitas dessas direcionadas para o sáculo e a glote, tendo grande importância na hidratação, lubrificação e proteção imunológica de toda a laringe, em especial das PVs (Gracco; Kahane, 1989). Dentre as funções da laringe, destaca-se, filogeneticamente, como mais primordial a sua atuação como esfíncter, protegendo a via aérea da entrada de líquidos e alimentos (Sasaki; Buckwalter, 1984). De acordo com Perelló (1978), a epiglote é a parte superior desse esfincter, as PVTs a porção medial e as PVs sua porção inferior. Pela descrição de Sasaki e Buckwalter (1984), a função respiratória da laringe surge no segundo momento da evolução junto com o desenvolvimento do complexo cricoide-aritenoide, governado pelo reflexo muscular de abertura da laringe, com a inspiração, e de fechamento parcial da laringe na expiração. Já a função fonatória e de comunicação da laringe, melhor observada nos mamíferos, surge em momento mais avançado da evolução; considerada por Negus (1949), a de menor importância dentre as funções laríngeas. Por ser a comunicação oral fundamental aos humanos, e como a principal estrutura vibratória e fonte sonora da laringe são as PVs, elas têm sua estrutura e funcionamento amplamente estudados (Chan et al., 2006). Sabe-se que a PV humana possui uma estrutura histológica muito peculiar e complexa, que possibilita a emissão de sons. O arranjo do tecido conjuntivo dentro da PV permite a vibração da membrana mucosa com mínima restrição. Para tal vibração, histologicamente, a PV contém cinco camadas: o epitélio escamoso; a camada superficial da lâmina própria, clinicamente conhecida como espaço de Reinke; a camada intermediária da LP e a camada profunda da LP; estas duas últimas juntas formam o ligamento vocal e, finalmente, o músculo vocalis ou músculo tireoaritenoideo (Noordzij; Ossoff, 2006). A camada superficial da LP é reconhecida pela pouca quantidade de fibras proteicas, já a camada intermediária LP, pela abundância em fibras elásticas, e a camada profunda da LP pela sua grande quantidade de colágenos (Hirano et al., 1983). Esse tecido conjuntivo, altamente especializado, é constituído por células imersas em uma matriz.

(21) Introdução. | 20. extracelular. Segundo Catten et al. (1998), as células mais abundantes da LP são os fibroblastos, macrófagos e miofibroblastos, enquanto a matriz extracelular se constitui por fibras colágenas e elásticas e uma substância fundamental amorfa constituída, essencialmente, de glicosaminoglicanas. As glicosaminoglicanas, como o queratan sulfato, heparan sulfato e sulfato de condroitina, se ligam a proteínas para formar as proteoglicanas (fibromodulina, decorina, biglican e condroitina) que exercem importante papel na ligação da LP à membrana basal, na migração celular, diferenciação celular, no transporte molecular e na concentração molecular, modulando a função do fibroblasto e a sua migração (Butler et al., 2001). Além disso, participam na viscosidade e no controle osmolar local. O ácido hialurônico é uma glicosaminoglicana produzida por diferentes tipos celulares como macrófagos e fibroblastos. Com meia vida de três a cinco dias, liga-se às fibras colágenas e a outras proteoglicanas e proteínas para constituir a matriz extracelular, a qual assegura a regulação osmótica, viscosidade, arquitetura e habilidade do tecido em resistir a traumas (Hammond et al., 1998). O ácido hialurônico, que também exerce papel importante na modulação da inflamação, permitindo a recomposição dos tecidos no pós-operatório (Pawlak et al., 1996; Chan et al., 2001); possui, segundo Branco et al. (2014), distribuição uniforme pela LP da PV. A quantidade de cada um dos componentes do tecido conjuntivo, células e matriz extracelular, varia ao longo da espessura da PV. Desde os estudos de Hirano et al. (1983), já se conhece a estratificação da LP da PV em camadas. Muñoz-Pinto et al. (2009) mostraram que a camada superficial da LP da PV contém poucas fibras colágenas e que a maioria dessas são fibras mais delgadas, enquanto a camada profunda da LP contém a maioria das fibras colágenas e estas são mais espessas. Julias et al. (2013), concordando com Madruga de Melo et al. (2003), mostraram que a quantidade de colágeno é menor na camada mais superficial, diminui ainda mais na camada média e torna-se maior na camada profunda junto ao músculo tireoaritenoideo. Essa estratificação em três camadas da LP das PV, como demonstrado por Hartnick et al. (2005), não está presente logo ao nascimento. Segundo os autores, já é possível detectar, aos dois meses de vida, uma diferenciação bilaminar da LP, porém é somente na puberdade que a maturação, em três.

(22) Introdução. | 21. camadas, dessa estrutura, está completa. Os autores sugerem, ainda, que essa diferenciação aconteça devido à função fonatória progressiva à qual a PV é submetida ao longo dos anos. Destaca-se, também, que as dimensões da laringe são diferentes no recém-nascido e no adulto, pois no recém-nascido a glote posterior (mais ligada à respiração) ocupa, aproximadamente, 70% de toda a área glótica; favorecendo, aparentemente, a respiração sobre a fonação nesse período da vida (Sato et al., 2015). Durante as últimas décadas, um novo componente celular da LP da PV vem sendo descrito e pesquisado, as stellate cells, ou células estreladas. Essas são uma classe especial de células intersticiais, morfologicamente similares aos fibroblastos, que têm importante papel no metabolismo da matriz extracelular da LP das PVs, atuando também como um tipo de célula tronco ou célula progenitora (Sato et al., 2003; Kurita et al., 2015). Fuja et al. (2005) mostraram que as stellate cells são um tipo celular bioquimicamente diferente dos fibroblastos da traqueia. Como as stellate cells de outras partes do corpo, elas estão associadas a um nicho, a mácula flava. Para Sato et al. (2012a), a mácula flava tem relação com o crescimento e a maturação das PVs e, segundo esses autores, a atividade das stellate cells no metabolismo, na produção e regulação da matriz extracelular da LP das PVs, é estimulada pela fonação (Sato et al. 2011). Por outro lado, a morfologia e a função da PVT têm despertado pouco interesse por ser um elemento anatômico com funções menos definidas e pouca ação na fonação (Guida et al., 1998). As PVTs são formadas por um tecido gorduroso e fibroelástico, fibras musculares e um ligamento vestibular, cobertos por um epitélio (Guida; Zorzetto, 2007); e além de agir como parede superior do ventrículo da laringe e de delimitar anteriormente o sáculo laríngeo, apresenta uma borda que se projeta para a supraglote e parece exercer importante função, como esfíncter, nos reflexos de engasgo, expectoração, vômito, defecação, micção, durante o riso e na manobra de Valsalva. Existe, segundo Kutta et al. (2002), uma função imunológica das PVTs ao secretar peptídeos com função antimicrobiana em seu muco. Confirmando o pouco interesse no estudo anatomofisiológico da PVT, somente em 1998 é que Reidenbach esclareceu como seria a distribuição das fibras musculares nesse elemento anatômico..

(23) Introdução. | 22. Segundo o autor, essas fibras se dispõem em forma de três fascículos musculares com função adutora. Um estudo mais recente mostrou que essas fibras estão dispostas lateralmente na PVT, tendo na borda livre maior concentração de tecido conjuntivo e glandular (Moon; Alipour, 2013). Guida e Zorzetto (2007) destacaram que esse tecido conjuntivo é constituído por fibras colágenas e elásticas, dispostas de forma irregular numa camada subepitelial. No entanto, ainda não havia identificação detalhada dos elementos que constituem esse tecido conjuntivo e principalmente a sua matriz extracelular, sendo esse estudo concluído por Lucas (2008), em sua dissertação de mestrado. Historicamente, as PVTs nunca foram implicadas na fisiologia normal da produção de voz; porém mais recentemente, alguns estudos têm demonstrado a sua participação na vocalização normal. A contração de estruturas supraglóticas pode aumentar a eficiência da vibração das PVs em indivíduos normais, de acordo com Bailly et al. (2014), que observaram que as contrações das PVTs podem sofrer alterações, diminuindo ou aumentando a vibração das PVs. Em estudo com pacientes que tiveram a supraglote ressecada para tratamento do câncer, diferenças significativas foram encontradas na ressonância e na qualidade vocal (Stager, 2011). Em algumas situações, as PVTs podem, até mesmo, ser a fonte vibratória produtora de sons específicos, como no glottal stop (Stager et al., 2000); na vocalização por sussurros (Rubin et al., 2006); ou até em alguns tipos de cantos (Borch et al., 2004). Há situações, porém, em que a PVT funciona como principal fonte sonora, principalmente em condições patológicas. As etiologias mais frequentes nesses casos são: severa tensão muscular; alterações psicológicas; inoperância da PV ou mesmo na sua ausência, como na ressecção cirúrgica de um câncer glótico (Sataloff, 1997). Desse modo, um som mais grave e de pior qualidade passa a ser emitido, é a chamada disfonia ventricular ou “Plica ventricularis”. Apesar da ausência de estudos mais recentes, a incidência estimada da disfonia ventricular, na população geral, é de 4% (Jackson, C; Jackson, CL, 1935). O uso da vibração das PVTs para a fonação gera voz caracterizada, principalmente, por pitch baixo, com frequência aproximada de 60 Hz (Kendall; Leonard, 1997) e monótona (Maryn et al., 2003). Ainda, segundo Maryn et al. (2003), o diagnóstico da disfonia ventricular é obtido.

(24) Introdução. | 23. por meio de avaliação perceptual da voz, quando podem ser percebidas as características desse tipo de disfonia (rouquidão, soprosidade e diplofonia), e ao exame endoscópico da laringe (videolaringoscopia com estroboscopia); que mostra a constrição anormal das PVTs e a onda mucosa, produtora do som. Essa função, anormalmente aumentada da PVT, leva, com o tempo, à hipertrofia da mucosa da PVT (Kosoković; Lenarcic-Cepelja, 1973; Kendall; Leonard, 1997). O exposto acima mostra que na PV os componentes do tecido conjuntivo exercem papel importante na emissão do som, e que o mesmo se apresenta estratificado e especializado somente a partir da puberdade, ou seja, após anos de estímulo vibratório fonatório. Com isso, supõe-se que o tecido conjuntivo da PVT tenderia a se estratificar também se passasse por estímulo semelhante. Assim, no presente estudo, pretendeu-se analisar as mudanças estruturais que ocorrem nos constituintes dos tecidos da PVT, em particular no tecido conjuntivo subepitelial, quando esta passa a ser a fonte sonora. Este estudo pode levar à melhor compreensão da complexa fisiologia de produção sonora pela laringe e ao refinamento das técnicas para o tratamento das patologias laríngeas..

(25) 2. Objetivo.

(26) Objetivo. | 25. O objetivo deste estudo foi analisar as mudanças nos constituintes da LP da PVT, de acordo com:  O uso fonatório da PVT;  O tempo de uso da vibração da PVT (até seis anos e por mais de seis anos);  O posicionamento da PVT aos níveis ventricular e glótico..

(27) 3. Casuística e Métodos.

(28) Casuística e Métodos. | 27. Foram avaliados seis indivíduos que utilizavam a vibração mucosa de pelo menos uma prega ventricular como fonte sonora para a produção de voz. Eles foram selecionados no Ambulatório de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (HCFMRP-USP) e no Ambulatório de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital das Clínicas da Universidade Estadual de Londrina. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do HCFMRP-USP, nº 4637/2010 (Anexo A) e todos os pacientes que concordaram em participar da pesquisa foram previamente informados sobre os objetivos e condições de realização da mesma e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo B). A seleção dos pacientes foi realizada de duas formas: - pacientes com disfonia: os pacientes com queixas de disfonia como rouquidão, soprosidade e diplofonia foram submetidos a um rigoroso exame. endoscópico. da. laringe. (videolaringoscopia. com. estroboscopia) para constatar se a voz emitida era realmente pela vibração das PVTs (Figura 1). Esses pacientes também precisavam apresentar lesões que exigissem uma laringoscopia direta. - pacientes com rebaixamento da PVT: nos ambulatórios da especialidade,. foram. identificados. pacientes. submetidos. à. laringectomia parcial vertical (LPV), em que se realizou cordectomia por via cervical seguida de reconstrução glótica com o rebaixamento da PVT (Figura 2); e que necessitavam de uma laringoscopia direta, sob anestesia geral. Rigoroso exame endoscópico da laringe (videolaringoscopia com estroboscopia) constatava a participação da PVT na emissão da voz..

(29) Casuística e Métodos. a. | 28. b. Figura 1 - Imagens representativas de videolaringoscopia de paciente portador de disfonia ventricular espontânea, em que a voz é produzida pela vibração das pregas ventriculares (PVT) e não pela vibração das pregas vocais (PV). (a) Laringe em abdução, visualizando-se as PV e as PVT. (b) Laringe em adução (fonação), em que a constrição das PVT não permite a visualização das PV. a. b. Figura 2 - Imagens representativas de videolaringoscopia de paciente submetido à laringectomia parcial vertical esquerda e reconstrução da glote com o abaixamento da prega ventricular (PVT) esquerda. A voz é produzida pela vibração da prega vocal (PV) direita com a PVT esquerda. (a) Laringe em abdução. (b) Laringe em adução - note que no momento da foto, a adução da laringe ainda não é máxima, ou seja, sem coaptação da PV com a PVT.

(30) Casuística e Métodos. | 29. Foram identificadas, nesses indivíduos, suas características demográficas, idade, sexo, consumo de tabaco, motivo e tempo de uso da PVT na fonação, realização ou não de fonoterapia, motivo da realização da laringoscopia direta e, finalmente, identificação da PVT, de onde foi retirada a amostra. Durante. a. laringoscopia. direta,. foi. coletada. uma. amostra. de. aproximadamente 0,5 cm2 do bordo livre do terço médio da PVT, que o paciente utilizava como fonte de vibração para a produção da voz. Como controle, foram utilizadas amostras do terço médio de PVT normal, obtidas de três indivíduos. As laringes foram retiradas até 24 horas post-mortem de cadáveres do sexo masculino, sem história prévia de patologias laríngeas, não tabagistas e que não foram submetidos à intubação orotraqueal por mais de três dias antes do óbito. As amostras de tecido foram fixadas, imediatamente após a coleta, durante 24 horas em formol a 10%. A seguir, os tecidos foram lavados em água destilada e desidratados em séries crescentes de álcool etílico (50% - 100%), permanecendo de 3 a 4 horas em cada álcool. Após, as amostras foram mergulhadas em óleo de terpineol e diafanizadas em benzol (três banhos com duração de 3 horas cada) e, então, incluídas em parafina, com orientação espacial, para a obtenção de cortes coronais da PVT. Aproximadamente 40 cortes de 6 μm de espessura foram obtidos de cada amostra. Os cortes foram desparafinizados em xilol, hidratados em série decrescente de alcoóis até 50% e, finalmente, lavados com água corrente e água destilada. Alguns cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) para a análise morfológica. No mínimo 15 cortes de cada amostra foram corados com Picrosirius Red (0,1 g de Sirius Red em 100 ml de solução de ácido pícrico saturado), pH 2,0, por 20 minutos (Junqueira et al., 1979), para a identificação de fibras colágenas. Outros 15 cortes foram corados com Weigert resorcina-fucsina por 60 minutos para a identificação de fibras elásticas. Após as colorações, os cortes foram desidratados, diafanizados e montados em lamínula com Permount. Para a análise de imagens foram selecionados 18 cortes de cada paciente (total 108 cortes) e seis de cada controle (total 18 cortes). Cinquenta e quatro cortes de pacientes e nove de controle foram corados com Picrosirius Red, outros 54 cortes de pacientes e nove de controle foram corados com a solução de.

(31) Casuística e Métodos. | 30. Weigert. As imagens desses cortes foram observadas em microscópio Olympus BX50 (objetiva de 20x) equipado com câmera digital SPOT - RT3. Todas as imagens foram adquiridas com os mesmos ajustes do microscópio e da câmera, no mesmo período de tempo. As imagens foram obtidas da LPS (camada subepitelial). Em seguida, as imagens foram analisadas utilizando-se o software Image-Pro Plus 3D suite: 7.0, para a quantificação do colágeno e das fibras elásticas. Para a coloração de Weigert foi utilizado o campo claro convencional. Os cortes corados com Picrosirius Red foram observados à microscopia de polarização, que diferencia as fibras colágenas por meio da birrefringência. As fibras com birrefringência nas cores amarela, laranja e vermelha representam o colágeno do tipo I, enquanto o colágeno tipo III possui birrefringência de cor verde. A coloração de Weigert cora as fibras elásticas de marrom escuro. Para a quantificação de fibras colágenas e elásticas, três áreas com 100 μm 2 (9.782,2207 pixels) foram mensuradas na camada mais superficial do tecido conjuntivo de cada imagem adquirida, totalizando 300 μm 2 (29.346,6621 pixels) por imagem. A quantificação do colágeno total dessas áreas foi realizada considerando a intensidade de birrefringência total (tons de vermelho mais os tons de verde) do colágeno (Figura 3). Depois, somente a birrefringência de cor verde, indicativa da presença de colágeno tipo III, foi quantificada. A cor verde (e seus tons) foi selecionada, manualmente, para que a quantificação fosse feita pelo software. Para a quantificação do colágeno tipo I, subtraímos do colágeno total o colágeno tipo III. Esse processo era repetido para cada uma das imagens coradas com Picrosirius Red. Para as fibras elásticas, o mesmo processo foi empregado, sendo selecionadas áreas similares, que foram utilizadas para a análise do colágeno. As fibras elásticas coradas em marrom escuro pelo corante de Weigert foram quantificadas por meio do software (Figura 4)..

(32) Casuística e Métodos. | 31. Figura 3 - Imagem representativa do software Image-Pro Plus para a quantificação de colágeno total em uma área de 100μm2. Ao final desse processo, foram obtidas nove medidas de cada fibra em 300 μm2 para cada um dos seis pacientes e três medidas para cada um dos três controles. Em cada medida foram quantificados o colágeno total, o do tipo III e do tipo I (pela subtração do colágeno total pelo do tipo III) e as fibras elásticas. Foram obtidas as médias das medidas de cada tipo de fibra para cada paciente e cada controle. A análise estatística foi realizada sobre essas médias, utilizando o Teste T de Student para amostras não pareadas, mostrada em porcentagem das fibras colágenas e elásticas, sobre a área total..

(33) Casuística e Métodos. | 32. Figura 4 - Imagem representativa do software Image-Pro Plus para a quantificação de fibras elásticas em área de 100 μm2.

(34) 4. Resultados.

(35) Resultados. | 34. Segundo os critérios estabelecidos, foram selecionados dois indivíduos do Ambulatório de Disfonias e quatro pacientes submetidos à LPV com reconstrução glótica. A média de idade dos pacientes foi de 56,6 anos, com média de tempo de uso da PVT na fonação de 9,8 anos e a média de idade dos controles foi de 51 anos. No corte histológico da PVT de um indivíduo controle, corado com HE, observou-se o epitélio colunar ciliado, sua LP não estratificada em camadas e a presença de tecido glandular (Figura 5a). Na PVT de um paciente notou-se, logo abaixo do epitélio colunar, maior quantidade de tecido conjuntivo (Figura 5b). Na coloração com Picrosirius Red, em uma PVT controle, foi possível identificar a predominância de fibras colágenas tipo III coradas em verde (Figura 5c). Já na PVT de um paciente, verificou-se maior concentração de colágeno, principalmente o de tipo I, corado em vermelho, laranja e amarelo (Figura 5d). Nos cortes corados com a solução de Weigert, evidenciou-se pouca quantidade de fibras elásticas, coradas em marrom escuro, na camada subepitelial, tanto de um controle (Figura 5e) quanto na PVT de um paciente (Figura 5f)..

(36) Resultados. | 35. Figura 5 - Imagens representativas dos cortes histológicos. (a) HE 40X, PVT do controle. (b) HE 40X, PVT de paciente (seta marca o epitélio, *marca a lâmina própria, + marca o tecido glandular). (c) Microscopia de polarização, Picrosirius Red 200X, do mesmo controle mostrado em a, notou-se maior quantidade de fibras colágenas tipo III, coradas em verde. (d) Microscopia de polarização, Picrosirius Red 200X, do mesmo paciente apresentado em b, nota-se a grande quantidade de colágeno tipo I, corado de vermelho, amarelo ou laranja. (e) Coloração de Weigert, 200X, para o mesmo controle evidenciado em a. (f) Coloração de Weigert, 200X, para o mesmo paciente mostrado em b. PVT: prega ventricular.

(37) Resultados. | 36. 4.1 Características dos indivíduos estudados. A Tabela 1 resume as características de cada um dos seis pacientes incluídos no estudo, que utilizavam a vibração das PVT como fonte produtora de som.. Tabela 1 - Características dos pacientes incluídos no estudo Iniciais. Idade na coleta (anos). Sexo. Motivo da vibração da PVT. Tempo de uso da PVT na fonação (anos). Tabagismo. Fonoterapia. Motivo da laringoscopia direta. PVT da coleta. SSSG. 44. F. Disfonia ventricular. 17. Não. Não. Retirada de pólipo da PV direita. Direita. CMM. 42. M. Disfonia ventricular. 6. Não. Sim. Suspeita de Tb laríngea - não confirmada. Esquerda. MEOL. 48. F. LPV. 6. Parou há 8 anos. Sim. Recidiva na glote à direita.. Esquerda. MSM. 67. M. LPV. 6. Sim. Sim. Área suspeita no seio piriforme. CUT. 61. M. LPV. 11. Sim. Não. Área suspeita na base da língua. Esquerda. OL. 78. M. LPV. 13. Parou há 14 anos. Sim. Área suspeita na comissura anterior. Esquerda. Direita. LPV: laringectomia parcial vertical; PV: prega vocal; PVT: prega ventricular; Tb: tuberculose. Os dados demográficos dos indivíduos utilizados como controle estão sintetizados na Tabela 2.. Tabela 2 - Características dos indivíduos controles Iniciais. Idade (anos). Tempo Most-Mortem (horas). LAF. 43. 6h e 40min. Sepse. CLV. 60. 6h e 50min. Infarto Agudo do Miocárdio / Hipertensão Arterial Sistêmica. AEM. 50. 10h e 30min. Insuficiência Respiratória / Pneumonia. Causa Mortis.

(38) Resultados. | 37. Não houve diferença estatística na média das idades dos pacientes em comparação com os controles.. 4.2 Quantificação de fibras colágenas. A porcentagem de colágeno total foi significativamente superior nas PVT utilizadas na vibração para a produção sonora, com média de 23,4% ± 2,7% da área total, em comparação com os controles, média de 7,4% ± 1,5% da área total (p<0,001) (Figura 6).. Figura 6 - Representação gráfica da porcentagem de colágeno total em área de 300 μm2, dos grupos controle e de pacientes. Os dados representam a média e o desvio padrão (p<0,001).

(39) Resultados. | 38. A porcentagem de fibras colágenas tipo I também foi estatisticamente superior nos pacientes em relação aos controles (p<0,001), com média nos pacientes de 18,8% ± 6,1% e média de 1,4% ± 0,6% (p<0,01) nos controles (Figura 7).. Figura 7 - Representação gráfica da porcentagem de colágeno tipo I, em área total de 300 μm2, dos grupos controle e de pacientes. Os dados representam a média e o desvio padrão (p<0,01). Na porcentagem de colágeno tipo III não houve diferença estatística (p=0,61) entre os grupos, com média de 4,5% ± 4,7% nos pacientes e 6,0% ± 0,9% nos controles (Figura 8)..

(40) Resultados. | 39. Figura 8 - Representação gráfica da porcentagem de colágeno tipo III, em área total de 300 μm2, dos grupos controle e de pacientes. Os dados representam a média e o desvio padrão (p=0,61). 4.3 Quantificação de fibras elásticas. Não foi observada diferença estatística (p=0,28) na porcentagem das fibras elásticas entre os grupos. O grupo de pacientes obteve média de 10,1% ± 11,8% e o grupo controle de 1,8% ± 0,7% (Figura 9)..

(41) Resultados. | 40. Figura 9 - Representação gráfica da porcentagem de fibras elásticas, em área total de 300 μm2, dos grupos controle e de pacientes. Os dados representam a média e o desvio padrão (p=0,61). 4.4 Análise entre grupos específicos. 4.4.1 Quanto ao tempo de uso da PVT na fonação Distribuindo os pacientes estudados de acordo com o tempo de uso da PVT na fonação em dois grupos, obteve-se um com seis anos de uso e outro com mais de seis anos de uso; e média de 13,6 anos. Neste último grupo, foram observados pacientes com 11, 13, e 17 anos, em que a PVT era utilizada para a fonação. Cada grupo era composto por três indivíduos. Comparando a quantidade de fibras colágenas totais, do tipo I e do tipo III e fibras elásticas, não se constatou diferenças estatisticamente significativas (Tabela 3)..

(42) Resultados. | 41. Tabela 3 - Média ± DP das porcentagens de cada tipo de fibra, em %, da área total de 300 μm2, para pacientes que utilizavam a PVT como fonte sonora por seis anos ou por mais de seis anos. Valores em % da área de 300 μm2, ocupada por cada tipo de fibra na camada mais superficial da LP da PVT Tempo de uso da PVT na fonação 6 anos. Mais de 6 anos. p. Colágeno Total. 23,1 ±1,8. 22,6 ± 3,9. 0,865. Colágeno Tipo I. 18,9 ± 3,2. 18,0 ± 9,0. 0,879. Colágeno Tipo III. 4,2 ± 1,4. 4,6 ± 7,2. 0,922. Fibras elásticas. 3,2 ± 5,1. 16,5 ± 13,3. 0,183. PVT: prega ventricular; LP: lâmina própria; DP: desvio padrão. 4.4.2 Quanto ao posicionamento da PVT na laringe Agrupando os pacientes, conforme a posição da PVT na fonação, obtveram-se dois grupos: - com PVT posicionada no nível glótico. Foram quatro pacientes com a PVT posicionada ao nível glótico (pós LPV). - com PVT posicionada no nível vestibular. Foram dois pacientes com a PVT ao nível ventricular (disfonia ventricular espontânea). A análise das quantificações de cada tipo de fibras não mostrou significância entre os grupos (Tabela 4).. Tabela 4 - Média ± DP das porcentagens de cada tipo de fibra entre os grupos de pacientes com a PVT ao nível ventricular e glótico. Valores em % da área de 300 μm2, ocupada por cada tipo de fibra na camada mais superficial da LP da PVT Posição da PVT na fonação Nível ventricular (disfonia ventricular). Nível glótico (Pós LPV). p. Colágeno Total. 22,8 ± 1,6. 23,0 ± 3,4. 0,957. Colágeno Tipo I. 14,4 ± 8,1. 20,5 ± 4,8. 0,292. Colágeno Tipo III. 8,4 ± 6,5. 2,5 ± 2,5. 0,156. Fibras Elásticas. 7,5 ± 10,2. 11,0 ± 13,5. 0,768. PVT: prega ventricular; LPV: laringectomia parcial vertical; LP: lâmina própria; DP: desvio padrão.

(43) 5. Discussão.

(44) Discussão | 43. Muitos pacientes foram excluídos da amostra, pois não apresentavam motivo para se realizar o exame sob anestesia geral, anestesia esta necessária para a ressecção do fragmento da PVT para este estudo. Nos pacientes selecionados, todo cuidado foi aplicado para que não ocorresse lesão decorrente desse procedimento. Constatou-se que nenhum paciente teve sua qualidade vocal alterada após o procedimento, confirmando a ausência de lesão adicional. Não houve dificuldades na execução do processamento histológico e na quantificação das fibras, pois foram realizados em laboratório experimentado neste tipo de pesquisa. Quando um indivíduo deixa de utilizar as PVs para a fonação e começa a usar a PVT para esta função, gera uma condição em que uma estrutura não adaptada à vibração passa a receber este estímulo. Com essa mudança, esperava-se que houvesse também alteração no padrão tissular para adequar esta estrutura à nova função. Porém, no presente estudo, observou-se que as PVTs utilizadas como fonte vibratória na produção de som por seis anos ou mais apresentaram maior quantidade de colágeno total e do tipo I na LPS. A única descrição histológica sobre PVTs acometidas por disfonia ventricular é de Kosoković et al. (1977), que descreveram edema e infiltrado inflamatório das PVTs em fases iniciais da disfonia ventricular, e em fases mais avançadas, hipertrofia e metaplasia escamosa do epitélio, e na LP redução do componente glandular e permeação por um tecido conectivo denso. Essa classificação em fases iniciais e tardias é histológica, e os autores não fazem referência à existência de alguma correlação clínica, com severidade da disfonia ou com o tempo de uso da PVT na fonação. Embora esses resultados se assemelhem aos do presente estudo, o trabalho é apenas descritivo e não trata de comparação estatística com uma PVT normal. Desde então, a PVT utilizada como fonte vibratória produtora de sons não havia sido estudada histologicamente. Dos seis casos analisados, quatro foram submetidos à cirurgia oncológica para tratamento de carcinoma epidermoide inicial da região glótica. Para isso, realizou-se LPV, na qual a PV comprometida foi extirpada e procedeu-se ao rebaixamento da PVT, a fim de preencher o espaço e reconstruir a área glótica; permitindo, assim, melhora na função fonatória (Martins Mamede et al., 2005)..

(45) Discussão | 44. Deve-se salientar que somente a laringectomia por via cervical permite essa reconstrução funcional, pois por via endoscópica, mais frequentemente utilizada nos dias de hoje, não existem técnicas para rebaixar a PVT. Nestes quatro pacientes, este foi o mecanismo utilizado na vibração das PVTs para a produção sonora; e estas PVT estavam posicionadas ao nível glótico. Os outros dois pacientes foram diagnosticados com disfonia ventricular espontânea, ou seja, a PVT estava posicionada ao nível ventricular e ambas vibravam quando da emissão sonora. Durante a fonação, as PVs, sob controle neuromuscular, são aduzidas, assumindo posição fonatória na linha média (Simonyan; Horwitz, 2011). Esse componente mioelástico tem também influência na tensão, massa e elasticidade das PVs, controlando a modulação e manutenção da vibração. A partir daí, predomina a função aerodinâmica, em que o fluxo expiratório, por encontrar a glote fechada, sofre aumento na pressão subglótica até conseguir entreabrir as PVs e eliminar pequeno fluxo de ar, que irá diminuir a pressão subglótica e, novo fechamento das PVs ocorre. Esse fluxo de ar, ao passar pelas PV entreabertas, faz com elas vibrem no sentido horizontal, gerando um som. Esse mesmo fluxo gera outro som devido à vibração da borda livre da PV no sentido vertical (de baixo para cima), decorrente do princípio de Bernoulli (atração da borda livre da PV para a linha mediana devido à passagem do fluxo de ar). Pelo menos mais outro som aparece, agora no plano anteroposterior. A resultante da somatória desses sons gera o produto final que é a voz harmônica (Khosla et al., 2008). Portanto, o som agradável da voz humana somente é possível numa estrutura especializada como a da PV, que possui uma LP própria, escalonada, que se mostra rígida no plano profundo e flexível no plano superficial; permitindo, assim, a vibração em vários planos. Por outro lado, a PVT apresenta uma estrutura diferente da PV, pois exerce a função de esfíncter para impedir a entrada de objetos estranhos na via aérea e também a saída de ar durante manobras do tipo Valsalva. Deve-se salientar que, segundo Lucas et al. (2015), uma PVT normal tem, na sua LP, quantidades de fibras colágenas muito semelhantes a uma PV, porém a sua LP não é estruturada em camadas como a PV. A LP da PV tem, na sua camada mais superficial, escassez de fibras colágenas (Hahn et al., 2006;.

(46) Discussão | 45. Noordzij; Ossof, 2006), estando a maioria dessas fibras concentradas na camada mais profunda da LP (Gray et al., 1993). Quando o indivíduo deixa de utilizar a PV e passa a usar a PVT na função de emitir som, gera estímulos que podem alterar as estruturas não adaptadas à vibração. Com a mudança da função, a PVT deve ficar sob a influência das variações de pressão, como as descritas acima, a fim de propiciar essa vibração e, por conseguinte, a emissão sonora. Porém, mesmo depois de 17 anos, a PVT não sofreu alteração na sua estrutura no sentido de se igualar à PV, pois os resultados do presente estudo mostraram que esses indivíduos apresentam na camada mais superficial da LP da PVT, maior quantidade de colágeno total e do tipo I em relação aos controles, sem diferenças nas quantificações de colágeno tipo III e fibras elásticas. Era esperado, caso a diferenciação fosse no sentido de melhora da qualidade do som, que a vibração para a produção sonora produzisse um estímulo de diferenciação da estrutura na direção de uma PV normal madura, ou seja, uma diminuição na quantidade de colágeno total na camada superficial da LP da PVT estudada. Sabe-se que cada região da laringe está sujeita a regimes de pressões diferentes durante a fonação normal (van den Berg et al., 1957; Scherer et al., 1983). A maior pressão fica ao nível subglótico, e essa diferença de pressão é fundamental para a fonação fisiológica harmônica (Jiang; Titze, 1994; Rosa et al., 2003). Mais recentemente, num estudo em laringes caninas excisadas, Alipour e Scherer (2012) mostraram que a pressão no ventrículo da laringe pode variar conforme as PVTs assumem determinada posição durante a fonação. Essa pressão ventricular é maior quanto mais próximas estão as PVTs, e tem seu pico quando elas começam a vibrar e produzir som, mas nunca essa pressão supera 65% da pressão infraglótica à que as PVs estão submetidas durante a fonação. Não se tem conhecimento, até o momento, qual é a influência desse regime de pressões durante a fonação na diferenciação das PVs e das PVTs, mas é possível supor que PVTs submetidas a um período longo de pressão mais elevada, podem ter sua LP modificada. No presente estudo, as diferenças de pressões aos níveis glótico e ventricular não parecem exercer influências na LP das PVTs no período de até 17 anos (período máximo avaliado neste estudo), pois não foram encontradas diferenças entre as PVTs que mantiveram ao nível.

(47) Discussão | 46. glótico (pacientes submetidos à reconstrução da glote com o rebaixamento da PVT pós-cirurgia) e as que permaneceram ao nível ventricular (pacientes com disfonia ventricular). Também foi possível observar que o trauma cirúrgico e o processo de reparo cicatricial pós-operatório não foram relevantes para a constituição da camada superficial da LP da PVT. De fato, o estímulo vibratório parece ser importante na composição da matriz extracelular da LP da PV e Sato et al. (2011) relataram que uma prega vocal adulta sem estímulo fonatório por mais de uma década mostrava-se atrófica, incluindo a mácula flava. A PV não apresentava o ligamento vocal, nem o espaço de Reinke; e a LP evidenciava estrutura uniforme. Sato et al. (2012b) detectaram que as PVs de crianças, que nunca foram submetidas à fonação, eram hipoplásicas e rudimentares, e em sua LP encontraram poucas fibras colágenas e elásticas e estas não estavam estruturadas em camadas. Isso mostra a importância do estresse fonatório sobre a PV na formação dos constituintes da sua matriz extracelular. O tempo de uso da PV na fonação também é fator importante na quantidade, distribuição e estratificação dos constituintes da LP (Hartnick et al., 2005; Sato et al., 2011, 2012a). No presente estudo, o tempo prolongado de uso da PVT como fonte vibratória produtora de som não se mostrou suficiente para alterar os componentes da camada superficial da LP, pois os grupos com seis anos de uso e mais de seis anos não se apresentaram diferentes quanto aos constituintes da LP da PVT. O efeito que o estímulo vibratório produziu na LP das PVTs foi o aumento do colágeno total e do tipo I, mas esse efeito não ocorre nas PVs, uma vez que o colágeno tipo I está associado a tecidos mais resistentes a forças de estiramento como ossos, tendões, ligamentos, cápsulas de articulações (Culav et at., 1999), sendo considerada uma fibra mais forte e de maior diâmetro quando comparada a outros tipos de fibras colágenas. O aumento na quantidade dessas fibras, observado neste estudo, pode dificultar as propriedades vibratórias da PVT na produção sonora. O colágeno tipo I também é o principal componente presente na fase tardia do tecido cicatricial (Clark, 1985), sugerindo que o mecanismo de aumento do colágeno tipo I na camada mais superficial da LP da PVT observado neste.

(48) Discussão | 47. estudo possa ser um mecanismo de reparo tissular cicatricial pelo trauma repetido causado pela vibração das PVT por tempo prolongado. Uma justificativa para as diversidades de respostas encontradas à fonação entre a PV e a PVT é a diferença de tamanho do epitélio escamoso estratificado de revestimento, presente na borda livre das duas pregas, muito menor nas PVTs. Kojima et al. (2014a) evidenciaram que a profundidade da lesão no epitélio estratificado da PV depende da duração e intensidade do fonotrauma, e que a barreira epitelial das PVs, em coelhos, se manteve intacta após o fonotrauma de intensidade moderada. É possível que esse fato ocorra, pois, segundo Gray (2000), o epitélio que recobre as PV tem entre suas células micro projeções que podem, entre outras funções, ser uma adaptação para suportar o trauma repetido, causado pela fonação. A escassez de epitélio escamoso estratificado de revestimento ou a ausência de micro projeções nas suas células, explicaria o tipo de resposta demonstrada pela PVT. Ainda com respeito à proteção que o epitélio oferece à LP da PV, o estudo de Kojima et al. (2014b) não identificou aumento na expressão de genes de citocinas inflamatórias, responsáveis pela formação de cicatriz fibrótica, como a interleucina 1β (IL-1β), ciclooxigenase-2 (COX-2) e o transforming growth factor β-1 (TGF-β1), após o trauma vibratório da fonação na PV. Chang et al. (2014) mostraram que a expressão do TGFβ-1 ocorre, principalmente, nos fibroblastos da LP da PV e não nas células do epitélio escamoso, sugerindo que somente após a lesão do epitélio das PVs é que acontece a produção dessas citocinas pelos fibroblastos de sua LP e a formação de cicatriz fibrótica, pois essas citocinas, principalmente o TGFβ-1, são bem identificadas nos processos inflamatórios que resultam nesse tipo de resposta (Shah et al., 1995; Ferguson et al., 2009; Occleston et al., 2011). No presente estudo, foi observado aumento de colágeno tipo I; colágeno este, geralmente ligado ao processo de reparo e cicatrização do tipo fibrótica. Apesar de não se conhecer o seu efeito sobre o epitélio das PVTs, é possível supor que o fonotrauma repetido sobre o epitélio de revestimento das PVTs é suficiente para estimular os fibroblastos da LP, ativando os genes responsáveis pela resposta inflamatória e cicatricial do tipo fibrótica, levando, assim, ao acúmulo de colágeno na camada subepitelial da PVT..

(49) Discussão | 48. Outra possibilidade a ser considerada é o tipo de resposta dos fibroblastos das PVs e das PVTs ao estímulo mecânico vibratório. Sabe-se que os fibroblastos respondem, de forma direta, aos estresses mecânicos, aumentando os níveis de expressão das glicoproteínas extracelulares (Wang, 2006); e é provável que fibroblastos de diferentes partes do corpo respondam diferentemente ao mesmo estímulo (Chang et al., 2002). Durante a fonação, a PV está sujeita a vibrações regulares, normalmente em frequências maiores de 120 Hz, o que não ocorre com nenhum outro tecido do corpo humano. Gaston et al. (2012), num estudo in vitro de cultura de fibroblastos de PVs humanas, submetidos a condições de vibração comparáveis às das PVs fisiológicas, observaram marcadores de proliferação celular aumentados em relação aos fibroblastos mantidos em repouso. O mesmo resultado (aumento dos marcadores de proliferação celular) foi obtido quando a cultura de fibroblastos de PV foi comparada à cultura de células tronco mesenquimais de medula óssea submetida ao mesmo estímulo vibratório. No entanto, o estímulo vibratório na cultura de fibroblastos de PV humana não aumentou a expressão gênica do colágeno tipo I desses fibroblastos. Este fato pode mostrar que a vibração fonatória fisiológica não leva ao acúmulo de colágeno tipo I e à formação de uma PV mais rígida. Além disso, culturas de fibroblastos de traqueia, submetidos a estímulos vibratórios semelhantes aos da fonação apresentaram expressão e produção de colágeno tipo I aumentadas (Titze et al., 2004; Wolchok et al., 2009). Assim, é possível supor que, diferentemente de fibroblastos das PVs, os fibroblastos da supraglote submetidos a estímulo vibratório fonatório respondem de forma a gerar uma cicatriz fibrótica com aumento do colágeno tipo I, como ocorreu na análise deste estudo na camada superficial da LP. As fibras elásticas são um importante componente da matriz extracelular da LP da PV, exercendo papel fundamental na produção sonora (Moore; Thibeault, 2012), a tal ponto que pacientes portadores de síndromes relacionadas a mutações do gene da elastina apresentam instabilidade do picth vocal e rouquidão perceptível quando comparados a indivíduos controles (Watts et al., 2008). A maior quantidade de fibras elásticas na LP das PVs está concentrada na camada intermediária LP (Hammond et al., 1997; Gray et al., 2000), e esta.

(50) Discussão | 49. estratificação só ocorre após os 11 ou 12 anos de idade (Hartnick et al., 2005). Sato et al. (2011) referiram que a quantidade de fibras elásticas na LP da PV é menor em uma laringe que não recebeu o estímulo fonatório por mais de 10 anos. Em laringes de crianças de 7 e 12 anos, que nunca falaram, a quantidade de fibras elásticas na LP das PVs é marcadamente menor em comparação às laringes normais (Sato et al., 2012b). Esses estudos mostram que a quantidade e localização das fibras elásticas na LP de PV também são influenciadas pelo estímulo vibratório. Contrariamente, Titze et al. (2004) não detectaram diferenças de níveis mRNA de elastina em fibroblastos de laringes expostos a estímulo vibratório de 100 Hz em comparação aos controles. Já Kutty e Webb (2010), em cultura de fibroblastos da derme, expostos a estímulo vibratório de 100 Hz, não observaram diferenças na expressão de mRNA de elastina em relação aos controles estáticos. Neste estudo, embora com médias muito diferentes, a porcentagem de fibras elásticas na camada superficial da LP das PVT não se mostrou significativamente diferente dos controles. Essa falta de significância pode ser explicada pela amostra relativamente pequena, ou pelo fato de as fibras elásticas serem muito estáveis durante a vida adulta do indivíduo, pois a elastogênese começa no período embrionário, tem seu pico no período neonatal e é muito pouco ativa na fase adulta (Swee et al., 1995); e talvez apenas o estímulo mecânico vibratório sobre as PVTs de adultos possa não ser suficiente para alterar a quantidade de fibras elásticas na sua LP. O fato de as PV possuírem mácula flava e suas respectivas stellate cells, o que ainda não foi evidenciado nas PVTs, pode explicar a diferença na resposta ao estímulo vibratório entre os dois tipos de pregas da laringe. Fuja et al. (2005), em estudo com culturas de stellate cells de PV e de fibroblastos de traqueia, observaram diferenças na resposta a diferentes estímulos inflamatórios e bioquímicos entre os dois tipos celulares. As stellate cells são consideradas essenciais no crescimento, desenvolvimento e processo de envelhecimento das PVs, e atuam também na composição e viscoelasticidade da LP das PVs (Sato et al., 2010a,b; Kurita et al., 2015). Alguns autores referem que essas células exercem papel regulatório sobre a matriz extracelular, controlando a síntese fibroelástica (Fayoux et al., 2004), enquanto outros sugerem participação ativa,.

(51) Discussão | 50. sintetizando os componentes da matriz extracelular da PV (Sato et al., 2012c). Uma explicação para o fato de as máculas flava das PVs se posicionarem nas duas extremidades das mesmas (junto à comissura anterior e ao processo vocal), locais de maior concentração do estresse mecânico vibratório durante a fonação, é que o estresse físico é importante no estímulo da produção da matriz extracelular pela stellate cells (Sato et al., 2009). Talvez, a falta dessas estruturas, vitais na produção e diferenciação da LP da PV, possa explicar a resposta diferente ao trauma fonatório nas PVT. A análise da LP de PVs não é uma tarefa simples e padronizada. Infusino et al. (2013), avaliando a habilidade de patologistas experientes em estratificarem as camadas da LP de PV de adultos humanos, fetos humanos e porcos, encontraram acurácia de 50 a 75%, evidenciando as dificuldades em estudos histopatológicos para se determinarem as camadas da LP de PVs. No presente estudo, analisou-se apenas a camada superficial da LP das PVTs, que é muito menos conhecida que a LP das PVs, em uma amostra relativamente pequena, embora se acredite que o tamanho da amostra não deva influenciar nos resultados, pois mesmo depois de 17 anos, nenhuma diferença foi notada. Porém, o resultado inicial obtido foi bastante interessante..

(52) 6. Conclusão.

(53) Conclusão. | 52. Os dados obtidos com este estudo permitem concluir que:  Sujeitos que utilizam a PVT como fonte vibratória para a produção de som apresentam, na LPS, aumento na porcentagem de colágeno total e do tipo I, sem alterar a porcentagem de colágeno tipo III e de fibras elásticas.  O tempo de utilização das PVT como fonte produtora de som (até seis e por mais de seis anos) manteve a porcentagem de colágeno total e do tipo I.  O posicionamento das PVT ao nível ventricular ou glótico (após reposicionamento cirúrgico) na vibração para produção sonora manteve a porcentagem de colágeno total e do tipo I..

(54) 7. Referências Bibliográficas.