UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENTO DE AQUICULTURA PÓS-GRADUAÇÃO EM AQUICULTURA
Indução à Triploidia em Crassostrea gigas
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Aquicultura do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal de Santa Catarina, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Aquicultura. Orientador: Cláudio Manoel Rodrigues de Melo
Emílio Mateus Costa Melo
Florianópolis/SC 2011
Indução à Triploidia em Crassostrea gigas
Por
EMÍLIO MATEUS COSTA MELO
Esta dissertação foi julgada adequada para a obtenção do título de
MESTRE EM AQUICULTURA
e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Aqüicultura.
_____________________________________ Prof. Evoy Zaniboni Filho, Dr.
Coordenador do Curso
Banca Examinadora:
__________________________________________ Dr. Cláudio Manoel Rodrigues de Melo – Orientador __________________________________________
Dra. Erica Pauls
__________________________________________ Dr. Evoy Zaniboni Filho
AGRADECIMENTOS
Inicialmente gostaria de agradecer a Deus por estar sempre presente na minha vida, me guiando, me protegendo e me abençoando com muitas alegrias.
Agradeço em especial a minha mãe, que desde cedo prezou pela família, a educação e o sucesso de seus filhos. Uma pessoa maravilhosa, cheia de amor e incentivo, mesmo nos momentos de dificuldades, uma guerreira que batalhou a vida toda para dar tudo de melhor aos seus entes mais queridos. A você minha mãe, muito obrigado por existir em minha vida.
As pessoas que me acompanharam nessa caminhada, aos colegas e amigos que proporcionaram muitos e muitos momentos de descontração e alegria.
Aos funcionários do Laboratório de Moluscos Marinhos (LMM), da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), por contribuírem de maneira efetiva nas várias etapas dos experimentos, fazendo com que o laboratório exerça sua principal função, a pesquisa.
Agradecimento especial aos técnicos do LMM Carlos Henrique de Araújo Miranda Gomes e Francisco Carlos da Silva por se envolverem no projeto, contribuindo de maneira decisiva para os resultados obtidos.
Ao meu orientador pela ajuda na elaboração e execução do projeto.
A Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação do Estado de Santa Catarina pelo apoio financeiro ao projeto e à CAPES pela bolsa concedida.
RESUMO
Três métodos de indução à triploidia (3N) foram testados em ostras diplóides (Crassostrea gigas), sendo dois químicos, Citocalasina-B (CB) e 6-dimetilaminopurina (6-DMAP) e um físico de temperatura. O objetivo foi avaliar uma tecnologia de indução à triploidia apropriada às características peculiares do Laboratório de Moluscos Marinhos da UFSC. Três experimentos foram realizados separadamente, a 25º C, e em todos foram obtidas larvas triplóides viáveis. No experimento-I avaliou a eficiência de indução à triploidia com a CB [0,5 mg L-1] e 6-DMAP [390 µmols L-1], sendo o tratamento com CB (57% 3N) estatisticamente mais eficiente que a 6-DMAP (22,32% 3N). No experimento-II, testou a eficiência de indução à triploidia com a CB [0,5 mg L-1] e 6-DMAP [450 µmols L-1], não havendo diferença entre os tratamentos (CB - 55% 3N e 6-DMAP - 56% 3N). No experimento-III a eficiência de indução à triploidia com CB [0,5 mg L-1] e com choque de temperatura (25º-36º C), sendo que os tratamentos não tiveram diferença significativa (CB - 57,31% 3N e Temperatura - 45,29% 3N). Em ambos os experimentos foi observada uma alta mortalidade nos tratamentos com os químicos, em especial a CB. A partir desses resultados, a substituição da CB por outros métodos de indução demonstrados é necessária, tendo em vista seu alto custo de aquisição, e ainda a alta toxicidade da substância, tanto ao meio ambiente quanto ao operador.
ABSTRACT
Indução à Triploidia em Crassostrea gigas (Thunberg, 1793)
Three methods of inducing triploidy (3N) were tested in diploid oysters (Crassostrea gigas), two chemical, Cytochalasin B (CB) and 6-dimetilaminopurina (6-DMAP) and a physical temperature. The goal was to evaluate a technology to triploidy induction appropriate to the peculiar characteristics of the Laboratory of Marine Molluscs. Three separate experiments were performed, at 25° C, and all viable triploid larvae were obtained. In the experiment I, assessed the efficiency of the induction of triploidy with CB [0,5 mg L-1] and 6-DMAP [390 µmols L-1], and the treatment with CB (57% 3N) was statistically more effective than 6-DMAP (22,32% 3N). In experiment II, we tested the efficiency of the induction of triploidy with CB [0,5 mg L-1] and 6-DMAP [450 µmols L-1], with no difference between treatments (CB - 55% and 6 - DMAP - 56% 3N). In experiment III, the efficiency of the induction of triploidy with CB [0,5 mg L-1] and shock temperature (25º-36º C), and the treatments had no significant difference (CB - 57,31% 3N and temperature - 45,29% 3N). In both experiments a high mortality was observed in treatments with chemicals, in particular the CB. From these results, the substitution of CB by other methods of induction shown is necessary in view of the high toxicity of the substance, both the environment and the operator, and also by its high cost.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Análise de Citometria de Fluxo de larvas com 48 horas de idade, resultantes do bloqueio do segundo corpúsculo polar, 26 minutos após a fertilização. O eixo X corresponde à florescência da célula núcleo e o eixo Y o número de células contadas... 19 Figura 2. Análise de Citometria de Fluxo de larvas com 48 horas de
idade, resultantes do bloqueio do segundo corpúsculo polar, 32 minutos após a fertilização. O eixo X corresponde à florescência da célula núcleo e o eixo Y o número de células contadas... 20 Figura 3. Análise de Citometria de Fluxo de larvas com 48 horas de
idade, resultantes do bloqueio do segundo corpúsculo polar, 35 minutos após a fertilização. O eixo X corresponde à florescência da célula núcleo e o eixo Y o número de células contadas... 21
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Porcentagem média (±desvio padrão), coeficiente de variação (C.V.), da poliploidia das larvas obtidas nos diferentes tratamentos (2N=diplóides e 3N=triplóides). ... 18 Tabela 2. Porcentagem média (±desvio padrão), coeficiente de
variação (C.V.), da poliploidia das larvas obtidas nos diferentes tratamentos e, sobrevivência (%) na larvicultura dos tratamentos após 25 dias. (2N=diplóides e 3N=triplóides). ... 19 Tabela 3. Porcentagem média (±desvio padrão), coeficiente de
variação (C.V.), da poliploidia das larvas obtidas nos diferentes tratamentos ... 20
SUMÁRIO INTRODUÇÃO ... 7 OBJETIVO... 10 ARTIGO CIENTÍFICO ... 11 ABSTRACT ... 12 INTRODUÇÃO ... 13 MATERIAIS E MÉTODOS ... 14 Metodologia Geral ... 14 Metodologia Específica ... 16 RESULTADOS ... 18 DISCUSSÃO ... 21 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 24 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 26
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1 INTRODUÇÃO
A produção de moluscos triplóides iniciou-se com animais da espécie Crassostrea gigas, na década de 80 do século passado, nos Estados Unidos (EUA).
Seu objetivo era manter as ostras em estágio maduro durante todo o ano, tendo em vista que, durante o período reprodutivo a qualidade de carne das ostras decai em função da desova (ALLEN; DOWNING, 1991). Ainda, neste período as ostras diplóides tornam-se pouco apreciadas para o consumo e comercialização em virtude da acentuada redução do nível de glicogênio (NELL, 2002).
Vários grupos vêm desenvolvendo trabalhos com poliploidia em moluscos, especialmente nos EUA, França, Austrália e China (ALLEN; DOWNING, 1991; PAULS et al., 2001; NELL et al., 2004; HUBERT, 2009). A indução a poliploidia (triploidia e tetraploidia) tem sido realizada principalmente em ostras (C. gigas, C. virginica, Saccostrea glomerata (sinônima de S. commercialis), Ostrea edulis), com menor enfoque em mexilhões (Mytilus edulis), em vieiras (Euvola zic zac, Nodipecten nodosos, Placopecten magelanicus, Argopecten irradians, Chlamys nobilis, Argopecten ventricosus) e, em ostras perlíferas (Pinctada martensii).
Uma característica importante em muitos organismos aquáticos para aplicação dos métodos de indução a poliploidia, é o fato de serem ovíparos de fertilização externa, o que implica que os ovócitos são liberados na água antes que sejam completadas as divisões meióticas. A maioria dos ovócitos dos moluscos é liberada na prófase-I da meiose I (COLAS; DUBÉ, 1998). Devido a isto, tanto a meiose I quanto a meiose II podem ser pontos de manipulações cromossômicas.
Outra característica importante dos moluscos, é que a meiose só é retomada após a fertilização, o que permite a aplicação dos tratamentos de manipulação cromossômica em tempos pré-determinados (PIFERRER et al., 2009).
Animais triplóides podem ser produzidos através de forma direta ou indireta. Na forma direta, os animais são produzidos a partir do cruzamento entre indivíduos diplóides e tetraplóides, sendo sua prole composta por 100% de indivíduos triplóides (ALLEN; GUO, 1994). Já na forma indireta, os animais são obtidos a partir da suspensão da liberação de um dos corpúsculos polares, pela inibição da Meiose I (MI) ou da Meiose II (MII) (STANLEY et al., 1981; ALLEN; DOWNING, 1986). Os resultados são variados de acordo com a técnica, porém, frequentemente menores que 100%.
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Assim, os animais triplóides obtidos, conterão um conjunto haplóide de cromossomos do pai, e dois provindos da mãe, sendo um conjunto haplóide de cromossomos do próprio ovócito e outro provindo da inibição de um dos corpúsculos polares.
No sul do país, com o aquecimento gradativo da água, no final da primavera e início do verão, o animal inicia seu ciclo de maturação sexual. Durante este processo, as reservas de glicogênio são utilizadas como matéria prima para a maturação dos gametas (gametogênese), reduzindo suas reservas de energia. Sob condições de estresse, provocado pela própria desova, o animal, por não contar mais com suas reservas, torna-se mais susceptível ao ataque de microorganismos e a fatores abióticos, presentes no meio ambiente, podendo vir a morrer.
A triploidia em função da desorganização genética leva a baixa capacidade reprodutiva do animal, a energia armazenada na forma de glicogênio pode ser empregada no crescimento e em outras funções metabólicas. Dessa forma, animais triplóides teriam mais energia para enfrentar os problemas decorrentes do aquecimento das águas, reduzindo com isso a mortalidade (ALLEN; DOWNING, 1991).
A gametogênese de triplóides de Saccostrea glomerata foi altamente retardada quando comparada às diplóides. Esse retardamento foi ainda mais severo, quando comparado ao que ocorre em animais triplóides de Crassostrea gigas (NELL et al., 1996).
Ostras triplóides de Crassostrea gigas apresentam redução da gonadogênese e uma lenta redução do glicogênio quando comparadas com diplóides, durante o período de desova (ALLEN; DOWNING, 1986).
É muito provável que a redução na gametogênese contribua diretamente para o crescimento mais acelerado das ostras triplóides, permitindo uma reorientação da distribuição energética da reprodução para o crescimento (ALLEN; DOWNING, op cit), conferindo maior teor de glicogênio à carne (GARNIER-GÉRÉ et al., 2002).
Outro efeito positivo da triploidia diz respeito a qualidade do produto. O sabor da ostra está relacionado ao seu teor de glicogênio. De modo geral, ostras magras (pós-desova) ou muito maduras não possuem o sabor apreciado (NELL, 2002). O ideal são ostras com uma concentração de glicogênio de médio a alto. Portanto, com a triploidia impedindo a maturação, ou seja, a transformação do glicogênio em lipídios, as características organolépticas do produto seria preservada ao longo de todo ano.
Deve-se destacar ainda, que, em Santa Catarina, as perdas financeiras da cadeia produtiva da ostreicultura são agravadas em
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decorrência da redução da queda na oferta do produto, de boa qualidade, ocorrer justamente no verão, época de forte demanda em razão da temporada de veraneio.
Do ponto de vista comercial, o cultivo de ostras triplóides pode ser atraente, pois o glicogênio confere a ostra um sabor adocicado, além disso, sua carne é mais consistente quando comparada a indivíduos diplóides maduros.
Com relação ao crescimento e ao ganho de peso, Nell (2002) verificou que Crassostrea gigas triplóides, cultivadas em áreas com alta produtividade crescem melhor, enquanto que em áreas pobres não há diferença entre animais triplóides e diplóides. Contudo, Garnier-Géré et al. (2002) observaram que em ambientes pobres, as triplóides e diplóides não apresentaram diferença em crescimento, somente em peso, enquanto que em ambientes ricos as triplóides apresentaram maior crescimento.
A diferença apresentada em peso, provavelmente, está relacionada com o fato delas não desovarem, enquanto a diferença em crescimento pode estar vinculada à disponibilidade e assimilação de nutrientes.
Há controvérsias com relação a taxa de sobrevivência de triplóides quando comparadas a diplóides. Embora em alguns casos as triplóides originárias da inibição do primeiro corpúsculo polar cresçam mais rápido que triplóides originárias da inibição do segundo corpúsculo polar (STANLEY et al., 1984), a indução à triploidia no segundo corpúsculo polar resulta em alta sobrevivência larval (NELL; HAND, 1999).
Allen e Downing (1986) relataram uma alta taxa de sobrevivência para animais triplóides de Crassostrea gigas em relação a diplóides do estágio de sementes até um ano de idade. Contudo, Garnier-Géré et al. (2002) não observaram diferenças entre estes dois níveis de ploidia em ambientes distintos.
Triplóides adultos também parecem ser menos sensíveis a fatores abióticos do que diplóides adultos (DUCHEMIN et al., 2007). Comparando a mortalidade acumulada entre ostras diplóides e triplóides cultivadas na Baía Sul da Ilha de Santa Catarina, Silveira Junior (2004) verificou menor mortalidade em indivíduos triplóides.
Dessa forma, a triploidia poderá favorecer a ostreicultura em três importantes aspectos: redução da mortalidade, manutenção da disponibilidade de ostras de qualidade durante todo o ano e na melhoria das características organolépticas da carne.
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Neste estudo foi avaliado o efeito da Citocalasina-B (C26H33O5),
da 6-Dimetilaminopurina (C7N5H9) e do choque de temperatura na
indução a indivíduos triplóides.
O presente trabalho será publicado, em forma de artigo científico, na revista Pesquisa Agropecuária Brasileira.
OBJETIVOS Objetivo Geral
Avaliar a eficiência de indução à triploidia em Crassostrea gigas. Objetivos Específicos
Otimizar, no Laboratório de Moluscos Marinhos, a técnica de indução à triploidia em Crassostrea gigas;
Avaliar o efeito de dois métodos químicos (Citocalasina-B e 6-Dimetilaminopurina) e um físico (temperatura) sobre a eficiência na indução à triploidia em ostras Crassostrea gigas.
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ARTIGO CIENTÍFICO Scientia Agricola Journal
Indução à Triploidia em Crassostrea gigas (Thunberg, 1793)
Emílio Mateus Costa Melo1,2, Carlos Henrique Araujo de Miranda Gomes2, Francisco Carlos da Silva2, Cláudio Manoel Rodrigues de Melo2
1- Programa de Pós-Graduação em Aquicultura, CCA, UFSC, Florianópolis, SC, Brasil.
2- Laboratório de Moluscos Marinhos, Departamento de Aquicultura, CCA, UFSC, Florianópolis, SC, Brasil.
email de contato: lmm@cca.ufsc.br
Autor responsável: Emílio Mateus Costa Melo
Endereço: Universidade Federal de Santa Catarina, Departamento de Aquicultura, Rodovia Ademar Gonzaga, 1346, Itacorubi, CEP: 88034-001, Florianópolis, SC, Brasil. Fone 55-48-33343441
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ABSTRACT
Indução à Triploidia em Crassostrea gigas (Thunberg, 1793)
Three methods of inducing triploidy (3N) were tested in diploid oysters (Crassostrea gigas), two chemical, Cytochalasin B (CB) and 6-dimetilaminopurina (6-DMAP) and a physical temperature. The goal was to evaluate a technology to triploidy induction appropriate to the peculiar characteristics of the Laboratory of Marine Molluscs. Three separate experiments were performed, at 25° C, and all viable triploid larvae were obtained. In the experiment I, assessed the efficiency of the induction of triploidy with CB [0,5 mg L-1] and 6-DMAP [390 µmols L-1], and the treatment with CB (57% 3N) was statistically more effective than 6-DMAP (22,32% 3N). In experiment II, we tested the efficiency of the induction of triploidy with CB [0,5 mg L-1] and 6-DMAP [450 µmols L-1], with no difference between treatments (CB - 55% and 6 - DMAP - 56% 3N). In experiment III, the efficiency of the induction of triploidy with CB [0,5 mg L-1] and shock temperature (25º-36º C), and the treatments had no significant difference (CB - 57,31% 3N and temperature - 45,29% 3N). In both experiments a high mortality was observed in treatments with chemicals, in particular the CB. From these results, the substitution of CB by other methods of induction shown is necessary in view of the high toxicity of the substance, both the environment and the operator, and also by its high cost.
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INTRODUÇÃO
Os primeiros estudos para a produção de ostras triplóides foram realizados utilizando-se métodos químicos (CB, 6-DMAP, cálcio, cafeína) e/ou físicos (choque térmico e pressão hidrostática), objetivando inibir a liberação de um dos dois corpúsculos polares durante os processos de meiose (Stanley et al., 1981; Allen e Downing, 1986; Scarpa et al., 1994). Os autores desses estudos verificaram que dentre os principais métodos disponíveis (CB, temperatura, cálcio, cafeína e as combinações destes) para a produção de animais triplóides viáveis, o estresse químico com CB era o mais efetivo.
Contudo, devido a toxicidade da CB, o alto custo e a instabilidade das respostas obtidas com esse produto químico (Guo et al., 1996), os processos físicos também começaram a ganhar destaque.
A máxima produção de triplóides obtida com a aplicação de temperatura (Quillet e Panelay, 1986) ou pressão foi, respectivamente, de 75 e 80%. Contudo, a porcentagem de triplóides obtidas utilizando CB pode chegar próxima a 100% (Allen e Downing, 1986). Entretanto, quando se trata de uma produção em grande escala, uma avaliação econômica deve ser feita, pois nem sempre os processos de indução alcançam boas taxas de triploidia.
A 6-DMAP foi recomendada por Desrosiers et al. (1993) e Gérard et al. (1994), como uma alternativa ao uso da CB para a indução à triploidia em ostras Crassostrea gigas. Essa substância apresenta uma maior eficiência na inibição do segundo corpúsculo polar. Esse fator favorece a obtenção de um maior número de larvas triplóides normais, pois indivíduos obtidos a partir da inibição do primeiro corpúsculo polar apresentam taxas superiores de anormalidades em relação aos provindos da inibição do segundo corpúsculo polar (Gérard et al., 1999).
Infelizmente, os métodos físicos para indução não são tão eficientes quantos os químicos, em particular a CB, que são caros (Nell et al., 1996), potencialmente perigosos ao operador (Guo et al., 1992) e frequentemente associados a uma alta mortalidade larval.
Dentre os fatores que afetam diretamente a eficiência de indução e a sobrevivência larval estão, a qualidade dos gametas, o sincronismo entre desenvolvimento embrionário e o momento da aplicação do choque de indução, a duração dos choques, a intensidade dos choques, a temperatura dos processos, e as técnicas de larvicultura utilizadas (Allen, 1987).
Com a hidratação dos ovócitos ocorrendo ao mesmo tempo, por um período superior a 30 minutos, ocorre a quebra da vesícula germinal
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de grande parte dos ovócitos, aumentando o sincronismo dos gametas (Allen et al., 1989).
A adição dos espermatozóides numa dose única levará a fertilização simultânea de grande parte dos ovócitos, garantindo com isso um desenvolvimento embrionário mais homogêneo. A temperatura está diretamente associada à velocidade dos processos de desenvolvimento embrionário e ainda com a melhoria da eficiência dos químicos (Allen, 1987; Allen et al., 1989).
O objetivo deste estudo foi avaliar a eficiência da Citocalasina-B, da 6-Dimetilaminopurina e do choque de temperatura na obtenção de indivíduos triplóides da ostra Crassostrea gigas no Laboratório de Moluscos Marinhos, da Universidade Federal de Santa Catarina.
MATERIAIS E MÉTODOS Metodologia Geral
Os animais diplóides utilizados no presente estudo foram obtidos do estoque de reprodutores do Laboratório de Moluscos Marinhos, da Universidade Federal de Santa Catarina LMM-UFSC.
Os mesmos foram abertos, sexados e observado os estágios de maturação dos ovócitos. A verificação da qualidade dos ovócitos foi realizada de forma subjetiva, sendo observado o formato e o conteúdo dos gametas femininos e a motilidade dos espermatozóides.
As fêmeas escolhidas foram lavadas com água do mar a uma temperatura de 24-26º C, sendo envolvidas em papel toalha para retirar o excesso de água. Os ovócitos foram retirados simultaneamente das fêmeas, com auxílio de uma lâmina, em recipientes secos.
Após a raspagem, o material foi separado usando peneiras com telas de 70µm (para reter impurezas) e 18µm (para reter gametas). Os gametas obtidos foram acondicionados em um recipiente de 20 litros e diluídos ao volume desejado, hidratando por uma hora a 25° C.
A contagem dos ovócitos foi realizada utilizando uma câmara de Sedgwick-Rafter. Durante a contagem foi verificado se não havia presença de células em desenvolvimento embrionário, o que caracterizaria fertilização antes do momento adequado.
Foi utilizado um “pool” de espermatozóides, obtidos por raspagem do tecido germinativo, para fertilização dos ovócitos. A fertilização ocorreu numa proporção aproximada de 7 espermatozóides por ovócito, numa dose única. Durante a adição dos espermatozóides foi realizada a homogeneização da solução.
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Após cinco minutos da fertilização, duas lâminas contendo 1 mL da solução fertilizada, foram preparadas para observação do desenvolvimento embrionário sob microscópio. Quando aproximadamente 50% dos ovócitos fertilizados presentes nas lâminas apresentaram o segundo corpúsculo polar, os choques de indução foram imediatamente iniciados.
No tratamento com CB (C29H37NO5) (Allen et al., 1989), as
soluções foram preparadas com 0,5 mg CB e 1 mL de Dimetil Sulfóxido – DMSO (C2H6SO), e armazenadas a uma temperatura de -20º C.
No momento do choque de indução, os ovócitos fecundados foram colocados na solução de CB, numa concentração de 0,5 mg L-1, sobre uma peneira de 18 µm, durante 15 minutos.
Após esse período, o material retido na tela foi suspenso e imerso em uma nova solução de DMSO 0,05%, por mais 15 minutos.
Todos resíduos gerados durante os processos de indução foram separados em recipiente adequado para descarte de substâncias químicas.
Com 6-DMAP (C7H9N5) (Desrosiers et al., 1993), as soluções
foram preparadas com concentrações de 390 e 450 µmols L-1 e armazenadas a uma temperatura de -20º C.
O choque de indução ocorreu com a transferência dos ovócitos fertilizados para solução de 6-DMAP, numa dada concentração, sobre uma peneira de 18 µm, por 15 minutos.
O choque térmico (Quillet e Panelay, 1986) foi realizado com a rápida transferência dos ovócitos fertilizados, de um recipiente a 25ºC, para outro a 36°C, onde os mesmos permanecem por 15 minutos. O fim do tratamento (após quinze minutos) os ovócitos foram transferidos novamente do recipiente a 36°C, para o recipiente a 25°C.
Utilizou-se como controle, ovócitos fecundados que não sofreram nenhum tipo de indução à triploidia, sendo mantidos separados para posteriores comparações.
Ao término dos tratamentos, os embriões foram transferidos para tanques de larvicultura de 2500 litros, previamente demarcados para cada repetição, onde permaneceram por 48 horas.
Após esse período, os tanques de larvicultura foram baixados e as larvas obtidas concentradas em recipientes de 20 litros para posterior contagem.
A continuidade da larvicultura (após 48h) foi realizada em sistema de fluxo contínuo de alimento e água, em tanques de 12 litros, numa densidade ajustada de acordo com o menor número de larvas
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obtido nas repetições. O manejo alimentar foi realizado de acordo com metodologia descrita por Breese e Malouf (1975).
Análise da Poliploidia
A comprovação da poliploidia das larvas foi realizada 48 horas após a fertilização, com a utilização de um Citômetro de Fluxo (Partec).
Foram utilizadas 2000 larvas de cada tratamento para confecção das amostras, coletadas após as contagens. As larvas foram concentradas e adicionou-se 0,5 mL da solução extratora de núcleo (HCl+NaOH) e 1,5 mL de uma solução corante específico DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole). Os organismos diplóides foram utilizados como padrão de comparações de ploidias.
Metodologia Específica
Foram realizados três experimentos, independentes, em um delineamento inteiramente ao acaso com três tratamentos (CB, 6-DMAP e temperatura), comparando dois métodos de indução e um controle, com três repetições.
Em cada um destes experimentos avaliou-se a eficiência (%) de cada tratamento sob a indução a triploidia, a quantidade de larvas “D” bem formadas e a relação entre a proporção de larvas “D” bem formadas por mL e o total de larvas obtidas em cada tratamento, após 48 horas da fertilização.
A seguir será descrita a metodologia específica de cada um dos três experimentos realizados.
Experimento I: Choque de Indução da CB [0,5 mg L-1] e 6-DMAP [390 µmol L-1]:
Foram utilizados 4 machos e 8 fêmeas, das quais foram obtidos 90 milhões de ovócitos. Os mesmos foram distribuídos em 3 tratamentos (CB [0,5 mg L-1], 6-DMAP [390 µmol L-1] e Controle) com 3 repetições, numa densidade de 10 milhões de ovócitos L-1.
Os ovócitos foram hidratados por uma hora e os choques de indução ocorreram 26 minutos após a fertilização, numa temperatura de 25º C.
A larvicultura foi conduzida em sistema de fluxo contínuo numa densidade de 2,3 larvas mL-1
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Experimento II: Choque de Indução da CB [0,5 mg L-1] e 6-DMAP [450 µmol L-1]:
Neste experimento foram utilizados 6 machos e 17 fêmeas, obtendo-se 440 milhões de ovócitos, dos quais 135 milhões foram distribuídos em 3 tratamentos (CB [0,5 mg 1], 6-DMAP [450 µmol L-1] e Controle) com 3 repetições, numa densidade de 15 milhões de ovócitos L-1 sendo os demais descartados.
Os ovócitos foram hidratados por uma hora e os choques de indução ocorreram 32 minutos após a fertilização, numa temperatura de 25º C.
A larvicultura foi conduzida em sistema de fluxo contínuo numa densidade de 19 larvas mL-1. Após 25 dias de larvicultura a sobrevivência larval foi avaliada e as larvas enviadas para o processo de assentamento.
Experimento III: Choque de Indução da CB [0,5mg L-1] e Temperatura (25º-36º C):
Foram utilizados 5 machos e 18 fêmeas, obtendo 213 milhões ovócitos. Destes 135 milhões foram distribuídos em 3 tratamentos (CB [0,5 mg L-1], temperatura (25º-36º C) e Controle) com 3 repetições, numa densidade de 15 milhões de ovócitos L-1 e o restante descartado.
O processo de hidratação teve duração de 1h25min., e os choques de indução ocorreram 35 minutos após a fertilização, a 25º C.
A larvicultura foi conduzida em sistema de fluxo contínuo numa densidade de 9,45 larvas mL-1.
Análise dos Dados
As porcentagens médias de larvas triplóides obtidas nos diferentes tratamentos, bem como a sobrevivência larval desses animais foram submetidas à análise de variância (ANOVA). Quando a ANOVA mostrou diferença entre as médias aplicou-se o teste de Tukey para comparação das mesmas. As análises foram realizadas utilizando o pacote computacional SAS®.
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RESULTADOS
No experimento I a porcentagem média de larvas triplóides obtidas com CB foi, estatisticamente, superior à média obtida com indução utilizando 6-DMAP (Tabela 1 e Figura 1). No grupo controle encontraram-se apenas indivíduos diplóides.
Tabela 1 - Porcentagem média (±desvio padrão), coeficiente de variação (C.V.), da poliploidia das larvas obtidas nos diferentes tratamentos (2N=diplóides e 3N=triplóides). 2N 3N Tratamentos Média (±DP) C.V. Média (±DP) C.V. Controle 76,35 (±5,38) 5,56 - - CB 23,24 (±8,83) 6,34 57,12 (±11,28) 5,55 6-DMAP 56,10 (±18,07) 8,59 22,32 (±14,36) 8,81
O número médio de larvas “D” bem formadas, após 48 horas da fertilização, não diferiu estatisticamente entre a CB (7,77±2,78 larvas mL-1) e 6-DMAP (36,44±40 larvas mL-1). O número médio de larvas “D” bem formadas obtidas no tratamento controle (449,77±88,51 larvas mL-1) foi, significativamente, diferente em relação aos outros tratamentos.
Após 48h da fertilização, não houve diferença significativa entre a proporção de larvas “D” bem formadas em relação ao total de larvas obtidas nos diferentes tratamentos (controle 51,82±12,47%; CB 60,07±3,56%; 6-DMAP 51,14±23,97%). Nota-se, que o número total de larvas “D” bem formadas obtidas nos tratamentos com os químicos (CB 7,77±2,78 larvas mL-1 e 6-DMAP 36,44±40 larvas mL-1) foi bem inferior a quantidade obtida no tratamento controle (449,77±88,51 larvas mL-1), demonstrando quão nocivo são os tratamentos químicos.
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Figura 1- Análise de Citometria de Fluxo de larvas com 48 horas de idade, resultantes do bloqueio do segundo corpúsculo polar, 26 minutos após a fertilização. O eixo X corresponde à florescência da célula núcleo e o eixo Y o número de células contadas.
O tratamento controle (2N) apresentou absorção de aproximadamente 50 na escala de florescência nas análises do citômetro e os indivíduos triplóides (3N) apresentaram uma absorção de 75 na escala de fluorescência. Resultados estes descritos como esperados na literatura (Gosling e Nolan, 1989).
No experimento II, não houve diferença estatística na eficiência de indução à triploidia entre os tratamentos com CB e 6-DMAP (Tabela 2 e Figura 2).
Ao final da larvicultura, a sobrevivência foi avaliada e os resultados apresentaram diferença significativa entre o controle e os tratamentos com os químicos. Porém não houve diferença na sobrevivência entre os tratamentos com CB e 6-DMAP (Tabela 2). Tabela 2 - Porcentagem média (±desvio padrão), coeficiente de variação (C.V.) do número de larvas triplóides e, sobrevivência (%) larval dos tratamentos testados. (2N=diplóides e 3N=triplóides).
2N 3N Sobrevivência
Tratamentos
Média (±DP) C.V. Média (±DP) C.V. Média (±DP) Controle 73,14 (±2,45) 4,84 - - 56,99 (±15,63) CB 15,66 (±9,79) 6,45 55,08 (±6,82) 5,72 20,90 (±12,9) 6-DMAP 23,11 (±3,89) 56,49 (±10,09) 6,3 17,43 (±10,60)
O número médio de larvas “D” bem formadas não diferiu estatisticamente entre os tratamentos com CB (35,99±4,66 larvas mL-1) e 6-DMAP (177,10±17,82 larvas mL-1). Contudo, o número médio de
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larvas “D” bem formadas do controle (462,22±85,72 larvas mL-1) foi estatisticamente diferente dos demais.
Já na proporção entre as larvas “D” bem formadas e o total de larvas obtidas nos tratamentos, não houve diferença (P>0,05) entre os tratamentos com a CB (71,27±1,51%), 6-DMAP (61,97±9,05%) e o controle (76,93±5,4%).
Figura 2- Análise de Citometria de Fluxo de larvas com 48 horas de idade, resultantes do bloqueio do segundo corpúsculo polar, 32 minutos após a fertilização. O eixo X corresponde à florescência da célula núcleo e o eixo Y o número de células contadas.
No experimento III não houve diferença estatística entre a porcentagem de larvas triplóides com indução utilizando CB e temperatura (P>0,05) (Tabela 3).
Tabela 3 - Porcentagem média (±desvio padrão), coeficiente de variação (C.V.) (2N=diplóides e 3N=triplóides). 2N 3N Tratamentos Média (±DP) C.V. Média (±DP) C.V. Controle 76,68 (± 11,62) 4,31 - - CB 17,11 (± 6,402) 4,45 57,31 (±9,57) 4,01 Temperatura 29,28 (± 11,10) 4,47 45,29 (±18,11) 4,99
Da mesma forma, o número médio de larvas “D” bem formadas não diferiu entre os tratamentos com CB (33,99±24,11 larvas mL-1) e temperatura (87,77±74,48 larvas mL-1). Contudo, o número médio de larvas “D” bem formadas obtidas no tratamento controle (471±204,04 larvas mL-1) foi significativamente diferente dos demais tratamentos (CB e temperatura).
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Na proporção de larvas “D” bem formadas em relação ao total de larvas obtidas, não foi observada diferença significativa entre os tratamentos com CB (55,95±20,93%), a temperatura (56,20±23,15%) e o controle (83,63±15,89%).
Figura 3- Análise de Citometria de Fluxo de larvas com 48 horas de idade, resultantes do bloqueio do segundo corpúsculo polar, 35 minutos após a fertilização. O eixo X corresponde à florescência da célula núcleo e o eixo Y o número de células contadas.
DISCUSSÃO:
A eficiência de indução à triploidia com CB [0,5 mg L-1] foi acima de 50% nos três experimentos, com o momento do choque variando entre 26 e 35 minutos após a fertilização, durante 15 minutos. Resultado comparado ao de Yamamoto et al. (1988), que obteve 67% de sucesso na produção de triplóides da mesma espécie, na mesma concentração de CB, com os choques aplicados 20 minutos após a fertilização, com duração de 10 minutos,.
Nell et al. (1994), trabalhando com Saccostrea glomerata na mesma concentração de CB, aplicando o choque 23 minutos após a fertilização, durante 20 minutos, obteve 81% de indivíduos triplóides.
No presente estudo o melhor resultado para 6-DMAP foi com a concentração de 450 µmol L-1, (experimento-II), alcançando uma média de 56,49% de eficiência à triploidia. Trabalhando com a mesma espécie, Gérard et al. (1994) obteve com a mesma concentração, 85% de triplóides com choque aplicado após 15 minutos da fertilização, durante 10 minutos. Já Desrosiers et al. (1993), com uma concentração de 300 µmol L-1, alcançou uma eficiência de indução ainda maior, de 90%, aplicando o choque 15 minutos após a fertilização, com duração de 20 minutos.
Mesmo não havendo uma comparação direta entre os experimentos I e II, o aumento da concentração de 6-DMAP no
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experimento-II melhorou a eficiência do choque de indução, sendo comparado estatisticamente ao tratamento com CB do mesmo experimento.
Desrosiers et al. (1993), utilizando a mesma substância para inibir massas polares de vieiras (Placopecten magellanicus), mexilhões (Mytilus edulis) e ostras (Crassostrea gigas), relatou que o aumento da concentração de 6-DMAP nos choques de indução está diretamente relacionada à melhorias nos resultados de indução.
Com relação ao choque de temperatura, a eficiência de indução foi de 45,29%. Yamamoto et al. (1988) obteve 83% de triploidia, na mesma espécie, aplicando o choque de indução 45 minutos após a fertilização, com duração de 15 minutos, a uma temperatura de 37o C.
Já Gosling e Nolan (1989), utilizando a indução térmica com Tapes semidecussatus (Manila clam), obteve 55% de triplóides, com choque a 32º C, por 10 minutos.
As variações entre os resultados podem estar relacionadas às adequações das técnicas de indução de cada laboratório de pesquisa, e ainda com a qualidade e sincronismo dos gametas nos processos de aplicação dos tratamentos.
Com exceção do tratamento com 6-DMAP no experimento-I, todos os outros choques de indução tiveram uma eficiência média de 50%, mostrando que qualquer um deles pode ser utilizado como forma de obtenção de indivíduos triplóides viáveis.
Em todos os tratamentos com a utilização da CB como indutor à triploidia, o número de larvas obtidas foi baixo, sendo registradas altas taxas de mortalidade, após 48 horas da fertilização. Este resultado corrobora com o relatado por outros autores (Stanley et al., 1981; Allen et al., 1989; Gérard et al., 1994).
A mortalidade medida após 48 horas comprovou os efeitos nocivos dos tratamentos de indução à triploidia com os químicos, principalmente com CB. Porém, nos tratamentos com 6-DMAP (experimento-II), a mortalidade foi menor do que com CB.
No trabalho realizado por Gérard et al. (1994), a mortalidade observada, após 48 horas da fertilização, foi de 64% para o tratamento da CB e de 36% para o tratamento com 6-DMAP.
De acordo com Allen et al. (1989), uma mortalidade entre 70 e 80% indica que o tratamento foi forte o bastante para causar o efeito de indução, mas não tão intenso a ponto de causar a mortalidade total das larvas, logo altas mortalidades são esperadas no processo de indução a poliploidia em ostras
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A comparação, entre o número de larvas “D” bem formadas e o total de larvas obtidas em cada tratamento, pôde demonstrar que proporcionalmente a sobrevivência das larvas “D” bem formadas foi equivalente entre os tratamentos, ainda que o número total de larvas obtidas nos tratamentos de indução seja muito inferior ao tratamento controle.
Este estudo teve como principal resultado, a produção e confirmação das primeiras larvas e sementes de ostras (Crassostrea gigas) triplóides do Brasil. E ainda, que os tratamentos com temperatura e 6-DMAP são igualmente eficientes à CB, conhecido agente nocivo ao ser humano e ao meio ambiente.
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CONSIDERAÇÕES FINAIS
As técnicas de indução à triploidia possuem inúmeros detalhes, cada um atuando de maneira decisiva para sucesso do procedimento.
Os experimentos realizados colaboram com a melhoria e escolha da técnica de indução à triploidia a ser utilizada em trabalhos futuros no Laboratório de Moluscos Marinhos. Porém, para o estabelecimento de uma produção comercial de sementes triplóides, mais estudos tornam-se necessários, na avaliação do custo de produção, na demanda e aceitação do mercado, e no rendimento desses organismos expostos as nossas condições de cultivo.
O presente estudo teve como principal resultado, a produção e confirmação das primeiras larvas e sementes de ostras (Crassostrea gigas) triplóides do Brasil.
Os tratamentos com 6-DMAP [450 µmol L-1] e temperatura foram igualmente eficientes na indução à triploidia, quando comparados a CB [0,5 mg L-1]. De acordo com esses resultados, a utilização da CB será evitada como forma de indução à triploidia em ostras (Crassostrea gigas) diplóides no Laboratório de Moluscos Marinhos, sendo substituída por choques de temperatura e pela 6-DMAP.
A substituição da CB está diretamente ligada ao seu alto custo de aquisição, a alta mortalidade larval nos choques de indução, e principalmente a sua elevada toxicidade, tanto para o aplicador, quanto para o meio ambiente.
Com a obtenção de indivíduos triplóides adultos, o próximo objetivo será a produção de lotes tetraplóides, a partir do cruzamento entre fêmeas triplóides viáveis, com machos diplóides, inibindo a saída do primeiro corpúsculo polar, durante a meiose I (Allen et al. 2000). Tal procedimento visa à produção de um plantel de reprodutores tetraplóides, que a partir de um simples cruzamento com indivíduos diplóides, 100% dos descendentes gerados serão triplóides, sem a necessidade dos choques de indução para que isso ocorra.
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DA INTRODUÇÃO
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