EFEITO DO TRATAMENTO COM EXTRATO DE PITUITÁRIA
EQUINA NA RESPOSTA OVARIANA E EFICIÊNCIA
REPRODUTIVA DE ÉGUAS IDOSAS EM PROGRAMA DE
TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES
Dissertação Mestrado
Botucatu-SP 2009
BRUNO FRITZSONS BONIN
EFEITO DO TRATAMENTO COM EXTRATO DE PITUITÁRIA EQUINA NA RESPOSTA OVARIANA E EFICIÊNCIA REPRODUTIVA DE ÉGUAS IDOSAS
EM PROGRAMA DE TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista, campus de Botucatu, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária, área de Reprodução Animal.
Orientador: Professor Adjunto Marco Antônio Alvarenga
Botucatu-SP 2009
AGRADECIMENTOS
A Deus que nos permite caminhar todos os dias vencendo batalhas e trilhando nosso caminho em companhia de nossas famílias e amigos.
A minha família, Bruna, Sophia e Matheus (a caminho) por sempre estarem ao meu lado entendendo o trabalho sem horário, conciliado com vários anos de estudo longe de casa.
Aos meus familiares, pelos incessantes incentivos na busca constante de novas informações e formação pessoal.
Ao meu orientador e amigo, Prof. Dr. Marco Antonio Alvarenga, pelos ensinamentos e confiança durante a realização do curso de Mestrado.
Ao Médico Veterinário e amigo José Antonio Dell’Aqua Júnior pelo auxilio na avaliação estatística dos dados.
Aos docentes, colegas pós-graduandos e funcionários do Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária da FMVZ, Unesp-Botucatu.
Ao amigo e proprietário da Central de Reprodução, Guilherme Gregolin, pela viabilização da condução deste trabalho, nas dependências de sua Central.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Efeito da idade da égua doadora nas taxas de
recuperação embrionária... 15 Tabela 2 – Número médio de ovulações por ciclo, número médio de
embriões por ciclo, número médio de embriões por ovulação e número médio de embriões por éguas... 22 Tabela 3 – Número de ovulações por égua no G1, G2 e G3... 23 Tabela 4 – Número de embriões recuperados por égua no G1, G2 e
G3... 24 Tabela 5 – Duração da fase folicular, tempo em dias da aplicação da
prostaglandina (D8) até a ovulação por égua no G1, G2 e G3... .
25 Tabela 6 - Condizência entre o Estagio de desenvolvimento para
cada embrião recuperado e o dia da recuperação (D8 do ciclo), no G1, G2 e G3... 26 Tabela 7 - Taxa de prenhez obtida por embriões recuperados no G1,
G2 e G3... 26 Tabela 8 - Taxa de prenhez por cicloobtidas no G1, G2 e G3... 27
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Porcentagem de éguas em atividade reprodutiva natural de
acordo com idade... 03 Figura 2 – Taxa de parição em éguas de acordo com idade... 04 Figura 3 – FSH e LH centralizado para ovulação... 08
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO... 01
2. REVISÃO DE LITERATURA... 03
2.1 Senilidade, dinâmica ovariana e ciclo estral... 04
2.2 Alterações hormonais relacionadas à idade... 06
2.3 Alterações da genitália externa e interna relacionadas à idade... 10
2.4Senilidade e qualidade de oócitos e embriões... 11
3. OBJETIVOS... 17
4. MATERIAL E MÉTODO... 18
4.1 Período e Local do Experimento... 18
4.2 Animais e Grupos Experimentais... 18
4.3 Delineamento Experimental... 18
4.3.1 Exames Ultrassonográficos... 19
4.3.2 Colheita de Sêmen, Inseminações e Indução das Ovulações 19 4.3.3 Tratamentos... 20
4.3.4 Colheita, Manipulação e Transferência dos Embriões... 20
4.3.5 Diagnóstico de Gestação... 21 4.4 Análise Estatística... 21 5. RESULTADOS... 22 6. DISCUSSÃO... 28 7. CONCLUSÕES... 34 8. REFERÊNCIAS... 35
RESUMO
BONIN, B.F., Efeito do tratamento com extrato de pituitária equina na
resposta ovariana e eficiência reprodutiva de éguas idosas em programa de transferências de embriões. Botucatu, 2009.
Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista.
O presente trabalho objetivou avaliar os efeitos de doses baixas do extrato de pituitária eqüina (EPE) no crescimento folicular, taxa de ovulação e de recuperação embrionária em éguas idosas. Doadoras de embrião (n=20) da raça Quarto de Milha de um programa comercial com idade de 15 a 20 anos de idade, foram utilizadas em 3 ciclos consecutivos. O primeiro e o terceiro ciclo foi utilizado como grupo controle e entre eles o grupo tratado com EPE no segundo ciclo. Em todos os ciclos, a ultrassonografia transretal dos ovários foi realizada diariamente após aplicação de prostaglandina e monitorando os dois maiores folículos. Durante os três ciclos as éguas foram inseminadas com sêmen a fresco ou refrigerado do mesmo garanhão e receberam uma aplicação de acetato de deslorelina após a detecção de pelo menos um folículo de 35 a 40 mm de diâmetro. A recuperação embrionária foi realizada por lavado uterino 8 dias pós ovulação seguidas da administração de prostaglandina. No ciclo tratado, injeções de EPE (7mg/IM/duas vezes ao dia) se iniciaram no dia 8 após a ovulação até que um folículo pré-ovulatório fosse observado. A porcentagem de éguas com mais de uma ovulação foi comparada pelo teste de Fisher e a média do número de ovulações e embriões, assim como o diâmetro folicular, entre os ciclos foram comparados usando teste de Student’s. A porcentagem de éguas com mais de uma ovulação e o número de ovulações foram maiores (p<0,05) no ciclo tratado com EPE (65% das éguas e 1,8 ovulações) do que o grupo controle antes (5% e 1,0) e depois do tratamento (5% e 1,0). O número de embriões recuperados por ciclo também foi maior (p<0,05) no grupo tratado com EPE (1,0/ciclo) comparado com os ciclos controle (0,42/ciclo). Entretanto a taxa de embrião recuperado por ovulação foi similar (p>0,05) entre os grupos controles (0,4 embriões/ovulação) e o ciclo
tratado (0,6 embriões/ovulação). O tratamento com EPE possibilitou a recuperação de embriões com estágio de desenvolvimento mais compatíveis ao estágio embrionário. A taxa de prenhez dos embriões transferidos foi similar entre os embriões recuperados no ciclo tratado (14/20-70%) e nos ciclos controle (9/17-55%). Baseado nos resultados do presente experimento, concluímos que o tratamento com EPE foi capaz de aumentar a eficiência reprodutiva de éguas idosas doadoras de embrião, recuperando ao menos um embrião por ciclo. O aumento nas taxas de recuperação embrionária nos ciclo tratados com EPE aparentam estar mais relacionados ao número de ovulações por ciclo do que uma melhora no oócito ou maturação folicular.
Palavras-chave: égua, idade, ovulações múltiplas, extrato de pituitária eqüino, transferência de embriões
ABSTRACT
BONIN, B.F., Effect of equine pituitary treatment on ovarian response and
reproductive efficiency of old mares in a embryo transfer program.
Botucatu, 2009.
Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista.
The present study aimed to evaluate the effect of the use of low doses of equine pituitary extract (EPE) on follicular growth, ovulation rate and embryo recovery rates in old mares. Embryo donors (n=20) of Quarter Horse breed from a commercial embryo center aging 15 to 20 years old , were used during 3 consecutive cycles. The first and third cycles were use as control being the EPE treatment performed on the second cycle. In all cycles transrectal ultrasonography of the uterus and ovaries was performed daily after PG injection to follow the development of the two largest follicles. During the 3 estrus mares were inseminated with cooled or fresh semen from the same stallion and received an injection of deslorelin (1 mg i.m.) upon detection of at least one follicle of 35 to 40 mm in diameter. The embryo flushing’s were performed on day 8 post-ovulation and were always followed by administration of PG. On the treated cycle, EPE injections (7mg twice daily i.m.) were started on day 8 after ovulation until a pre-ovulatory follicle was observed. The percentage of mares with more than one ovulation was compared by means using Fischer’s test and the mean number of ovulations and embryos, as well as follicular diameters, between cycles were compared using Student’s t test. The percentage of mares with more than one ovulation and number of ovulations were higher (p<0.05) in the EPE-treated cycle (65% of mares and 1.8 ovulations) than in the control cycle before (5% and 1.0) and after treatment (5% and 1.0). Also the mean number of embryos recovered per cycle were higher (p<0.05) on EPE treated cycle (1.0 /cycle) than in no treated cycles (0.42/cycle). However the embryo rate per ovulation was similar (p>0.05) between no treated cycles (0.4 embryo/ovulation) and treated cycle (0.6 embryo/ovulation). The treatment with EPE allowed the recovery of embryos in
stage of development more compatible with the embryonic age. The pregnancy rates of the transferred embryos was also similar between embryos recovered on treated (14/20-70%) an non treated cycles (9/17 -55%). Based on the results of the present experiment we can concluded that EPE treatment was able to increase the reproductive efficiency of old embryo donor mares, providing the recovery of at least one embryo on average per cycle. The improvement on embryo recovery rates on EPE treated cycle seems to be more related with the increase in the number of ovulations per cycle than with improvement on oocyte or follicle maturation.
Key words: mare, age, multiple ovulations, equine pituitary extract, embryo transfer.
1. INTRODUÇÃO
Fêmeas mamíferas apresentam um declínio gradativo na capacidade reprodutiva com o avançar da idade. Diferente de outros animais domésticos, as éguas com o avançar da idade permanecem como parte da população de reprodutoras ativas nos haras.
O declínio da fertilidade relacionado à idade em fêmeas tem pelo menos dois componentes básicos: a diminuição da taxa de concepção/prenhez por ciclo e um aumento das taxas de morte embrionária e abortamento nestes animais.
As éguas são mais valiosas com sua progênie comprovada ou por seu maior tempo destinado a vitórias em competições, isso geralmente ocorre quando a égua possui aproximadamente 15 anos de idade, coincidindo com a queda em seu índice de fertilidade. Havendo assim um grande interesse dos criadores de cavalo em manter estas reprodutoras de idade superior aos 15 anos na reprodução, justificado nos valores de venda de seus produtos.
Visando um maior aproveitamento e intensificação do ritmo do melhoramento genético e da eficiência reprodutiva, se faz necessário à utilização de biotecnologias reprodutivas, desta forma a transferência de embriões busca suprir a demanda existente em relação a produtos oriundo de éguas mais velhas com alto potencial genético.
Um dos problemas que interfere na eficiência reprodutiva de programas de transferência diz respeito ao elevado percentual de éguas idosas existentes nestes programas, pois sabidamente estas éguas têm uma eficiência reprodutiva mais baixa do que éguas jovens.
As éguas idosas ainda podem apresentar uma maior porcentagem de deformidades anatômicas, prejudiciais para reprodução como má coaptação e conformação de vulva. Além de serem mais susceptíveis a endometrite pós-cobertura, pela redução das contrações miometriais, sistema linfático deficiente, útero mais penduloso e a incompetência de cérvix.
A fêmea eqüina por natureza é monovular, o que significa dizer que a cada ciclo estral, geralmente, uma única ovulação irá ocorrer. A possibilidade de se incrementar o número de ovulações no ciclo estral da égua traz consigo
potenciais benefícios, como o aumento no número de oócitos disponíveis para aplicação de diferentes técnicas de reprodução assistida e aumento no número de embriões recuperados em uma única colheita, com conseqüente redução dos custos do programa de transferência de embriões.
A ocorrência de ovulações duplas espontâneas em éguas é um fator que incrementa a recuperação de embriões. Assim sendo, alguns grupos de pesquisa têm se dedicado ao estudo dos fatores responsáveis pela baixa recuperação embrionária em éguas superovuladas e ao desenvolvimento de protocolos que driblem esses fatores, que produzam menos efeitos adversos e promovam estimulação moderada e não excessiva dos ovários.
Farinasso (2004) utilizou doses de EPE mais baixas do que as tradicionalmente utilizadas para superovulação e obteve aumento no número médio de ovulações, provocado pela maior incidência de ovulações duplas e triplas e de embriões recuperados em éguas. Por outro lado Jacob, 2008 demonstraram que éguas idosas apresentam baixo níveis de hormônio luteinizante (LH) sérico no período periovulatório.
O referidos trabalhos nos motivaram a investigar a aplicabilidade de uma baixa dose de EPE para incrementar o número de ovulações e embriões recuperados em éguas, partindo da hipótese de que a aplicação exógena de EPE poderia atuar beneficamente aumentando o número de ovulações por ciclo bem melhorando a maturação folicular e ou oocitária por levar a um aumento dos níveis séricos de LH.
2. REVISÃO DE LITERATURA
Na industria eqüina em geral e entre os criadores principalmente, existe um mercado interessado em aumentar a eficiência reprodutiva de seus animais mais valiosos, as fêmeas eqüinas obtêm seu maior valor econômico quando sua progênie se destaca. Isto ocorre na égua quando passado sua vida média reprodutiva, coincidindo com a diminuição dos índices de fertilidade, a partir de 15 – 17 anos de idade (LOSINNO et. al, 2000).
Fonte : LOSINNO,2006
Figura 1 – Porcentagem de éguas em atividade reprodutiva natural de acordo
com idade, adaptado por BAKER, 1993.
A diminuição da eficiência reprodutiva com o avançar da idade fica evidente quando avaliadas as taxas de nascimentos com idade materna após 14 – 16 anos e aumento da morte embrionária precoce em éguas idosas (BALL et al., 2000, BAKER, 1993).
As reprodutoras mais idosas (acima 16 anos), representam de 10 – 25% das éguas que estão em um programa de reprodução (BAKER, 1993). É grande a diferença da eficiência reprodutiva entre éguas idosas e jovens, quanto a prenhez/ciclo (32% e 65 % respectivamente), nascimentos (54% e
82%, respectivamente) e perda embrionária (29% e 7% respectivamente) (VANDERWALL, 1989).
Fonte: LOSINNO,2006
Figura 2 – Taxa de parição em éguas de acordo com idade, adaptado por
BAKER, 1993.
Corroborando com estes trabalhos, em um experimento com éguas pônei, cobertas com o mesmo garanhão, éguas jovens (5 – 7 anos) e idosas (> 15 anos), obtiveram respectivamente, 100% de prenhez no dia 12 vs 32%, a morte embrionária no d50 foi de 62% nas éguas idosas contra 11 % nas jovens (CARNEVALE & GUINTER, 1992).
Esta diminuição da eficiência reprodutiva, demonstrada por menores índices de prenhez e menores taxas de nascimentos, pode estar relacionada, como em outros mamíferos a disfunções neuro-endócrinas, perda gestacional ou uma combinação de todas elas. (BALL et al., 2000).
2.1. Efeito da senilidade no ciclo estral
A divergência em trabalhos é muito grande relacionado à idade, onde cada pesquisador seleciona e classifica as éguas nas faixas etárias como jovens, intermediárias e idosas, dificultando a comparação entre os grupos.
Conforme publicado pelos seguintes autores: Carnevale et. al, (1993): 5-7 anos nas jovens, 15-19 anos idade intermediária e > 20 anos nas idosas; Vanderwall et. al,(1993) : 16 – 20 anos nas éguas idosas; Carnevale & Ginther (1995): 5 – 7 anos nas jovens e > 15 anos nas idosas; Fleury et al (1989) : jovens < 3 anos, intermediárias de 3 – 18 anos e idosas > 18 anos; Vogelsang & Vogelsang (1989): jovens de 2 – 8 anos, intermediárias de 9 – 17 anos e idosas de 18 a 28 anos; Alonso et. al.(2005) : jovens de 2 – 17 anos e idosas de 18 - 26 anos; Losinno (2006) :jovens de 3 - 8 anos e idosas >15 anos e Jacob (2008) : jovens de 4 a 6 anos, intermediária de 10 a 14 anos e idosas >18 anos; Rambags et. al. (2008) jovens < 12 anos e idosas > 15 anos.
Originalmente, as éguas têm aproximadamente 40.000 folículos primordiais e ciclam continuamente por 25 anos. Presumivelmente o pool de folículos primordiais é finito principalmente, por não ter sido citado, até o presente momento, a ocorrência de mitoses em oogônias de potras ou éguas (GINTER, 1993). A égua é poliéstrica estacional, com ciclos reprodutivos regulares durante o período de maior intensidade de luz e intervalos transicionais no início e fim do período ovulatório da estação (CARNEVALE, 2008).
O efeito da idade sobre a atividade ovariana tem sido caracterizado também pelo decréscimo do volume ovariano, pela redução do número de folículos antrais e pela menor vascularização do estroma intra-ovariano em mulheres idosas (KUPESIC et al., 2003). A disfunção ovariana também tem sido responsabilizada como causa do decréscimo da eficiência reprodutiva em éguas idosas (WESSON & GUINTER, 1981).
Com o avançar da idade mudanças no ciclo estral ocorrem refletindo alterações na função ovariana. Características comparadas no ciclo de éguas de meia idade (15 -19 anos) e éguas jovens (5 – 7 anos) mostraram que a fase luteal não diferiu , porém houve redução de 15 % da fase folicular , 9,4 dias das éguas jovens contra 8,0 dias das éguas de meia idade e as éguas de meia idade ovularam com folículos menores (CARNEVALE, 2008).
Diferenças significativas não foram encontradas na duração do ciclo estral entre éguas velhas e jovens da primeira para segunda ovulação (VANDERWALL et al,.1993). Diferentemente Carnevale et al., (1993)
encontraram intervalos de 23,9 ± 0,6, 23,0 ± 0,8 e 26,5 ± 0,7 dias para éguas jovens (5 - 7 anos), com idade intermediária (15-19 anos) e idosas (>20 anos) respectivamente.
Em outro estudo Jacob (2008) relatou que a duração do período interovulatório para as éguas jovens, de idade intermediária e idosas foram, respectivamente 22,6 ± 0,48, 22,4 ± 0,38 e 23,9 ± 0,55 dias (p= 0,0567). A taxa de crescimento (mm/dia) nos 4 dias antes da ovulação nas éguas jovens, de meia idade e idosas foi de 3,0 ± ,18; 2,5 ± 0,13 e 2,1 ± 0,32 respectivamente.
Um prolongado período interovulatório deveu-se ao prolongamento da fase folicular e conseqüentemente ao prolongado intervalo da indução da luteólise até a ovulação, foi citado por Vanderwall et al,. (1993) em éguas velhas (16 a 20 anos), quando comparado ao das éguas entre 10 e 11 anos. Entretanto como todas as éguas foram cobertas, os autores sugeriram que o prolongado intervalo entre ovulações pode ter se devido à não detecção de perda embrionária precoce nos animais idosos.
Em mulheres, observa-se que nos anos que antecedem o período de transição para a menopausa, ocorrem ovulações regulares, enquanto o ciclo menstrual é progressivamente encurtado. Fenômeno este que se deve ao encurtamento da fase folicular em mulheres idosas (KLEIN et al., 2002).
Éguas com mais de 20 anos possuem significantemente um maior intervalo interovulatório, com fase luteal similar, mas com longa fase folicular comparada ás éguas jovens. Fato associado com atraso de 3 dias para na emergência do folículo dominante e o crescimento mais lento do folículo ovulatório (CARNEVALE et al.,1993).
2.2. Alterações hormonais e da dinâmica ovariana relacionadas à senilidade
Na égua, a idade pode também afetar os níveis dos hormônios reprodutivos (CARNEVALE et al., 1993), embora em bovinos os níveis de gonadotrofinas não tenham sido afetados pela idade das vacas (MALHI et al., 2005).
O efeito da idade sobre a concentração plasmática de progesterona não foi observada durante os dois períodos ovulatórios em éguas (VANDERWALL et al., 1993). Diferentemente Carnevale et al., (1993) observaram maiores concentrações de progesterona em éguas idosas quando comparadas a éguas com idade intermediária.
Carnevale et al (1993) demonstraram o efeito da idade sobre a função do corpo lúteo, sendo que o grupo de éguas velhas apresentou concentração de progesterona mais elevada, após a segunda ovulação, do que o grupo de meia idade, embora o mesmo não tenha sido observado na primeira ovulação.
As concentrações sistêmicas do hormônio folículo estimulante (FSH) e a atividade folicular durante a fase luteal são maiores em éguas de meia-idade (de 15 a 19 anos), quando comparadas às de éguas idosas (> 20 anos) ou jovens (de 5 a 7 anos) (CARNEVALE et al., 1993).
No trabalho de Jacob (2008) não foi observado efeito de idade sobre as concentrações de FSH, progesterona e estradiol séricos, em éguas pônei com meia-idade ou idosas.
Resultados observados por Carnevale et al.(1993), revelaram que a concentração de LH não diferiu entre as fêmeas do grupo 1 (5 a 7 anos), e grupo 2 (15 a 19 anos), embora o grupo 3 (20 anos ou mais) apresentou uma baixa concentração de LH durante um segundo período ovulatório, porem, a concentração de LH foi suficiente para induzir a ovulação.
Um efeito significativo de grupo foi observado sobre o LH ao redor da ovulação e no período periovulatório (Figura 3). Assim, a concentração de LH em éguas jovens ao redor da ovulação foi mais elevada do que em éguas de idade intermediária e nas idosas. Foram observados menores níveis séricos de LH ao redor da ovulação ou seja 4 dias antes do momento ovulatório, em éguas pôneis com mais de 18 anos (JACOB,2008).
Elevadas concentrações de FSH, sem aumento na concentração de LH, aparentam ser os sinais iniciais da idade alterando a reprodução em éguas (SOULES et al, 2000). Estas alterações poderiam estimular uma maior proporção de folículos primordiais a entrar neste grande pool de folículos e acelerar a depressão da reserva de folículos primordiais (RICHARDSON et al.,1987).
O primeiro sinal da idade afetando a reprodução é o encurtamento do ciclo estral com elevadas concentrações de hormônio folículo estimulante (FSH), seguido de ciclos longos com intermitentes ovulações e elevadas concentrações de FSH e LH, se cessando com a falha no crescimento folicular com gonadotrofinas elevadas aparentemente pela falência dos ovários (CARNEVALE et al.,2008). LH Dias da Ovulação -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 LH (n g/ m l) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Jovem Média Velha
FSH
Dias da ovulação -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 FS H (ng /m l) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Fonte : JACOB, 2008Segundo Carnevale et al (1993) a redução da concentração de LH relatada em éguas velhas pode ter sido devido ao prolongamento da fase
folicular. Diferentemente, Jacob, 2008, não encontrou aumento da fase folicular, nem houve diferenças entre as faixas etárias quanto à fase luteal.
Jacob (2008) verificou ainda um efeito de idade sobre a taxa de crescimento folicular envolvendo o folículo dominante. Em éguas velhas, a taxa de crescimento folicular não diferiu das éguas de meia idade, porém foi menor (P<0,05) que nas éguas jovens, mesmo não havendo diferenças entre ciclos nem no diâmetro do maior folículo.
Nas éguas velhas os folículos subordinados ao redor da ovulação foram menores do que as éguas de meia-idade e jovens (JACOB, 2008). Muitas éguas idosas (> 20 anos) eram reprodutivamente ativas, porém, os ovários de poucas éguas poderiam ser classificados como senescentes (Wesson & Ginther, 1981).
Estudando as diferentes classes foliculares, Carnevale et. al, (1993), encontraram efeito de idade significativo sobre o número de folículos de 16 a 20 mm de diâmetro, bem como interação significativa para o diâmetro do maior folículo e o número de folículos de 11 a 15 mm, sugerindo que a maior atividade folicular ocorreu no final fase lútea para o grupo de (15 a 19 anos) em relação aos grupos de (5 a 7 anos) e grupo (20 anos ou mais), associada aos níveis de FSH durante o meio da fase luteal.
Em outro estudo não foram observadas diferenças do número de folículos ovarianos de 11 a 20 mm de diâmetro, quando foram comparadas das éguas velhas e éguas jovens, durante o período periovulatório na primeira e segunda ovulação (VANDERWALL et al., 1993).
Este autor também observou crescimento folicular mais rápido do folículo dominante em éguas jovens (5 e 6 anos), ao redor da ovulação de quatro dias antes há quatro dias após sua ocorrência, o número de folículos para as classes foliculares de 5,1 a 10, 10,1 a 15, 15,1 a 20 mm foi menor nas éguas velhas. Embora observadas algumas diferenças entre os grupos etários neste estudo, demonstrou-se que os hormônios reprodutivos e atividade folicular são mantidos em éguas velhas (JACOB, 2008).
A literatura tem registrado falha de ovulação associada à idade. Em dois experimentos foram documentadas que quatro éguas idosas de um grupo não ovularam durante um período de 60 e 90 dias na estação fisiológica.
Entretanto, essas éguas tinham 29, 30, 30 e 33 anos de idade enquanto tais falhas não foram observados no grupo de éguas jovens (VANDEWALL et al., 1993).
2.3. Alterações da genitália externa e interna relacionadas à idade
Outros estudos relacionando o efeito da idade sobre a capacidade reprodutiva de fêmeas têm focalizado anormalidades morfológicas do trato genital. Dentro deste contexto, tem-se concluído que anormalidades estruturais são mais comuns em animais idosos. Éguas velhas podem ser afetadas por problemas reprodutivos como outros que não estão relacionados ao eixo hipotalâmico hipofisário gonadal como má conformação na genitália externa, patologias uterinas e tubáricas. Relata-se também que a endometrite é mais freqüente em éguas velhas do que nas éguas jovens (CARNEVALE, 2008).
Brinsko et al., (1996), fizeram avaliações histopatológicas na ampola e ístimo da tuba uterina de éguas não encontrando diferenças entre as faixas etárias (velhas e jovens) nem associação entre idade e incidência de salpingite.
Clinicamente anormalidades no endométrio são consideradas como importantes fatores que resultam em baixa fertilidade em éguas velhas. Inúmeros estudos caracterizaram mudanças degenerativas no endométrio com o aumento da idade da égua e como conseqüência, declínio da fertilidade. Estas mudanças incluem endometrose, endometrite e alterações vasculares (BALL, 2000).
O sistema imune da égua sofre um declínio na sua eficiência com avançar da idade, com redução da habilidade do sistema de fornecer fagócitos, imunoglobulinas e componentes do sistema complemento (MELO et al., 2008).
Éguas com idade avançada e susceptíveis a endometrite demonstraram menor capacidade de limpeza uterina, acumulando fluido uterino após contato com o espermatozóide ou inoculação bacteriana durante o estro, sendo o principal fator relacionado à instalação da inflamação uterina (LEBLANC, 1997). O fluido pode estar presente devido a menor limpeza uterina seja
através do cérvix, ou devido à atividade diminuída dos vasos linfáticos, em função de distúrbio no mecanismo de contração uterina (LEBLANC, 1994).
A razão da menor limpeza uterina não está bem estabelecida, mas anormalidade miometrial, exaustão do músculo liso uterino, sinais hormonais inapropriados controlando as contrações uterinas e conformação perineal anormal tem sido implicada como fatores etiológicos (VANDERWALL & WOODS, 2003).
Alterações vasculares degenerativas na parede uterina de éguas idosas também têm sido descritas como fatores relacionados à deficiência do mecanismo de defesa uterino, porém não está determinado se essas alterações podem afetar o suprimento sanguíneo miometrial. A posição do útero mais voltado para o abdômen em éguas idosas pode também alterar e prejudicar a eficiência da limpeza uterina (TROEDSSON, 1999).
As éguas mais velhas possuem uma maior incidência de degeneração e alterações inflamatórias crônicas no endométrio. Contudo, quando morfologicamente normais embriões em estágio de blastocisto transferidos nos úteros de receptoras jovens e idosas não obtiveram diferenças estatísticas de prenhez (55% vs 45% respectivamente) no dia 12 da gestação. O impacto das alterações de endométrio, seria em períodos mais avançados da gestação destas éguas com a maior taxa de morte embrionária nas receptoras mais velhas (BALL, 2000).
2.4. Senilidade e qualidade de oócitos e embriões
O declínio da fertilidade em éguas velhas está bem documentado nestes últimos anos. Para as éguas jovens e idosas respectivamente, a concepção por ciclo foi de 57% vs 31% e taxa de nascimento 82% vs 48% segundo Madill, 2002. Outros trabalhos relacionando idade com a fertilidade se preocuparam em estudar oócitos de éguas jovens (3-8 anos) e éguas idosas (> 15anos) de Aguilar et al.(2002) e Losinno, (2006). A queda na eficiência reprodutiva de éguas idosas (14 -16 anos) e os efeitos da idade da doadora sobre a taxa de recuperação embrionária em eqüinos (grupo de maior idade >
16 anos) foram também relatados por Ball et. al, (2000) e Duarte & Vieira, (2005).
O decréscimo da eficiência reprodutiva foi demonstrado por baixas prenhezes e menor produção de potros em éguas de idade superior a 15 anos, e como em outras espécies existe uma relação com a falha na ovulação, pobre qualidade do oócito e morte embrionária (LOSINNO, 2006).
As causas deste declínio em éguas idosas (acima de 20 anos), aparentam estar relacionados com a prolongada fase folicular, ovulação irregular, menor número de folículos, menor taxa de crescimento do folículo ovulatório e inatividade folicular que podem finalmente levar a alterações na maturação do ovócito (CARNEVALE et al., 1993).
A qualidade do oócito é o fator primário que afeta a performance reprodutiva em éguas e mulheres mais velhas, as causas e o momento que isto ocorre não estão bem determinadas (SAUER et al., 1994, CARNEVALLE et al, 2008).
A menor taxa de fertilidade em éguas idosas pode resultar da fertilização de oócitos que não sofreram maturação meiótica adequada ou porque os oócitos de éguas idosas podem ter maior prevalência de complementos cromossomais anormais (BRINSKO et al., 1994).
A deterioração de oócitos associados com aumento da idade foi descrita em muitas espécies. Examinando in vitro a maturação oocitária de éguas jovens e idosas, foi observado que oócitos de éguas idosas possuem mais falhas na maturação para metáfase II comparado aos das éguas jovens (BRINSKO et al., 1995).
Utilizando modelos in vivo Carnevalle & Guinther,(1995), demonstraram pela primeira vez na égua a relação entre idade cronológica e danos a oócitos e embriões, ou seja próximo da ovulação e estágios iniciais de desenvolvimento.
Estudos em éguas sugerem que os problemas relacionados com a reprodução de éguas idosas ocorram no período de pré-blastocisto. Comparando taxa de fertilização entre éguas jovens e idosas não revelou diferenças significativas, porém mostrando tendência (p<0,1) das éguas jovens
com uma taxa maior de fertilização de 96% contra 81% das éguas idosas. As taxas de recuperação embrionária no dia 4 pós-ovulação foram maiores no grupo de éguas jovens contra o grupo de éguas idosas 92% contra 65%, respectivamente. Embriões que foram recuperados e transferidos para receptoras jovens os índices de prenhez foi de 84% para embriões das éguas jovens e de 25% para os embriões das éguas idosas, tendo ocorrido uma perda embrionária de 9 % nos embriões provenientes de éguas jovens contra 62% para os de éguas idosas (BALL et al, 1989). Demonstrando que infertilidade relacionada à idade nas éguas está alterações estruturais ou funcionais do período embrionário inicial, intra-oviduto sendo menos importante ambiente tubárico .
Carnevale et al.,(1993), descreveram uma taxa e fertilização significativamente maior em éguas jovens versus éguas idosas no dia 1,5 pós-ovulação (88% em éguas jovens contra 45% em éguas idosas). Estes dados se correlacionam com as menores taxas de recuperação embrionária em éguas doadoras jovens versus idosas (LOSINNO & ALVARENGA 2006).
Carnevale & Ginther (1995) reportando os resultados da transferência intrafalopiana de gametas (GIFT), com oócitos coletados de folículos pré-ovulatórios, de éguas velhas (> 20 anos) e jovens (6 – 10 anos) e somente os oócitos maduros transferidos para receptoras jovens inseminadas, observaram menores taxas de prenhez quando transferiram os oócitos de éguas velhas obtiveram 31% versus 92%. Confirmando assim o declínio da fertilidade com a idade sendo o oócito um dos fatores primários de redução da fertilidade.
Existem diferenças significativas quanto ao desenvolvimento embrionário entre os grupos etários e anomalias morfológicas observadas nos oócitos de éguas idosas. Ainda os oócitos das éguas mais velhas possuem muitas anormalidades morfológicas como: vesícula ocupando > 50% do ooplasma, diferentes formas, partes do ooplasma sem organelas e outras alterações (CARNEVALE et al., 1999).
As causas dos defeitos morfológicos de oócitos de fêmeas mais velhas não estão bem determinadas. Supõe-se que mutações no ácido desoxirribonucléico (DNA) e a produção de espécies radioativas de oxigênio
(ROS), afetam diretamente os oócitos, assim como os danos mitocôndriais também foram descritos (RAMBAGS et al.,2005).
Rambags et al, (2008), estudando através de PCR o número de cópias de acido desoxirribonucléico (DNA) de oócitos e embriões provenientes de éguas jovens (< 12 anos) e idosas (>15 anos), observaram que os embriões de éguas jovens possuíam mais mitocôndrias do que seus oócitos, já nas éguas idosas a quantidade de mitocôndrias não aumentou nos embriões quando comparado aos seus oócitos, indicando um atraso na replicação mitocondrial.
Segundo Losinno (2006) as éguas velhas ovulam oócitos com alterações morfológicas com mais freqüência com danos estruturais na cromatina nuclear, diminuindo assim o índice de fertilidade desta categoria. Este autor comparando oócitos de éguas velhas e jovens, obtidos após recente ovulação, obteve uma maior proporção de oócitos com citoplasma fragmentado tendo sido estes valores de 18,5% em éguas velhas e 5,6% em éguas jovens. Comparando o estagio de maturação nuclear (metáfase x não determinado) obteve em oócitos de éguas jovens 71,4% metáfase (I ou II) e 28,6% não determinado e no grupo de éguas velhas, 46,6% metáfase (I ou II) e 53,4% não determinado.
Os achados de Losinno (2006) são concordantes com os dados de fertilidade em campo, monta natural, inseminação artificial ou transferência de embrião, onde se encontra a fertilidade média por ciclo nestas categorias de 70 % para éguas jovens e 40% nas éguas velhas (WOODS, 1989).
Segundo Ball, (2000) após transferência do embrião, quando este se apresenta morfologicamente normal, a taxa de prenhez na receptora não diferiu estatisticamente (55% versus 45% dia 12) entre éguas receptoras jovens e velhas, respectivamente nos dias 12 e 28 de gestação, o impacto das alterações uterinas seriam em períodos mais longos da gestação.
Vogelsang & Vogelsang (1989), observaram que de 624 tentativas de coletas foram recuperados 271 embriões, gerando 159 prenhezes. Quando subdivididos em faixas etárias no grupo das éguas de idade de 2-8 anos as taxas foram 61% recuperação, 70 % de prenhez e 14 % morte embrionária precoce. Por outro lado no grupo das éguas de 9-17 anos foi obtido 51% recuperação embrionária, 52% de prenhez e 24 % de morte embrionária. No
grupo das éguas velhas de 18-28 anos foram obtidos 30% recuperação embrionária, 56% prenhez e 30 % de morte embrionária.
Duarte & Vieira (2005), também observaram que a idade da doadora alterou as taxas de recuperação embrionária em eqüinos quando divididos em grupos de diferentes idades, sendo 2-4 anos, 4-17 anos e >17 anos, as taxas de recuperação obtidas foram, 81,1%, 73,2% e 53,3% respectivamente.
A literatura é contraditória quanto à possibilidade dos embriões coletados provenientes de éguas velhas (acima 18 anos) levarem uma gestação a termo. Onde alguns autores encontraram um índice de prenhez similar aos 15 e 50 dias (ALONSO et al., 2005). Hunt et al, (2005) observaram queda na eficiência reprodutiva de éguas idosas em programa de transferência de embriões (tabela 1).
Idade Taxa de Recuperação Taxa de Prenhez Eficiência
4-7 (n=30) 81,5% 64,3% 52,4%
8-14(n=113) 101,6% 65,4% 66,4%
15-19(n=59) 70,4% 59,1% 41,6%
>20(n=10) 46,2% 54,2% 25%
Adaptado de HUNT et al. 2005
Tabela 1 – Efeito da idade da égua doadora nas taxas de recuperação
embrionária*
Um estudo demonstrou que blastocistos provenientes de éguas idosas apresentavam menos células totais, menores escores de qualidade e tendiam a ter menor diâmetro. Nele foram sugeridos que os defeitos de desenvolvimento do embrião ou ambiente do oviduto podem explicar a falha no estabelecimento da gestação em éguas idosas e subférteis (CARNEVALE et al., 1993).
Embriões de éguas velhas possuem menos blastômeros e um escore de classificação mais pobre que os embriões de éguas jovens (BRINSKO et al., 1994).
É consenso que o envelhecimento reprodutivo associado à idade está relacionado a uma perda da viabilidade de oócitos e embriões. Em bovinos entre os sinais mais evidentes está no aumento da quantidade de ovócitos/embriões com anomalias cromossômicas, ativação partenogênica
espontânea, fragmentação citoplasmática associada a apoptose dos ovócitos, polispermia, desenvolvimento anormal dos embriões e aumento da morte embrionária precoce (ARMSTRONG, 2001).
Segundo Carnevale (2008) a idade associada às alterações de fertilidade e atividade cíclica na égua têm a provável causa a falha na atividade ovariana. O declínio da fertilidade está correlacionado com a redução da viabilidade do oócito podendo ser resultado de seu tempo em estágio meiótico nos ovários por décadas.
3. OBJETIVOS
O presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do tratamento com extrato de pituitária eqüina (EPE) na resposta ovariana e na eficiência reprodutiva de éguas idosas em programa de transferência de embriões.
4. MATERIAL E MÉTODO
4.1. Período e Local do Experimento
O presente trabalho foi realizado durante a estação reprodutiva 2006/2007 e 2007/2008, mais especificamente entre os meses de setembro a janeiro dos anos citados, nas dependências da Central de Reprodução de Eqüinos Guilherme Gregolin Services Center Inc., localizada no município de Tatuí, São Paulo.
4.2. Animais e Grupos Experimentais
Foram utilizadas 20 éguas doadoras de embrião da raça Quarto de Milha, com idade entre 15 e 20 anos (média de 16,9 anos) e pesando 450 a 550 Kg. Todas as éguas utilizadas estavam em plena atividade reprodutiva.
As éguas doadoras eram mantidas em piquetes de capim coast cross (Cynodon dactylon) e capim-transvala (Digitaria decumbens) com acesso a água e sal mineralizado à vontade e 2 kg de ração comercial peletizada própria para eqüinos duas vezes ao dia.
4.3. Delineamento Experimental
Após terem sido monitoradas e inseminadas durante o estro imediatamente anterior ao início do experimento, as éguas doadoras foram submetidas ao procedimento de colheita de embrião no oitavo dia pós-ovulação. Nesse mesmo dia, as mesmas recebiam, por via intramuscular, 7,5 mg de dinoprost-trometamina e eram incluídas no grupo experimental. Três ciclos estrais consecutivos foram monitorados em todas as éguas pertencentes ao grupo experimental, de modo que o primeiro e o terceiro ciclo estudado serviram de controle e no segundo ciclo foram realizados os tratamentos a base de extrato de pituitária eqüina (EPE). Dessa forma, cada animal utilizado foi o seu próprio controle. As colheitas de embrião eram sempre seguidas da administração de agente luteolítico.
4.3.1 Exames ultra-sonográficos
Nos três ciclos estudados, desde o dia 10 (dia 0 = ovulação) dois dias após a colheita do embrião (dia 8), até a ovulação seguinte, as éguas doadoras tiveram a atividade ovariana e condição uterina monitoradas diariamente por ultra-sonografia transretal com auxílio de um aparelho equipado com um transdutor linear de 6 a 8 MHz (Pie-Medical 485, Holanda). Os diâmetros dos maiores folículos foram determinados por meio da média aritmética das duas maiores distâncias transversais do antro folicular em uma única imagem congelada no monitor do aparelho de ultra-sonografia (GINTHER, 1995) em todos os grupos.
Os folículos foram mensurados (altura e largura) e posteriormente desenhados em ficha própria de acordo com suas posições nos ovários, sendo usado como referência a presença do corpo lúteo e outros folículos a fim de manter-se a identidade dos dois maiores folículos. Quando observados mais de um folículo dominante foi feita à média entre eles para comparações futuras. 4.3.2 Colheita de Sêmen, Inseminações e Indução das Ovulações
Sêmen proveniente de um único garanhão de fertilidade comprovada foi utilizado para as inseminações. Após a colheita, realizada com auxílio de uma égua em cio, por meio de vagina artificial própria para garanhões, o sêmen era filtrado para a remoção da fração gelatinosa. A concentração espermática era determinada com auxílio de uma câmara de Neubauer, a motilidade espermática avaliada em microscópio de luz e o sêmen diluído na concentração de 25 – 50 milhões de espermatozóides por mililitro (mL), em meio diluente à base de leite desnatado Botu-sêmen (Biotech Botucatu – Botucatu - SP)
Durante o estro, após a detecção de pelo menos um folículo com 35 mm de diâmetro, as éguas eram inseminadas com no mínimo 1.000 x 106 espermatozóides móveis. As inseminações foram repetidas a cada 48 horas, quando necessário, até que fosse detectada a ovulação. As ovulações foram induzidas por meio da administração de 1 mg de acetato de deslorelina
intramuscular, mediante a detecção de pelo menos um folículo ovariano com 35 a 40 mm de diâmetro. Vale ressaltar que os protocolos de inseminação artificial e indução das ovulações foram os mesmos para os ciclos controle e tratado.
4.3.3 Tratamentos
Passado o ciclo controle e finalizada a colheita e a avaliação do embrião no oitavo dia pós-ovulação, era iniciado o tratamento para indução de ovulações múltiplas a base de extrato de pituitária eqüina (EPE). Esse tratamento foi administrado do dia 8 até o dia anterior à indução das ovulações por meio da administração de 1mg de acetato de deslorelina.
Os animais pertencentes ao Grupo EPE (n=20) receberam 7,0 mg de extrato de pituitária eqüina por via intramuscular duas vezes (entre 7 e 8 horas da manhã e nova aplicação entre 5 e 6 horas da tarde) ao dia durante o período especificado. O extrato de pituitária utilizado no presente trabalho foi produzido no Laboratório de Reprodução Animal do Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, FMVZ, Unesp-Botucatu, SP, Brasil, conforme descrito por GUILLOU e COMBARNOUS (1983).
4.3.4 Colheita, Manipulação e Transferência dos Embriões
Os embriões foram recuperados no oitavo dia pós-ovulação por meio de lavagem uterina usando três litros de solução de Ringer com lactato, a 35 ºC, conforme descrito (ALVARENGA et. al., 1993). Após a identificação e classificação quanto ao grau de desenvolvimento do embrião, o mesmo era submetido à dez passagens de meio e mantido por menos de uma hora em meio de manutenção filtrado até o momento da transferência.
Os embriões foram transferidos através do método não-cirúrgico (transcervical) para receptoras ciclantes que haviam ovulado entre 5 e 8 dias antes da transferência. Resumidamente, os embriões eram acondicionados entre colunas de meio de manutenção e ar no interior de uma palheta de 0,25 ou 0,5 ml e colocadas no inovulador. O inovulador era recoberto então por
uma camisa sanitária plástica. Antes da transferência as receptoras tinham a cauda enfaixada, o conteúdo fecal retirado da ampola retal e as regiões perivulvar e perianal higienizadas. O inovulador contendo o embrião era conduzido através da cérvix da receptora, a camisa sanitária rompida e o embrião depositado lentamente no corpo do útero.
4.3.5 Diagnóstico de Gestação
As receptoras foram examinadas por meio de ultra-sonografia transretal, quatro a seis dias após a transferência do embrião para se determinar à presença ou não de vesícula embrionária.
4.4 Análise Estatística
Valores percentuais para variáveis qualitativas foram comparados pelo teste exato de Fischer. Foi considerada diferença significativa quando p<0,05. Variáveis quantitativas (número de ovulações e embriões por ciclo, duração da fase folicular e crescimento médio diário do folículo dominante) foram comparadas utilizando-se análise de variância (ANOVA) seguido quando necessário pelo teste Tukey a 5% de significância.
5. RESULTADOS
O percentual de éguas com múltiplas ovulações no ciclo pré-tratamento (G1), ciclo tratado com EPE (G2) e ciclo pós-pré-tratamento (G3) foi de 5% (1/20), 65% (13/20) e 5% (1/20), respectivamente (p<0,05).Em nenhum dos ciclos foi observado falha da ovulação ou mesmo desenvolvimento de folículos hemorrágicos. Nos ciclos com mais de uma ovulação as mesmas aconteceram em intervalo de tempo médio de 24 a 48 horas entre as ovulações.
O tratamento com EPE (G2) resultou em um maior número de ovulações e embriões por ciclo (p<0.05) em comparação aos ciclos controles no pré-tratamento (G1) e pós-tratamento (G3). Não foram contudo observadas diferenças significativas (p>0,05) no número de ovulações entre os grupos controle. Da mesma forma não foram encontradas diferenças significativas quando comparado o número de embriões recuperados por ovulação entre G1, G2 e G3 (p>0,05). O número de ovulações por égua foi significativamente superior nos ciclos tratados com EPE (G2) quando comparados aos obtidos nos grupos controle (G1 e G3). O tratamento com EPE também resultou em um maior número de embriões recuperados por égua por ciclo (p< 0,05) em comparação aos controles (G1 e G3). Os resultados estão sumarizados na tabela 2 e particularizados nas tabelas 3 e 4.
Tabela 2 : Número médio de ovulações por ciclo, número médio de embriões
por ciclo e número médio de embriões por ovulação.
Pré-Tratamento (G1) Tratamento (G2) Pós-Tratamento (G3) Ovulações/ciclo 1,05 ª 1,8 b 1,05 ª Embriões/ciclo 0,45 ª 1,0 b 0,4 ª Embrião/ovulação 0,4 ª 0,6 ª 0,4 ª
Tabela 3: Número de ovulações por égua no ciclo pré-tratamento, ciclo tratado
com EPE (7 mg b.i.d) e no ciclo pós-tratamento.
Animal Pré Tratamento Tratamento Pós Tratamento
01 1 1 1 02 1 2 1 03 1 3 1 04 1 1 1 05 1 3 1 06 1 2 1 07 1 1 1 08 1 2 1 09 1 2 1 10 1 2 2 11 1 2 1 12 1 2 1 13 1 1 1 14 1 2 1 15 1 3 1 16 2 1 1 17 1 2 1 18 1 1 1 19 1 1 1 20 1 2 1 1,05 ª 1,8 b 1,05 ª
Tabela 4: Número de embriões recuperados por égua no ciclo pré-tratamento
(G1), no ciclo tratado com EPE (7 mg b.i.d) e no ciclo pós-tratamento (G3).
Animal Pré-Tratamento Tratamento Pós-Tratamento
01 0 0 0 02 0 1 1 03 0 0 1 04 1 1 0 05 0 0 0 06 0 1 0 07 1 1 0 08 1 1 1 09 0 2 1 10 0 2 1 11 1 2 0 12 0 1 1 13 0 1 0 14 0 2 0 15 1 2 1 16 2 0 0 17 1 1 0 18 0 0 0 19 0 0 0 20 1 2 1 0,45 ª 1,0 b 0,4 ª
Os ciclos que não se obteve embrião recuperado ou lavado negativo foram de 60% (12/20), 30% (06/20) e 60% (12/20) nos grupos G1, G2 e G3 respectivamente, mostrando tendências de significância do grupo tratado com EPE em relação aos grupos controle (p=0,11). Quando agrupamos os grupos controle (G1 + G2) em comparação ao grupo tratado com EPE (G1) obtivemos uma diferença significativa de lavados negativos (p<0,05) dos grupos controle 60% (24/40) contra 30% (6/20) do grupo tratado.
Conforme mostra a tabela 5, o tratamento com baixa dose de EPE (G2) resultou em um encurtamento da fase folicular (diminuição do número de dias) da aplicação da prostaglandina (D8) até 1 dia antes da ovulação (p< 0,05) diferindo do ciclo controle pós-tratamento (G3). Mas não houve diferença significativa entre o grupo tratado (G2) e o grupo pré-tratamento (G1).
Tabela 5: Média em dias da duração da fase folicular da aplicação da
prostaglandina (D8) até a ovulação por égua nos grupos G1, G2 e G3.
Pré- Tratamento (G1) Tratamento (G2) Pós-Tratamento (G3)
10,2 ± 1,7 ab 9,4 ± 1,9 a 10,9 ± 1,4 b
Não foram observadas diferenças estatísticas (p>0,05) quanto ao crescimento folicular médio (mm) do folículo dominante do dia D10 até oum dia antes da ovulação nos diferentes grupos. Tendo sido de 19,7 ± 6,3 mm, 21,4 ± 5,4 mm e 22,9 ± 4,5 mm, os valores médios de crescimento para G1, G2 e G3. Da mesma forma não foram observadas diferenças significativas, havendo contudo tendência à significância (p=0,1) á ser maior a taxa de crescimento diário do folículo dominante no grupo tratado. Onde observamos uma taxa de crescimento médio diário de foi de 2,5 ± 0,7 mm, 2,8 ± 0,6 mm e 2,6 ± 0,4 mm no G1, G2 e G3 respectivamente. Em 40 % (8/20) dos ciclos tratados com EPE e 15 % (6/40) dos ciclos não tratados observou-se crescimento folicular médio diário a 3mm(p<0,05).
O tratamento com baixa dose de EPE resultou em um maior número de embriões (p<0.001) oito dias após a ovulação com grau de desenvolvimento condizente com idade gestacional em D8 (blastocistos ou blastocistos expandidos) ou mórulas e blastocistos iniciais em D6 nas ovulações assincrônicas nas éguas com múltiplas ovulações. Por outro lado não foram observadas diferenças significativas no grau de desenvolvimento dos embriões recuperados entre os grupos controle (Tabela 6).
Tabela 6: Condizência entre o estágio de desenvolvimento para cada
embrião recuperado e o dia da recuperação (D8 do ciclo), no G1, G2 e G3.
Grau de Desenvolvimento Pré-Tratamento (G1) Tratamento (G2) Pós-Tratamento (G3) Não Condizente 44,45%(4/9) ª 0%(0/20) b 75%(6/8) ª Condizente 55,55%(5/9) ª 100%(20/20) b 25%(2/8) ª
Conforme mostra a tabela 7, o tratamento com baixa dose de EPE (G2) não foram observadas uma maior taxa de prenhez (70 %), quando comparado aos grupos controle no pré-tratamento (G1) e pós-tratamento (G3), 55,5% e 50% respectivamente (p=0.07). Não houve diferenças significativas (p>0,05) do número de prenhezes obtidas pelos embriões recuperados do grupo tratado com EPE (G2) em comparação aos controles (G1 e G3).
Tabela 7: Taxa de prenhez obtida por embriões recuperados no G1, G2 e G3
Pré-Tratamento (G1) Tratamento (G2) Pós-Tratamento (G3)
Prenhez 55,5% (5/9) ª 70,0%(14/20) ª 50,0%(4/8) ª
Conforme mostra a tabela 8, no tratamento com EPE foram observadas diferenças significativas (p<0,01), para melhoria da taxa de prenhez por tentativa de transferência de embrião em comparação aos controles no pré-tratamento e pós-tratamento.
Pré-Tratamento (G1) Tratamento (G2) Pós-Tratamento (G3) Prenhez/Ciclo 25% (5/20) ª 70%(14/20) b 20%(4/20) ª
A eficiência do programa (taxa de recuperação embrionária x taxa de prenhez) entre ciclos tratados e ciclos não tratados foi de 21.8% ( 42% x 52%) para os grupos controle (G1 e G2) e de 70% (100% x 70%) para o grupo tratado (G2) com diferença significativa (p<0,05).
A taxa de morte embrionária precoce aos 50 dias nas éguas tratadas com EPE (G2) foi de 7,1% (01/14), não diferenciando ( P>0.05) dos grupos controle que foi de 20% (01/05) no G1 e 0% (0/04) no G3.
6. DISCUSSÃO
No presente trabalho o tratamento com EPE foi capaz de estimular com eficiência a atividade ovariana em éguas idosas cíclicas, onde o percentual de éguas com múltiplas ovulações no ciclo tratado com EPE (G2) foi de 65% (13/20) enquanto os grupos controles no pré e pós-tratamento foram de 5% (1/20) e 5% (1/20) respectivamente. Valores diferentes, mais altos, são relatados por autores como Douglas (1979) que relatam 75% de resposta nas éguas com tratamento superovulatório, Farinasso (2004) descreve uma porcentagem de 76,9% de múltiplas ovulações utilizando doses de 4 e 6 mg uma vez ao dia de EPE em éguas ciclantes e Carmo (2007) 84% de resposta e outro valor mais baixo como de 30,8% Rocha Filho (2004) estes trabalhos foram realizados com éguas jovens e férteis. Em nenhum dos ciclos dos grupos controle ou grupo tratado foi observado falha da ovulação ou mesmo desenvolvimento de folículos anovulatórios, o que seria esperado segundo alguns autores tanto para éguas superovuladas, (DIPPERT et. al, 1994; LAPIN & GINTHER, 1997) como em éguas idosas (NEWCOMBE et al.,1997; McCUE & SQUIRES, 2002).
No presente trabalho obtivemos em média 1,0 embrião por ciclo, média superior aos grupos controle que tiveram 0,45 e 0,4 embrião por ciclo. A média do grupo tratado foi muito próxima ao obtido no experimento desenvolvido por Carmo et. al, (2003) trabalhando com superovulação em éguas jovens, que obteve em média 1,1 embrião por ciclo , havendo contudo este autor utilizado uma dose mais alta de EPE (25 mg a cada 12 horas) que a do presente trabalho onde este autor obteve uma taxa de recuperação embrionária por ovulação de 30%, mais baixa que a do presente experimento. Outros trabalhos com múltiplas ovulações relatam a recuperação de aproximadamente 1 a 2 embriões por ciclo (DOUGLAS, 1979; WOODS & GUINTER, 1984; McCUE, 1996, MACHADO, 2003; FARINASSO, 2004). Considerando à média de recuperação embrionária do grupo controle (0,45 e 0,4) pode-se verificar que estas foram menores que as médias esperadas (0,6 embriões/ciclo) em programas de transferência de embriões segundo Alvarenga et. al, (2008) e de 0,7 reportada por Hunt et. al, (2005) em éguas de
15 – 19 anos e similares às reportadas por Vogelsang & Vogelsang, (1989) que obteve 51% de recuperação em éguas de 9-17 anos. Contudo superior as relatadas por Fleury et al, (1989), relatando uma taxa de 24,1 % em éguas com mais de 18 anos.
Analisando o número de embriões recuperados por ovulação obtivemos 0,4 (40%) nos grupos controle e 0,6 (60%) no grupo tratado, o que não diferiu significativamente . Estes dados são similares aos descritos por Woods & Ginther (1984) em éguas jovens tratadas com EPE para múltiplas ovulações onde relataram uma taxa de 0,6 e 0,7, no grupo tratado e no grupo controle, respectivamente. Mas superiores quando comparados aos trabalhos de Alvarenga, (2001); Scoggin et al, (2002); Carmo et. al., (2003); Machado et. al, (2003), onde obtiveram 49%, 43,2%, 30,2% e 26% respectivamente. Estando de acordo com o trabalho de Carmo et. al., (2005) que observou ser maior taxa de recuperação por ovulação em éguas com menos de 3 ovulações por ciclo.
Comparando os lavados que não recuperaram embriões, ao agruparmos os grupos controle (G1 + G3) em comparação ao grupo tratado com EPE (G2) obtivemos 60% (24/40) de lavados negativos nos grupos controle contra 30% (6/20) no grupo tratado diferindo estatisticamente. As éguas do grupo tratado tiveram uma taxa de lavados negativos similares ao reportado na literatura para éguas não superovuladas reprodutivamente jovens e normais. E inferiores aos dados apresentados por Farinasso (2004) no trabalho com múltiplas ovulações em éguas jovens que obteve 45% de lavados negativos e Machado et al (2003) 70% de lavados negativos. Mas superiores ao trabalho de Adans et al (1993) que obteve 24% de lavados negativos em éguas jovens.
Das reprodutoras analisadas no presente trabalho, quatro delas (número 01,05,18 e 19) não obtivemos nenhum embrião coletado, mesmo com o tratamento. Estas éguas também não foram responsivas as doses de 7 mg b.i.d de EPE, suas idades são de 15, 18, 19 e 19 anos. Sugerindo que outros fatores ligados à infertilidade como obstrução tubárica, conforme relatado por
Allen (2008), desta forma o transito dos gametas e /ou embriões estarão impossibilitados por um aspecto mecânico.
Os dados na literatura são variados quando avaliado o período em dias entre a aplicação de prostaglandina até a primeira ovulação. No presente trabalho o tempo decorrido entre a aplicação de prostaglandina e primeira ovulação observada foi de 9,4 dias para o grupo tratado com EPE, e de 10,2 e 10,9 dias nos grupos controle pré (G1) e pós-tratamento (G3) respectivamente. Farinasso (2004) observou intervalo de tempo inferior ou seja de 7,4 dias no tratamento com 4mg e 5,6 dias com 6mg, resultados semelhantes a Dippert et. al, (1994) que relataram 7,0 dias, trabalhos estes que selecionaram de acordo com a população de folículos ovarianos (menores que 25 mm), para as éguas jovens tratadas e um período de 8,3 dias de Alvarenga et. al, (2001). Entretanto outro trabalho relata um período mais longo de 10,2 dias de Rosas et al (1998). Em ciclos não estimulados exogenamente a maioria dos autores relata uma média de 9 dias entre aplicação de prostaglandina na fase intermediaria do diestro e ovulação, valor este que não difere dos obtidos no presente trabalho.
Analisando o crescimento folicular médio (mm) do folículo dominante do dia D10 até 1 dia antes ovulação nos diferentes grupos obtivemos 19,7 mm, 21,4 mm e 22,9 mm os valores médios de crescimento para G1, G2 e G3, não foram observadas diferenças significativas entre eles, quando observado dois ou mais folículos era feita à média entre eles.
Da mesma forma não foram observadas diferenças significativas, havendo contudo tendência à significância (p=0,1) nas médias de crescimento diário do folículo dominante nos diferentes grupos que foram de 2,5mm, 2,8 mm e 2,6 mm no G1, G2 e G3 respectivamente.. As taxas de crescimento folicular nos trabalhos com múltiplas ovulações mostraram-se dentro da faixa de variação também observadas por outros autores como: variações de 2,6 mm em média obtidos por CARMO, (2007) 2,1 mm em éguas Pôneis (PALMER, 1993) e 3,0 mm observados por Ginther (1986) em éguas não superovuladas e 2,25 mm/dia relatado por (GINTHER et al, 1992 e MACHADO, 2003) também em éguas não tratadas.
Quando analisado individualmente foi observado no grupo tratado com EPE um maior percentual de éguas com folículos com taxa de crescimento igual ou maior a 3,0 mm (40% x15%). Jacob, (2008) observou que nos 4 dias anteriores a ovulação a taxa de crescimento do folículo dominante das éguas jovens se aproximou de 3,0 mm por dia tendo sido superior as taxas de crescimento folicular observadas em éguas de meia idade (2.5 mm/dia) e idosas (2.1 mm/dia).
Observamos que o tratamento com baixa dose de EPE resultou em um maior número de embriões aos oito dias após a ovulação com grau de desenvolvimento compatível com idade gestacional em D8 (blastocistos ou blastocistos expandidos) ou mórulas e blastocistos iniciais em D6 nas ovulações assincrônicas nas éguas com múltiplas ovulações. Um atraso no desenvolvimento de até 36 horas é esperado nos embriões de éguas velhas em relação aos embriões de éguas jovens (CARNEVALE et al, 1993). Este atraso no desenvolvimento embrionário pode ser consequência de defeitos intrinsicos nos embriões, meio de desenvolvimeto pobre na tuba uterina e/ou útero e inseminação pós-ovulatória (GUINTER,1992). Brisnsko et al (1996) observaram um atraso no desenvolvimento embrionário após realização de fertilização in vitro em oócitos de eguas idosas, demostrando ser o fator qualidade do oócito implicado no retardo do embrião. Ball et. al, (1989) corroborando com esta linha de raciocinio observou que fatores inerentes a formacao o embrião são mais importantes que o ambiente tubarico no que diz respeito a perda embrionaria na fase tubarica.
Rambags et. al, (2008), observaram que os embriões de éguas jovens (<12 anos) possuíam mais mitocôndrias do que seus oócitos, já nas éguas idosas (>15 anos) a quantidade de mitocôndrias não aumentou nos embriões quando comparado aos seus oócitos, indicando um atraso na replicação mitocondrial. Observamos no presente trabalho que em 58.8% dos embriões recuperados nos grupos controle estavam com desenvolvimento não condizentes como D8, atrasados, ou seja eram mórulas ou blastocistos iniciais. Entretanto ao tratar estas éguas com EPE este atraso não foi verificado em
100% dos embriões, sugerindo que o EPE teve um efeito na maturação deste oócito e transporte mais rápido deste embrião ao útero.
A taxa de prenhez por ciclo dos embriões coletados foi de 25% (5/20) no G1, 70% (14/20) no grupo tratado com EPE (G2) e 20% (4/20) no G3. Se compararmos a taxa de prenhez por ciclo nas éguas idosas temos uma média de 32% de prenhez (Vanderwall,1989), um pouco acima do grupo controle mas muito inferior ao grupo tratado com EPE.
A taxa de prenhez por embrião transferido das éguas tratadas com EPE (G2) foi de 70 % (14/20), mostrou tendência (p=0.07) em ser superior nos ciclos tratados diferenciando do grupo controle que foi de 55,5% no G1 e 50% no G3. Autores demonstraram que a taxa de prenhez de embriões de éguas de 15 - 19 anos foi de 54,2 % citado por HUNT et al (2005), 52 % em éguas 9 - 17 anos e 56% em éguas de 18-28 anos citado por Vogelsang & Vogelsang (1989), 65% em éguas de 10 – 18 anos, citado por Carnevale et. al.,2000. Valores semelhantes foram encontrados no presente trabalho nos grupos controle G1 e G3 com idade de 15 -20 anos. Os embriões com estágio mais lento de desenvolvimento, menores que esperados e estágios iniciais de desenvolvimento no dia 7 ou 8 (D7 ou D8) resultam em taxas menores de prenhez após inovulação (CARNEVALE et al., 1993). Entretanto ao compararmos a taxa de prenhez por embrião do grupo tratado com EPE (G2) de 70% foi superior ou semelhante à literatura às taxas de prenhezes de embrião de doadoras jovens não tratadas, como 67,7 % em éguas de 2 – 9 anos (CARNEVALE et al, 2000), 65,4% nas éguas de 8 – 14 anos (HUNT et al, 2005) e com a taxa média de prenhez em programas de transferência de embrião de 60% (ALVARENGA et al,2008) e 70% (SQUIRES & SEIDEL, 1995).
A eficiência do programa, ou seja, a relação entre a taxa de prenhez e taxa de recuperação embrionária foi superior nas éguas tratadas com EPE (70%) quando comparadas as não tratadas (21.8 %), demonstrando que o uso do EPE em baixas doses beneficia altamente as éguas na faixa etária do presente experimento (15 a 20 anos).
No que diz respeito às taxas de perda embrionária precoce (até 50 dias) os resultados não diferiram entre os grupos. Reafirmando os achados de vários autores (FLEURY et al, 1989; ALONSO et al, 2005) os quais observaram taxas similares de perda embrionária entre éguas idosas e jovens após TE para o útero de receptoras reprodutivamente saudáveis. Contudo contradizem os resultados de Carnevale et al,(2000) que observaram uma taxa de perda embrionária de 20,5% em embriões de éguas idosas transferidos contra 13,3% em éguas jovens e Vogelsang & Vogelsang (1989), 24% em éguas de 9 - 17 anos e 14 % em éguas de 2 - 8 anos.
7. CONCLUSÕES
Os resultados obtidos no presente experimento permite concluir que a administração de Extrato de Pituitária Equina em éguas idosas doadoras de embriões:
1- Interferiu positivamente na dinâmica de crescimento do folículo dominante e codominante
2- Aumentou a incidência de multiplas ovulações
3- Incrementou a da taxa de recuperação embrionária por ciclo
3-Propiciou a recuperação de embriões em fase de desenvolvimento mais condizente com a idade do embrião no D8
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