UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS GENÉTICOS
VEGETAIS
VERÔNICA DA SILVA SANTOS
OTIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DE MANGANÊS PEROXIDASE
PELO BASIDIOMICETO Lentinus crinitus E APLICAÇÃO DO
EXTRATO BRUTO FÚNGICO NA DESLIGNIFICAÇÃO DE
RESÍDUOS VEGETAIS
FEIRA DE SANTANA-BAHIA
VERÔNICA DA SILVA SANTOS
OTIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DE MANGANÊS
PEROXIDASE PELO BASIDIOMICETO Lentinus crinitus E
APLICAÇÃO DO EXTRATO BRUTO FÚNGICO NA
DESLIGNIFICAÇÃO DE RESÍDUOS VEGETAIS
FEIRA DE SANTANA-BAHIA
VERÔNICA DA SILVA SANTOS
OTIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DE MANGANÊS
PEROXIDASE PELO BASIDIOMICETO Lentinus crinitus E
APLICAÇÃO DO EXTRATO BRUTO FÚNGICO NA
DESLIGNIFICAÇÃO DE RESÍDUOS VEGETAIS
FEIRA DE SANTANA-BAHIA
2012
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, da Universidade Estadual de Feira de Santana, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Recursos Genéticos Vegetais.
Orientadora: Profª. Drª. Maria Gabriela Bello Koblitz
Ficha Catalográfica – Biblioteca Central Julieta Carteado - UEFS
Santos, Verônica da Silva
S239o Otimização da produção de Manganês Peroxidase pelo basidiomiceto Lentinus Crinitus e a aplicação do extrato bruto fúngico na deslignificação de resíduos vegetais / Verônica da Silva Santos. – Feira de Santana - BA, 2012.
72 f. : il.
Orientador: Maria Gabriela Bello Koblitz
Dissertação (Mestrado em Recursos Genéticos Vegetais)– Universidade Estadual de Feira de Santana, Departamento de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, 2012.
1. Resíduos agroindustriais. 2. Biomassa ligninocelulósica. 3. Enzimas ligninilíticas. 4. Deslignificação. 5. Lentinus crinitus. I. Koblitz, Maria Gabriela Bello. II. Universidade Estadual de Feira de Santana. III. Departamento de Ciências Biológicas. IV. Título.
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________
Prof. Dr. Hélio Mitoshi Kamida
__________________________________________
Profª. Drª. Andrea Miura Costa
__________________________________________
Profª. Drª. Maria Gabriela Bello Koblitz.
Orientadora e Presidente da Banca
Feira de Santana – BA
Dedico este trabalho aos meus PAIS, Ângela e Souza, pelo apoio, incentivo e amor incondicional.
AGRADECIMENTOS
A Deus e aos soldados de luz por me darem força, paciência e coragem para sempre seguir em frente.
Aos meus pais pelos ensinamentos, por sempre acreditarem em mim e por todo o amor.
As minhas irmãs Rosângela e Larissa por toda a compreensão e carinho.
Aos meus familiares pelo apoio incondicional.
A minha orientadora Gabriela, pela confiança e oportunidade de realizar este trabalho, pelo imenso aprendizado, pela paciência e por se fazer tão presente
mesmo quando estava distante.
A minha querida e amiga Prof. Marília Lordelo, por toda a sua paciência, ensinamentos, palavras de conforto e companheirismo. Lila, você foi uma peça
fundamental para eu chegar até aqui, muito obrigada.
Aos meus amigos, Aline, Andson, Antônio e Bárbara por toda a paciência e boa vontade para me ajudar, vocês deixaram o andamento do trabalho mais leve.
A meu companheiro Mel, por toda a paciência, dedicação, compreensão e amor.
A Prof Dr. Sandra por todo o apoio, toda a atenção dispensada e por toda a contribuição.
Aos professores do Departamento de Tecnologia pelo apoio no desenvolvimento do projeto e por auxiliarem a minha formação.
A bolsista Leonaiara pela colaboração e pela disponibilidade sempre em me ajudar.
Aos amigos que fiz no laboratório, em especial Patrícia e Cintia por todo o carinho e atenção compartilhada durante os trabalhos
A Capes pela concessão da bolsa.
RESUMO
A necessidade de aproveitar resíduos agroindustriais gerando menor impacto ambiental faz com que os mesmos tornem-se fontes importantes para a produção de novos materiais biotecnológicos, o bagaço da cana de açúcar e a casca de coco são exemplos desses materiais. Os fungos basidiomicetos ligninocelulolíticos crescem sobre madeira e outros resíduos de origem vegetal, produzindo um sistema enzimático capaz de degradar celulose, hemicelulose e lignina, o que tem propiciado diversas pesquisas visando às potenciais aplicações destes fungos em resíduos vegetais. O objetivo deste trabalho foi otimizar as condições para a produção de manganês peroxidase de Lentinus crinitus utilizando resíduos agroindustriais como substrato para aumentar a produção da enzima de interesse e a aplicação da enzima secretada na deslignificação de resíduos vegetais. Na otimização das condições de cultivo e produção de enzimas utilizou-se planejamento experimental multivariável gerada pelo software Statistica (7.0), o L. crinitus, no meio suplementado com cana (50%) e coco (50%), pH 7,0, temperatura 25°C, umidade 80%, 5 dias de cultivo, apresentou a maior atividade desta enzima (77 U.L -1), a enzima extraída apresentou pH ótimo 13 e a temperatura ótima 20°C. Assim, podemos concluir que o L. crinitus possui potencial para a produção da enzima ligninolítica manganês peroxidase.
PALAVRAS-CHAVE: Lentinus crinitus. Resíduos agroindustriais. Biomassa ligninocelulósica. Enzimas ligninolíticas. Deslignificação.
ABSTRACT
The need of utilize agro-industrial residues causing a less environmental impact makes them to become an important sources for the production of new biotechnological materials, the sugar cane bagasse and the coconut shell are examples of these materials. The Ligninocelulolíticos Basidiomycete fungi grow on the wood and other plant wastes, producing an enzyme system able to degrade cellulose, hemicellulose and lignin, which has provided intense research aiming at potential applications of these fungi on plant residues. This study objective was to optimize the conditions for the production of manganese peroxidase crinitus using agroindustrial residues as a substrate to increase the enzymes productions interested and the application of enzyme secreted in the delignification of plant residues. In the optimization of culture conditions and enzyme production was used multivariable experimental design obtained by the software Statistica (7.0), the L. crinitus in a medium supplemented with sugar cane (50%) and coconut (50%), pH 7.0, temperature 25 ° C, humidity 80%, 5 days of culture, showed the highest activity of this enzyme (77 UL -1), the extracted enzyme showed the best pH 13 and the best temperature 20 ° C. Therefore, is possible to conclude that L. crinitus has the potential for the production of the ligninolytic enzyme manganes peroxidase.
KEYWORDS: Lentinus crinitus. Agroindustrial residues. Lignocellulosic biomass. Ligninolytic enzymes. Delignification.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 15
2 REVISÃO DE LITERATURA... 187
2.1MATERIAIS LIGNINOCELULÓSICOS... 187
2.1.1 Bagaço de cana de açúcar...19
2.1.2 Resíduo da casca de coco...20
2.2COMPOSIÇÃO DA BIOMASSA LIGNINOCELULÓSICA. ... 22
2.2.1 Celulose. ... 23
2.2.2 Hemicelulose. ... 24
2.2.3 Lignina. ... 25
2.2.4 Constituintes menores... 27
2.3FUNGOS DEGRADADORES DE LIGNINA. ... 277
2.3.1 Basidioma do gênero Lentinus. ... 288
2.4ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS. ... 299
2.4.1 Lignina Peroxidase (LiP). ... 30
2.4.2 Manganês Peroxidase (MnP). ... 30
2.4.3 Lacase (Lac). ... 31
2.5 CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO...32
3 MATERIAL E MÉTODOS ... 34
3.1CULTIVO E CRESCIMENTO DO FUNGO. ... 34
3.2OBTENÇÃO DOS SUBSTRATOS. ... 344
3.3PLANEJAMENTO MULTIVARIÁVEL PARA OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE CULTIVO PARA A SECREÇÃO DA ENZIMA MNP. ... 355
3.3.1 Condições de cultivo para a produção da enzima. ... 377
3.3.2 Obtenção do extrato enzimático. ... 388
3.4DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA. ... 388
3.5DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ESPECÍFICA. ... 40
3.6ESTUDO DO TEMPO DE CULTIVO. ... 40
3.7DETERMINAÇÃO DO PH E TEMPERATURA ÓTIMOS DA MNP DE L. CRINITUS. ... 41
3.8DESLIGNIFICAÇÃO. ... 42
3.8.1 Reação enzimática. ... 42
3.8.2 Determinação do teor de lignina. ... 43
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 44
4.1OTIMIZAÇÃO DO MEIO DE CULTIVO PARA A PRODUÇÃO DE ENZIMAS. ... 444
4.2 ESTUDO DO TEMPO DE CULTIVO. ... 50
4.3DETERMINAÇÃO DO PH E TEMPERATURA ÓTIMA. ... 52
4.4REMOÇÃO DO TEOR DE LIGNINA. ... 577
5 CONCLUSÃO ... 59
6 REFERÊNCIAS ... 60
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura de uma fibra vegetal. ... 23 Figura 2. Estrutura da celulose, formada por unidades consecutivas de celobiose . ... 24 Figura 3. Representação esquemática de uma xilana de gramínea. (1) 1,4-Dxilopiranose; (2) L-arabinose; (3) ácido 4-O-D-metil-_-D-glicurônico; (4) grupoacetil ... 25 Figura 4. Lignina de madeira dura ... 26 Figura 5: Lentinus crinitus CCB274 cultivado e frutificado em bagaço de cana-de-açúcar, laboratório de Micologia, Instituto de Botânica ... 29 Figura 6. Cultivo de L.crinitus para secreção de MnP após15 dias de incubação. ... 37 Figura 7. Extratos enzimáticos centrifugados. ... 38 Figura 8. (a) Meio reacional e (b) Meio reacional após paralisação da reação por adição de NaOH. ... 39 Figura 9. (a) Gráficos tridimensional e bidimensional (b) para as variáveis Temperatura e pH sobre a atividade de MnP. ... 47 Figura 10 (a). Efeito tridimensional das variáveis Substrato e pH sobre a atividade de MnP. ... 48 Figura 10 (b). Efeito bidimensional das variáveis Substrato e pH sobre a atividade de MnP. 48 Figura 11 (a). Efeito tridimensional das variáveis Substrato e temperatura sobre a atividade de MnP. ... 49 Figura 11 (b). Efeito tridimensional das variáveis Substrato e Temperatura sobre a atividade de MnP. ... 49 Figura 12. Diagrama de Pareto para pH e Temperatura ótimo. ... 53 Figura 13. Análise tridimensional da atividade de MnP em relação ao pH e Temperatura ótimo. ... 53 Figura 14. Análise bidimensional da atividade de MnP em relação ao pH e Temperatura ótimo. ... 54 Figura 15. Diagrama de Pareto com novas faixas de pH e Temperatura. ... 55 Figura 16. Análise bidimensional da atividade de MnP em relação ao pH e Temperatura ótimo utilizando faixas mais estreitas. ... 56
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Resumo dos dados de produção total e geração de resíduos, ano base 2009. ... 19
Tabela 2. Comparação das características da fermentação no estado sólido (FES) e da fermentação submersa(FS)... ...30
Tabela 3: Variáveis independentes dos parâmetros de otimização. ... 35
Tabela 4: Ensaios para o cultivo para a produção da enzima. ... 36
Tabela 5: Variáveis independentes e seus níveis para otimização do pH e Temperatura ótimos de manganês peroxidase. ... 41
Tabela 6: Ensaios para otimização da atividade de manganês peroxidase. ... 42
Tabela 7: Condições experimentais do planejamento para a produção de MnP e a variável de resposta. ... 44
Tabela 8: Análise de variância (ANOVA) para a atividade de MnP. ... 46
Tabela 9: Resultado da atividade de pH e Temperatura. ... 52
Tabela 10: Tabela ANOVA ... 52
Tabela 11: Planejamento com novas faixas de pH e Temperatura. ... 55
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLA
Abs – Absorbância
ANOVA – Análise de variância
CCMB – Coleção de Cultura de Micro-organismos da Bahia
EMBRAPA – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
FAO – Food and Agriculture Organization
FS – Cultura submersa
FES – Cultivo sobre substrato sólido
H2O2 - Peróxido de Hidrogênio Lac – Lacase
LAPEM – Laboratório de Pesquisa em Microbiologia
LiP – Lignina peroxidase
MnP – Manganês peroxidase
t- Tonelada
t/ano – tonelada/ano
U – Unidades de atividade enzimática
1 INTRODUÇÃO
Nas últimas décadas tem havido uma crescente busca da utilização de resíduos agroindustriais, devido à incessante demanda das atividades agrícolas. O acúmulo destes resíduos gera a deterioração do meio ambiente e perda de recursos, com contribuição significante para o problema da reciclagem e conservação da biomassa. Assim seu uso como substrato em bioprocessos, além de ser economicamente viável, ajuda a resolver os problemas ambientais decorrentes de seu acúmulo na natureza (MENEZES, 2009).
A região Nordeste é abundante em resíduos vegetais como bagaço de cana-de-açúcar, casca de coco, fibra de sisal, dentre outros. Esses resíduos ligninocelulósicos são uma importante alternativa para geração de energia, ração animal e como fonte de carboidratos para processos biotecnológicos de bioconversão (NORONHA et al., 2010). A ligninocelulose é uma estrutura composta de lignina, celulose e hemicelulose, os polímeros de carboidratos são fortemente ligados à lignina principalmente por ligações de hidrogênio, mas também por algumas ligações covalentes (TENGERDY e SZAKACS, 2003; LEE, 2007).
A biodegradação de lignina pode ser realizada, principalmente por fungos basidiomicetos de degradação branca, que secretam três enzimas essenciais para que o processo ocorra: lignina peroxidase, manganês peroxidase e lacase. Essas enzimas são de natureza oxidativa e agem sobre as unidades fenólicas e/ou não-fenólicas da lignina (CARDOSO, 2009). A produção de enzimas por processos fermentativos é um amplo campo da biotecnologia e nas últimas décadas observou-se a utilização de fermentação em meio sólido para a produção dessas enzimas. Esse processo imita o meio natural do fungo e em geral possibilita a obtenção de elevada atividade das enzimas ligninolíticas (OLIVEIRA, 2010). Assim, como alternativa para reduzir os custos da produção de bioprodutos, pode-se substituir os substratos convencionais por resíduos ligninocelulósicos e o tratamento com fungos basidiomicetos ou suas enzimas ligninolíticas, permite que a lignina seja removida.
Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi otimizar as condições de cultivo do basidiomiceto (Lentinus crinitus), coletado no estado da Bahia, utilizando resíduos agroindustriais sob fermentação em estado sólido para obter a secreção otimizada de manganês peroxidase, bem como testar sua aplicação na deslignificação de resíduos vegetais.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Materiais ligninocelulósicos.
Materiais ligninocelulósicos, sob forma de resíduos agrícolas e florestais, são acumulados anualmente no mundo em grandes quantidades, como mostra a Tabela 1. Devido à sua natureza renovável e a seu baixo custo, estes materiais têm sido amplamente utilizados como matéria-prima para geração de energia, ração animal e como fonte de carboidratos para processos de bioconversão. Quando hidrolisados, estes materiais ligninocelulósicos liberam açúcares (D-glicose, D-galactose, D-manose, D-xilose e L-arabinose) e diversos compostos derivados dos açúcares e da lignina (furfural, hidroximetilfurfural, ácido acético, ácido siríngico, p-hidroxibenzóico, vanilina, entre outros) (NORONHA et al., 2010). A América Latina produz mais de 500 milhões de toneladas de subprodutos de resíduos agroindustriais e sua utilização minimiza progressivamente o impacto ambiental por eles provocado. Uma alternativa para a utilização desses resíduos é a sua aplicação em processos fermentativos, uma vez que eles podem ser utilizados como substratos sólidos para o crescimento de microrganismos (a fonte de matéria orgânica que os constitui é utilizada como fonte de energia e carbono), síntese da biomassa celular e outros produtos de metabolismo microbiano. (MENEZES et al., 2006)
Tabela 1: Resumo dos dados de produção total e geração de resíduos, ano base 2009.
PRODUTO PRODUÇÃO TOTAL (t) RESÍDUOS (t/ano)
Soja 57.345.382 41.862.129 Milho 50.745.996 29.432.678 Cana-de-açúcar (bagaço, torta e vinhaça) 671.394.957 201.418.487 Feijão 3.486.763 1.847.984 Arroz 12.651.774 2.530.355 Trigo 5.055.525 3.033.315 Mandioca 23.786.281 - Café 2.440.057 1.220.029 Cacau 218.487 83.025 Banana 199.282 99.640 Laranja 16.944.529 8.825.276 Coco da baía 675.012 405.009 Castanha de caju 110.253 80.484 Uva 614.574 - Subtotal 845.668.872 290.838.411
2.1.1 Bagaço de cana-de-açúcar.
O Brasil possui uma grande vocação para a agricultura sucroalcooleira que, aliada às suas dimensões continentais, faz dele o maior produtor de açúcar do mundo (NORONHA et al., 2010). A produção nacional de cana-de-açúcar moída pela indústria sucroalcooleira em 2010 chegou a 624,99 milhões de toneladas. O número é recorde e representa aumento de 3,4% na produção total na comparação com o ciclo 2009/2010 (CONAB, 2011). Em média, 60% da cana colhida é destinada à produção de álcool (para todos os fins) e o restante para a produção de açúcar (NEVES e CONEJERO, 2007). Em relação ao comportamento do consumo mundial, entre 2002 e 2006, o crescimento foi de 1,28% ao ano, em média. Em 2006/2007, o consumo atingiu 146 milhões de toneladas, estima-se que em 2014, o consumo mundial de açúcar deve chegar à casa dos 180 milhões de toneladas (NEVES e CONEJERO, 2007). O Brasil é o único país que domina todos os estágios da tecnologia de produção da cana-de-açúcar e apresenta uma cadeia de produção bem organizada (VIDAL; SANTOS; SANTOS, 2006). Mesmo gerando riquezas e desenvolvimento para o país, tais números trazem como consequência um grande problema, que é a geração aproximada de 128 milhões de toneladas de bagaço ao ano.
O bagaço da cana é o material orgânico fibroso do colmo da cana de açúcar, que sobra depois do processo de moagem, após a extração do caldo para produzir açúcar e álcool (RUEDA, 2010). Cada tonelada de cana produz aproximadamente 250 quilos de bagaço e 204 quilos de palha/ponta (NASCIMENTO, 2007). Em sua maior parte, estes subprodutos são aproveitados pela própria indústria, entretanto, ainda há um excedente que preocupa os ambientalistas (NORONHA et al., 2010).
A grande parcela não utilizada do bagaço de cana-de-açúcar apresenta potencial de aproveitamento devido à sua composição que consiste sobretudo em água (46-52%), fibras (25 a 43%) e pequenas quantidades (2 a 6%) de sólidos solúveis (sacarose) e não solúveis (cera). Esta composição é variável em função da variedade da cana empregada, de seu grau de maturidade, do método de colheita utilizado e da eficiência do processo industrial (RUEDA, 2010). A fração
de fibras desse resíduo é composta por celulose, hemicelulose e lignina. A lignina presente no bagaço de cana-de-açúcar, contém uma maior proporção de anéis aromáticos do tipo p-hidroxifenila, com relação a anéis do tipo guaiacila e siringila, forma uma barreira física que dificulta a atividade de enzimas celulolíticas, dificultando o processo de sacarificação da celulose (TITA et al., 2002; ISRAEL, 2005), os hidrolisados ligninocelulósicos podem ser utilizados para a produção de xilitol, etanol e outros produtos úteis, já que estes materiais apresentam alta concentração de carboidratos, baixo conteúdo relativo de lignina, fácil utilização, baixo custo de colheita, transporte e armazenagem (GOUVEIA et al., 2009).
2.1.2 Resíduo da casca de coco.
O Brasil é o líder mundial na produção de coco verde (OLIVEIRA, 2010). Em 2007 cerca de 2,77 bilhões de toneladas de coco foram produzidas, numa área cultivada de 273.459 hectares (FAO, 2008). No Brasil, o coqueiro tornou-se popular pelo charme que dá às paisagens litorâneas e pelos frutos comestíveis e de aplicação culinária, quando transformados em leite de coco ou coco ralado (SILVEIRA, 2008). Aproximadamente 85% da produção nacional de cocos são comercializados como produto seco: a metade é destinada ao uso culinário e o restante é industrializado, obtendo-se uma série de produtos como: leite, sabão, óleo etc. Cerca de 15% da produção é consumida ainda verde, para extração de água, que também é industrializada (SILVEIRA, 2008).
A composição química da casca de coco varia amplamente, conforme a fonte, época do ano e regime pluviométrico (KAMPF e FERMINO, 2000), é constituída por uma fração de fibras que segundo Rosa et al (2001) correspondem a cerca de 90% do peso bruto do fruto.
O aumento na comercialização e do consumo da água de coco tem gerado cerca de 6,7 milhões de toneladas de resíduos/ano (MACHADO, DAMM, JÚNIOR, 2009). O fruto descartado, normalmente, é depositado nos aterros e nos denominados lixões. Nas cidades litorâneas e turísticas do Brasil podem ser
obtidas grandes quantidades de coco verde descartados diariamente por comerciantes informais e por empresas que comercializam a parte comestível ou a água desse fruto (ANDRADE et al., 2004). Segundo Silveira (2008) um exemplo que ilustra tal problemática é a cidade de Salvador, em que a quantidade média diária de coco verde, na alta estação, corresponde a um volume de 56m3 ,o que equivale a ocupação média de 2,4m2/dia no aterro sanitário da cidade. A decomposição desse resíduo pode levar cerca de 8 a 12 anos, causando assim possíveis impactos negativos ao ambiente, por isso é de suma importância encontrar uma forma de agregar valor aos resíduos do coco, com fim econômico e tecnológico, reduzindo os impactos negativos ao meio ambiente, além de proporcionar emprego e renda (MACHADO, DAMM, JÚNIOR, 2009).
Uma alternativa para a minimização desse problema consiste no aproveitamento de tais resíduos, um vez que eles podem ser usados como substratos sólidos para o crescimento de microorganismos (MENEZES et al.,2006).
2.2 Composição da biomassa ligninocelulósica.
As fibras naturais utilizadas industrialmente provêm, em sua maioria, dos materiais ligninocelulósicos. A ligninocelulose é uma estrutura composta de lignina, celulose e hemicelulose. Os polímeros de carboidratos são fortemente ligados à lignina principalmente por ligações de hidrogênio, mas também por algumas ligações covalentes (TENGERDY e SZAKACS, 2003; LEE, 2007). A composição química da biomassa em geral apresenta em media 40-50% de celulose, 18-27% de hemicelulose e 21 a 28% de lignina (CASTRO, 2006). A figura 1 a seguir demonstra a estrutura de uma fibra vegetal destacando a celulose, hemicelulose e lignina.
Figura 1. Estrutura de uma fibra vegetal (SILVA et al.,2009).
2.2.1 Celulose.
A celulose é o componente mais abundante nos materiais ligninocelulósicos (FERRAZ, 2004). Trata-se de um polímero formado por inúmeras unidades de glicose, ligadas entre si por ligações glicosídicas do tipo β - 1,4. Essas cadeias podem estar ligadas entre si por ligações de hidrogênio, formando regiões cristalinas (regiões altamente ordenadas) ou podem não estar ligadas, formando regiões amorfas (regiões menos ordenadas), que constituem 15% do total do polímero. Na região cristalina a fibra tem maior resistência à tração, ao alongamento e à solvatação, e na região amorfa a fibra tem maior flexibilidade. O conjunto das cadeias de glicose (regiões cristalinas e amorfas) forma as fibrilas da celulose, que unidas formam as microfibrilas (KOBLITZ, 2008). Estritamente a
celulose é composta por unidades de celobiose (Figura 2) que se repetem, sempre apresentando o oxigênio que liga os anéis glicosídicos na posição equatorial (FERRAZ, 2004). O acoplamento de cadeias adjacentes de celulose por pontes de hidrogênio e forças de van der Waals resulta em um alinhamento paralelo e numa estrutura cristalina com fibras estáveis, retas, de grande força tensoativa e baixa acessibilidade (DEMAIN et al., 2005).
Figura 2. Estrutura da celulose, formada por unidades consecutivas de celobiose (FENGEL e WEGENER,1989).
Assim, devido à sua estrutura, a celulose apresenta um vasto potencial de utilização industrial para a produção de diversos produtos (papel, tecidos, açúcares, ácidos orgânicos, tensoativos, adesivos, corantes, solventes, produtos farmacêuticos), além do chamado “etanol de segunda geração” (MENDES, 2010).
2.2.2 Hemicelulose.
A hemicelulose é formada por polissacarídeos de menor peso molecular que a celulose, compostos por pentoses (xilose e arabinose) e hexoses (manose, glicose e galactose) na cadeia principal e ramificações de ácidos glicurônicos, acetil e arabinose dependendo de sua origem, são ligadas entre si por ligações β 1-4 (Figura 3). Entre os polissacarídeos formadores da hemicelulose as xilanas estão entre as mais abundantes. Geralmente a hemicelulose se encontra associada à celulose e à lignina (KOBLITZ, 2008; SÁNCHEZ, 2009, MENDES, 2010). A estrutura amorfa da hemicelulose, que contém em torno de 100 a 200 unidades de monossacarídeos, a torna mais facilmente hidrolisável do que a celulose (KUHAD e SINGH, 1993).
Figura 3. Representação esquemática de uma xilana de gramínea. (1) 1,4-D- xilopiranose; (2) L-arabinose; (3) ácido 4-O-D-metil-D-glicurônico; (4) grupoAcetil (PITARELLO, 2007).
2.2.3 Lignina.
Depois da celulose, a lignina (Figura 4) é a substância orgânica polimérica mais abundante nas plantas, que está presente na lamela média e na parede secundária, representando cerca de 20% do material lignocelulósico (RABELO, 2007; RUEDA, 2010). Trata-se de uma macromolécula amorfa, que possui alta massa molecular e é altamente insolúvel e recalcitrante. Sua estrutura é composta basicamente de unidades de fenilpropano, o que confere rigidez às paredes celulares, desempenhando assim importantes papéis biológicos, (CARDOSO, 2009; MENDES, 2010). Dessa forma, essa rigidez dificulta a degradação química e enzimática, reduzindo a degradabilidade dos materiais ligninocelulósicos (CARDOSO, 2009; SÁNCHEZ, 2009).
A biossíntese da lignina se processa por via radicular a partir da reação de três diferentes álcoois cinamílicos precursores: álcool p-cumarílico, álcool coniferílico e álcool sinapílico, que geram unidades p-hidroxibenzílicas, guaiacílicas e siringílicas, respectivamente (RABELO, 2007).
A degradação da lignina apresenta grande importância econômica, tornando disponíveis substâncias de interesse na indústria, pecuária e na agricultura. A extração da lignina pode fornecer uma séria de compostos fenólicos de interesse comercial, como o siringaldeído e o p-hidroxibenzaldeído, assim como a vanilina (essência de baunilha), que é produzida por oxidação dos produtos de sua hidrólise alcalina (AGUIAR, 2010).
Biologicamente, a lignina é degrada principalmente por fungos, basidiomicetos da podridão branca, mas também por algumas actinomicetos. Estes fungos produzem um conjunto de enzimas extracelulares denominadas ligninases, que atuam sinergicamente na degradação da lignina (TESTONI, 2010). A degradação da lignina por fungos basidiomicetos ocorre por meio de reações intermediadas por um mecanismo, que começa com a subtração de um elétron de seu núcleo aromático, para formarem radicais catiônicos instáveis e, em seqüência, formam produtos de reações não enzimáticas, de radicais catiônicos com água e outros nucleófilos (SALVI, 2008).
.
2.2.4 Constituintes menores.
Os constituintes menores dos materiais ligninocelulósicos incluem compostos orgânicos e inorgânicos. Os compostos orgânicos pertencem à diferentes classes de compostos como ácidos graxos, ésteres, alcoóis, esteróides, hidrocarbonetos de elevada massa molecular entre outros (RUEDA, 2010).Os compostos inorgânicos estão presentes em quantidades que variam de 1% a 10%. São constituídos principalmente de sulfatos, oxalatos, carbonatos, e silicatos de cálcio, potássio e magnésio, além de outros sais em quantidades menores (RUEDA, 2010).
2.3 Fungos degradadores de lignina.
Os fungos são microrganismos eucariontes que obtêm sua energia pela ruptura de moléculas orgânicas, podendo ocupar diversos nichos ecológicos (TORTORA et al., 2000). No ambiente terrestre, os fungos tem um papel importante nos ciclos biogeoquímicos do carbono, do nitrogênio e do fósforo (ANDRADE, 2011).
O grupo dos basidiomicetos possui cerca de 14000 espécies, entretanto menos de 10% são conhecidas. São fungos que produzem esporos (basidiósporos) de origem sexuada em estruturas especializadas denominadas de basídios e popularmente chamadas de cogumelos e orelhas de pau. A fase vegetativa dos basidiomicetos é denominada de micélio, que por sua vez é formada por muitos filamentos septados chamados hifas. Os basidiomicetos são caracterizados por possuírem dois tipos básicos de basidiósporos (LINDEQUIST, 2005; ANDRADE, 2011), esses fungos também são classificados de acordo com as diferenças de padrões de degradação da madeira que apresentam, levando-se em conta a característica macroscópica da degradação (SOUZA e ROSADO, 2010).
Os fungos decompositores da madeira podem ser classificados em três grupos: fungos de decomposição branca (white-rot fungi), capazes de degradar os três componentes da parede celular vegetal (celulose, hemicelulose e lignina) e proporcionando coloração clara na sua degradação; fungos de decomposição parda (brown-rot fungi), capazes de degradar principalmente as frações polissacarídicas (celulose e hemicelulose) observando-se uma coloração escura nos locais degradados, e fungos de decomposição branda ou macia (soft-rot
fungi), que podem degradar tanto os polissacarídeos quanto a lignina
(CARVALHO et al., 2009).
De acordo com Moreira Neto (2006), os basidiomicetos ligninolíticos secretam enzimas que convertem polímeros externos em moléculas menores, que são assimiladas e utilizadas como nutrientes. Assim os basidiomicetos ligninolíticos produzem enzimas pertencentes ao grupo das peroxidases, contendo o grupo heme, sendo as principais a lignina peroxidase (LiP), a manganês peroxidase (MnP) e outras peroxidases com ampla atuação, principalmente na degradação de compostos recalcitrantes (MOREIRA NETO, 2006).
Um número significativo de fungos foi identificado como produtores de enzimas ligninolíticas, alguns exemplos são: Phanerochaete chrysosporium (KUWAHARA et al.,1984), Pleurotus sajor-caju (KAMIDA et al.,2005), Ganoderma spp. (SILVA et al., 2005), Trametes villosa (CARDOSO, 2009), Phanerochaete
chrysosporium, Phlebia radiata, Phlebia tremellosa, Trametes versicolor, Bjerkandera adusta, Junghuhnia seprabilina e Phlebia ochraceofulva (SOUZA e
ROSADO,2010 )
2.3.1 Basidioma do gênero Lentinus.
O fungo Lentinus crinitus (Figura 5) é uma espécie de basidiomiceto bastante comum no Brasil, sendo frequentemente encontrado em troncos em decomposição. São fungos que apresentam basidioma centralmente estipitado. Apesar de freqüentemente degradarem a madeira, esse fungo apresenta grande
versatilidade com relação aos substratos a serem degradados, podendo ser utilizados nas mais diversas áreas de biorremediação, visto que sejam capazes de degradar hidrocarbonetos aromáticos, compostos bifenílicos, produtos originados em indústria têxtil, papel e celulose (PUTZKE, 2002; AUST,1990; BARR, 1994).
Figura 5: Lentinus crinitus CCB274 cultivado e frutificado em bagaço de cana-de-açúcar, laboratório de Micologia, Instituto de Botânica (Foto: Mendes, 2010).
2.4 Enzimas ligninolíticas.
Enzimas são substâncias orgânicas específicas compostas por polímeros de aminoácidos que atuam como catalisadores no metabolismo dos seres vivos, possuem estrutura proteica globular terciária e quaternária termolábeis, que aceleram a velocidade de uma reação química (OLIVEIRA, 2010). Uma das possibilidades na degradação de materiais ligninocelulósicos é o uso de microrganismos que produzem enzimas específicas que hidrolisam a celulose, enzimas que atuam sobre a porção hemicelulósica e enzimas oxidativas como LiP, MnP e Lac, que atuam sobre a lignina (OLIVEIRA, 2010).
Em termos gerais, as enzimas do complexo ligninolítico podem ser ordenadas segundo suas capacidades oxidativas da seguinte forma: LiP > MnP > Lac. Estas enzimas são comumente produzidas por fungos causadores de podridão branca, no entanto, existem algumas espécies que são eficientes na degradação de lignina, mas que produzem somente uma, duas ou as três enzimas simultaneamente(AGUIAR, 2010).
2.4.1 Lignina Peroxidase (LiP).
A LiP é uma glicoproteína extracelular que contém ferroprotoporfirina IX (heme) como grupo prostético, requer peróxido de hidrogênio (H2O2) para sua atividade catalítica e apresenta múltiplas formas, possuindo massa molecular entre 38 e 43 kD. Essa enzima já foi isolada a partir de numerosos fungos de degradação branca e a partir de alguns fungos de degradação marrom e macia (ESPOSITO e DURAN, 1997). Na presença de peróxido de hidrogênio, esta enzima é capaz de degradar compostos fenólicos e não fenólicos, além de anéis aromáticos alcooxilados. O peróxido de hidrogênio (H2O2) primeiramente oxida a enzima formando um intermediário oxidado, que retira um elétron de núcleos aromáticos formando radicais aril, que se decompõem espontaneamente via reação de caráter radicalar (CARVALHO, 2005).
O álcool veratrílico tem um papel importante na catálise da LiP, pois é o redutor preferido pela enzima produzida pelo fungo de degradação branca após hidrólise da lignina e ainda protege a enzima contra a inativação por excesso de H2O2. Na presença do peróxido de hidrogênio, a LiP oxida o álcool veratrílico a aldeído veratrílico (DURAN, 2004). Avalia-se que o melhor pH para a remoção de fenóis desta enzima seja em torno de 4,0 (SOARES, 2000).
2.4.2 Manganês Peroxidase (MnP).
Esta enzima extracelular é uma glicoproteína de massa molecular de aproximadamente 46KD que atua oxidando diretamente Mn(II) a Mn(III) que, por sua vez, atua como espécie ativa nos processos de oxidação catalítica, sendo quelado por ácido orgânicos como o oxalato, formando complexos estáveis de alto potencial de oxidorredução. No entanto, a MnP é apenas capaz de oxidar estruturas fenólicas (SOUZA e ROSADO, 2009).
Essa enzima é ativada por lactato e oxida uma grande variedade de corantes, incluindo o vermelho fenol e o o-dianisidina (KUWAHARA et al., 1984).
De acordo com MOREIRA NETO (2006), a produção de MnP é aparentemente limitada a certos fungos basidiomicetos, que ainda assim é considerada a enzima chave na degradação de lignina. As condições ótimas para atividade desse grupo de enzimas variam entre as espécies fúngicas que as produzem, sendo uma faixa ótima de pH entre 4 e 7, e de temperatura entre 40º a 60º C (SILVA, 2009).
2.4.3 Lacase (Lac).
São fenol-oxidases produzidas por fungos e por vegetais e pertencem ao grupo de oxidases com cobre em seu sítio ativo, que por processo oxidativo remove o grupo fenil-propano mais externo à cadeia, gerando radicais fenoxila. Esses radicais atuam em reações não catalíticas, como acoplamento radical-radical e desprotonação a ataques nucleofílicos pela água, levando a reações de polimerização, quebras alquilarílicas e oxidações (ESPOSITO e DURAN, 1997; TIEN e KIRK, 1988).
As lacases fúngicas vem recebendo grande atenção em várias aplicações industriais, devido à sua capacidade de catalisar a oxidação de fenóis e outros compostos aromáticos, como a deslignificação, produção de etanol, modificação de fibras da madeira, clareamento de corantes e remediação de solos e águas contaminados (MOREIRA NETO, 2006).
2.5 CULTIVO EM ESTADO SÓLIDO (FES)
Para a obtenção de biomassa podem ser utilizados processos fermentativos, classificados em função da quantidade de água no meio. Esses processos podem ser por fermentação submersa (FS) ou por fermentação em estado sólido (FES). A fermentação submersa tem como característica principal o meio fermentativo líquido com nutrientes solúveis (ORTIZ, 2008).
Denomina-se cultura em estado sólido ou fermentação em estado sólido o tipo de cultivo no qual um microrganismo se desenvolve em superfícies de materiais sólidos que apresentam a propriedade de absorver ou conter água com umidade suficiente apenas para manter o crescimento e o metabolismo do microrganismo, isto é isento de água livre (ALEXANDRINO et al., 2007; CASTRO e PEREIRA, 2009; SANTOS, 2010). A matriz utilizada no processo deve ser fonte de carbono, energia, nutrientes e ter umidade suficiente para o crescimento e metabolismo do microrganismo (ORTIZ, 2008). A FES tenta imitar o meio natural dos basidiomicetos e, em geral, possibilita a obtenção de elevadas atividades de enzimas, incluindo as ligninolíticas. O crescimento do microrganismo pode ocorrer na superfície ou em todo substrato, dependendo da porosidase e da umidade do substrato. A água presente nesses sistemas encontra-se complexada com a matriz sólida de substrato ou como uma fina camada absorvida pela superfície das partículas. Em geral, nesses processos o teor de umidade varia entre 30-85% e a atividade de água típica vai de 0,40-0,90, mimetizando condições encontradas na natureza (ALEXANDRINO et al., 2007). Abaixo segue a tabela 2 com as principais características e vantagens de ambos cultivos (FES e FS).
Tabela 2. Características da fermentação no estado sólido (FES) e da fermentação submersa (FS).
FES FS
Menor gama de produtos obtidos e de micro-organismos aptos a crescer nessas condições
Maior demanda energética associada à esterilização do meio e à remoção de produto do meio fermentado
Menor possibilidade de contaminação, pela ausência de água livre no sistema
A purificação dessas moléculas é facilitada pela ausência ou baixa con-centração de partículas de substrato Menor disponibilidade de informações
na literatura, no que tange a fenômenos de transporte e cinéticas de crescimento e de produção enzimática
O alto teor de água e a natureza diluída do meio facilitam o controle da temperatura de cultivo, reduzindo a degradação do produto, em especial enzimas com baixa termoestabilidade O extrato obtido é em geral de três a
quatro vezes menos diluído que na FS, de forma que a produtividade e a concentração final de produto são maiores na FES
Quando operando com elevadas concentrações de substrato, podem ocorrer problemas reológicos no sistema
Maior dificuldade no controle do processo e na adição de soluções desejadas
Processos difusionais e de mistura são facilitados devido ao caráter homogêneo do sistema
Menor volume de resíduos líquidos gerado
Tecnologias de monitoramento de variáveis on line mais amplamente disponíveis
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Cultivo e crescimento do fungo.
O basidiomiceto utilizado (Lentinus crinitus) foi coletado na Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS) e pertence à coleção Cultura de Microrganismos do Estado da Bahia (CCMB) sob o numero de depósito CCMB 555. O fungo foi reativado em meio de ágar e 2% extrato de malte. O meio para crescimento do fungo foi preparado e esterilizado por 121°C/15 minutos, vertido em placas estéreis de 9 cm de diâmetro. O inóculo por placa foi constituído de três plugs de 0,6 cm do meio sólido contendo micélio.
As placas foram incubadas em estufa tipo B.O.D a 28°C por sete dias. Após esse período, foi observado o crescimento dos fungos, posteriormente conservados a 4°C. Foram utilizadas placas sem a presença dos fungos como controle.
3.2 Obtenção dos substratos.
O bagaço de cana de açúcar foi obtido de uma feira livre na cidade de Feira de Santana.O resíduo da casca de coco foi doado de uma indústria que processa água de coco localizada na cidade de Feira de Santana.
Os resíduos foram cortados manualmente e depois triturados em tamanhos aproximadamente de 1cm, esse material foi guardado em sacos plásticos transparentes em geladeira até o uso. A umidade dos substratos foi determinada pelo método gravimétrico em estufa a 105°C até peso constante (IAL, 2005). A partir dos resultados de umidade, secou-se os substratos até 50% de umidade para usar nos experimentos.
3.3 Planejamento multivariável para otimização das condições de cultivo para a secreção da enzima MnP (RODRIGUES e LEMMA, 2009).
Com o objetivo de verificar a influência das diversas variáveis (pH, temperatura e tipo de substrato) na secreção de MnP pelo Lentinus crinitus, montou-se um planejamento experimental multivariável aplicando o programa Statistica (7.0). Foi realizado um fatorial completo 23, incluindo seis pontos axiais e 3 repetições no ponto central, totalizando 17 ensaios. O programa gerou as planilhas de ensaio e as superfícies de resposta de acordo com a análise de variância. Na Tabela 3 abaixo estão apresentadas as variáveis independentes e seus níveis e na Tabela 4 encontra-se a planilha de ensaio gerada pelo programa. Como variável dependente (resposta) utilizou-se a medida da atividade de MnP secretada em cada ensaio.
Tabela 3: Variáveis independentes dos parâmetros de otimização.
-α -1 0 1 α pH 3 4,6 7,0 9,4 11,0 Temperatura (ºC) 10 16 25 34 40 Substrato Cana (%) 0 20,3 50 79,7 100 Coco (%) 100 79,7 50 20,3 0
Tabela 4: Ensaios para o cultivo para a produção da enzima. Ensaio pH Temperatura (ºC) Substrato (%) Cana/Coco 1 -1,00 4,6 -1,00 16 -1,00 20,3+79,7 2 -1,00 4,6 -1,00 16 1,00 79,7+20,3 3 -1,00 4,6 1,00 34 -1,00 20,3+79,7 4 -1,00 4,6 1,00 34 1,00 79,7+20,3 5 1,00 9,4 -1,00 16 -1,00 20,3+79,7 6 1,00 9,4 -1,00 16 1,00 79,7+20,3 7 1,00 9,4 1,00 34 -1,00 20,3+79,7 8 1,00 9,4 1,00 34 1,00 79,7+20,3 9 -1,68 3,0 0,00 25 0,00 50+50 10 1,68 11,0 0,00 25 0,00 50+50 11 0,00 7,0 -1,68 10 0,00 50+50 12 0,00 7,0 1,68 40 0,00 50+50 13 0,00 7,0 0,00 25 -1,68 0+100 14 0,00 7,0 0,00 25 1,68 100+0 15 0,00 7,0 0,00 25 0,00 50+50 16 0,00 7,0 0,00 25 0,00 50+50 17 0,00 7,0 0,00 25 0,00 50+50
3.3.1 Condições de cultivo para a produção da enzima.
A umidade dos substratos foi determinada pelo método gravimétrico em estufa a 105°C, secou os substratos até 50% de umidade e ajustou até % de umidade desejado com tampão no pH correspondente ao indicado na planilha para cada ensaio.
Para o cultivo do fungo visando a secreção máxima de MnP foram utilizados frascos erlenmeyer (250 mL) contendo 20 g de substrato com 80% de umidade. O meio sólido foi autoclavado a 121°C por 15 minutos antes de ser inoculado. Após a esterilização cinco plugs (0,6cm de diametro) contendo micélio com sete dias de crescimento foram inoculados nos erlenmeyers contendo o substrato. A temperatura de incubação e o tipo de substrato utilizado em cada ensaio correspondem ao indicado na tabela 4.
Todos os ensaios foram incubados por 15 dias e realizados em triplicata.
Figura 6. Resultado do cultivo de L.crinitus para secreção de MnP após15 dias de incubação.
3.3.2 Obtenção do extrato enzimático.
O método consistiu da adição de 50 mL de água destilada gelada ao meio de cultivo, que permaneceu em banho de gelo por uma hora, com a agitação ocasional. O conteúdo foi filtrado em gaze e os extratos enzimáticos obtidos foram separados em alíquotas de 10 mL, que foram congelados para posterior determinação da atividade enzimática.
3.4 Determinação da atividade enzimática.
Para determinação da atividade de MnP os extratos enzimáticos obtidos foram centrifugados a 4000 x g, por 10 minutos, a 4°C (Figura 7).
Figura 7. Extratos enzimáticos centrifugados.
Foi utilizado a metodologia modificada de Kuwahara et al (1984). O meio reacional foi composto de: 500 μL de sobrenadante do extrato centrifugado, 50 μL de sulfato de manganês (2,0 mM), 200 μL de albumina bovina (0,5%), 50 μL de peróxido de hidrogênio (2mM) em tampão succinato de sódio (0,2 M; pH 4,5), 100 μL de lactato de sódio (0,25 M), 100 μL de vermelho de fenol (0,01%) (Figura 8.a). Segundo essa metodologia, a atividade de manganês peroxidase foi determinada pela oxidação de vermelho de fenol na presença de peróxido de hidrogênio. A
reação foi acompanhada pela leitura da absorbância a 610 nm em espectrofotômetro UV-Vis (Cary 50 Varian) a cada 10 segundos. Transcorrido o tempo total de reação de 5 minutos, a reação foi paralisada pela adição de 40 μL solução de hidróxido de sódio (2,0 M). Após a paralisação (Figura 8.b) a absorbância foi acompanhada por mais um minuto.Todas as análises foram realizadas em triplicata.
Essa mesma metodologia foi utilizada para o ensaio chamado de “branco”, entretanto nesse ensaio o extrato enzimático foi inativado por 15 minutos a 100ºC. Todas as análises também com o branco foram realizadas em triplicata.
Figura 8. (a) Meio reacional e (b) Meio reacional após paralisação da reação por adição de NaOH.
A atividade de MnP foi calculada através da seguinte equação:
Equação I.
Abs é a diferença entre a absorbância obtida para o teste e para o branco nos tempos 0 e 5 minutos;
€ é o coeficiente de extinção (= 4460) (L/m X cm ).
R é alíquota de sobrenadante do extrato bruto centrifugado (μL); t é o tempo da reação em minutos.
(a) a
(b)
3.5 Determinação da Atividade Específica.
A atividade específica foi calculada pelo quociente da atividade enzimática pelo teor de proteína bruta do extrato.
3.5.1 Determinação de proteína bruta
Para a determinação de proteína bruta foi utilizado o método de Lowry, sendo todos os ensaios realizados em triplicata.
A reação aconteceu misturando-se 500 μL do extrato bruto enzimático com 5 mL do reagente de Lowry seguido de repouso por 10 minutos. Em seguida, 500 μL do reagente de Folin-Ciocalteau diluído (1:4) foram adicionados e, após 10 minutos, procedeu-se à leitura da absorbância a 660 nm, em espectrofotômetro (UV-Vis). Todos os ensaios foram realizados em triplicata
3.6 Estudo do tempo de cultivo.
Esse experimento teve como finalidade verificar a influência do tempo de cultivo, nas condições otimizadas sobre a secreção da enzima em estudo (MnP). A atividade enzimática foi determinada após 5, 10, 15, 20, 25 e 30 dias de crescimento do fungo em frascos Erlenmeyer (250 mL) contendo 20 g do resíduo agroindustrial (50% bagaço de cana e 50% casca de coco) com 80% de umidade e pH 7,0 incubados a 25°C em estufa tipo B.O.D. Todos os ensaios foram realizados em triplicata.
Para comparação entre as médias foi utilizada análise de variância, seguida do teste de Tukey a 5% de significância, aplicando o programa Sisvar (5.0).
3.7 Determinação do pH e Temperatura ótimos da MnP de L. crinitus.
Foi elaborado um planejamento experimental para a determinação de pH e temperatura ótimos de atividade da enzima MnP secretada.
Tabela 5: Variáveis independentes e seus níveis para otimização do pH e Temperatura ótimos de manganês peroxidase.
FATOR -1,41 -1 0 1 1,41
pH 3,0 4,16 7,0 9,84 11,0
Tabela 6: Ensaios para otimização da atividade de manganês peroxidase. ENSAIO pH TEMPERATURA (°C) 1 -1 4,16 -1 30,18 2 -1 4,16 1 79,82 3 1 9,84 -1 30,18 4 1 9,84 1 79,82 5 -1,41 3 0 55 6 +1,41 11 0 55 7 0 7 -1,41 20 8 0 7 +1,41 90 9 0 7 0 55 10 (C) 0 7 0 55 11 (C) 0 7 0 55 12 (C) 0 7 0 55 3.8 Deslignificação. 3.8.1 Reação enzimática.
Para a deslignificação enzimática utilizou-se 4 g do bagaço de cana seco, 16 mL de tampão succinato de sódio (0,2 M, pH 13,0) contendo sulfato de manganês (2,0 mM), albumina de bovino (0,5%) , peróxido de hidrogénio (2 mM) e lactato de
sódio (0,25 M) e, 5 ml do extrato enzimático contendo 19,2 U/L de atividade de MnP em frascos Erlenmeyer de 250 mL. A reação durou 6 horas, a 25°C, sob agitação (150 rpm). O substrato foi recolhido em cadinho sinterizado e lavado com 200 mL de água destilada, e em seguida secou em estufa a 105° até peso constante. Foi realizado o ensaio com a enzima inativada (branco), para comparar o teor de lignina. Todos os testes foram realizados em triplicata.
3.8.2 Determinação do teor de lignina.
Os métodos de Fibra detergente ácido (FDA) e Fibra em detergente Neutro (FDN) foram descritos respectivamente por Van Soest, 1967 e por Van Soest e Wine. Van Soest propõe um detergente em meio ácido a fim de solubilizar a fração solúvel mais hemicelulose, obtendo assim um resíduo insolúvel denominado Fibra Detergente ácido (FDA), constituído basicamente de lignina e celulose (ligninocelulose). 1 g da amostra foi diluído em 100 mL de solução de detergente ácido por 1 hora, após determinado tempo foi realizada a filtração a vácuo em cadinhos filtrantes com lavagem de água quente e acetona. Subsequente os cadinhos foram secos em estufas a 105ºC por 8 horas. Os cadinhos contendo o resíduo filtrado a partir da fibra em detergente ácido foram adicionados ácido sulfúrico 72% e submetido a filtração em vácuo. Após a filtração, os cadinhos contendo o resíduo foram lavados com água quente até retirada toral do ácido. Os resíduos foram secos em estufa a 100 ° C durante 8 horas e depois colocados na mufla a 550 ° C durante 3 horas. O teor de lignina foi calculada pela perda de peso após incineração.
Para comparação entre as médias foi utilizada análise de variância, seguida do teste de Tukey a 5% de significância, aplicando o programa Sisvar (5.0).
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Planejamento multivariável para otimização das condições de cultivo para a secreção da enzima MnP
A tabela 7 apresenta os valores utilizados no planejamento com sua respectiva resposta (atividade de MnP ) nas condições estabelecidas pelo planejamento.
Tabela 7: Condições experimentais do planejamento para a produção de MnP e a variável de resposta. Ensaio pH Temperatura (ºC) Substrato Cana/Coco Atividade enzimática (U/L) 1 4,6 16 20,3+79,7 1,25 2 4,6 16 79,7+20,3 3,82 3 4,6 34 20,3+79,7 0 4 4,6 34 79,7+20,3 0 5 9,4 16 20,3+79,7 0 6 9,4 16 79,7+20,3 2,21 7 9,4 34 20,3+79,7 0 8 9,4 34 79,7+20,3 0 9 3,0 25 50+50 0 10 11,0 25 50+50 11,93 11 7,0 10 50+50 3,35 12 7,0 40 50+50 7,05 13 7,0 25 0+100 0 14 7,0 25 100+0 0 15 7,0 25 50+50 12,35 16 7,0 25 50+50 13,54 17 7,0 25 50+50 14,02
Tabela 8: Análise de variância (ANOVA) para a atividade de MnP.
Fonte de
variação SQ GL QM Fcal Ftab Regressão 362,5864 3 120,8621 14,3099 5,74% (1%) Resíduo 109,7983 13 8,4460 3,41% (5%) Falta de ajuste 108,3112 11 2,56% (10%) Erro Puro 1,4872 2 Total 472,3848 16
*SQ= soma dos quadrados; GL= graus de liberdade; QM= quadrado médio; F= valor de F calculado; p= probabilidade; R2= Coeficiente de regressão
Pela análise de variância (tabela 8) conclui-se que o modelo está bem ajustado às observações, a regressão é estatisticamente significativa e serve para fins preditivos, com 95% de confiança. Com R2 = 0,76, significa que mais de 76% das variações nos resultados obtidos podem ser explicados pelo modelo ajustado e se devem às diferenças entre os tratamentos. Com o F calculado maior que o F tabelado a 1, 5 e 10% de probabilidade pode considerar o modelo para predizer a atividade de manganês peroxidase. Assim o Modelo matemático obtido para a Atividade de MnP em funções das variáveis codificadas que contém os termos estatisticamente significativos é:
Figura 9. (a) gráficos tridimensional e bidimensional (b) para as variáveis Temperatura e pH sobre a produção de MnP.
b
(a)
Figura 10. (a) Gráfico tridimensional e (b) Gráfico bidimensional das variáveis Substrato e pH sobre a produção de MnP.
(b) (a)
Figura 11(a) Gráfico tridimensional (b) Gráfico bidimensional das variáveis Substrato e Temperatura sobre a produção de MnP.
De acordo com as superfícies de respostas obtidas (Figuras 9, 10 e 11), podemos considerar que foi possível determinar que o processo de cultivo para secreção de MnP por L. crinitus foi otimizado. As condições mais indicadas para secreção dessa enzima foram: meio de cultivo em pH=7,0, contendo 50% do de bagaço de cana e 50% de casca de coco com incubação estática a 25ºC.
A atividade enzimática obtida de 14,02U/L foi satisfatória comparada alguns autores como mostra a tabela 9 abaixo.
(a)
Tabela 9: Referências bibliográficas pesquisadas de atividade de MnP
Microrganismo Substrato Atividade de MnP Autor
Polyporus arcularius
Meio basal / 7 dias < 1 U/L Pelaez et al.,1995
Lentinus tigrinus Meio sólido (Agar
e corante)
1,435 U/g Zhao et al.,1996
Polyporaceae Farelo de trigo 29,8 U/ml Arora et al., 2002
Lentinus tigrinus
Água de lavagem de moinho de azeitona
400 U/L Fenice et al., 3003
Ganoderma spp. Cultura líquida 0,035 U/L Silva et al.,2004
4.2 ESTUDO DO TEMPO DE CULTIVO.
Com as condições de cultivo otimizadas analisamos a atividade máxima da enzima em relação ao tempo. A figura 12 apresenta os resultados para atividade de MnP para os ensaios de 5, 10, 15, 20, 25 e 30 dias de incubação.
Pelo teste de Scott-Knot podemos observar que no quinto dia obteve a máxima produção da enzima (77,83 U/L). Sendo que nos outros dia de análise não houve diferença significativa. A atividade enzimática máxima foi obtida no quinto dia e depois passou a decrescer, sendo que a partir do 20 dias a atividade ficou em aproximadamente zero. Lopez et al (2007) encontraram atividade máxima de 0,22 U/L em Coniochaeta ligniaria com 10 dias de cultivo sob fermentação sólida de resíduos de pimenteira; Em Trametes villosa sob fermentação liquida com suplementação de glicose, a atividade de MnP atingiu o máximo de 6 U/L em 27 dias (YAMANAKA et al, 2008); Baldrian e Snajdr, 2006, realizaram ensaios para MnP com alguns microrganismos em meio líquido contendo nitrogênio e carbono, entretanto os fungos que se destacaram foram T.
versicolor com atividade máxima de 33,2 U/L no17 dia e C. dryophila com 33,0
U/L sendo que a máxima atividade foi obtida no dia 28; Para Aguiar et al (2010) o
P. ostreatoroseus não apresentou atividade de MnP, já o P. ostreatus teve o
máximo de atividade 27.69 U/L no 21 dia e o T. reesei teve a máxima atividade entre o 15 e 18 dia com respectivas atividades de 19.02U/L e 18.08 U/L,todos esses microrganismos foram testados em meio sólido com bagaço e vinhaça da cana.
Entretanto nesse trabalho utilizando o microrganismo L. crinitus e o bagaço de cana e casca de coco como substrato, obteve-se um bom resultado para a produção de MnP (77,83 U/L), porém com um tempo de produção bem menor (5 dias) que os apresentados para outros microrganismos descrito na literatura. Dessa forma, o fungo L. crinitus apresenta um grande potencial para a produção de MnP para ser utilizada na deslignificação de resíduos vegetais e outras aplicações tecnológicas.
4.3 Determinação do pH e Temperatura ótima de MnP.
Tabela 10: Resultado da atividade de pH e Temperatura.
Ensaio pH Temperatura (ºC) Atividade de MnP U/L 1 4,16 30,18 0,00 2 4,16 79,82 0,00 3 9,84 30,18 12,77 4 9,84 79,82 0,00 5 3 55 0,00 6 11 55 3,11 7 7 20 0,00 8 7 90 0,00 9 (C)* 7 55 3,83 10 (C)* 7 55 4,10 11 (C)* 7 55 5,02 12 (C)* 7 55 4,99 *( C) Pontos centrais
Tabela 11: Tabela ANOVA
SQ GL MQ Fcalc Ftab Regressão 116,4326 5 23,2865 2,8141 1% = 10,97 Resíduo 41,3747 5 8,2749 5% = 5,05 Falta de Ajuste 40,8201 3 10% = 3,45 Erro puro 0,5546 2 25% = 1,89 Total 157,8073 10
DV: Ativ (U) -4,33384 -7,8533 -8,58261 11,53373 -12,1202 p=,05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value) pH(Q)
Temp (ºC)(Q) (2)Temp (ºC)(L) (1)pH(L) 1Lby2L
Figura 13. Diagrama de Pareto para pH e Temperatura ótimo.
DV: Ativ (U) 10 8 6 4 2
Figura 14. Análise tridimensional da atividade de MnP em relação ao pH e Temperatura ótimo.
DV: Ativ (U) 10 6 2 -2 -6 3 4 5 6 7 8 9 10 11 pH 20 30 40 50 60 70 80 90 T em p (º C )
Figura 15. Análise bidimensional da atividade de MnP em relação ao pH e Temperatura ótimo.
Com o resultado do planejamento experimental para o pH e Temperatura ótimos podemos observar que todos os resultados foram significativos. O R² de
0,73781 significa que mais de 73% das variações nos resultados obtidos podem
ser explicados pelo modelo ajustado e se devem às diferenças entre os tratamentos. De acordo com os resultados mostrados na Tabela 11, observou-se que os fatores estudados foram significativos no nível de 10% de probabilidade. No Diagrama de Pareto (Figura 13) é possível visualizar a influência dos fatores estudados sobre a atividade enzimática. Como todos esses resultados foram significativos estreitamos a faixa de pH e Temperatura como mostra os resultados a seguir.
Tabela 12: Planejamento com novas faixas de pH e Temperatura. Ensaio pH Temperatura (º C) Atividade de MnP U/L 1 6,2 13 0 2 6,2 27 0 3 11,8 13 5,8296 4 11,8 27 0 5 5 20 11,8984 6 13 20 19,2825 7 9 10 0 8 9 30 3,4978 9 (C) 9 20 12,9947 10 (C) 9 20 11,9581 11 (C) 9 20 12,6756
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: Ativ (U) 2 factors, 1 Blocks, 11 Runs; MS Pure Error=,2818618
DV: Ativ (U) -,551751 -1,10375 -5,49023 10,85179 -31,8836 p=,05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value) (2)Temp.(L)
pH(Q) 1Lby2L (1)pH(L) Temp.(Q)
Fitted Surface; Variable: Ativ (U) 2 factors, 1 Blocks, 11 Runs; MS Pure Error=,2818618
DV: Ativ (U) 12 8 4 0 -4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 pH 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Te m p .
Figura 17. Análise bidimensional da atividade de MnP em relação ao pH e Temperatura ótimo utilizando faixas mais estreitas.
De acordo com esses novos resultados (Tabela 12), existe a probabilidade de ter 2 isoenzimas (figura 16 e 17) nesse extrato, uma com pH ótimo alcalino e temperatura ótima entre 20 e 30ºC, pois foram nessas condições que se obteve a máxima atividade, e outra com temperatura ótima bem mais baixa e pH ácido em torno de 5. O pH ótimo verificado nesse estudo discorda de outros trabalhos, pois na literatura os fungos de degradação branca geralmente apresentam atividade ótima de MnP em valores de pH ácidos, variando de 3,0 a 5,0. Gomes (2009) produziu MnP em substrato sólido e obteve a máxima atividade de Lentinus sp em pH 3,5 a 4,0 e temperatura de 65°C, P. rimosus teve o pH ótimo em torno de 5,0-6,0 e temperatura ótima de 30°C .
A faixa alcalina de atuação indica que essa enzima poderá vir a ser uma vantagem para a utilização em processos industriais.
4.4 Remoção do teor de lignina.
De acordo com os resultados expressos na tabela 13, podemos constatar que o tratamento enzimático teve efeito significativo na remoção de lignina, pois o bagaço de cana tratado com a MnP de Lentinus Crinitus sob após 6 horas de reação teve perda da lignina de 20%.
Já o resíduo da casca de coco nas mesmas condições testadas teve uma remoção de lignina maior cerca de 32,61%.
Tabela 13: Resultados do teor de lignina após análises.
AMOSTRA Lignina % Hemicelulose % Celulose % Bagaço de Cana (controle) 7,19 15,56 37,05 Bagaço de Cana (com enzima) 5,78 17,72 34,20 Casca de Coco (controle) 15,33 10,98 35,59 Casca de coco (com enzima) 10,19 9,44 31,10
Moniruzzaman e Ono (2012), utilizando enzimas comerciais de Trametes sp. foram capazes de remover 10,2 a 50,1% da lignina da biomassa de madeira em diversos tratamentos usados, já Mukhopadhyay et al (2011) utilizando lacase comercial de Ricinus promoveu a remoção de 80% da lignina. Pelo resultado obtidos nesse experimento podemos constatar que mesmo em condições semelhantes de reação, a remoção de lignina pode variar em determinados resíduos.
Assim, os resultados encontrados neste trabalho indicam que o extrato bruto obtido nas condições otimizadas para a produção de manganês peroxidase por
Lentinus crinitus é capaz de realizar a remoção de lignina nos resíduos vegetais
5 CONCLUSÃO
O trabalho realizado possibilitou o estudo da produção manganês peroxidase por basidiomiceto (Lentinus crinitus) para a deslignificação nos resíduos agroindustriais (bagaço de cana e casca de coco).
As condições de cultivo sob substrato sólido para secreção de manganês peroxidase foi otimizada, ou seja, condições de cultivo para a produção dessa enzima foram 50% de bagaço de cana e 50% da casca de coco acrescido de tampão em ph 7,0 (totalizando 20 g de substrato), 80% de umidade, temperatura de 25°C por 5 dias em erlenmeyer de 250 ml. Nessas condições foi possível produzir extrato com alta atividade de manganês peroxidase (77,0 U/L) em pouco tempo (5 dias). Utilizando esses parâmetros é possível produzir extrato com alta atividade de MnP, que tem potencial de aplicação na deslignificação de materiais ligninocelulósicos.
Com 5 ml de manganês peroxidase, obtido nas condições acima e 16 ml de tampão succinato de sódio no pH 13 em 6 horas de reação a 150 rpm foi possível realizar a deslignificação nos substratos testados. Os resultados obtidos foram remoção 20% de lignina do bagaço de cana e 32% na casca de coco.
Assim L. crinitus apresenta um grande potencial para a produção de MnP para ser utilizada na deslignificação de resíduos vegetais e outras aplicações tecnológicas que tem potencial de aplicação na deslignificação de materiais ligninocelulósicos.
