Roberto Rudge de Moraes Barros
Estudos sobre a estrutura e organização das extremidades cromossômicas de Trypanosoma cruzi com ferramentas de bioinformática, cromossomo artificial e radiação ionizante
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do título de Doutor em Ciências.
Roberto Rudge de Moraes Barros
Estudos sobre a estrutura e organização das extremidades cromossômicas de Trypanosoma cruzi com ferramentas de bioinformática, cromossomo artificial e radiação ionizante
Orientador: Prof. Dr. José Franco da Silveira
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do título de Doutor em Ciências.
Trabalho realizado na disciplina de Parasitologia do Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia da Universidade Federal de São Paulo, com auxílios financeiros concedidos pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado
de São Paulo (FAPESP) e Programa “United Nations
University for Biotechnology of Latin America and
“A ciência permanecerá sempre a satisfação do desejo mais alto da nossa natureza, a curiosidade; fornecerá sempre ao homem o único meio que ele possui de melhorar a própria sorte.”
Aos meus pais, Caco e Marina, pelo apoio incondicional.
Às minhas irmãs, Helena e Marta, pela paciência.
À Raquel, pelo carinho.
Agradecimentos
Ao Professor Franco, pela oportunidade, orientação e exemplo - não apenas de pesquisador e orientador, mas também de pessoa.
Ao Dr. Mariano Levin, por me receber em seu laboratório, pelo entusiasmo, pelo apoio e pela alegria. Nunca me esquecerei de um dos cientistas mais encorajadores que conheci.
A Amy pela amizade e pela ajuda com todos os experimentos com o cormossomo artificial.
A todos os amigos do LaBMECh – Buenos Aires: Joaquin, Juan Elizondo, Juan Burgos, Tomas, Margarita, Leticia, Vanina, Benson, Marc, Alejandro, Maxi, Gabi, Lara, Leandro, Tamara. Muito obrigado por me acolherem tão bem.
À Márcia, pela disposição a ajudar e tirar dúvidas, sempre.
Aos professores do Ipen, Dra. Sizue e Dr. Rogero, por disponibilizar o irradiador e pela ajuda com a irradiação.
À Marjorie, grande amiga e companheira de trabalho – principalmente na parte dos telômeros. Sem sua ajuda certeza essa tese não sairia.
À Renata Souza, sempre disposta ajudar, com sugestões e apoio nos experimentos dos cromossomos artificiais.
Ao Paulo, pela conversa, pela cerveja e pela ajuda com a infecção de camundongos.
Ao Fábio, um grande companheiro nos cursos e nos experimentos de Pulsed Field.
À Renata Baida, que me orientou na Iniciação Científica e se tornou uma boa amiga.
À Cris, a nova estagiária do lab, que me ajudou nos últimos experimentos.
Ao Dr. Jerônimo Ruiz, pelo auxílio com as análises de Bioinformática.
A todos que passaram pelo laboratório nestes anos: Danielle, Michelle, Ethel, Nadini, Tamiris, Alexandra, Esteban, Luciana, Dong. Todos sempre facilitaram o trabalho, deixando o dia a dia do laboratório leve e divertido.
Aos “peritos” em microscopia, Mário e Fernando Real, pela ajuda com as
imagens dos parasitas.
Aos amigos da Disciplina de Parasitologia: Cristian, Mauro, Maeda, Renan, Viviane, Priscila, Dani, Charles, Rafa, Carlos, Miriam, Gisele, Silene, Paulo Henrique, Érico, Vanessa, Cris, Diana, Carol e Isabella.
Aos funcionários da Disciplina de Parasitologia e do Departamento: Sandra, Adilson, Henrique, Simone, Lima, Solange, Mércia e Regiane. Sem vocês com certeza nada iria funcionar.
Aos professores da Disciplina: Dr. Renato, Dra. Nobuko, Dra. Clara Lúcia, Dr. Maurício e Dr. Michel.
Aos amigos da Disciplina de Imunologia, Felipe e Maria Fernanda, pela ajuda com o FACs.
Aos grandes amigos do CEB. As noites de Poker e cerveja atrapalharam algumas manhãs, mas com certeza ajudaram a tese. A amizade de todos é o bem mais importante que obtive na UNIFESP.
À Beluga, minha companheira nas madrugadas no computador.
Às agências financiadoras: CAPES, CNPq, FAPESP e UNU-BIOLAC.
Sumário
Dedicatória v
Agradecimentos vi
Lista de abreviaturas xii
Lista de figuras xiv
Lista de tabelas xvi
Resumo xvii
Abstract xix
1. Introdução 1
1.1. Trypanosoma cruzi e doença de Chagas 2
1.2. Genoma de T. cruzi 6
1.3. Antígenos de superfície de T. cruzi 7
1.4. Telômeros de T. cruzi 9
1.5. Reparo e recombinação de DNA 12
1.5.1. Reparo e recombinação de DNA em
tripanossomatídeos 14
1.5.2. A via de reparo de DNA por micro-homologia e seu
papel nos mecanismos de variação antigênica 17
2. Objetivos 20
3. Material e Métodos 22
3.1. Análises de bioinformática 23
3.1.1. Identificação e mapeamento de “contigs” cromossômicos
(TcChr) contendo a repetição telomérica 23
3.1.2. Análises de sintenia dos “contigs” cromossômicos
homólogos 24
3.1.3. Análises in silico de trans-sialidases subteloméricas 24
3.2. Soluções, tampões e reagentes 25
3.4. Meios de cultura 28
3.4.1. Meios para cultura de bactérias 28
3.4.2. Meios para cultura de T. cruzi 28
3.5. Antibióticos (concentração final no meio de cultura) 29 3.5.1. Antibióticos para seleção de bactérias recombinantes 29 3.5.2. Antibióticos para seleção dos parasitas transfectantes 29
3.6. Bactérias 29
3.7. Vetores e plasmídeos recombinantes 29
3.8. Preparação de bactérias competentes 29
3.9. Ligação de fragmentos de DNA nos vetores e transformação
de bactérias competentes 30
3.10. Cultivo de bactérias recombinantes 30
3.11. Extração em pequena escala do DNA dos BACs e
plasmídeos recombinantes (“mini-prep”) 31
3.12. Digestão de DNA genômico de T. cruzi e de BACs e
plasmídeos recombinantes 31
3.13. Amplificação de DNA pela reação em cadeia da polimerase
(PCR) 32
3.14. Sequenciamento do DNA plasmidial 32
3.15. Análise das sequências clonadas em plasmídeos 33
3.16. Cultivo de T. cruzi 33
3.17. Infecção de camundongos com tripomastigotas metacíclicos 34
3.18. Extração de DNA genômico de T. cruzi 34
3.19. Transfecção de epimastigotas com o vetor pTAC 35
3.20. Clonagem de linhagens de T. cruzi por diluição seriada 36 3.21. Preparação e inclusão de DNA cromossômico de T. cruzi
em blocos de agarose 36
3.22. Eletroforese de campo invertido (FIGE) para separação de
3.23. Eletroforese em campo pulsado (PFGE) para separação de
bandas cromossômicas de T. cruzi 38
3.24. Transferência do DNA em géis de agarose para membranas
de náilon (“Southern blot”) 39
3.25. Síntese de DNA marcado com nucleotídeo radioativo dCTP
(32P) 39
3.26. Hibridização das membranas contendo DNA com as sondas
radioativas 40
3.27. Indução na quebra na dupla fita de DNA de Trypanosoma
cruzi utilizando radiação ionizante 40
3.28. Marcação de quebra nas fitas de DNA com a enzima terminal transferase (TUNEL – “Terminal deoxynucleotidyl
transferase dUTP nick end labeling”) 41
4. Resultados 43
4.1. Mapeamento e caracterização das extremidades
cromossômicas de Trypanosoma cruzi 44
4.1.1. Identificação de “contigs” contendo a repetição
telomérica e localização destes nos grandes “contigs”
cromossômicos de T. cruzi (TcChr) depositados nos bancos de
dados 44
4.1.2. Análise e caracterização das regiões subteloméricas de
T. cruzi 47
4.1.3 Identificação e caracterização in silico dos genes de
trans-sialidases subteloméricos 58
4.1.4. Mapeamento dos “contigs” teloméricos nas bandas
cromossômicas de T. cruzi separadas por PFGE 59
4.1.5. Análise da sintenia entre as extremidades
cromossômicas de cromossomos homólogos de T. cruzi 61
4.2. Uso de cromossomos artificiais de T. cruzi na análise de
recombinação envolvendo as extremidades cromossômicas 68
4.2.1. Construção de cromossomos artificiais contendo
sequências teloméricas de Trypanosoma cruzi 68
4.2.2. Transfecção de epimastigotas com o cromossomo
artificial de T. cruzi (pTAC) 78
4.2.3. Caracterização dos parasitas transfectados com
4.2.3.1. Análises dos parasitas CL Brener/ pTAC-gp85-1 80 4.2.3.2. Análise dos clones derivados de parasitas
transfectados com as construções pTAC-gp85-1 e pTAC 83
4.2.4. Análise dos parasitas CL Brener/ pTAC-gp85-2 92
4.2.5. Análise dos parasitas transfectados submetidos a
diferentes situações de estresse 94
4.2.5.1. Indução de quebra na dupla fita de DNA com
radiação ionizante 94
4.2.5.2. Infecção de camundongos com os parasitas
transfectantes 96
4.3. Reparo de DNA e manutenção do cariótipo molecular em T.
cruzi 98
4.3.1. Reparo no DNA de epimastigotas de T. cruzi (clone CL
Brener) submetidos a altas doses de radiação ionizante 98 4.3.2. Reparo de quebras na dupla fita de DNA em diferentes
cepas de T. cruzi 107
4.3.3. Mapeamento cromossômico em parasitas irradiados:
análise de grupos sintênicos 110
5. Discussão 117
5.1. Organização das regiões subteloméricas de T. cruzi 117 5.2. Análise de recombinação envolvendo sequências
subteloméricas utilizando o cromossomo artificial pTAC 122 5.2.1. Estabilidade e organização do cromossomo de T. cruzi
(pTAC) 122
5.2.2. Análise de recombinação das sequências subteloméricas
inseridas no cromossomo artificial pTAC 125
5.3. Efeito da radiação ionizante no cariótipo molecular de T. cruzi 131
6. Referências Bibliográficas 137
Lista de abreviaturas
BLAST - “Base Local Alignment Search Tool“
DNA - Ácido desoxirribonucléico
dNTPs - Desorribonucleotídeo trifostato
DSB - “Double Strand Break” (quebra na dupla fita de DNA) EDTA - Ácido etilenodiamino tetracético
ESAG - “Expression Site Associated Genes” (genes associados ao sítio de expressão)
BAC - “Bacteria Artificial Chromosome” (cromossomo artificial de bactéria) DGF-1 –“Dispersed Gene Family 1”
g - grama
°C - graus Celsius
GFP - “Green Fluorescent Protein” (proteína fluorescente verde) GPI - Glicosil Fosfatidil Inositol
Gy - Grey h - hora
IPTG - isopropyl-beta-D-thiogalactopiranosideo Kb - Quilobases
KDa - Quilodaltons
kDNA - DNA do cinetoplasto L - Litro
LB - Meio de cultura Luria Bertani M – Molar
MASP –“Mucin Associated Surface Proteins”
Mb - Megabase µM - Micromolar
min - Minutos mL - Mililitros
MMEJ - “Microhomology mediated end joining” (recombinação mediada por micro-homologia)
mM - Milimolar
NCBI - National Center for Biotechnology Information
NHEJ - “Non-homologous end-joining” (junção de terminais não homólogos) nm - Nanômetro
nt - Nucleotídeo
OD - Densidade óptica
ORF - “Open Reading Frame” (fase aberta de leitura) pb - Pares de bases
PBS - Tampão de fosfato salino
PCR - "Polimerase Chain Reaction" (reação em cadeia da polimerase)
PFGE - "Pulsed Field Gel Electrophoresis" (eletroforese em gel de campo pulsado)
RHS –“Retrotransposon Hot Spot”
RNA - Ácido ribonucléico RPM - Rotações por minuto SDS - Duodecil sulfato de sódio SSC - Tampão sódio salino citrato TE - Tampão Tris – EDTA
TELT - Tampão Tris-EDTA-Lítio-Triton TBE - Tampão Tris-Borato-EDTA TS - Trans-sialidase
U - unidade
V - Volts
Lista de figuras
Figura 1: Ciclo de vida do T. cruzi 3
Figura 2: Estimativa global da população infectada com T. cruzi
(junho 2009) 5
Figura 3: Telômeros de T. cruzi 10
Figura 4: Reparo de DSBs por recombinação homóloga (HR) 16
Figura 5: Representação esquemática da diluição dos parasitas em
placa de cultura de 96 poços 37
Figura 6: Distribuição das famílias gênicas presentes nas regiões
subteloméricas nas bandas cromossômicas de T. cruzi 51
Figura 7: Extremidades cromossômicas de T. cruzi 52
Figura 8: Mapeamento das extremidades cromossômicas
identificadas in silico nas bandas cromossômicas de T. cruzi 62 Figura 9: Análise da sintenia entre as extremidades cromossômicas
de cromossomos homólogos de T. cruzi 65
Figura 10: Clone telomérico BacD6 69
Figura 11: Amplificação e clonagem de um fragmento de 1,7 Kb do
BacD6 72
Figura 12: Clonagem do amplicon GP85-1 no plasmídeo pEGFP-N1 73 Figura 13: Clonagem do fragmento gp85-GFP no vetor pTAC 74 Figura 14. Clonagem de um fragmento telomérico de 6,5 Kb,
derivado do BacD6 76
Figura 15: Clonagem do fragmento telomérico gp85-2-GFP no
plasmídeo pEGFP-N1 77
Figura 16: Construção pTAC-gp85-2 79
Figura 17: Análise de populações transfectadas com o cromossomo artificial pTAC-gp85-1 por eletroforese de campo pulsado em
sistema CHEF DRIII 82
Figura 18: Análise do cariótipo molecular dos clones transfectantes pTAC-gp85-1 por eletroforese de campo pulsado no sistema CHEF
DRIII e hibridização com a sonda Neo 84
Figura 19: Determinação do tamanho do cromossomo artificial por
Figura 20: Organização do cromossomo artificial pTAC-gp85-1:
análise de restrição e hibridização com a sonda GFP 88
Figura 21: Organização do cromossomo artificial pTAC-gp85-1:
análise de restrição e hibridização com a sonda Neo 89
Figura 22: Diagrama esquemático da disposição dos cromossomos
artificiais pTAC-gp85-1 nos diferentes clones analisados 91
Figura 23: Hibridização dos parasitas transfectados com a
construção pTAC-gp85-2 com as sondas Neo e GFP 93
Figura 24: Recuperação do cariótipo molecular e da taxa de crescimento em parasitas transfectados com a construção
pTAC-gp85-1 irradiados 95
Figura 25: Análise do cariótipo molecular de parasitas recuperados
após a irradiação 97
Figura 26: Análise do cariótipo molecular dos parasitas isolados de camundongos infectados com tripomastigotas metacíclicos contendo
a construção pTAC-gp85-1 99
Figura 27: Cariótipo molecular dos clones de parasitas reisolados de
camundongos, derivados da população C8m 100
Figura 28: Recuperação do cariótipo molecular e da taxa de crescimento em parasitas submetidos a altas doses de radiação
ionizante 103
Figura 29: Análise de geração de quebras na dupla fita de DNA (DSBs) após o tratamento com radiação ionizante pelo método de
TUNEL 104
Figura 30: Recuperação do cariótipo molecular dos parasitas das
cepas G e CL após tratamento com radiação ionizante 108
Figura 31: Cariótipo molecular dos clones reisolados por diluição
seriada dos parasitas recuperados após a irradiação 109
Figura 32: Hibridização de marcadores específicos da banda XX do
clone CL Brener com clones isolados após irradiação 111
Figura 33: Hibridização de marcadores específicos da banda XVI do
clone CL Brener com clones isolados após irradiação 113
Figura 34: Hibridização de marcadores de DNA repetitivo com clones
Lista de tabelas
Tabela 1: Características gerais das extremidades teloméricas de T.
cruzi 45
Tabela 2: Presença de genes nas extremidades cromossômicas de
T. cruzi 49
Tabela 3: Agrupamento das extremidades cromossômicas pela sua
composição gênica 55
Tabela 4: Análise in silico de trans-sialidases das extremidades
cromossômicas 60
Tabela 5: "Contigs" cromossômicos homólogos contendo a repetição
telomérica 63
Resumo
Formas tripomastigotas de T. cruzi expressam glicoproteínas de superfície da superfamília das trans-sialidases (TS), implicadas nos processos de invasão da célula hospedeira. As TSs constituem uma grande família gênica codificando grande número de proteínas de superfície. Populações de T. cruzi podem expressar diferentes formas antigênicas de TS. A identificação de genes TS localizados próximos aos telômeros sugeriu que as terminações cromossômicas poderiam atuar como local de geração de novas variantes TS. O objetivo deste trabalho é caracterizar as regiões teloméricas e subteloméricas do T. cruzi e investigar seu papel na recombinação e geração de variantes TS.
Idfentificamos 49 “contigs” obtidos durante o projeto genoma que contém a repetição telomérica (TTAGGG). Destes “contigs”, em 45 a repetição telomérica está localizada em uma extremidade, e em quatro “contigs” está localizada internamente. A presença de repetições teloméricas internas poderia ser explicada por erros no alinhamento in silico das sequências ou por eventos de fusão de telômeros, formando cromossomos com repetições teloméricas intersticiais. Todos os contigs apresentam uma sequência conservada de 189 pb adjacente à repetição telomérica, denominada junção telomérica, que representa uma assinatura de extremidades cromossômicas de T. cruzi.Durante o trabalho, localizamos 40 dos 4λ “contigs” teloméricos nos “contigs” cromossômicos de T. cruzi e relacionamos algumas extremidades cromossômicas às bandas cromossômicas separadas por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE).
A estrutura das sequências subteloméricas de T. cruzi varia muito, principalmente como resultado de diferenças na quantidade e na organização de genes de proteínas de superfície (TS e DGF-1), genes “retrotransposon hot spot” (RHS), retroelementos e genes de RNA
helicase e N–acetiltransferase entre as extremidades cromossômicas. As regiões
subteloméricas possuem um grande número de pseudogenes, porém, também contêm genes completos, possivelmente expressos. Isto indica que estas regiões não representam apenas DNA não-funcional adjacente aos telômeros, mas formam parte do genoma expresso. O tamanho das regiões subteloméricas varia de 5 kb a 182 kb, sendo que as pequenas extremidades podem ter surgido de eventos recentes de quebra cromossômica e reparo dos telômeros. A falta de sintenia nas regiões subteloméricas sugere que genes localizados nestas regiões estão sujeitos a recombinação, o que aumenta sua variabilidade, inclusive em cromossomos homólogos. A presença de genes típicos subteloméricos pode facilitar a ocorrência de mecanismos de recombinação homóloga ou de recombinação mediada por micro-homologia, que podem usar estas regiões para o emparelhamento e recombinação de extremidades livres.
estável como um cromossomo do parasita. Estas construções (pTAC-gp85) não se integram ao genoma do parasita, e contém sequências subteloméricas, incluindo um pseudogene gp85, marcadores de seleção em ambos os braços e o gene repórter GFP. Após a eletroporação de epimastigotas com as construções, estas se mantiveram lineares epissomais e estáveis, por diversas gerações, mesmo na ausência de pressão seletiva com antibióticos. Ao longo do ciclo de vida do parasita, o cromossomo artificial se manteve estável, segregando-se junto aos outros cromossomos do parasita. Não foram detectados eventos de recombinação envolvedo deslocamento de genes do cromossomo articial para outro sítio genômico. Eventos de recombinação envolvendo genes TS subteloméricos podem estar ocorrendo em T. cruzi, mas possivelmente com menos frequência do que o esperado pela diversidade genética observada entre as linhagens e o grande número de variantes de antígenos de superfície no parasita. Eventos de recombinação em alguns parasitas da população dificilmente seriam detectados pela estratégia utilizada em nossos experimentos.
Abstract
T. cruzi trypomastigotes express surface glycoproteins from the trans-sialidases (TS) superfamily which are implicated in the host cell invasion. TSs constitute a large gene family encoding a diverse family of proteins. Single populations of T. cruzi may express different antigenic forms of TS. Analysis of TS genes located at the telomeres suggested that chromosomal ends could have been the site for generation of new TS variants. The aim of our work is to characterize telomeric and subtelomeric regions of T. cruzi and investigate their role in recombination and generation of TS variant proteins.
To connect the sequences of telomeres to the T. cruzi working draft sequence, we first identified sequence contigs carrying the telomeric repeat (TTAGGG). Of 49 contigs identified, 45 have telomeric repeats at one end, whereas in four the repeats are located internally. The presence of telomeric repeats within the contigs could be explained by an error occurred during the alignment of sequences in silico or occurrence of telomere fusions, forming a chromosome with interstitial telomeric repeats. All contigs display adjacent to the hexamer repeat a conserved 189 bp junction, which represents a signature of T. cruzi chromosomal ends. We found that 40 telomeric contigs are located on T. cruzi chromosome-sized scaffolds. We were able to connect several telomeric ends to the chromosomal bands separated by pulsed field gel electrophoresis.
T. cruzi subtelomeric sequence structure varies widely, mainly as a result of large differences in the abundance and organization of genes encoding surface proteins (TS and DGF-1), retrotransposon hot spot genes (RHS), retroposons elements, RNA-helicase and N-acetyltransferase genes at individual telomeres. The subtelomeric regions are enriched in pseudogenes, however, they also contain complete gene sequences, matching both known
and unknown expressed genes. This indicates that theseregions are not nonfunctional DNA
next to the telomere, but they are instead functional parts of the expressed genome. The size of subtelomeric regions varies from 5 kb to 182 kb, the small one ends could be generated by a recent event of chromosome breakage and telomere healing. The lack of synteny in the subtelomeric regions suggests that genes located in these regions are subject to recombination, which increases its variability, even in homologous chromosomes. The presence of typical subtelomeric genes might increase the chance of homologous recombination mechanisms or microhomology-mediated end joining which would use these regions for pairing and recombination of free ends.
the parasite's life cycle. No recombination events involving displacement of gp85 pseudogene in pTAC-gp85 to T. cruzi genomic DNA could be detected. Recombination events involving subtelomeric TS genes might be occurring in T. cruzi, but possibly less frequently than expected due to the genetic diversity among strains and the large number of subtelomeric variant surface antigens. Recombination events in a few parasites of the population would hardly be detected by the strategy used in our experiments.
1. Introdução
1.1. Trypanosoma cruzi e doença de Chagas
O Trypanosoma cruzi é um protozoário parasita flagelado, identificado em 1909 por Carlos Chagas como agente etiológico da doença de Chagas, descrita no mesmo estudo (Chagas, 1909). O parasita pertence ao filo Euglenozoa, classe Kinetoplastea, ordem Kinetoplastida e família Trypanosomatidae. Os kinetoplastideos se caracterizam por possuírem uma organela rica em DNA, chamada cinetoplasto.
O T. cruzi possui um complexo ciclo de vida (Fig. 1), compreendendo três formas de desenvolvimento denominadas de acordo com a posição do cinetoplasto: amastigotas, epimastigotas e tripomastigotas (De Souza, 2002). As formas de vida do parasita se alternam nos hospedeiros vertebrado (marsupiais, roedores, o homem, entre outros) e invertebrado (insetos da ordem Hemíptera, família Reduviidae, subfamília Triatominae (De Souza, 2002).
No tubo digestivo de insetos triatomíneos se multiplicam os epimastigotas, formas alongadas de aproximadamente 20 µm de comprimento, com um flagelo localizado no extremo anterior do parasita (Fig. 1). O cinetoplasto de aspecto alongado encontra-se anterior ao núcleo. Na porção final do tubo digestivo dos triatomíneos, os epimastigotas se diferenciam em tripomastigotas metacíclicos, que não se replicam, porém são capazes de invadir células de mamíferos. Os tripomastigotas são formas alongadas, também de 20 µm, porém, com cinetoplasto compacto, posterior ao núcleo alongado.
Durante a alimentação, os triatomíneos eliminam os tripomastigotas metacíclicos juntamente com as fezes. Os tripomastigotas podem então penetrar no hospedeiro mamífero no local da picada ou através de mucosas, e invadir células onde se diferenciam em formas amastigotas (Fig. 1).
Figura 1: Ciclo de vida de T. cruzi. As diferentes formas de vida do parasita são apresentadas na figura. À esquerda estão as formas encontradas no hospedeiro invertebrado (insetos hemípteros) e à direita no hospedeiro vertebrado.
tripomastigotas metacíclicos invadem células de mamíferos
amastigotas se multiplicam dentro de células
tripomastigotas sanguíneos liberados no sangue tripomastigotas sanguíneos
são ingeridos por triatomíneos epimastigotas se
multiplicam no intestino do inseto
tripomastigotas metacíclicos são liberados com as fezes do inseto
Modificado de: www.dpd.cdc.gov/dpdx
Diferenciação
Com o rompimento da célula, os tripomastigotas são liberados na corrente sanguínea, sendo denominados tripomastigotas sanguíneos, que podem invadir outras células ou ser ingeridos por insetos hematófagos. No intestino médio dos triatomíneos, os tripomastigotas se transformam em epimastigotas, completando o ciclo de vida do parasita.
O grande número de hospedeiros vertebrados (gambás, quatis, tatus) e invertebrados (barbeiros) dificulta a interrupção da transmissão vetorial do T. cruzi em uma área endêmica que compreende regiões de 21 países da América Latina (Fig. 2) (Schmunis, 1999). Esforços no controle vetorial e de melhorias nas moradias rurais reduziram o número de novos casos em toda a região nos últimos anos, sendo que no Brasil, Chile e Uruguai a transmissão vetorial foi interrompida na década de 2000 (Moncayo, 2003). Ainda assim, a Organização Mundial de Saúde estima que 25 milhões de pessoas vivam em áreas de risco (WHO, 2010).
Além da transmissão vetorial, a doença de Chagas ou tripanossomíase americana pode ser transmitida por transfusões de sangue e transplantes de órgãos, por ingestão de alimentos contaminados (transmissão oral) e de mães contaminadas para fetos por transmissão congênita (Yoshida, 2006). Dados de países endêmicos indicam que a transmissão vetorial é responsável por mais de 40.000 novos casos por ano e a transmissão congênita por mais de 10.000 novos casos (WHO, 2010). Micro epidemias de transmissão oral foram relatadas no Brasil nos últimos anos. Atualmente existem cerca 10 milhões de infectados e mais de 10.000 óbitos foram causados pela doença de Chagas ou tripanossomíase americana em 2008 (WHO, 2010).
Figura 2: Estimativa global da população infectada com T. cruzi (junho 2009). O mapa apresenta os números de pacientes infectados com doença de Chagas em junho de 2009. A área endêmica da doença compreende os países da América Latina continental, em uma área que vai do Chile ao México. Atualmente, existem casos relatados na América do Norte, Europa, Japão e Austrália, causados provavelmente pela migração de pacientes que contraíram a doença na área endêmica.
Modificado de: Revista Pesquisa Fapesp, junho 2009
Em alguns indivíduos (20 – 35% dos infectados), a doença progride para a fase crônica, mesmo após anos na fase indeterminada. A fase crônica é caracterizada por lesões no coração (cardiopatia chagásica crônica) e no trato gastro-intestinal (mega-cólon e mega-esôfago). Os sintomas da fase crônica podem causar afastamento de trabalho e aposentadoria precoce e, em casos graves, podem levar a morte por falência cardíaca (Diotaiuti, Pereira et al., 1995; Rassi, Rassi et al., 2010).
Durante a fase aguda, o tratamento com drogas tripanomicidas, como o benzonidazol, se mostrou efetivo, interrompendo a infecção e prevenindo a doença crônica. Entretanto, não existem tratamentos efetivos para a fase crônica da doença, sendo um desafio para a ciência o desenvolvimento d enovas estratégias de combate da enfermidade (Maya, Orellana et al., 2010) (WHO, 2010).
1.2. Genoma de Trypanosoma cruzi
Diversos trabalhos têm relatado grande diversidade genética e biológica entre diferentes cepas e linhagens do T. cruzi. Os parasitas diferem em relação a aspectos morfológicos, infectividade, patogenicidade, taxa de crescimento, número de cromossomos e quantidade de DNA (Buscaglia e Di Noia, 2003).
A análise genética de isolados com diferentes marcadores, como sequências
do gene do RNA ribossômico 24Sα e o espaçador do gene mini-exon,
No projeto genoma de T. cruzi foi utilizado o clone CL Brener, pertencente ao grupo T. cruzi VI. O DNA do clone CL Brener foi sequenciado e os resultados publicados em 2005. O genoma diplóide do clone CL Brener tem tamanho estimado em 106,4 a 110,7 Mb, sendo composto por cerca de 50% de sequências repetitivas, como retrotransposons, proteínas de superfície e repetições subteloméricas. Existem aproximadamente 12 mil genes por genoma haplóide e as proteínas de superfície (trans-sialidases - TS, mucinas, MASPs, DGF-1) são as famílias mais abundantes (El-Sayed, Myler et al., 2005).
A grande quantidade de sequências repetitivas e famílias multigênicas no genoma do parasita dificultam o alinhamento das sequências, impedindo até o momento a correta montagem in silico dos cromossomos. O rascunho do genoma de CL Brener contém 32.746 “contigs” alinhados em 638 “scaffolds”, porém, não foi possível definir a sequência completa de nenhum cromossomo (El-Sayed, Myler et al., 2005). Em 2009, Weatherly e colaboradores publicaram um estudo organizando “contigs” e “scaffolds” em cromossomos, utilizando como base mapas de sintenia de Leishmania major e Trypanosoma brucei (tripanossomatídeos com a maioria dos cromossomos definidos) e uma biblioteca genômica de T. cruzi em BACs (Weatherly, Boehlke et al., 2009). Os resultados destes esforços estão disponíveis em um novo banco de dados, chamado TriTrypDB (http://tritrypdb.org), com o agrupamento inicial de 419
“contigs” em 71 “contigs” cromossômicos, com tamanhos de 78 Kb a 2,3 Mb. O
banco de dados TriTryp se tornou uma importante ferramenta para estudos de localização gênica e mapeamento genômico em T. cruzi, porém, ainda são necessários mais experimentos e dados para confirmar os cromossomos sugeridos no site.
1.3. Antígenos de superfície de T. cruzi
2005; Azuaje, F., Ramirez, J. L. et al., 2007; Azuaje, F. J., Ramirez, J. L. et al., 2007; Bartholomeu, Cerqueira et al., 2009; Lander, Bernal et al., 2010).
Apesar da heterogeneidade encontrada entre os antígenos de superfície, grande parte é codificada por genes relacionados, agrupados na superfamília das trans-sialidases (TS) (Colli, 1993; Frasch, 2000; Azuaje, F. J., Ramirez, J. L. et al., 2007), a mais abundante do genoma de T. cruzi, com 1.430 genes identificados, sendo 630 (pseudo) genes (El-Sayed, Myler et al., 2005).
A superfamília TS é composta por 4 grupos: grupo I, proteínas com atividade de neuraminidase e/ou trans-sialidase (TS); grupo II, glicoproteínas de massas moleculares de 70-90 kDa (TC85, GP85, GP82, GP90) presentes na superfície das formas tripomastigotas, atuam como adesinas no processo de invasão celular e não tem atividade enzimática conhecida; grupo III, proteínas de massas moleculares de ~160 kDa (FL-160, CEAμ “Chronic Exo Antigen”, 160
kDa, CRP: “Complement Regulatory Protein”) localizadas na região da bolsa
flagelar das formas tripomastigotas, inibem a lise mediada pelo complemento; e grupo IV, composto de genes que codificam antígenos de superfície de formas tripomastigotas cuja função ainda não é conhecida (Colli, 1993; Frasch, 2000b; Azuaje, F. J., Ramirez, J. L. et al., 2007).
apresentado pelos membros deste grupo seria uma das maneiras encontrada pelo parasita para penetrar em diferentes tipos celulares e/ou escapar da resposta imune do hospedeiro.
A diversidade de proteínas de superfície é uma característica explorada por diversos parasitas em mecanismos de escape da resposta imune do hospedeiro - variação antigênica de Trypanosoma brucei e Plasmodium falciparum. Na variação antigênica apenas uma variante de proteína de superfície é expressa em determinado momento (Borst, Bitter et al., 1998; Craig e Scherf, 2001; Pays, 2005), porém, em T. cruzi diversas variantes são
expressas simultaneamente, formando um quadro de “variabilidade antigênica”
(Ruef, Dawson et al., 1994; Rubin-De-Celis, Uemura et al., 2006; Yoshida, 2006).
Entre os possíveis mecanismos geradores de variabilidade antigênica do T. cruzi podemos citar a recombinação recíproca entre cromátides, com o intercâmbio de sequências de genes TS, mutações pontuais, duplicações gênicas e transposição para outro lócus genômico (conversão gênica). Evidentemente, outros mecanismos poderiam estar envolvidos e não seriam obrigatoriamente excludentes.
1.4. Telômeros de T. cruzi
Cromossomos de eucariotos caracterizam-se pela presença de extremidades livres denominadas telômeros. Telômeros são complexos especializados de DNA - proteína, com a função de estabilizar as terminações cromossômicas, protegendo-as de nucleases ou da maquinaria de recombinação. Os telômeros são constituídos de repetições ricas em G, no caso de T. cruzi por uma região
simples fita de λ nucleotídeos (5’- GGGTTAGGG-3’) seguindo-se 9 a 50
Figura 3. Telômeros de T. cruzi
Diagrama esquemático de um telômero de T. cruzi. O quadro vermelho representa a terminação do cromossomo, com a sequência de nove nucleotídeos GGGTTAGGG em simples fita. O quadro azul claro representa as repetições hexaméricas (TTAGGG) e o quadro amarelo a sequência de 189 pares de base típica de T. cruzi, denominada junção telomérica. Os genes subteloméricos estão indicados pelo quadro verde, e sua transcrição sempre ocorre em direção ao telômero do parasita (indicado pela seta).
Genes intersticiais
Modificado de Chiurillo et al., 1999 e Cano, MI, 2001
GGGTTAGGG repetição
telomérica (TTAGGG)n Junção
Em colaboração com o grupo do Dr. José Luis Ramirez (Venezuela) isolamos as regiões subteloméricas de T. cruzi (Kim, Chiurillo et al., 2005). Os resultados indicam que genes da superfamília TS são extremamente abundantes nas regiões subteloméricas, onde também foram encontrados genes das famílias RHS (“Retrotransposon Hot-Spot”) e DGF-1 (“Dispersed Gene Family-1”). Os
genes RHS foram inicialmente descritos em T. brucei, são proteínas encontradas no núcleo do tripanosoma, codificadas por uma família multigênica cujos membros apresentam um sítio para inserção de retrotransposons (Bringaud, Biteau et al., 2002). Os genes DGF-1 constituem uma família multigênica com função ainda incerta, apesar de terem sido identificados domínios trans-membrânicos, que sugerem a presença destas proteínas na superfície do parasita, e da observação da secreção de proteínas desta família (Kawashita, Da Silva et al., 2009; Lander, Bernal et al., 2010). Retroelementos (L1Tc, SIRE, VIPER) também foram encontrados nas regiões subteloméricas, como esperado por se tratarem de sequências abundantes no todo o genoma do parasita.
As cópias subteloméricas de GP85 e RHS descritas até o momento são truncadas, constituindo (pseudo)genes. Por outro lado, cópias completas do gene DGF-1 foram encontradas nas regiões subteloméricas analisadas. Este dado indica que a região subtelomérica poderia também atuar como sítio de expressão do gene DGF-1, o que explicaria a capacidade desta sequência de aproximadamente 11 Kb manter-se intacta em uma região geneticamente instável como os telômeros.
Callejas, Leech et al., 2006; Lira, Giardini et al., 2007), indispensáveis para a virulência destes parasitas. Em T. brucei, genes de proteínas de superfície (VSGs –“Variant Surface Genes”) inativos estão “armazenados” nos telômeros, sendo transpostos para sítios de expressão por mecanismos que utilizam a micro-homologia de repetições adjacentes para a recombinação gênica (Glover, Mcculloch et al., 2008a; Boothroyd, Dreesen et al., 2009; Glover e Horn, 2009).
A presença de (pseudo)genes de antígenos de superfície nas regiões subteloméricas é um indício de que estas regiões também possuem um papel importante na geração de variantes de glicoproteínas de superfície em T. cruzi.
Mecanismos de recombinação homóloga ou de microhomologia (“MMEJ –
microhomology mediated end joining”) envolvendo (pseudo)genes teloméricos
e suas repetições adjacentes poderiam ser os responsáveis pela geração de novas variantes para antígenos de superfície em T. cruzi, permitindo o
desenvolvimento da chamada “variabilidade antigênica”.
1.5. Reparo e recombinação de DNA
Diversos agentes causam lesões no DNA das células. O reparo destas lesões é essencial para a manutenção da integridade genômica das células, para a correta transcrição gênica e transferência do material genético para as células filhas.
Alterações espontâneas no DNA podem ocorrer pela incorporação errada de nucleotídeos durante a replicação, desaminação de bases, perda de bases após depurinação e modificação de bases por alquilação (Lindahl e Barnes, 2000; Ciccia e Elledge, 2010). Agentes endógenos genotóxicos formados naturalmente pelo metabolismo celular, como os reativos de oxigênio (ROS, do
inglês “Reactive Oxigen Species”), são capazes de causar quebras simples fita
(SSB, do inglês “Single Strand Breaks”) entre outras lesões no DNA. Estudos estimam que cada célula humana pode sofrer até 105 lesões espontâneas no DNA em um único dia (Hoeijmakers, 2009).
induzir até 105 lesões como dímeros de pirimidina por dia em cada célula humana (Hoeijmakers, 2009); ou a radiação ionizante, como raios-X e raios gama de isótopos radiativos, capazes de induzir quebras na simples fita (SSBs
– “single strand breaks”) ou na dupla fita (DSBs – “double strand breaks”) do
DNA. Diversos agentes químicos podem causar uma grande variedade de lesões e são utilizados atualmente em tratamentos de câncer, para induzir lesões não reparáveis de DNA, capazes de iniciar a apoptose nas células lesadas. Agentes como o metil-metanosulfato atacam os grupos alquil enquanto agentes como a mitomicina C e a cisplatina são capazes de introduzir links covalentes entre bases da mesma fita (“intrastrand crosslinks”) ou de fitas diferentes (“interstrand crosslinks” – ICLs).
Para corrigir a grande variedade de lesões que afetam o DNA, as células desenvolveram diversos mecanismos de reparo, que podem ser utilizados isoladamente ou conjuntamente para correção da lesão (Hakem, 2008). Bases inseridas incorretamente podem ser removidas e substituídas pelo “reparo de erro de pareamento” (MMR – “mismatch repair”), ou pelo reparo de excisão de bases. Lesões mais extensas como dímeros de pirimidina são corrigidos pelo mecanismo de reparo de excisão de nucleotídeos, que repara uma região de até 30 pb (Lindahl e Barnes, 2000; Hakem, 2008), enquanto quebras na simples fita (SSBs) possuem um mecanismo específico de reparo denominado
reparo de “SSB repair” (Hoeijmakers, 2009).
As lesões mais complexas e, possivelmente, mais nocivas às células são as quebras na dupla fita do DNA (DSBs). As DSBs são reparadas por mecanismos de recombinação homóloga (HR – “homologous recombination”),
1.5.1. Reparo e recombinação de DNA em tripanossomatídeos
Mecanismos de reparo de DSBs são alguns dos responsáveis pela plasticidade genômica em diversos organismos e podem ter papel importante na variação e variabilidade antigênicas em tripanossomatídeos.
Em eucariotos, o processo de NHEJ envolve diversas proteínas e inicia-se com o reconhecimento das DSBs pelo complexo protéico formado pelas proteínas Ku70 e Ku80. Este processo pode religar moléculas de DNA diferentes. Para isso, as extremidades de DNA devem ser modificadas antes da ligação, pela remoção de nucleotídeos pelas DNA-PKs (proteínas quinases dependentes de DNA) (Mcvey e Lee, 2008) ou pela adição de nucleotídeos por polimerases envolvidas no processo (polimerases µ e , família Pol IX) (Ma, Lu et al., 2004). A modificação das extremidades de DNA anterior à ligação pode então causar deleções ou inserções, diminuindo assim a fidelidade do reparo do DNA por esta via. Em mamíferos, o complexo Ku interage com as DNA-PKs e com polimerases (Sandoval e Labhart, 2002; Ma, Lu et al., 2004) permitindo modificações nas extremidades livres de DNA, que serão ligadas pela ação do complexo protéico DNA Ligase IV/XRCC4 (Critchlow, Bowater et al., 1997; Kass e Jasin, 2010).
Em T. brucei, T. cruzi e L. major foram identificadas proteínas Ku70 e Ku80, porém, estudos em T. brucei descrevem o papel destas proteínas na manutenção dos telômeros neste parasita, não sendo notada nenhuma função destas proteínas no reparo de DSBs induzidas artificialmente (Conway, Mcculloch et al., 2002; Burton, Mcbride et al., 2007). Nos tripanossomatídeos, outros genes de proteínas da maquinaria de NHEJ como a DNA Ligase IV e XRCC4 não foram identificados até o momento, o que coloca em dúvida a existência deste mecanismo nos parasitas (Passos-Silva, Rajao et al., 2010).
O mecanismo de recombinação homóloga (HR) constitui a principal via de reparo de DSBs em eucariotos inferiores (Bhattacharyya, Norris et al., 2004). A
HR se inicia com a formação de regiões simples fita 3’ (“3’ single strand
overhangs”) nas extremidades da DSB. Estudos em Saccharomyces cerevisiae
uma exonuclease específica 5’-3’ (Exo1) ou o complexo DGS1/DNA2, que
possui atividades de helicase e nuclease (Sung e Klein, 2006). As
extremidades simples fita 3’ se ligam à proteína de replicação A (RPA), que
estimula o recrutamento de diversas outras proteínas, como RAD51 e BRCA2 (San Filippo, Sung et al., 2008). A RAD51 é um proteína essencial no processo, uma ATPase dependente de DNA que forma filamentos nucleoprotéicos com a simples fita. Após se ligar ao DNA, RAD51 catalisa a invasão de uma dupla fita
homóloga pela extremidade simples fita 3’, formando uma região de fita tripla, chamada “tríplex” (Fig. 4) (Sung e Klein, 2006). Ocorre então a síntese da fita
“invasora”, complementar a sequência da fita molde do tríplex.
A fase final da HR, também chamada de resolução, pode ocorrer por dois
mecanismos. O primeiro mecanismo é chamado de SDSA (“synthesis
-dependent strand annealling”). Neste mecanismo a fita invasora se desprende
do tríplex e se alinha com a região homóloga da outra extremidade da DSB e
se religa, permitindo o preenchimento da simples fita da extremidade “não invasora” da DSB. Este mecanismo repara a fita original que sofreu DSB sem
que ocorram grandes recombinações entre as fitas, os chamados “crossovers”. A segunda via de resolução de HT é usualmente chamada de DSBR (“double strand break repair”) e ocorre após a formação de uma “junção dupla de
Holliday”, pela aproximação da outra extremidade da DSB. A junção dupla de
Holliday deve ser resolvida com a quebra e religação das fitas de DNA. Durante este processo as fitas podem se religar de maneira idêntica a sua conformação anterior à DSB, ou podem formar moléculas que contém grandes fragmentos de DNA de diferentes moléculas dupla-fita originalmente presentes na reação – os chamados “crossovers” (Fig. 4) (Sung e Klein, 2006).
Figura 4: Reparo de DSBs por recombinação homóloga (HR). Após a quebra na dupla fita de DNA, as extremidades são modificadas, com a formação de extremidades 3’ livres. As extremidades livres são capazes de
invadir regiões dupla-fita de DNA homólogas. Após a invasão, ocorre a extensão de DNA na fita invasora.
A via de resolução DSBR ocorre com a formação da junção dupla de Holliday, após a aproximação da outra extremidade da DSB. A resolução da junção resulta em moléculas de DNA contendo fragmentos das duas dupla-fita
originais. Esta via pode resultar nos chamados “crossovers”, moléculas
contendo grandes fragmentos de DNA não homólogos, adjacentes às sequências homólogas. A via SDSA sempre resulta na formação de moléculas iguais as originais, pela separação da fita invasora do tríplex e posterior alinhamento com a outra extremidade da DSB. O DNA recém sintetizado está indicado pela linha pontilhada.
Quebra na dupla fita de DNA (DSB)
Edição das extremidades 3’
Invasão da dupla-fita homóloga (formação do tríplex)
Síntese da extremidade 3’
DSBR SDSA
Junção dupla de Holliday Alinhamento das extremidades
da fita original
Reparo sem a formação de “crossovers”
Reparo com a formação de “crossovers”
Síntese da fita 3’ não invasora
e religação.
Diversas proteínas que participam dos processos de HR foram identificadas em tripanossomatídeos, como MRE11(Robinson, Mcculloch et al., 2002; Tan, Leal et al., 2002) RAD51, RAD50 (Mcculloch e Barry, 1999), RPA, BRCA2 e RAD54 (Berriman, Ghedin et al., 2005). A caracterização de algumas destas proteínas (MRE11, RAD51 e BRCA2) comprovou seu papel no reparo do DNA de parasitas tratados com agentes indutores de DSBs (radiação ionizante ou drogas como a zeocina) (Mcculloch e Barry, 1999; Robinson, Mcculloch et al., 2002; Hartley e Mcculloch, 2008). A caracterização de RAD51 mostrou que a superexpressão desta proteína pode afetar a frequência de troca de variantes de proteínas de superfície (VSGs) expressas, sendo um indício da participação da HR na variação antigênica (Mcculloch e Barry, 1999).
Em T. cruzi e L. major, foi demonstrado o papel de RAD51 no reparo de DSBs induzidas por radiação ionizante (Mckean, Keen et al., 2001; Regis-Da-Silva, Freitas et al., 2006). É interessante ressaltar que estes parasitas são muito resistentes à radiação ionizante, fato que não ocorre em T. brucei (Mckean, Keen et al., 2001; Regis-Da-Silva, Freitas et al., 2006; Passos-Silva, Rajao et al., 2010). A expressão de Rad51 nestes parasitas pode ser aumentada em casos de lesão no DNA, fato que não ocorre em T. brucei (Mckean, Keen et al., 2001; Regis-Da-Silva, Freitas et al., 2006; Passos-Silva, Rajao et al., 2010). Este mecanismo pode conferir vantagem durante a invasão de células, onde o estresse oxidativo e a consequente formação de radicais livres, pode causar lesões no DNA. O fato do T. brucei ser um parasita de vida extracelular poderia explicar o não desenvolvimento deste mecanismo neste tripanossomatídeo.
1.5.2. A via de reparo de DNA por micro-homologia e seu papel nos mecanismos de variação antigênica
Além dos processos de HR e NHEJ, nos últimos anos vem sendo descrito um novo mecanismo de recombinação, denominado recombinação de micro-homologia (MMEJ –“microhomology mediated end joining”).
parasita pode necessitar de uma terceira via de reparo quando a HR não é eficiente. Trabalhos recentes (Barnes e Mcculloch, 2007; Glover, Mcculloch et al., 2008b) sugerem que esta via seja a MMEJ, independente de Ku e da maquinaria de NHEJ. Inicialmente descrita como uma via de revisão, utilizada no caso de falhas no reparo por HR (Roth, Porter et al., 1985; Roth e Wilson, 1986), trabalhos recentes demonstraram o importante papel da MMEJ no processo de geração de anticorpos por recombinação em linfócitos B de camundongos (Nussenzweig e Nussenzweig, 2007), indicando uma maior importância biológica desta via de reparo do DNA. É importante ressaltar que este mecanismo resulta na deleção de nucleotídeos flanqueando a região da DSB, sendo frequentemente relacionado com aberrações cromossômicas, como deleções, translocações e inversões (Chen, Umezu et al., 1998; Welcker, De Montigny et al., 2000; Yu e Gabriel, 2003; Weinstock, Brunet et al., 2007).
A caracterização completa do mecanismo de MMEJ ainda carece de estudos, porém, já existem modelos propostos (Mcvey e Lee, 2008), com a participação de genes inicialmente descritos para HR. O processo inicia-se pela formação de extremidades simples fita, sendo utilizado o complexo MRX e a exonuclease EXO1 (Decottignies, 2007; Lee e Lee, 2007). O alinhamento de pequenas sequências homólogas é um passo chave do mecanismo ainda não decifrado. Estudos com S. cerevisiae e Drosophila sugerem a preferência do mecanismo por algumas pequenas sequências específicas, porém, ainda não se sabe como ocorre o processo, e se este é independente de RAD51 (Ma, Kim et al., 2003; Yu e Gabriel, 2003; Mcvey, Radut et al., 2004).
Nos últimos anos, alguns estudos associaram o reparo de DSBs por MMEJ à recombinação no DNA cromossômico (Glover, Mcculloch et al., 2008) ou mesmo ao mecanismo de variação antigênica em T. brucei (Boothroyd, Dreesen et al., 2009). Segundo este trabalho, regiões repetitivas de 70 pb, seriam suficientes para a recombinação por MMEJ de sítios subteloméricos de expressão de VSGs, (Barry e Mcculloch, 2009; Boothroyd, Dreesen et al., 2009).
mecanismos poderiam também ser utilizados na geração de variantes de antígenos de superfície em T. cruzi. Além disso, poderiam ter tido papel fundamental na geração de variabilidade genética entre as diferentes linhagens e cepas deste parasita.
2. Objetivos
Variação e variabilidade antigênicas são mecanismos desenvolvidos por protozoários parasitas relacionados à invasão de diferentes tipos celulares e a permanência no hospedeiro vertebrado. Mecanismos de recombinação de que alteram genes localizados nas regiões subteloméricas são os grandes responsáveis pela variação antigênica em T. brucei.
Em T. cruzi, mecanismos genéticos ainda não definidos podem ser os geradores da grande variedade de genes de antígenos de superfície existentes no genoma do parasita.
O objetivo do trabalho é investigar o papel das regiões subteloméricas de T. cruzi na recombinação e geração de variantes de glicoproteínas de superfície da superfamília das trans-sialidases.
Para alcançar o objetivo acima, estabelecemos as seguintes metas:
1: Identificar e caracterizar as sequências subteloméricas depositadas nos bancos de dados do projeto genoma de T. cruzi, determinando os genes de antígenos de superfície da superfamília TS;
2: Verificar a ocorrência de recombinações envolvendo os genes TS subteloméricos utilizando a tecnologia de cromossomo artificial;
3. Material e Métodos
3.1. Análises de bioinformática
3.1.1. Identificação e mapeamento de “contigs” cromossômicos (TcChr) contendo a repetição telomérica
Nosso grupo recebeu da Professora Daniela Bartolomeu (Departamento de Parasitologia, UFMG) a anotação de 48 “contigs” contendo a repetição telomérica de T. cruzi. Com número de acesso dos genes anotados
localizamos os “contigs” cromossômicos (TcChr) disponíveis no Banco de
dados TriTryp (http://tritrypdb.org/tritrypdb/) que contém a repetição telomérica.
As sequências completas dos “contigs” cromossômicos foram analisadas
visando: 1) buscar e determinar do tamanho do bloco de repetições teloméricas (TTAGGG); 2) verificar da presença da junção de 189 pb descrita por Chiurillo e colaboradores (Chiurillo, Cano et al., 1999), característica dos telômeros de T. cruzi; 3) avaliar qual o primeiro gene encontrado e a qual distância ele se encontrada da repetição telomérica; 4) determinar qual o tamanho, quais o genes encontrados e o sentido da transcrição nas regiões subteloméricas.
Analisamos então regiões de 200 Kb dos “contigs” cromossômicos, partindo da
repetição telomérica. As regiões subteloméricas foram definidas como a região localizada entre o telômero e a primeira sequência interna (intersticial) do cromossomo. As anotações de genes dos “contigs” cromossômicos foram
confirmadas por análises com o programa BLASTn
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), submetendo as sequências dos genes ao banco de dados de sequências de nucleotídeos não redundantes (“nr/ nt”).
A presença de elementos repetitivos (SIRE e VIPER) foi verificada com o programa “RepeatMasker” (http://www.repeatmasker.org/). As extremidades cromossômicas analisadas foram agrupadas de acordo com o padrão gênico encontrado.
de grandes sequências, que informam a posição dos genes e o sentido de transcrição.
3.1.2. Análises de sintenia dos “contigs” cromossômicos homólogos
Com o auxílio do Dr. Jerônimo Ruiz, Centro de Pesquisas René Rachou (FIOCRUZ-MG) verificamos a sintenia dos “contigs” cromossômicos definidos como homólogos no banco de dados TriTryp. As sequências completas dos
“contigs” foram submetidas a um BLAST recíproco, que compara as duas
sequências e identifica as regiões sintênicas. O resultado do BLAST recíproco foi enviado para o programa “Artemis Comparision Tool” (ACT)
(http://www.sanger.ac.uk/resources/software/act/) que fornece uma interface gráfica da análise. Desta maneira podemos observar as regiões sintênicas dos cromossomos homólogos, e identificar possíveis quebras de sintenia, especialmente nas regiões subteloméricas.
3.1.3. Análises in silico de trans-sialidases subteloméricas
Para analisar individualmente as sequências de TS, coletamos, a partir do número de acesso dos bancos de dados, todas as sequências transcritas das TS mapeadas até o momento nas regiões subteloméricas. Com estas sequências efetuamos uma análise de BLASTp (protein-protein BLAST) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), buscando sequências de proteínas expressas depositadas no banco de dados (GeneBanK). A busca foi feita no banco de dados de sequências não redundantes (nr), segundo o algoritmo BLASTp (Berman, Zhang et al., 2000). As maiores similaridades foram anotadas e utilizadas para a classificação das TS nos grupos.
Além da classificação, verificamos a integridade dos transcritos, observando quais continham códons de terminação interno, pela observação das sequências. Outra característica de TS verificada foi à presença do domínio VTV-FLY. As sequências não interrompidas por códons de terminação internos foram utilizadas em buscas por sequências aceptoras de âncora GPI, e do peptídeo sinal.
(Poisson, Chauve et al., 2007; Nakayasu, Yashunsky et al., 2009) e para a
predição de peptídeo sinal, o programa Signal IP 3.0
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) (Bendtsen, Nielsen et al., 2004).
3.2. Soluções, tampões e reagentes
Soluções para lise alcalina:
Solução 1: glicose 50 mM; Tris-HCl 25 mM, pH 8,0; EDTA 10 mM;
Solução 2: NaOH 0,2 M; SDS 1%
Solução 3: acetato de potássio 3 M; ácido acético 5 M
Solução de lisozima: lisozima 10 mg/mL; Tris-HCl 10 mM pH8,0
RNAse A
Tampão para separação eletroforética de DNA TBE 1X: Tris-base 89 mM; ácido bórico 89 mM; EDTA 2 mM (pH 8,3)
Tampão TE: Tris 10 mM; EDTA 1 mM
Solução de Denhardt’s 50Xμ Ficol 1% tipo 400; Polivinilpirrolidona 1%; BSA fração V 1%
Solução de Hibridização: Formamida 50% (v/v); solução de Denhart’s 5X; SSC 5X; DNA de esperma de salmão 0,1 mg/mL; RNAt de levedura 0,01 mg/mL
Soluções de lavagem das membranas de náilon:
Solução 1: SSC 2 X; SDS 0,1%; NaPi 0,1%
Solução 2: SSC 1 X; SDS 0,1%; NaPi 0,1%
Solução 3: SSC 0,1 X; SDS 0,1%; NaPi 0,1%
Tampão PBS 1 X: Fosfato de sódio monobásico: 1,3%; fosfato de sódio dibásico: 0,074%; NaCl: 0,4%
Solução de lise NDS: Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 0,5 M, pH 8,0; Sarkosil 1%; Proteinase K 1 mg/mL
Soluções para transferência do DNA de gel de agarose para membranas de náilon - “Southern Blot”μ
Solução de depurinação: HCl 0,25 M
Solução de denaturação: NaCl 1,5 M; NaOH 0,5 M
Solução de neutralização: NaCl 1,5 M; Tris HCl 1,0 M; pH 7,4
SSC 1X: NaCl 0,15 M; citrato de sódio 0,015 M; pH 7,0
Tampão de amostra de DNA (6X): Azul de bromofenol 0,25 %; xileno cianol 0,25 %; sacarose 40 %
Tampão TELT para extração de DNA de parasitas: 62,5 mM EDTA pH 9,0; Tris 50mM pH 8,0; LiCl 2,5 mM; Triton – X100 4 %
PBS 1X: cloreto de sódio 120 mM; fosfato de sódio monobásico 2 mM; fosfato de sódio dibásico 8mM, pH 7,2
Solução FB: cloreto de potássio 100 mM; cloreto de cálcio 50 mM; acetato de potássio 10 mM; glicerol 10% p/v, pH6,2
Tampão de fixação de parasitas para microscopia: PBS – paraformaldeído 4%
Tampão de permeabilização de parasitas: Triton X-100 0,1% em solução 0,1% de citrato de sódio
X-Gal (concentração final no meio de cultura): 80 g/mL
IPTG (concentração final no meio de cultura): 0,5 mM
Agarose para corrida eletroforética de DNA: Agarose, “molecular biology tested”,
(SIGMA)
Brometo de etídio (concentração no gel de agarose): 0,5 ug/mL
Padrão de tamanho de DNA para gel de agarose: fragmentos de DNA do fago
Taq DNA polimerase (LGC biotecnologia)
Tampão 10X para Taq DNA polimerase sem magnésio (LGC biotecnologia)
MgCl2 50 mM (LGC biotecnologia)
T4 DNA ligase (Invitrogen)
T4 DNA ligase Buffer 5X (Invitrogen)
Enzimas de restrição: ApaI; BamHI; EagI; EcoRI; HindIII; KpnI; NotI; SalI; (Invitrogen)
Kit de Purificação de DNA de gel de agarose: Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)
Kit para sequenciamento de DNA: “Big Dye terminator cycle sequencing ready reaction” (Perkin-Elmer) contendoμ tampão “Big Dye Terminator Buffer v1.1,
3.1”; mix para reação “Big Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit”; oligonucleotídeos iniciadores (“primers”) M13 –21 forward e M13 –21 reverse
Tampão de amostra para gel de sequência (aparelho ABI377): Tampão “Blue
Dextran”/EDTA (Perkin Elmer)μ 25 mM EDTA (pH 8,0); 50 mg/ml “Blue
Dextran”; diluído em formamida deionizada (1μ5)
Gel de acrilamida para sequenciamento no aparelho ABI 377 (mistura para 25 mL): Uréia (λ g); “Long Ranger gel solution” – BMA (2,5 mL); tampão TBE 10 X (2,5 mL); água milli Q (13 mL); persulfato de amônio 5% (125 µL); TEMED - Tetrametiletilenodiamina (SIGMA) (17,5 µL)
Membrana para transferência de ácidos nucléicos: Hybond N (Amersham Biosciences)
Kit para marcação de DNA radioativo: Random Primers DNA Labeling System, (Invitrogen)
Kit para marcação de quebra na fita de DNA: “In situ Cell Death Detection kit,
3.3. Oligonucleotídeos iniciadores (“primers”)
M13Fwd: 5'GTA AAA CGA CGG CCA G 3'
M13Revμ 5’CAG GAA ACA GCT ATG AC 3’
T7μ 5’TAA TACGAC TCA CTA TAG GG 3’
Sp6μ 5’ATT TAG GTG ACA CTA TAG 3’
Kpnφgp85-Fwd: 5’AT GGT ACC GCG ACG AGG GCC 3’
Bamgp85-Rev: 5’ATG GAT CCC ACC ACC CGC TTC 3’
KpnEGFPRevμ 5’ AT GGT ACC CAA ATG TGG TAT GGC 3’
NeoFwd:5’ CAG GTT CTC CGG CCG CTT 3’
NeoRev:5’ GCA TCG CCA TGG GTC ACG 3’
ApaEGFP-Fwd: 5' G GGC CCG GTC GCC ACC ATG GTG 3'
ApaEGFP-Rev: 5' GG GCC CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3'
3.4. Meios de cultura
3.4.1. Meios para cultura de bactérias
LB líquido (Luria Bertani): triptona 1%; extrato de levedura 0,5%; NaCl 0,5%; pH 7,5
LB sólido: LB líquido adicionado de Agar bacteriológico 1,5%
3.4.2. Meios para cultura de T. cruzi
LIT (“Liver Infusion Tryptose”)μ infusão de fígado 5 g/L; triptona 5 g/L; NaCl 4 g/L; KCl 0,4 g/L; fosfato de sódio 8 g/L ; glicose 2 g/L; hemina 10 mg/L; soro fetal bovino 100 mL/L; pH 7,2
3.5. Antibióticos (concentração final no meio de cultura)
3.5.1. Antibióticos para seleção de bactérias recombinantes
Cloranfenicol 25 g/mL
Kanamicina 30 g/mL
Ampicilina 100 g/mL
3.5.2. Antibióticos para seleção dos parasitas transfectantes
Geneticina (G418): 60 g/mL
Puromicinaμ 10 g/mL
3.6. Bactérias
Escherichia coli, cepas DH5α e DH10
3.7. Vetores e plasmídeos recombinantes
pGEMT e pGEMT-easy (Promega)
pGEM-3Z (Promega)
pGEM-5Zf (Promega)
pEGFP-N1 (Clontech)
pTAC (plasmídeo do cromossomo artificial de T. cruzi)
pBeloBAC11
3.8. Preparação de bactérias competentes
Bactérias E. coli DH5α foram inoculadas em 3 mL de meio LB e cultivadas a 37
h. Novamente as células foram centrifugadas e o sobrenadante descartado, sendo o precipitado homogeneizado em 20 mL de solução FB gelada. As bactérias foram então divididas em alíquotas de 0,5 mL e armazenadas a -70 °C.
3.9. Ligação de fragmentos de DNA nos vetores e transformação de bactérias competentes
O plasmídeo pGemT-Easy apresenta extremidades contendo caudas poli(T), facilitando assim a clonagem de produtos de PCR que contém extremidades livres poli(A). Para a ligação dos produtos de PCR neste plasmídeo foram utilizados a enzima DNA ligase e o tampão fornecidos pelo fabricante juntamente com o plasmídeo, seguindo o protocolo do kit.
Os plasmídeos pTAC, pGEM-3Z e pEGFP-N1 foram digeridos com enzimas de restrição adequadas e ligados a insertos contendo extremidades coesivas compatíveis. A ligação foi feita utilizando-se 1 U de T4 DNA ligase (Invitrogen) e 100 ng do vetor (relação molar inserto: vetor, 2:1). A mistura contendo o tampão adequado foi incubada 16 h à 16 ºC.
A transformação das bactérias foi iniciada pela adição de 100 L de bactérias
competentes ao produto da ligação, seguindo-se incubação por 40 min no gelo. As bactérias foram submetidas ao choque térmico, sendo incubadas por 2 min em banho-maria a 42 ºC e rapidamente recolocadas no gelo. Após 10 min de
incubação foram adicionados 400 L de meio LB líquido e as bactérias
incubadas a 37 °C com agitação por 1 h. Após este período, elas foram semeadas em placas de Petri contendo LB ágar, antibiótico apropriado, e, para os plasmídeos pGEM-3Z e pGEM-T Easy, X-Gal (80 g/mL) e IPTG (0,5 mM).
3.10. Cultivo de bactérias recombinantes
Bactérias das cepas DH5α e DH10 foram utilizadas para clonagem e
amplificação de plasmídeos e BACs recombinantes.
adequados e, quando necessário, com o substrato cromogênico X-Gal e com o indutor IPTG.
Colônias recombinantes das placas de cultura foram coletadas com o auxílio de palitos esterilizados por autoclavação e colocadas em meio LB líquido contendo o antibiótico adequado para o crescimento das culturas.
3.11. Extração em pequena escala do DNA dos BACs e plasmídeos recombinantes (“mini-prep”)
Para a extração de DNA dos BACs e dos plasmídeos recombinantes foi utilizado o método de lise alcalina (Sambrock et al., 1989). Após crescimento por 16 h a 37 oC, as bactérias eram precipitadas por centrifugação por 8 min a 2.000 x g, o sobrenadante descartado e o precipitado ressuspenso em 100 µL de solução 1 (item 3.2) contendo RNAse A (2 µg/mL). A suspensão celular foi transferida para tubos Eppendorf de 1,5 mL, adicionando-se 200 µL de solução de lise 2 (item 3.2). A mistura foi homogeneizada por forte inversão e mantida à temperatura ambiente durante 5 min, quando foram adicionados 200 µL de solução de lise 3 (item 3.2) e os tubos incubados no gelo por 20 min. O material foi então centrifugado por 8 min a 17.400 x g a 13 oC. Com o auxílio de uma micropipeta, 400 µL do sobrenadante foram transferidos para outro tubo Eppendorf. A seguir, adicionou-se ao sobrenadante 300 µL de isopropanol para precipitação do DNA. Foi feita uma nova centrifugação por 5 min a 17.400 x g a 13 oC. O sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado com 500 µL de etanol 70% e, novamente, centrifugado durante 5 min a 17.400 x g a 13 oC. O
sobrenadante era descartado, o precipitado seco a 42 oC e ressuspenso em 30
µL de água destilada. A integridade do DNA foi observada após corrida eletroforética em gel de agarose e coloração com brometo de etídeo.
3.12. Digestão de DNA genômico de T. cruzi e de BACs e plasmídeos recombinantes
