Estudo do fator de crescimento endotelial vascular VEGF e da densidade de microvasos em osteossarcomas humanos

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ESTUDO DO FATOR DE CRESCIMENTO ENDOTELIAL

VASCULAR VEGF E DA DENSIDADE DE MICROVASOS EM

OSTEOSSARCOMAS HUMANOS

Tese apresentada à Universidade Federal

de São Paulo – Escola Paulista de

Medicina, para obtenção do Título de

doutor em Ciências.

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Marinho, Larissa Cardoso

Estudo do fator de crescimento endotelial vascular VEGF e da

densidade de microvasos em osteossarcomas humanos./ Larissa

Cardoso Marinho.--São Paulo, 2009.

Tese (Doutorado). Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Patologia.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA

Chefe do Departamento:

Profa. Dra Maria Teresa de Seixas Alves

Coordenador do Curso de Pós-graduação:

(4)

DEDICATÓRIA

Aos meus pais Marinho e Teresinha sempre presentes exemplos de amor, paciência, apoio e incentivo. À minha irmã, Luciana, pelo carinho e amizade. Ao meu filho e amor, Gabriel Augusto. Ao meu esposo Nei.

(5)

AGRADECIMENTOS

Os meus mais sinceros agradecimentos a todos que auxiliaram e incentivaram a execução deste trabalho, em especial:

Profa. Dra. Maria Teresa de Seixas Alves, a quem admiro como patologista e mais

ainda como pessoa. A quem as declarações de amor nunca serão suficientes. Agradeço a amizade, os ensinamentos e apoio incondicional em todos os momentos.

Profa. Dra. Francy Reis da Silva Patrício, agradeço pelos ensinamentos em patologia

pediátrica e pela dedicação principalmente durante o meu período de formação.

Prof. Dr. Marcello Fabiano Franco, por sua dedicação, incentivo e brilhantismo; pelo

apoio científico e amizade, influenciando minha formação humana, ética e profissional.

À Luciana Nakao Odashiro Miiji, médica patologista, pela ajuda na análise dos dados

deste trabalho.

À Leonor Cristina Manoja Roman, bióloga e colaboradora do laboratório de

Imuno-histoquímica da UNIFESP-EPM, obrigada pela padronização e realização das reações imuno-histoquímicas.

À Nathanael Pinheiro, pela atenção dispensada na análise estatística do material.

À todos os Docentes e médicos do Departamento de Patologia de UNIFESP-EPM que participaram da minha formação e influenciaram direta ou indiretamente a realização desse trabalho.

A Norberto Lobo e colaboradores do Departamento de Patologia da UNIFESP-EPM

pela presteza e colaboração.

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Aos médicos e colaboradores do Centro de Anatomia Patológica do Hospital

Universitário da Universidade de Brasília - UnB , obrigada pela amizade e

companheirismo durante o desenvolvimento deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Paulo Luiz C. Francescantonio , corpo docente e discente da faculdade

de medicina da Universidade Católica de Goiás - UCG, obrigada pelo apoio durante

o desenvolvimento deste trabalho.

A FAPESP pelo apoio financeiro.

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RESUMO

INTRODUÇÃO: O papel da angiogênese como indicador prognóstico em câncer é estudado frequentemente e resultados demonstram correlação entre angiogênese e prognostico em neoplasias malignas. Em osteossarcoma poucos estudos foram realizados e permanecem controversos. OBJETIVO: avaliar a densidade de microvasos (MVD) e a expressão do VEGF (vascular endothelial growth factor) como marcadores de angiogenese e a sua correlação com fatores prognósticos. MATERIAL E METODO: blocos de parafina de 50 pacientes pré-quimioterapia ( 22 deles metastáticos ao diagnostico) com osteossarcoma central de alto grau tratados na nossa instituição foram estudados pela técnica de imuno-histoquimica para VEGF e densidade de microvasos determinada por CD 34 e CD 31. A expressão de ambos foi correlacionada com aspectos clinicopatologicos e fatores relacionados ao prognostico (metástases e óbito). As neoplasias foram consideradas positivas para VEGF quando mais que 64,7% (media) das células demonstravam positividade. MVD foi obtida em cada caso pela média de contagem de microvasos em 10 campos de grande aumento (400x) em cada biopsia. Foi considerada alta e baixa usando a media como ponto de corte. RESULTADOS: apesar da alta vascularização não houve significância estatística entre MVD e fatores prognósticos para CD 31 e CD 34. Em relação ao VEGF houve correlação entre VEGF melhor sobrevida global e livre de doença para o total de pacientes. Quando separamos os pacientes metastaticos ao diagnostico os que foram VEGF negativos tiveram melhor sobrevida global e livre de doença. CONCLUSÃO: osteossarcomas são neoplasias bem vascularizadas e a imunoexpressão de VEGF dá informações prognosticas importantes principalmente em pacientes metastaticos ao diagnostico

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Distribuição dos pacientes com osteossarcoma,

de acordo com o sexo ...22

de acordo com a faixa etária ...22

de acordo com a localização óssea ...23

de acordo com o tamanho do tumor ...23

segundo o tipo de procedimento cirúrgico ...24

segundo o tempo de seguimento em meses ...24

segundo o seguimento clínico ...24

Tabela 8 - Distribuição dos pacientes com osteossarcoma, de acordo

com a presença de metástase ou não ao diagnóstico. ...25

Tabela 9 - Distribuição dos pacientes com osteossarcoma, de acordo

com o grau de necrose pós-quimioterapia, segundo Huvos ...25

Tabela 10 - Análise de aspectos clínicos e histológicos e a presença

ou não de metástase ao diagnóstico...26

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Tabela 11 – Distribuição dos pacientes com osteossarcoma

segundo a expressão do VEGF...31

Tabela 12 - Correlação entre imunoexpressão do VEGF

e o tamanho do tumor ...36

Tabela 13 - Correlação entre imunoexpressão do VEGF

e o tipo de cirurgia...36

Tabela 14 - Correlação entre a imunoexpressão do VEGF

e o grau de necrose ...36

Tabela 15 - Correlação da imunoexpressão do VEGF com o

desenvolvimento de metástase durante o seguimento ...37

Tabela 16 - Tabela descritiva para CD 31 e CD 34 ...37

Tabela 17 - Correlação entre a imunoexpressão do CD 31

e tipo de cirurgia ...41

e o tamanho do tumor ... 42

e o grau de resposta à quimioterapia ...42

Tabela 20 - Correlação da imunoexpressão do CD 31 com o

(10)

e o tipo de cirurgia ...46

Tabela 22 - Correlação da imunoexpressão do CD 34

e o tamanho do tumor ...47

e o grau de resposta à quimioterapia ...47

Tabela 24 - Correlação da imunoexpressão do CD 34 com o

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LISTA DE GRÁFICOS / FIGURAS

Gráfico 1 - Curva de Sobrevida global para o total de pacientes ... 28

Gráfico 2 - Curva de Sobrevida livre de doença para o total de pacientes ... ...28

Gráfico 3 - Curva de sobrevida global em relação à presença ou não de

metástase ao diagnóstico ... 29

Gráfico 4 - Curva de sobrevida global em relação à resposta pós quimioterapia :respondedores (graus I e II) e

não respondedores (graus III e IV) ... ... 30

Gráfico 5 - Curva de Sobrevida global de pacientes para pacientes VEGF acima e abaixo da média ... ...31

Gráfico 6 - Curva de Sobrevida global de pacientes com metástases ao diagnóstico e imunoexpressão do VEGF ... 32

Gráfico 7 - Curva de Sobrevida global de pacientes sem metástases ao diagnóstico e imunoexpressão do VEGF ... 32

Gráfico 8 - Curva de Sobrevida livre de doença para pacientes VEGF acima e abaixo da média ... . 33

Gráfico 9- Curva de Sobrevida livre de doença para pacientes VEGF acima e abaixo da média com metástases ao diagnóstico...34

Gráfico 10- Curva de Sobrevida livre de doença para pacientes VEGF acima e abaixo da média sem metástases ao diagnóstico...35

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Gráfico 11 - Curva de Sobrevida global de e a

imunoexpressão de CD 3.1...38 Gráfico 12 - Curva de Sobrevida global de pacientes sem metástases ao diagnóstico e

imunoexpressão do CD 31 ... ....39

Gráfico 13 - Curva de Sobrevida global de pacientes com metástases ao diagnóstico e imunoexpressão do CD 31 ... 39

Gráfico 14 - Curva de Sobrevida livre de doença para pacientes CD 31 acima e baixo da média com metástases ao diagnostico...40

Gráfico 15 - Curva de Sobrevida livre de doença para pacientes CD 31 acima e baixo da média sem metástases ao diagnostico...41

Gráfico 16 - Relação entre imunoexpressão de VEGF e CD 31 ...43

Gráfico 17 - Curva de Sobrevida global e a

imunoexpressão de CD 34... ...44 Gráfico 18- Curva de Sobrevida global de pacientes sem metástases ao diagnóstico e

imunoexpressão do CD 34 ... 44

Gráfico 19 - Curva de Sobrevida global de pacientes com metástases ao diagnóstico e imunoexpressão do CD 34 ... 45

Gráfico 20 – Curva de Sobrevida livre de doença de pacientes CD 34 acima e abaixo da média com metástases ao diagnostico...45

Gráfico 21 - Curva de Sobrevida livre de doença de pacientes CD 34 acima e abaixo da média sem metástases ao diagnostico...46

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Gráfico 22 - Relação entre imunoexpressão de VEGF e CD 34 ... .48

Figura 1 - Imunoexpressão de VEGF - 400X ... .67

Figura 2 - Imunoexpressão de VEGF - 400X ...67

Figura 3 - Imunoexpressão de Cd 31 - 400X ...68

Figura 4 - Imunoexpressão de Cd 34 - 400X ...68

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LISTA DE ABREVIATURAS

bFGF Fator de crescimento fibroblástico básico

Beta-FGF Fibroblast growth factor-beta

COOS Cooperative German Austrian Swiss Osteosarcoma Study Group

CXCR4 Chemokine (C-X-C motif) receptor 4

ELISA Enzimed-Linked Immunosorbent Assay

GRAACC Grupo de Apoio ao Adolescente e à Criança com Câncer

HIF-1α Fator de transcrição induzido pela hipoxia

IL-8 Interleucina-8

IOP Instituto de Oncologia Pediátrica

kDa Kilodalton

MDV Densidade de microvasos

OMS Organização mundial de saúde

POG Pediatric oncology group

PGF Fibroblast growth factor

Rb Gen supressor de tumor retinoblastoma

RNAm Acido ribonucléico mensageiro

RT-PCR Reverse transcription-polymerase chain reaction

SEER Surveillance, Epidemiology and End Results

SG Sobrevida global

SLE Sobrevida livre de eventos.

TGF B1 Fator de transformação de crescimento B1

TSP Trombospondina

VEGF Fator de crescimento endotelial vascular

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...1

1.1 Objetivos ...8

2 REVISÃO DE LITERATURA ...9

3 PACIENTES E MÉTODO ...17

3.1 Casuística ...17

3.2 Aspectos clínicos ...17

3.3. Anatomia patológica ...17

3.3.1 Estudo imuno-histoquímico ...19

3.4 Análise estatística ...20

3.4.1 Aspectos clínicos e histológicos ...20

3.4.2 Estudo imuno-histoquimico...21

3.5 Detalhamento da amostra (Anexo C) ...22

4 RESULTADOS ...26

4.1 Análise de aspectos clínicos e histológicos e a presença ou não de metástase ao diagnóstico ...26

4.2 Análise de sobrevivência ...27

4.2.1 Análise de sobrevivência, em relação a presença ou não de metástase ao diagnóstico ...29

4.2.2 Análise de sobrevivência, em relação à resposta (necrose) à quimioterapia ...30

4.3 Análise imuno-histoquímica – VEGF ...30

4.4 Análise da densidade de microvasos por CD 31 e CD 34...37

4.4.1 Análise imuno-histoquímica – CD 31 ...38

4.4.2 Análise imuno-histoquímica – CD 34 ...43

5 DISCUSSÃO ...49

6 CONCLUSÕES ...57

ANEXOS ...58

REFERÊNCIAS ...69

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1- INTRODUÇÃO

Osteossarcoma é a neoplasia maligna primaria óssea não hematopoetica mais comum (Fletcher et al 2002).

Informações dos registros de câncer de bases populacional (RCBP) sugerem que a incidência de osteossarcoma seja maior na população negra dos Estados Unidos da América, Itália, Brasil, Alemanha e Espanha (Parkin et al, 1988). Para o Brasil, a incidência do osteossarcoma, na faixa etária entre 10 e 14 anos, foi maior no RCBP de São Paulo ( Parkin et al ,1993) .

A etiologia do processo é incerta. Apesar da historia de trauma ser freqüente é possível que e evento apenas chame atenção para o tumor mais do que o cause. A doença de Paget óssea e a exposição à radiação por longo tempo têm sido associadas com o aumento da incidência do processo. Apesar de uma grande variedade de tumores e condições não neoplásicas serem associadas ao osteossarcoma à extrema raridade dessas associações sugerem que qualquer relação de causa-efeito é tênue (Fletcher et al, 2002).

Na experiência da clinica Mayo com 8.542 neoplasias ósseas primárias, osteossarcomas somaram 16% de todos os tumores e 19% de todas as neoplasias malignas do osso (Unni et al.,1986). Esta neoplasia abrange amplo espectro de lesões com características patológicas e clinicas distintas, com diferentes comportamentos biológicos.

De acordo com o padrão de crescimento as lesões podem ser subdivididas nas que se originam primariamente dentro do osso (osteossarcoma intramedular) e naquelas que crescem na superfície óssea (osteossarcoma de superfície) (Dorfman & Czerniak,1998). São considerados subtipos do central, o condroblastico, o osteoblastico,o fibroblastico, o telangiectásico, o intra-ósseo bem diferenciado (baixo grau) e o de células redondas. Entre os de crescimento periférico temos o parosteal (justacortical), o periosteal e o de superfície de alto grau (Fletcher et al, 2002)

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O sintoma mais comum é dor contínua por várias semanas ou meses que aumenta gradativamente em intensidade, acompanhada tumoração e limitação da movimentação.

Radiologicamente, a apresentação varia amplamente tendo como substrato anatomopatológico a diversidade de subtipos histológicos do tumor. A lesão pode ser completamente lítica ou esclerótica, porém ocorre com maior freqüência, uma combinação destas características.

Tradicionalmente, a idade, sexo, localização, tamanho de tumor, estadiamento e resultado de vários testes laboratoriais, são usados como fatores prognósticos. Contudo, a resposta à terapia pré-operatória ainda é o indicador mais sensível de sobrevida. Ao mesmo tempo é reconhecido que um parâmetro único não se aplica a todos os casos. A agressividade biológica ímpar associada à inabilidade de ressecar completamente o tumor em determinados sítios (por exemplo, crânio e vértebras) é um exemplo.Existem determinados locais (mandíbula, pelve) em que a resposta terapêutica não parece refletir o prognóstico apesar da capacidade de ressecção completa.

A morte de 80 a 90 % dos pacientes com metástases pulmonares apesar do tratamento pré-cirurgico e cirúrgico imediato e pulmões radiologicamente normais na ocasião do diagnostico implica em que micro-metástases pulmonares subclinicas estão presentes na grande maioria dos pacientes na ocasião do diagnostico.

A terapêutica contemporânea é multidisciplinar e incorpora cirurgia e quimioterapia. Com essa conduta o tempo livre de doença é de 60 a 80% permitindo o uso da cirurgia conservadora em mais de 80% dos pacientes e a sobrevida está diretamente relacionada à resposta a quimioterapia pré-operatória.

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O primeiro ensaio clinico para osteossarcoma no Brasil iniciou-se em 1982 no hospital do câncer em São Paulo. Este estudo utilizou protocolo quimioterapico com a administração de cisplatina e adriamicina intra-arterial e resultou em sobrevida livre de eventos (SLE) de 44,1%. Após esta experiência adicionaram-se altas doses de metotrexate. O segundo estudo foi conduzido entre 1987 e 1990 e a SLE foi de 65%.Identificaram-se como fatores relevantes com valor prognóstico o tamanho do tumor, o grau de necrose e tipo de cirurgia (Petrilli et al, 1991a). O terceiro estudo registrou pacientes de 1991 a 1996 e o quarto 1996 e 1999. Esses dois estudos foram analisados em conjunto e a sobrevida global (SG) em cinco anos, de 209 pacientes, foi de 50,1% a e SLE foi de 39%.Para pacientes com doença localizada sem metástases ao diagnostico, a SG a e SLE foi de 60,5% e 45% respectivamente (Petrilli et al, 2006). A análise multivariada demonstrou que os fatores prognósticos foram: metástases ao diagnostico (p<0,0001), grau de necrose I e II (p= 0,046) e tamanho do tumor (p= 0,0071).

O estudo da biologia do osteossarcoma torna-se importante devido à necessidade clinica de fatores prognósticos para estratificação do tratamento e do conhecimento de novos alvos moleculares que possam direcionar agentes terapêuticos no tratamento. Recentemente a proliferação vascular determinada ao diagnostico demonstrou ter valor prognóstico independente em diversas neoplasias malignas como mama, próstata e carcinomas gástricos.

A possibilidade de informação precoce e precisa sobre quais tumores especificamente encerram pior ou melhor prognóstico desperta grande interesse, considerando-se que poderiam ser estabelecidas condutas distintas para tumores com diferentes probabilidades de cura (Banner et al, 1998; Galindo-Gallego et al, 2000b). A angiogênese é processo fisiológico de neovascularização essencial para o desenvolvimento tissular, a reprodução e a cicatrização das feridas. O descontrole desse processo, entretanto tem sido observado em inúmeras doenças incluindo diabetes, artrites e as neoplasias (Cotran et al, 2000).

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entendimento de que neovascularização em neoplasias depende de mensageiros químicos que a medeiam e modulam surgiram nas ultimas 3 décadas principalmente a partir dos trabalhos pioneiros de Folkman (Folkman, J. 1971; Folkman, J. 1995 ; Folkman, J. 2002 )

Os recentes avanços no campo da genética e da biologia molecular fornecem base para compreensão da oncogênese, do crescimento tumoral e dos mecanismos de metástase. Assim, algumas pesquisas são conduzidas com finalidade de descobrir fatores que possam auxiliar no aperfeiçoamento da avaliação prognostica.

O processo de neovascularização é complexo e envolve a remodelação da matriz extracelular, a migração e proliferação endotelial, a diferenciação capilar e as anastomoses vasculares. O VEGF (“vascular endothelial growth factor”) é reconhecido como o principal elemento regulador da angiogênese fisiológica e patológica, apesar da existência de outras substâncias envolvidas nesse processo (Rak et al, 1996). Alguns mecanismos foram descritos como participantes na regulação do VEGF, entre esses, a baixa tensão de oxigênio, considerada como um dos principais estímulos para proliferação de microvasos, especialmente quando se trata de angiogênese tumoral (Ferrara & Davis-Smyth, 1997).

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al, 2002).São consideradas substâncias inibidoras: trombospondina-1 (TSP), angiostatina ,interferon alfa, fragmento de prolactina 16 –Kd, inibidores da metalo-proteinase, fator plaquetario 4, genisteína, fator beta de transformação do crescimento, heparina e talidomida ( Saito et al ,2001).

O desequilíbrio entre fatores angiogênicos e anti-angiogênicos que atuam nos receptores das células endoteliais, inicia o processo da angiogênese. As células endoteliais estimuladas ao crescimento secretam proteases que digerem a membrana basal proporcionando a abertura de orifícios por onde elas migram e se dividem, criando um novo capilar que cresce em direção ao local de onde provem o estimulo angiogênico. Com este estimulo mantido, as células endoteliais dividem-se e formam uma luz, desenvolvendo-se um capilar igual ao que o originou.

A angiogênese tumoral reflete a integração simultânea de fatores que afetam a migração endotelial, proliferação e diferenciação. A angiogênese influencia o crescimento tumoral através do efeito de perfusão e pelo efeito paracrino das células endoteliais nas células tumorais. Células endoteliais migrantes também facilitam a invasão local das células tumorais pela degradação da matriz extra-celular. E a formação de novos vasos possibilita a entrada de células neoplasicas na circulação possibilitando o aparecimento de metástases à distância. Muitos estudos já demonstram a correlação entre a densidade de microvasos ( MVD) com a expressão de fatores angiogênicos, crescimento tumoral e a ocorrência de metástases a distância, sugerindo que a MDV assim como a quantificação da morfologia vascular contem importantes informações quanto ao grau e funcionabilidade da vascularização tumoral (Vermeulein et al, 1996).

A contagem da densidade de microvasos tumoral revela-se como eficiente marcador prognóstico de vários tumores malignos como melanoma (Grahan et al., 1994) carcinoma de mama (Toli e al., 1993) e próstata (Weidner et al., 1993).

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endotelial, como sensível marcador de célula endoteliais (Maehara et al, 2000;Saito et al,2001).

VEGF, primeiramente descrito por Dvorak, 1995 é glicoproteina homodimerica ,com peso molecular e 34-43 kDa, sintetizada por células normais e hiperexpresso pela maior parte dos tumores humanos,sendo considerada potente fator angiogênico.VEGF é chave regulatória para angiogênese fisiológica e patológica ( Ferrara , 1997).Possui 5 isoformas e é predominantemente um mitogênico especifico para células endoteliais ( Ferrara , 1989)

Diversos estudos experimentais indicam que o VEFG tem ação mitogênica em receptores específicos na superfície de células endoteliais in vitro e angiogênica in vivo (Saito, Tsujitani, 2001). A expressão do VEGF é demonstrada pela indução da hipoxia.Transformação oncogênica Ras e Raf-1 também aumentam a sua expressão.Entretanto ,a expressão do VEGF é induzida em células tratadas com fator de crescimento epitelial, fator de crescimento plaquetário ou interleucina -6.Embora a região promotora do VEGF tenha numerosos sítios de fatores de transcrição ,a sua regulação ainda demanda estudos ( Yamamoto et al., 1998). A expressão do VEGF é representada por pelo menos cinco isoformas contendo 121, 145, 165,189 ou 206 aminoacidos,sendo a isoforma VEGF 165 a que predomina na maior parte das neoplasias ( Yu et al., 2002).

Estudos demonstram que o RNAm do VEGF regula a angiogênese da maioria dos tumores humanos ,como os do colon, pulmões, rins, bexiga, ovário, endométrio e as neoplasias hematológicas.

Recentemente a hiperexpressão de VEGF foi identificada como indicador prognóstico ruim em muitos tipos de neoplasias epiteliais como mama (Yoshiji et al, 1996) esôfago (Inoue et al, 1996), estômago (Maeda et al, 1996) e câncer colo retal (Takahashi et al, 1995).

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1.1 OBJETIVOS

1. Pesquisar e quantificar a imunoexpressão do VEGF e avaliar a densidade de microvasos utilizando CD 31e CD 34em osteossarcomas humanos.

2. Correlacionar os dados histopatológicos e imuno-histoquímicos entre si e aos dados clínicos.

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2 - REVISÃO DA LITERATURA

Lee et al, 1999 estudaram biopsias de 30 osteossarcomas sem quimioterapia

prévia. Examinaram nessas amostras a expressão do RNA mensageiro do VEGF, as isoformas do VEGF e os receptores de VEGF (ftt-1e KDR) através da técnica de RT-PCR em tecido congelado. A vascularização tumoral foi estimada através do estudo imuno-histoquímico do CD 34nos blocos de parafina. A contagem dos vasos foi avaliada num aumento de 200 vezes usando sistema de análise de imagem computadorizada e foi estabelecida a média do número de vasos.

Nesse estudo houve correlação significativa entre a presença de metástases e maior número de vasos e a expressão da isoforma VEGF 165.

Não houve associação entre a expressão da isoforma VEGF 165 e o tipo histológico e estadiamento do tumor. Também não houve associação entre a expressão dos receptores de VEGF e características clínicas ou vascularização tumoral.

Neste trabalho considera-se que as isoformas VEGF 165 e VEGF 189 estudadas e associadas ao prognóstico estão presentes sob a forma solúvel e também retidas na superfície celular agindo não só como fatores angiogênicos, mas também como estimuladores do crescimento via autócrina e parácrina usando para tal receptores nas superfícies das células dos osteossarcomas.O exame dos padrões das isoformas de VEGF é útil predizer o prognóstico.

Kaya et al, 2000 estudaram a significância clínica do VEGF em osteossarcoma através da imuno-histoquímica. Foram estudados 27 ostessarcomas primários ( pré- quimioterapia) em paciente com idade variando de 9 a 82 anos em esqueleto axial e ossos longos.Nesses pacientes foram correlacionados VEGF e densidade de microvasos a variáveis clinicopatológicas e sobrevida.

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comparados entre si, com a densidade de microvasos e com dados clinicopatológicos (idade, sexo, tipo histológico, estadiamento, resposta à quimioterapia e metástases pulmonares). Neste trabalho houve correlação entre tumores VEGF positivos e maior densidade de microvasos.Os vasos que eram positivos para o CD 34eram menores nos tumores VEGF negativos que nos VEGF positivos, indicando que alguns vasos induzidos pelo VEGF dão ao tumor maior área de tecido vascularizado.A taxa de metástases em pacientes VEGF positivos (82,35%) foi maior que nos VEGF negativos (10,0% )(p =0,003). Esse resultado sugere a possibilidade de que o VEGF seja marcador de metástases. Também houve correlação entre VEGF positivo e o sexo masculino ( p = 0,005) . A sobrevida em cinco anos de pacientes VEGF negativos foi de 90% assim como o tempo livre de doença contra uma taxa de 18,5% de tempo livre de doença e 38,5% para sobrevida dos pacientes VEGF positivos. Não houve correlação entre VEGF e idade, grau de necrose tumoral pos quimioterapia, subtipo histológico e estadiamento.

Holzer et al, 2001 estudaram a expressão de VEGF em 27 casos de tumores ósseos malignos (17 osteossarcomas de alto grau, 6 sarcomas de Ewing e 4 condrossarcomas) e compararam com grupo controle. A medida do VEGF foi feita no sangue periférico por ELISA no período pré-operatório. Apesar da média dos três grupos de pacientes com tumores serem maiores que a média verificada no grupo controle somente no sarcoma de Ewing essa diferença foi significativa. Não houve nenhuma correlação entre níveis de VEGF e a idade, sexo, tipo de tumor, tempo de história e metástases.

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usando regressão logística exploratória demonstraram que a única variável relacionada com a sobrevida foi a localização primária do tumor no fêmur. Nesse estudo concluiu-se que a neovascularização não prediz prognóstico em osteossarcomas osteoblásticos e fibroblásticos não metastáticos.

Sulzbaher et al, 2002 investigaram a expressão de osteopontina e VEGF em tumores ósseos benignos e malignos (11 osteoblastomas e 57 osteossarcomas de alto grau dentre eles 32 osteoblásticos, 15 condroblásticos, 6 anaplásicos, 2 fibroblásticos ,1 telangiectásico e 1 de pequenas células). Em relação aos osteossarcomas foram estudadas biopsias pré-cirúrgicas de pacientes com idade entre 6 a 65 anos. O estudo foi realizado em blocos de parafina avaliando-se a porcentagem de células positivas em cada lâmina do tumor. O número de células VEGF positivas variou de 5 a 90% (mediana 60%). Os casos foram posteriormente divididos em VEGF maiores que 60% e VEGF menores que 60% e correlacionados com a sobrevida geral, tempo livre de doença e dados clínicopatológicos. Em relação aos osteossarcomas nenhuma correlação foi encontrada entre a osteopontina ou VEGF e a idade, sexo, extensão tumoral, localização e resposta à quimioterapia.

O VEGF não se correlacionou com a sobrevida, mas houve tendência ( p= 0,0841) de que pacientes com VEGF acima de 60% tivessem menor sobrevida. Não houve correlação entre a expressão de osteopontina com o tempo livre de doença e a sobrevida global apesar de haver correlação entre a expressão de osteopontina e VEGF.

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microvasos. Os níveis de VEGF no soro também foram maiores nos pacientes que tinham VEGF positivo na biopsia do que nos VEGF negativos. Nesse trabalho sugere-se que a avaliação do VEGF pré-terapêutica tem valor em predizer a recaída precoce do osteossarcoma,

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diagnostico, e envolvimento das margens de ressecção não influenciaram na sobrevida. Quando os tumores pós-quimioterapia apresentaram mais que 25% de células tumorais positivas houve menor sobrevida (p= 0,019) e menor tempo livre de doença ( p= 0,009).

Ek et al, 2006 (a)estudaram retrospectivamente biopsias pré-quimioterapia de 25

pacientes portadores de osteossarcomas sem metástases ao diagnostico em relação à microdensidade vascular com imunofluorescencia e imuno-histoquimica para CD 34e CD 31e a angiogênese através do VEGF por imuno-histoquimica. Nesse estudo não houve significância estatística entre a microdensidade vascular ou imunoexpressão de VEGF e fatores clinicopatologicos (idade maior ou menor que 40 anos, sexo subtipo histológico, sitio primário e resposta a quimioterapia ) e evolução do paciente, ( recorrência ,metástases ou óbito ) . Os osteossarcomas de maneira geral tiveram alta expressão de VEGF o que o autor justificou como amostragem que corresponde radiologicamente a áreas de alto metabolismo que foram escolhidas pelos radiologistas para serem biopsiadas.

Ek et al, 2006 (b) estudaram a angiogênese através da microdensidade vascular tumoral por método imuno-histoquimico utilizando CD 31e CD 34e também avaliaram a proliferação vascular por VEGF em 46 pacientes com osteossarcoma sendo 11 deles com idade maior que 40 anos. Foi feita a correlação entre MVD e VEGF recorrência local, metástases e óbito em dois grupos: pacientes acima e abaixo de 40 anos. Detectou-se que MDV foi maior em pacientes acima de 40 anos de idade apesar de não ser estatisticamente significante. Não houve correlação entre a imunoexpressão de VEGF, a idade, metástases, recorrência local e óbito.

(29)

estudo pacientes VEGF positivos no sitio primário da lesão tiveram menor sobrevida que os VEGF negativos ( p= 0,0053). Demonstrou também que a expressão de CXCR4 era maior na metástase que no sitio primário nas não houve correlação da sua expressão com a sobrevida. A MDV foi maior na metástase que no sitio primário. Não houve correlação entre a MVD e o VEGF. Os tumores VEGF positivos demonstraram alto índice de proliferação pelo Ki-67 quando comparados aos tumores negativos. Os autores concluíram que a expressão de VEGF pode ser um dos fatores define o comportamento biológico do tumor.

Huang et al, 2008 estudaram através de imuno-histoquimica os níveis de αv

integrina e VEGF em blocos de parafina de 20 pacientes com osteossarcoma virgens de tratamento e em 31 peças cirúrgicas de pacientes que foram submetidas a quimioterapia ( adriamicina, cisplatina, ifosfamida ). Neste grupo em 13 pacientes conseguiram-se biopsias pré-quimioterapia e a peça cirúrgica. A expressão de integrinas e VEGF era maior nas neoplasias que no tecido ósseo normal, reduzindo-se de maneira dramática depois da quimioterapia. O estudo demonstrou que a expressão do VEGF e da αv-integrina em pacientes após quimioterapia, correlacionou-se à recaída e o estadiamento de ENNEKING. Não houve correlação com sexo, idade ,necrose tumoral ,subtipo histológico ou localização. A expressão de VEGF correlacionou-se com maior incidência de metástases.

Mizobuchi et al, 2008 estudaram por método imuno-histoquimico a expressão do

(30)

quando comparados com os de baixo grau. Nesse estudo não houve correlação entre a MVD e a imunoexpressão do VEGF. Em relação ao índice de proliferação celular não houve correlação entre Ki-67 e parâmetros clínicopatologicos avaliados (sexo, tipo histológico, localização do tumor primário, metástases ao diagnostico e grau de Huvos). As metástases estavam presentes em 61% de pacientes HIF-1α positivos.

Sorensen et al, 2008 estudaram a angiogênese, a resistência a drogas (MDR) e a

atividade proliferativa em 117 pacientes com osteossarcomas convencionais e não convencionais. A angiogênese foi avaliada pelo CD 34, a atividade proliferativa pelo MIB-1 e também foram avaliadas as imunoexpressões de p53 e MDR utilizando p-glicoproteina. O CD 34foi avaliado pela imuno-histoquimica em 95 pacientes de acordo com Vermeulein et al, 2002 e a contagem média de microvasos foi realizada em 3 campos considerados “hot spots”. Em relação à angiogênese o estudo não demonstrou correlação entre prognóstico e a vascularização neoplásica em osteossarcomas.Também não houve diferença entre a vascularização em tumores pré e pós-quimioterapia. Não houve correlação entre angiogênese e a expressão da p-glicoproteina em osteossarcomas; por isso os autores consideraram que o acesso dos quimioterapicos ao leito vascular tumoral não está associada à angiogênese.Neste estudo houve tendência a menor numero de microvasos em osteossarcomas não convencionais. Os autores ainda demonstraram que a quimioterapia diminuiu a quantidade de cirurgias radicais (amputações). A p–glicoproteina estava “super-expressa” em 48% das biopsias de osteossarcomas primários. Os tumores com altos níveis de p-glicoproteína pré-quimioterapia permaneciam com índices elevados na peça cirúrgica pós-quimioterapia. Demonstraram ainda que a proliferação celular avaliada MIB -1 diminuiu nas peças cirúrgicas pós-quimioterapia.

(31)

(32)

3- PACIENTES E MÉTODOS 3.1 Casuística

Entre 2000 e 2005, estudaram-se 50 pacientes com osteossarcomas acompanhados no Instituto de Oncologia Pediátrica (IOP)/ UNIFESP/EPM que foram submetidos a tratamento segundo o Protocolo Brasileiro Osteossarcoma 2000.

3.2Aspectos clínicos

Foram discriminados: idade, sexo, localização óssea, tamanho do tumor ( <12 cm e ≥ 12cm) ( Petrilli et. al, 2006) , tipo de tratamento cirúrgico, recidiva tumoral e a evolução clínica até dezembro de 2008, levando-se em consideração a presença ou não de metástases ao diagnóstico. Para a análise da sobrevida livre de doença e sobrevida global foram excluídos os pacientes com neoplasia em esqueleto axial.

3.3Anatomia patológica

O material de biopsia pré-quimioterapia estudado consistia de fragmentos cilíndricos de tecido ósseo obtidos do sitio primário da lesão pré-quimioterapia e previamente fixados em formal a 10% .Para o estudo anatomopatologico o material foi submetido à descalcificação em EDTA em temperatura ambiente.

Posteriormente foi feita a análise de lâminas coradas pela hematoxilina-eosina e pelo método imuno-histoquímico para os marcadores VEGF, CD 31 e CD 34. A avaliação foi feita pelo anatomopatologista sem o conhecimento da evolução dos pacientes.

(33)

− Desparafinização com xilol a quente (60°C) por 15 minutos e a temperatura ambiente por 15 minutos.

− Hidratação dos cortes histológicos em concentrações decrescentes de álcool a 100, 95, 80, e 70% respectivamente por 30 segundos cada.

− Lavagem das lâminas em água corrente e destilada.

− Cocção em panela de pressão para o VEGF e em microondas para o CD 34 e Cd 31, por 5 minutos após fervura em tampão citrato.

− Bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio a 6% diluído volume a volume com metanol, em 06 banhos de 05 minutos cada.

− Lavagem em água corrente, destilada e em solução salina tamponada com fosfatos (PBS 10mM pH 7,4).

− Incubação com anticorpo primário CD 34(monoclonal mouse anti-human ,clone QB-END/10 ,Dako, código M7165); CD 31(monoclonal mouse anti-human ,clone JC70A , Dako, IR610) e VEGF ( monoclonal mouse anti-VEGFA ,Santa Cruz, código SC7269 ) na diluição de 1:50 , 1:20 e 1:100 ,respectivamente ,em BSA (soro albumina bovina a 1%), durante a noite, a 4°C em câmara úmida.

− Lavagem em solução de PBS.

− Incubação em anticorpo secundário, biotinilado (LSAB-plus) do “kit” LSAB / HRP Duet Mouse / Rabbit Dako / código K0690, por 20 minutos a 37°C.

− Lavagem em solução de PBS.

− Incubação com o complexo estreptavidina-biotina-peroxidase por 20 minutos a 37°C.

− Revelação da reação utilizando-se o substrato cromógeno: 60 mg de Diaminobenzidina, 1 mL de água oxigenada a 20 volumes, 100 mL de PBS e 01 mL de dimetilsufóxido; durante 5 minutos a 37°C, ao ab rigo da luz, observando-se ao microscópio a formação do precipitado castanho-escuro, nas lâminas controle positivo, como produto final da reação.

(34)

− Posteriormente fez-se a desidratação em concentrações crescentes de álcool etílico a 70, 80,95 e 100%.

− Imersão das lâminas em xilol e montagem da lâmina com bálsamo (Entellan) para a leitura em microscopia óptica.

3.3.1 Estudo imuno-histoquimico

A imunoexpressão do VEGF, CD 34e CD 31 foi avaliada quantitativamente utilizando programa de análise de imagem equipado com software Image pro-plus versão 3.0 para Windows ,da media Cybernetic. As imagens foram obtidas através de microscópio Olympus Bx40, acoplado a videocâmara Sony _CCD-IRIS

,modelo DXC-107 e transferidas para computador (Pentium  233 Mhz) com placa digitalizadora de imagens.Procedeu-se a contagem das células de maneira interativa ,com aumento de 400x ,iniciando-se na área mais positiva da amostra ,com observação dos demais campos consecutivos.

Avaliação da densidade de microvasos

A avaliação angiogênese foi realizada utilizando-se método proposto por Mantadakis et al, 2001. Para a quantificação da microvascularização todas as lâminas foram avaliadas em menor aumento (100x) para a identificação das áreas com maior número de vasos sanguíneos dentro do tumor. Posteriormente, passou-se para aumento de 400x computando-se o numero de vasos por campo, em dez campos consecutivos de cada lâmina. Células endoteliais únicas ou agrupamento de células endoteliais, com ou sem lúmen foram consideradas como vasos individualmente (figuras 3 e 4). A contagem foi expressa como número total de microvasos.

(35)

expressa pela contagem de microvasos por campo de 400x (microscópio Olympus BX40). A média dos valores foi usada subdividindo-se os vasos em dois subgrupos. Neste trabalho a média para CD 31 foi de 65,5 microvasos e para CD 34 foi de 65,45 microvasos .

Em todo o estudo foram considerados valores baixos para o CD 31 valores menores que 65,5 microvasos e altos valores maiores ou iguais a 65,5 microvasos. Foram considerados valores baixos para o CD 34 valores menores que 65,45 e altos valores maiores ou iguais a 65,45 microvasos .

Avaliação da imunoexpressão do VEGF

A expressão do VEGF foi considerada positiva na célula cuja membrana citoplasmática ou citoplasma exibisse colorido castanho. A partir de áreas com maior positividade para o marcador foram contadas células em 10 campos consecutivos de aumento de 400x e posteriormente até completar um total de 1000 células neoplásicas (figuras 1 e 2). Da relação entre as células neoplásicas positivas e o numero total de células analisadas, multiplicada por 100, obteve-se o percentual de imunoexpressão em cada caso.

Para análise estatística os casos foram subdivididos posteriormente em duas categorias utilizando-se o valor médio da expressão do marcador (VEGF < média e VEGF ≥ média ). Foram considerados altos os índices de VEGF com valor ≥ 64,7% e baixos índices de VEGF valores < 64,7%

3.4 Análise estatística

Toda essa análise foi calculada utilizando-se o programa Prism 5.0, GraphPad Software Inc., San Diego CA, USA, 2003.

3.4.1. Aspectos clínicos e histológicos

(36)

de Fisher (tipo de cirurgia, sexo, grau de necrose, localização da neoplasia primaria, recaída e seguimento do pacientes); o Teste T de Student (t) (idade e tempo de acompanhamento), o teste do Qui-quadrado (tipo histológico e a localização do tumor) e a correlação de Spearman (densidade de microvasos e VEGF).

Os resultados foram submetidos à análise estatística com a finalidade de determinar se a densidade de microvasos e a expressão do VEGF são capazes de interferirem no prognóstico dos osteossarcomas, considerando-se significativos valores de p < 0,05.

Curvas de sobrevida

Todas as curvas de sobrevida foram construídas de acordo com a técnica de Kaplan-Meier e estão expressas em fração de sobrevida (sobrevida livre de doença – SLD – ou sobrevida global – SG) versus tempo em meses. A comparação entre as curvas foi feita usando o teste de Log-rank.

As curvas gerais foram construídas considerando SLD ou SG versus presença ou ausência de metástase ao diagnóstico.

As curvas de sobrevida com base nos marcadores imuno-histoquímicos foram feitas de três formas: (a) geral, considerando-se todos os casos, com ou sem metástase ao diagnóstico; (b) considerando-se somente os casos sem metástase ao diagnóstico e (c) apenas os casos com metástase ao diagnóstico.

3.4.2. Estudo Imuno-histoquímico

(37)

3.5 DETALHAMENTO DA AMOSTRA (ANEXO C)

Do total de 50 osteossarcomas analisados, 30 (60%) eram do sexo masculino e 20 (40%) do feminino (Tabela 1).

TABELA 1– DISTRIBUIÇÃO DOS PACIENTES COM OSTEOSSARCOMA ACORDO

COM O SEXO.

Sexo _N %

Masculino 30 60

Feminino 20 40

Total 50 100,0

O paciente mais novo tinha cinco anos e o mais velho 29 anos, com mediana de 15 anos (Tabela 2).

TABELA 2 – DISTRIBUIÇÃO DOS PACIENTES COM OSTEOSSARCOMA DE

ACORDO COM A FAIXA ETÁRIA.

Média Mediana Mínimo Máximo

IDADE 15,4 15 5,00 29,00

(38)

TABELA 3 – DISTRIBUIÇÃO DOS PACIENTES COM OSTEOSSARCOMA DE ACORDO COM A LOCALIZAÇÃO ÓSSEA.

O tamanho do tumor foi obtido em 48 osteossarcomas sendo que 18 (36 %) tinham menos de 12 cm e 30 (60 %) eram maiores ou iguais a 12 cm (Tabela 4).

ACORDO COM O TAMANHO DO TUMOR

Tamanho N %

<12 cm 18 36

> ou igual a 12 cm 30 60

Não informado 2 4

Total 50 100,0

Em 45 casos foram realizados procedimentos cirúrgicos nessa instituição, sendo que 36 (80%) fizeram cirurgia conservadora e 9 (20%) foram submetidos à cirurgia não conservadora (tabela 5).

LOCALIZAÇÃO N %

Fêmur 28 56

Tíbia 16 32

Úmero 2 4

Outras 4 8

(39)

TABELA 5 – DISTRIBUIÇÃO DOS PACIENTES COM OSTEOSSARCOMA SEGUNDO O TIPO DE PROCEDIMENTO CIRÚRGICO

Procedimento Cirúrgico N %

Conservadora 36 80

Não Conservadora 9 20

Total 45 100,0

O tempo mínimo de acompanhamento do paciente foi de 7,9 meses e o máximo foi de 94,6 meses com média de 45,1 meses (Tabela 6).

TABELA 6 – DISTRIBUIÇÃO DOS PACIENTES COM OSTEOSSARCOMA

SEGUNDO O TEMPO DE SEGUIMENTO EM MESES

Média Mínimo Máximo

TEMPO 45,1 7,9 94,6

O ultimo “follow-up” dos pacientes está discriminado na tabela 7.

TABELA 7 – DISTRIBUIÇÃO DOS PACIENTES COM OSTESSARCOMA SEGUNDO

O SEGUIMENTO CLÍNICO

Seguimento N %

Óbito 25 50

Remissão completa 22 44

Recaída 2 4

Perda de follow -up 1 2

(40)

Dos 50 pacientes analisados, 22 tinham metástases ao diagnostico (44%) e 28 (56% ) não apresentavam metástases ao diagnostico. A tabela 8 demonstra distribuição desses pacientes (tabela 8).

ACORDO COM A PRESENÇA DE METÁSTASE OU NÃO AO DIAGNÓSTICO.

Metástase N %

Sim 22 44

Não 28 56

Total ₅₀ _100,0

Em 48 pacientes obtivemos informação clínica do grau de necrose pós quimioterapia (tabela 9).

ACORDO COM GRAU DE NECROSE PÓS-QUIMIOTERAPIA SEGUNDO HUVOS.

Grau de Necrose pós QT N %

I 24 48

II 6 12

III 10 20

IV

Não informado

8 2

16 4

(41)

4 RESULTADOS

4.1 Análise de aspectos clínicos e histológicos e a presença ou não de metástases ao diagnostico

Na tabela 10 demonstra-se que no grupo de pacientes não metastaticos ao diagnostico a maior parte dos pacientes teve boa resposta ao tratamento quimioterápico ( grau III e IV de Huvos) (p= 0,0010).

TABELA 10 - ANÁLISE DE ASPECTOS CLINICOS E HISTOLÓGICOS E A

PRESENÇA OU NÃO DE METÁSTASES AO DIAGNOSTICO.

continua na pagina seguinte

Grupos

Geral Sem metástase Com metástase Valor de p

Sexo

Masculino 30 (60%) 18 (64,3%) 12 (54,5%) > 0,05

Feminino 20 (40%) 10 (35,7%) 10 (45,5%)

Necrose

GI 24 (48,0%) 10 (35,7%) 14 (63,7%) 0,0010

GII 6 (12,0%) 2 (7,1%) 4 (18,3%) GI-II vs III-IV

GIII 10 (20,0%) 9 (32,2%) 1 (4,5%)

GIV 8 (16,0%) 7 (25,0%) 1 (4,5%)

Não informado 2 (4,0%) 0 2 ( 9,0%)

Localização do tumor primário

Fêmur 28 (56,0%) 17 (60,7%) 11 (50,0%) >0,05

Tíbia 16 (32,0%) 8 (28,6%) 8 (36,4%)

Úmero 2 (4,0%) 1 (3,6%) 1 (4,5%)

Outros 4 ( 8,0%) 2 ( 7,2%) 2 ( 9,0%)

Tipo de cirurgia

Não conservadora 9 (18,4%) 3 (11,1%) 6 (27,3%) >0,05

Conservadora 36 (73,5%) 24 (88,9%) 12 (54,5%)

Recaída

Ausente 23 (46%) 15 (53,6%) 8 (36,4%) >0,05

Pulmão 10 (20%) 4 (14,3%) 6 (27,3%)

Pulmão e Local 4 (8%) 1 (3,6%) 3 (13,6%)

Local 4 (8%) 3 (10,7%) 1 (4,5%)

Outras 7 (14%) 5 (17,9%) 2 (9,1%)

(42)

Tamanho do tumor

< 12cm 18 (36%) 13 (46,4%) 5 (22,7%) >0,05

≥ 12cm 30 (60%) 15 (53,6%) 15 (68,2%)

Não informado 2 (4%) 0 2 (9,1%)

Seguimento

Recaída 2 (4,0%) 1( 3,5%) 1( 4,5%) >0,05

Óbito 25 (50%) 11(39,3%) 14 ( 63,6%)

Remissão 22(44%) 15 (53,7%) 7 ( 31,9%)

Perda 1 (2%) 1 ( 3,5%) 0

Tipo histológico

Osteoblástico 30 (68,18%) 21( 80,76%) 9 ( 50%) >0,05

Condroblástico 10 (22,72%) 3( 11,53%) 7 ( 38,88%)

Fibroblástico 2 (4,54%) 1( 3,84%) 1 ( 5,55%)

Teleangiectásico _{1 (2,25%)} _{1 ( 3,84%)} ₀

Pequenas Células 1 (2,25%) 0 1 ( 5,55%)

4.2 ANÁLISE DA SOBREVIVÊNCIA

Para a análise da sobrevida global e livre de eventos excluímos dois pacientes com neoplasia localizada em esqueleto axial (gráfico 1 e 2).

(43)

GRAFICO 1 - CURVA DE SOBREVIDA GLOBAL PARA O TOTAL DE PACIENTES:

GRÁFICO 2 - CURVA DE SOBREVIDA LIVRE DE DOENÇA PARA O TOTAL DE

PACIENTES:

0 20 40 60 80 100

GERAL N: 48

S o b re vi vê n ci a a cu m u la ti va %

0 20 40 60 80 100

(44)

4.2.1 ANÁLISE DA SOBREVIDA EM RELAÇÃO À PRESENÇA OU NÃO DE METÁSTASES AO DIAGNOSTICO:

Quando comparamos a influencia da presença de metástases ao diagnostico com a sobrevida global, observa-se que pacientes com metástase ao diagnostico têm pior sobrevida do que aqueles sem metástases ao diagnostico (p= 0,003 ) – Gráfico 3

GRÁFICO 3 - CURVA DE SOBREVIDA GLOBAL EM RELAÇÃO À PRESENÇA OU

NÃO DE METÁSTASE AO DIAGNÓSTICO.

0 20 40 60 80 100

0 20 40 60 80 100 Não metastaticos Metastaticos S o b re vi vê n ci a a cu m u la ti va ( % )

p= 0,00366

(45)

4.2.2 ANÁLISE DA SOBREVIVENCIA EM RELAÇÃO A RESPOSTA À QUIMIOTERAPIA:

Quando comparamos a sobrevida dos pacientes em relação ao grau de resposta a quimioterapia observa-se que pacientes bons respondedores ( graus III e IV) tiveram maior sobrevida global que os não respondedores ( graus I e II ) ( p= 0,006 ) – gráfico 4

GRÁFICO 4 - CURVA DE SOBREVIDA GLOBAL EM RELAÇÃO À RESPOSTA PÓS

QUIMIOTERAPIA :RESPONDEDORES (GRAUS I E II) E NÃO RESPONDEDORES (GRAUS III E IV).

4.3 ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA - VEGF

O VEGF foi expresso em percentagem. A média para os casos foi de 64,7%.A

maior parte dos casos analisados (70%) expressou o marcador (tabela 11).

S

o

b

re

vi

vê

n

ci

a

cu

m

u

la

ti

va

(

%

)

(46)

TABELA 11 – DISTRIBUIÇÃO DOS PACIENTES COM OSTEOSSARCOMA SEGUNDO A EXPRESSÃO DO VEGF.

VEGF N %

≥ 64,7% ₃₅ ₇₀

< 64,7% ₁₅ ₃₀

Total 50 100,0

CURVAS DE SOBREVIDA E IMUNOEXPRESSÃO DE VEGF

Observa-se no gráfico abaixo que para o total de pacientes aqueles com VEGF acima ou igual à média tiveram pior sobrevida global (gráfico 5).

GRÁFICO 5 - CURVA DE SOBREVIDA GLOBAL PARA PACIENTES VEGF ACIMA E

ABAIXO DA MEDIA.

Quando separamos para análise pacientes VEGF acima e abaixo da média com e sem metástases ao diagnostico observamos que para aqueles VEGF abaixo da média metastaticos ao diagnóstico obtivemos melhor sobrevida global (gráfico 6).Para os

0 20 40 60 80 100

0 20 40 60 80 100 < 64,7% ≥ 64,7%

(47)

pacientes sem metástases ao diagnostico não houve significância estatística (gráfico 7).

GRÁFICO 6- CURVA DE SOBREVIDA GLOBAL DE PACIENTES COM METÁSTASES

AO DIAGNOSTICO E IMUNOEXPRESSÃO DO VEGF.

GRÁFICO 7 - CURVA DE SOBREVIDA GLOBAL DE PACIENTES SEM METÁSTASES

AO DIAGNOSTICO E IMUNOEXPRESSÃO DO VEGF.

0 2 0 4 0 6 0 8 0 10 0 0 20 40 60 80 100 < 64,7%

≥ 64,7%

p=0,0059

MESES

0 20 40 60 80 100

0 20 40 60 80 100 p=0,9350 MESES S o b re vi vê n ci a a cu m u la ti va

(48)

Observa-se no gráfico 8 que para o total de pacientes, aqueles com VEGF acima ou igual a média tiveram maior probabilidade de eventos.

GRÁFICO 8- CURVA DE SOBREVIDA LIVRE DE DOENÇA PARA PACIENTES VEGF

ACIMA E ABAIXO DA MÉDIA.

0 20 40 60 80 100

< 64, 7%

p=0,0457

P

ro

b

ab

ili

d

ad

e

liv

re

d

e

ev

en

to

s

≥ 64,7%

(49)

Quando separamos para análise pacientes VEGF acima e abaixo da média com e sem metástases ao diagnóstico observamos que para aqueles VEGF com valor inferior a 64,7% metastáticos ao diagnóstico obtivemos melhor sobrevida livre de eventos ( gráfico 9).Para os pacientes sem metástases ao diagnóstico não houve significância estatística em relação à sobrevida livre de eventos (gráfico 10).

GRÁFICO 9- CURVA DE SOBREVIDA LIVRE DE DOENÇA PARA PACIENTES VEGF

ACIMA E ABAIXO DA MÉDIA COM METÁSTASES AO DIAGNOSTICO

0 2

0 40 60 80 100

0 20 40 60 80 100

< 64,7%

≥ 64,7%

p=0,0188

P

ro

b

ab

ili

d

ad

e

liv

re

d

e

ev

en

to

s

(50)

GRÁFICO 10- CURVA DE SOBREVIDA LIVRE DE DOENÇA PARA PACIENTES VEGF ACIMA E ABAIXO DA MÉDIA SEM METÁSTASES AO DIAGNOSTICO.

Quando comparamos a expressão do VEGF com o tamanho do tumor observamos que houve tendência a que tumores maiores o ou iguais a 12 cm tivessem VEGF com valor menor que 64,7% (tabela 12). Em relação ao tipo de cirurgia e resposta à quimioterapia não encontramos correlação significativa com a expressão do VEGF ( tabelas 13 e 14) .

0 20 40 60 80 100

< 64,7% ≥ 64,7%

P

ro

b

ab

ili

d

ad

e

liv

re

d

e

ev

en

to

s

p=0,6793

(51)

TABELA 12 – CORRELAÇÃO DA IMUNOEXPRESSÃO DO VEGF E O TAMANHO DO TUMOR

TAMANHO DO TUMOR

<12cm TAMANHO DO TUMOR ≥12cm

VEGF < 64,7% 9 24

≥ 64,7% 9 6

p=0,0523

TABELA 13 - CORRELAÇÃO DA IMUNOEXPRESSÃO DO VEGF E TIPO DE

CIRURGIA

CIRURGIA

CONSERVADORA CONSERVADORA CIRURGIA

NÃO-VEGF < 64,7% 12 2

≥ 64,7% 24 7

p =0,6976

TABELA 14 – CORRELAÇÃO DA IMUNOEXPRESSÃO DO VEGF E GRAU DE

NECROSE

GRAU DE NECROSE GI E GII

GRAU DE NECROSE GIII E GIV

VEGF < 64,7% 21 12

≥ 64,7% 9 6

(52)

Quando selecionamos pacientes não-metastaticos ao diagnostico e correlacionamos a expressão do VEGF com o evento metástases durante o seguimento clinico não encontramos correlação dos pacientes com a expressão do VEGF e o desenvolvimento de metástases (tabela 15).

TABELA 15 – CORRELAÇÃO DA IMUNOEXPRESSÃO DO VEGF COM O

DESENVOLVIMENTO DE METÁSTASES DURANTE O SEGUIMENTO.

COM METÁSTASES

NA EVOLUÇÃO SEM METÁSTASES NA EVOLUÇÃO

VEGF < 64,7% 3 5

≥ 64,7% 9 10

p=0,6957

4.4 ANÁLISE DA DENSIDADE DE MICROVASOS POR CD 31E CD 34

Em relação ao CD 31e CD 34a contagem de microvasos foi expressa pela contagem média de microvasos por campo de 400x. A média dos valores foi usada para estabelecer o que era MVD alta (≥ média) e baixa (< média) (tabela 16).

TABELA 16 - TABELA DESCRITIVA PARA CD 31E CD 34

Marcador Mediana (média) Desvio padrão Valor de corte

66 BAIXO <65,5

Cd31

(65,5) 26,2 ALTO ≥ 65,5

67 BAIXO <65,45

CD 34

(53)

4.4.1 ANÁLISE IMUNO-HISTOQUIMICA - CD 31

Os gráficos na seqüência demonstram que a expressão de CD 31acima e abaixo da media não esteve relacionada à sobrevida global para o total de pacientes e também quando separamos pacientes metastaticos e não metastaticos ao diagnostico (gráficos 11,12 e13) .

GRÁFICO 11 – CURVA DE SOBREVIDA GLOBAL E A IMUNOEXPRESSÃO DE CD

31.

0 20 40 60 80 100

0 20 40 60 80 10 0 CD 31<65,6 CD 31≥ 65,5

MESES S o b re vi vê n ci a a cu m u la ti va %

(54)

GRÁFICO 12 – CURVA DE SOBREVIDA GLOBAL DE PACIENTES SEM METÁSTASES AO DIAGNÓSTICO E A IMUNOEXPRESSÃO DE CD 31.

GRÁFICO 13 - CURVA DE SOBREVIDA GLOBAL DE PACIENTES COM

METÁSTASES AO DIAGNÓSTICO E A IMUNOEXPRESSÃO DE CD 31. p= 0,5965

p= 0,3462

0 20 40 60 80 100

0 20 40 60 80 100 <65,5% >65,5% MESES S o b re vi vê n ci a ac u m u la ti va %

0 20 40 60 80 100

(55)

Os gráficos abaixo demonstram que a expressão de CD 31 acima e abaixo da média também não esta relacionada à sobrevida livre de eventos para pacientes metastáticos e não metastáticos ao diagnostico ( gráficos 14 e 15).

GRÁFICO 14 - CURVA DE SOBREVIDA LIVRE DE DOENÇA PARA PACIENTES CD

31ACIMA E BAIXO DA MÉDIA COM METÁSTASES AO DIAGNOSTICO.

0 20 40 60 80 100

0 20 40 60 80 100 < 65,5% > 65,5% MESES P R O B A B IL ID A D E L IV R E D E E V E N T O S

(56)

GRÁFICO 15 - CURVA DE SOBREVIDA LIVRE DE DOENÇA PARA PACIENTES COM CD 31ACIMA E BAIXO DA MÉDIA SEM METÁSTASES AO DIAGNOSTICO.

Quando comparamos a expressão do CD 31com o tipo de cirurgia, tamanho do tumor e grau de resposta à quimioterapia não encontramos correlação significativa ( tabelas 17 ,18 e 19).

TABELA 17 - CORRELAÇÃO ENTRE A IMUNOEXPRESSÃO DO CD 31

E O TIPO DE CIRURGIA

CIRURGIA

NÃO-CD 31 < 65,5 17 3

≥ 65,5 17 4

p=1,000

0 20 40 60 80 100

0 20 40 60 80 100 < 65,5% > 65,6% MESES P ro b ab ili d ad e liv re d e ev en to s

p= 0,9680

(57)

TABELA 18 - CORRELAÇÃO ENTRE A IMUNOEXPRESSÃO DO CD 31 E O TAMANHO DO TUMOR.

≥12cm

TAMANHO DO TUMOR <12cm

CD 31 < 65,5 13 8

≥ 65,5 14 8

p = 1,000

TABELA 19 – CORRELAÇÃO ENTRE A IMUNOEXPRESSÃO DO CD 31

E O GRAU DE RESPOSTA À QUIMIOTERAPIA.

CD 31 < 65,5 13 9

≥ 65,5 14 8

p = 1,000

Quando selecionamos pacientes não-metastaticos ao diagnostico e correlacionamos a imunoexpressão do CD 31 com o evento metástases durante o seguimento clinico não encontramos correlação dos pacientes com a expressão do CD 31 e o desenvolvimento de metástases (tabela 20).

TABELA 20 – CORRELAÇÃO DA IMUNOEXPRESSÃO DO CD 31COM O

DESENVOLVIMENTO DE METÁSTASE DURANTE O SEGUIMENTO.

CD 31 METÁSTASES NA EVOLUCÃO

SIM NÃO

< 65,5 2 6

≥ 65,5 2 11

(58)

No gráfico 16 observa-se que existe correlação entre O VEGF e a expressão de CD 31 no teste de Spearman (P= 0,0186).

GRAFICO 16 - RELAÇÃO ENTRE A IMUNOEXPRESSÃO DE VEGF E CD 31.

4.4.2 ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA - CD 34

Os gráficos na seqüência demonstram que a expressão de CD 34acima e abaixo da média não esteve relacionada à sobrevida global para o total de pacientes e também quando separamos pacientes metastáticos e não metastáticos ao diagnóstico ( gráficos 17,18 e19) .

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00

0 25 50 75 100 125 150

p= 0,0186

C

D

31

(59)

GRÁFICO 17 - SOBREVIDA GLOBAL E A IMUNOEXPRESSÃO DE CD 34

GRÁFICO 18 - CURVA DE SOBREVIDA GLOBAL DE PACIENTES SEM

METÁSTASES AO DIAGNÓSTICO E IMUNOEXPRESSÃO DO CD 34.

p= 0,3563

0 20 40 60 80 100

0 20 40 60 80 100 < 65,45% >65,45% MESES S o b re vi vê n ci a ac u m u lt iv a %

p= 0,9932

0 20 40 60 80 100

(60)

GRÁFICO 19 - CURVA DE SOBREVIDA GLOBAL DE PACIENTES COM METÁSTASES AO DIAGNÓSTICO E IMUNOEXPRESSÃO DO CD 34.

Os gráficos na seqüência demonstram que a expressão de CD 34 acima e abaixo da média também não esta relacionada à sobrevida livre de eventos para pacientes metastáticos e não metastáticos ao diagnostico (gráficos 20 e 21).

GRÁFICO 20 - CURVA DE SOBREVIDA LIVRE DE DOENÇA DE PACIENTES CD 34

ACIMA E ABAIXO DA MÉDIA COM METÁSTASES AO DIAGNOSTICO.

p= 0,3462

0 20 40 60 80 100

0 20 40 60 80 100 <65,45% >65,45% P ro b ab ili d ad e liv re d e ev en to s

p= 0,4376

0 20 40 60 80 100

(61)

GRÁFICO 21 - CURVA DE SOBREVIDA LIVRE DE DOENÇA DE PACIENTES CD 34 ACIMA E ABAIXO DA MÉDIA SEM METÁSTASES AO DIAGNOSTICO.

Quando comparamos a expressão do CD 34acima e abaixo da média com o tipo de cirurgia, tamanho do tumor e grau de resposta a quimioterapia não encontramos correlação significativa ( tabelas 21 ,22 e 23).

E O TIPO DE CIRURGIA

CIRURGIA

NÃO-CD 34 < 65,45% 17 3

≥ 65,45% 18 4

p =1,0000

0 20 40 60 80 100

0 20 40 60 80 100 < 65,45% > 65,45% MESES P ro b ab ili d ad e liv re d e ev en to s

(62)

TABELA 22 – CORRELAÇÃO DA IMUNOEXPRESSÃO DO CD 34 E O TAMANHO DO TUMOR.

≥12cm

TAMANHO DO TUMOR <12cm

CD 34 < 65,45% 12 9

≥ 65,45% 15 9

p =0,7674

E O GRAU DE RESPOSTA À QUIMIOTERAPIA.

CD 34 < 65,45% 12 8

≥ 65,45% 15 9

p =1,000

Quando selecionamos pacientes não-metastaticos ao diagnóstico e correlacionamos a imunoexpressão do CD 34com o evento metástases durante o seguimento clinico não encontramos correlação dos pacientes com a expressão do CD 34e o desenvolvimento de metástases ( tabela 24).

TABELA 24 – CORRELAÇÃO DA IMUNOEXPRESSÃO DO CD 34COM O

DESENVOLVIMENTO DE METÁSTASE DURANTE O SEGUIMENTO

CD 34 METÁSTASES NA EVOLUCÃO

SIM NÃO

< 65,45% 2 7

≥ 65,45% 2 10

(63)

No gráfico 22 observa-se que existe correlação entre O VEGF e a expressão de CD 34no teste de Spearman (p= 0,0182).

GRAFICO 22 - RELAÇÃO ENTRE IMUNOEXPRESSÃO DE VEGF E CD 34.

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00

0 25 50 75 100 125 150

C

D

3

4 p= 0,0182