Influência dos polimorfismos no receptor beta 2 adrenérgico na presença de broncoespasmo induzido pelo exercício em adolescentes.

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REVISTA

PAULISTA

DE

PEDIATRIA

ARTIGO

ORIGINAL

Influência

dos

polimorfismos

no

receptor

beta

2

adrenérgico

na

presenc

¸a

de

broncoespasmo

induzido

pelo

exercício

em

adolescentes

夽

Cássio

Leandro

Mühe

Consentino

,

Lupe

Furtado-Alle

,

Larissa

Rosa

da

Silva

,

Wendell

Arthur

Lopes

_,

_Luciane

_Viater

_Tureck

_,

_Gerusa

_Einsfeld

_Milano

_,

Leilane

Lazarotto

_,

_Cláudia

_Regina

_Cavaglieri

_e

_Neiva

_Leite

a_{UniversidadeFederaldoParaná(UFPR),Curitiba,PR,Brasil} b_{UniversidadeEstadualdeMaringá(UEM),Ivaiporã,PR,Brasil} c_{UniversidadeEstadualdeCampinas(Unicamp),Campinas,SP,Brasil}

Recebidoem2demarçode2015;aceitoem9dejunhode2015 DisponívelnaInternetem9deoutubrode2015

PALAVRAS-CHAVE

Adolescente; Broncoespasmo induzidopelo exercício; GeneADRB2

Resumo

Objetivo: Determinar a influência dos polimorfismos dos receptores adrenérgicos beta 2 (ADRB2)nodesencadeamentodebroncoespasmoinduzidopeloexercício(BIE)emadolescentes.

Métodos: Ossujeitosforamdivididosemdoisgrupos:BIEpresente(BIE+)(n=45)eBIEausente (BIE−)(n=115).Otestedebroncoprovocac¸ãocomexercíciofoifeitocomprotocoloque con-sistiuemcaminhar/correrdurantenomínimooitominutosemintensidadesuperiora85%da frequênciacardíacamáxima,considerandocomoBIEpresenteumaquedade10%dovolume expiratórioforc¸adonoprimeirosegundo(VEF1).AgenotipagemdogeneADRB2foifeitapelo

métodoTaqmanpormeiodoaparelhoStepOnePlus.Paraanáliseestatísticausaram-seostestes

tindependente,UdeMann-Whitney,qui-quadradoecoeficientedecorrelac¸ãodeSpearman.

Resultados: Idade,massa corporal,estatura, VEF1,CVFerelac¸ão VEF1/CVF forammenores

nogrupo BIE+em comparac¸ãocomo BIE− (p<0,05).Nãohouve diferenc¸assignificativasna proporc¸ãodoalelonaposic¸ão 27edosgenótiposArg16GlyeGln27GluentreosgruposBIE+ eBIE−(p=0,26;p=0,97ep=0,43,respectivamente).Entretanto,verificou-seumatendênciaà significânciaestatísticanamaiorproporc¸ãodoaleloGly16paraogrupoBIE+comparadocomo BIE−(p=0,08).

Conclusões: Apresenc¸adepolimorfismosassociadosao aleloGlu27eosgenótiposArg16Gly

eGln27GlunãoinfluenciamnoBIE.Porém,atendênciaestatísticaobservadaparaumamaior frequênciadoaleloGly16nosindivíduoscomapresenc¸adeBIEpodeserconsideradoindício dainfluênciadepolimorfismosnogeneADBR2noBIEemadolescentes.

©2015SociedadedePediatriadeSãoPaulo.PublicadoporElsevierEditoraLtda.Esteéumartigo OpenAccesssobalicençaCCBY(https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/deed.pt).

DOIserefereaoartigo:http://dx.doi.org/10.1016/j.rppede.2015.06.021

夽 _{Esteartigofazpartedadissertac¸ãodemestradodeCássioLeandroMüheConsentino.} ∗_{Autorparacorrespondência.}

E-mail:cassioleandromc@hotmail.com(C.L.M.Consentino).

KEYWORDS

Adolescent; Exercise-induced bronchospasm;

ADRB2gene

Influenceofpolymorphismsofthebeta-2adrenergicreceptoronthepresence ofexercise-inducedbronchospasminadolescents

Abstract

Objective: Todetermine the influenceofpolymorphisms ofthebeta-2 adrenergicreceptor (ADRB2)intriggeringexercise-inducedbronchospasm(EIB)inadolescents.

Methods: Thesubjectsweredividedintotwogroups:presentEIB(EIB+)(n=45)andabsentEIB (EIB−)(n=115).Thebronchialprovocationtestwithexercisewasperformedwithaprotocol thatconsisted ofwalking/runningfor atleasteightminutesat highintensity,i.e.,>85%of maximumheart rate,consideringEIB+asa10%decreaseinforcedexpiratoryvolumeinone second(FEV1).ThegenotypingoftheADRB2genewasperformedbytheTaqmanmethod,using theStepOnePlussystem.Independentt-test,Mann-WhitneyandChi-squaretests,aswellas Spearman’scorrelationcoefficientwereusedforthestatisticalanalysis.

Results: Age,bodyweight,height,FEV1,FVCandFEV1/FVCratiowerelowerintheEIB+group whencomparedtoEIB−(p<0.05).Therewerenosignificantdifferencesintheproportionof the alleleatposition 27andArg16GlyandGln27Glugenotypes betweenthe EIB+andEIB−

groups(p=0.26;p=0.97andp=0.43,respectively).However,therewasatrendtowardsstatistical significanceregardingthegreaterproportionoftheGly16allelefortheEIB+whencompared totheEIB−group(p=0.08).

Conclusions: The presenceofpolymorphismsassociated withtheGlu27alleleandArg16Gly

andGln27GlugenotypeshadnoinfluenceonEIB.However,thestatisticaltrendtowardsgreater frequencyoftheGly16alleleinindividualswithEIB+canbeconsideredevidenceoftheinfluence ofpolymorphismsoftheADBR2geneonEIBinadolescents.

©2015SociedadedePediatriadeSãoPaulo.PublishedbyElsevierEditoraLtda.Thisisanopen accessarticleundertheCCBYlicense(https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Introduc

¸ão

O broncoespasmo induzido pelo exercício (BIE) é definido como estreitamento transitório das viasaéreas que acon-tecelogoapósexercíciosintensosematé90%dosindivíduos asmáticos1 _{e em quase 20% das pessoas sem histórico de}

doenc¸asrespiratórias.2_{Apresenc¸adeexcessodepesopode}

contribuirparaaumentodagravidadedoBIEemasmático.3

O acúmulo excessivo de tecido adiposo na região central podealterar amecânicapulmonarearesposta inflamató-riadasviasaéreas,levaraoaumentodacontratilidadeeda responsividadedamusculaturalisadosbrônquios4_elimitar

assimapráticadeexercícios físicos5 _{comoterapêuticana}

asma6_{enaobesidade.}7

Algumasalterac¸õesgenéticas,comoospolimorfismosnos receptoresadrenérgicosbeta2(ADRB2),têmsidoassociadas àpresenc¸adeasma8_{edeobesidade.}9_{OgenedoADRB2está}

localizadonocromossomo5q31epodeserencontradoem diversasregiõesdocorpo,inclusivenamusculaturalisa.10_Os

ADRB2atuammediadospelaac¸ãodaadrenalinaeda

nora-drenalinaepromovemorelaxamentodomúsculoliso,até na região pulmonar,11 _{alémde desempenharpapel}

impor-tantenabroncodilatac¸ãoduranteoexercícioemindivíduos saudáveis.12_{OspolimorfismosArg16GlyeGln27Gludogene}

do ADRB2 vêm sendo relacionados a sintomas da asma,7

incluindoareduc¸ãodafunc¸ãopulmonaredaresposta bron-codilatadoraàmedicac¸ão,poistêminfluêncianegativano efeito damedicac¸ãobroncodilatadora,13 _recurso

terapêu-ticoquefazpartedaprevenc¸ãodoBIEpré-exercício.14

Recentemente, nosso grupo de pesquisas verificou

maior presenc¸a de polimorfismo Arg16Gly em crianc¸as e

adolescentesasmáticosem comparac¸ãocom oscontroles. Além disso, verificou-se tendência a maior frequênciado polimorfismoGly16 em asmáticos com excesso de peso.15

Contudo, a influência da presenc¸a de polimorfismo no receptor ADRB2 na presenc¸a de BIE em crianc¸as e ado-lescentesainda nãofoiinvestigada. Nossahipótese é que a maior frequência de polimorfismo no receptor ADRB2

poderia estar relacionada à maior presenc¸a de BIE nessa populac¸ão. Portanto, o propósito do presente estudo foi determinar ainfluência dos polimorfismos nogeneADRB2

nodesencadeamentodeBIEemadolescentes.

Método

Estudotransversalcom160adolescentesdeambosossexos, deetniabranca,entre9-17 anos,selecionadospor conve-niênciaeprovenientesdeescolaspúblicasdeCuritiba(PR). Aamostrafoidivididaemdoisgrupos,BIEpresente(BIE+) (n=45)eBIEausente(BIE−)(n=115).Constatou-sepresenc¸a deBIEquandohouvequedamaiorouiguala 10%do VEF1

emrelac¸ãoaovalorbasalnotestedebroncoprovocac¸ãopor exercício.Todososparticipanteseresponsáveisassinaramo termodeconsentimentolivreeesclarecido,conforme pro-jetodepesquisaaprovadopeloComitêdeÉticaemPesquisa emSeresHumanosdoHospitaldeClínicasdaUniversidade FederaldoParaná(protocolon◦ _{2460.067/2011-03).O} cál-culo amostral foi feito com nível de confianc¸a de 95% e a fórmula descrita por Santos.16 _{O tamanho da amostra}

emfunc¸ãodacomplexidadedosexamesedanecessidadede coletasanguínea.

Mensurou-se a massa corporal (kg) em balanc¸a digital (Toledo®_{), com resoluc¸ão de0,1kg, e aestatura (cm) em}

estadiômetro (Sanny®_{) com resoluc¸ão de 0,1cm. O Índice}

de Massa Corporal (IMC) foi calculado pela fórmula IMC (kg/m2_{)=Massacorporal(kg)/Estatura}2_{(m).Essavariávelfoi}

convertidaparaIMC-escore Z, pormeiodosoftwareWHO Anthroplusv.1.0.4 desenvolvidopela Organizac¸ão Mundial daSaúde(OMS), classificadode acordocom os pontosde cortepropostospelaOMSem2006.17

A circunferência abdominal (CA) foi mensurada em

centímetros (cm) com fita antropométrica inextensível (Cardiomed®_{),medidanopontomédioentreoúltimoarco}

costal e a crista ilíaca, com o indivíduo de pé, abdome relaxado e brac¸os ao longo do corpo. Para classificac¸ão, usaram-se os valorespropostos por Fernandézet al., em 2004.18

Para o diagnóstico da asma, conforme o III Consenso BrasileirodoManejo daAsma(SBPT, 2002),19 _usaram-sea

avaliac¸ãomédicaeoquestionáriodoInternationalStudyof AsthmaandAllergiesinChildhood(Isaac)econfirmou-sea doenc¸apormeiodaquestãodenúmero 6.

Afunc¸ãopulmonarfoiavaliadaporespirometriano pré--exercícioepós-exercício(5,10e15minutos).Fizeram-se trêsmanobras,com oavaliado emposic¸ãosentada ecom clipenasal.Foramselecionadasascurvasqueapresentaram osmaiores valores para as variáveis de volume expirató-rioforc¸adonoprimeiro segundo(VEF1) ecapacidadevital

forc¸ada(CVF)emlitros(L).Osvalorespreditoseo coefici-enteexpiratórioforc¸ado(VEF1/CVF)forammostradospelo

softwaredoespirômetro(marcaOneFlow®_),queusacomo

referênciaosvalorespropostosporKnudsonetal.20

Otestedebroncoprovocac¸ãocomexercíciofoifeitoem ambiente controlado (temperatura entre 20-25◦_{C e}

umi-dade relativa de 50%), no período da tarde, em esteira ergométrica(modeloMasterSuperATL-Inbramed),comum protocoloque consistiu em caminhar/correr durante oito minutos,emintensidadesuperiora85%dafrequência car-díacamáxima(FCmáx),deacordocom oguia daAmerican

ThoracicSociety.14_AFC

máxfoicalculadapormeiodafórmula

propostaporTanakaetal.21_{emonitorada,duranteoteste,}

porfrequencímetro(Polar®_{).Osavaliadosforamorientados}

anãoingerirbebidasà base decafeína,duas horas antes daavaliac¸ão,suspenderousodebroncodilatadoresdeac¸ão curtaelonga,48horasecincodiasantesdasavaliac¸ões, res-pectivamente.Oexercícionãofoifeitoquandohouverelato decrisedeasmaouinfecc¸ãoviralnasviasaéreasnasúltimas quatrosemanasantesdoteste.Aintensidadedaquedafoi calculadapelaquedamáximadoVEF1(QMVEF1)pormeioda

equac¸ão: QMVEF1=[(VEF1 pré-exercício-VEF1 pós-exercício

maisbaixo)/VEF1pré-exercício]×100.14

A extrac¸ão do DNA ocorreu por meio de amostra san-guínea,coma genotipagemdos polimorfismos Arg16Glye

Gln27GludogeneADRB2pelométodoTaqman,pormeiodo

kitTaqMan SNPgenotypingassaysdaAppliedBiosystemse

dosoftwareEppendorfrealplexv.1.5,comousodoaparelho

deStepOnePlus.Aseguir,foifeitoumgráficodedispersão (XY)paraaseparac¸ãoFAM-VICeconsequentedeterminac¸ão dogenótipodecada adolescenteparacada polimorfismo. Classificaram-se como usuais os indivíduos homozigóticos paraoaminoácidoargininanocódon16(ArgArg)eglutamina

nocódon27(GlnGln)ecomoportadoresosindivíduos homo-zigóticos,naposic¸ão16,paraoaminoácidoglicina(GlyGly) e,naposic¸ão27,paraácidoglutâmico(GluGlu),bemcomo osheterozigóticos.

A análise estatística foi feita no software SPSS versão 19.Anormalidadefoiverificadapelotestede Kolmogorov--Smirnov. Para comparac¸ão dos grupos, aplicou-se o teste

t de Student nas variáveis paramétricas e o teste U de Mann-Whitneynasnãoparamétricas.Otestequi-quadrado foi usado para analisar as proporc¸ões entre os grupos. A correlac¸ãoentreasvariáveis foiavaliada pelocoeficiente decorrelac¸ão deSpearman e classificadasdeacordo com Dancey e Reidy.22 _{O nível de significância adotado foi de}

p<0,050.

Resultados

As características basais dos grupos são mostradas na tabela1.Foramencontradasdiferenc¸asnasvariáveisidade, massa corporal, estatura, VEF1 (tanto em litros quanto

no percentual do predito) e CVF em litros e na relac¸ão VEF1/CVF,menoresnogrupoBIE+.

Comrelac¸ãoaospolimorfismos dogenedoADRB2,não foramencontradasdiferenc¸assignificativasparaoalelo27 e paraosgenótipos dopolimorfismoArg16Glye Gln27Glu

entre os grupos BIE+ e BIE− (p=0,26; p=0,97 e p=0,43, respectivamente).Porém,foiencontradaumatendênciaà significânciaestatística paramaior proporc¸ão de polimor-fismodoalelo16entreogrupoBIE+comparadocomoBIE− (p=0,08)(tabela2).

O percentual de queda máxima do VEF1 apresentou

correlac¸ão moderadacom a presenc¸a deasma (rho=0,47;

p<0,01). Entretanto, para as variáveis IMC escore-z (rho=0,01), CA(rho=0,20), polimorfismoArg16Gly(−0,01)

eGln27Glu(rho=−0,07)nãoforamencontradascorrelac¸ões

significativas.

Discussão

O objetivo do presente estudo foi determinar a influên-ciadospolimorfismosnogeneADRB2nodesencadeamento deBIEemadolescentes.Nãoforamencontradasdiferenc¸as significativasnasfrequênciasparaoalelo27eparaos genó-tiposdoaleloArg16GlyeGln27GlunogrupoBIE+comparado comoBIE−,oquerefuta,emparte,nossahipóteseinicial. Porém,verificou-seumatendênciaàsignificânciaestatística paraumamaiorfrequênciadoalelo16nogrupoBIE+ com-paradocomoBIE−.Esseachadopodeserconsideradoum indício darelac¸ãoentrepolimorfismosnogeneADRB2e a presenc¸adeBIE.

Os indivíduos com diagnóstico de BIE+ apresentaram func¸ão pulmonar reduzida em relac¸ão aos BIE−, com excec¸ãodaCVF(%dopredito),quenãodiferiuentreosdois grupos.23_{Poroutrolado,estudosanterioresnão}

identifica-ramtaisdiferenc¸asaoavaliaradolescentesobesos,24_obesos

asmáticos3_ecomrinite.25_{Essasdivergênciaspodemser}

jus-tificadaspelasdiferenc¸asnaidadeenaestaturainicialdos gruposnapresentepesquisa.

O percentual de queda máxima VEF1 apresentou

Tabela 1 Característicasantropométricas eespirométricas basaisdos grupos broncoespasmoinduzido peloexercício(BIE) presente(+)eausente(−)

Variáveis BIE+ (n=45)

BIE−

(n=115)

touU p-valor

Idade(anos)a _{13,6±1,6 14,5±1,5}** _{4,05 0,00}

Massacorporal(kg) 65,0±15,2 74,5±18,3**

−3,09 0,00

Estatura(cm) 160,4±9,4 165,5±8,9** _{−3,18 0,00}

IMC(kg/m2_{) 25,3±5,5 27,0±5,3 −1,88 0,06}

IMCescore-z 1,6±1,3 1,9±1,2 −1,30 0,19

CA(cm) 84,6±13,6 84,9±13,9 1,57 0,12

VEF1(L) 2,9±0,5 3,4±0,6** −4,28 0,00

VEF1(%predito) 95,4±10,8 102,0±18,8* −2,21 0,02

CVF(L) 3,4±0,7 3,9±0,8**

−3,57 0,00

CVF(%predito) 102,3±12,2 106,0±13,4 −1,61 0,10

VEF1/CVF(%)a 86,7±10,3 88,5±7,0* 2,01 0,04

IMC,índicedemassacorporal;CA,circunferênciaabdominal;VEF1,volumeexpiratórioforc¸adono1◦segundo;CVF,capacidadevital

forc¸ada;VEF1/CVF,razãoentreVEF1eCVF.

Valoresexpressosemmédia±desviopadrão.

*_p<0,05;**_p<0,01.

a _{Variáveisquenãoapresentaramdistribuic¸ãonormal.}

Tabela 2 Frequência dosalelos e genótiposdo gene ADRB2entreos grupos broncoespasmo induzido peloexercício(BIE) presente(+)eausente(−)

BIE+ BIE− X2 _p-valor Alelos

Arg 30(37,5%) 103(48,6%) 2,87 0,08 Gly 50(62,5%) 109(51,4%)

Total 80(100%) 212(100%)

Gln 47(69,1%) 140(69,3%) 0,001 0,97 Glu 21(30,9%) 62(30,7%)

Total 68(100%) 202(100%) Genótipos

ArgArg 7(17,5%) 28(26,4%) 2,64 0,26 ArgGly 16(40,0%) 47(44,4%)

GlyGly 17(42,5%) 31(29,2%)

Total 40(100%) 106(100%)

GlnGln 19(55,9%) 51(50,5%) 1,68 0,43 GlnGlu 9(26,5%) 38(37,6%)

GluGlu 6(17,6%) 12(11,9%) Total 34(100%) 101(100%)

Arg,arginina;Gly,glicina;Gln,glutamina;Glu,ácidoglutâmico;valoresexpressosemfrequênciaabsolutaerelativa.

metodológicasquanto ao diagnósticodo BIEpodem expli-car essa discrepância, visto que na presente pesquisa foi feito testede broncoprovocac¸ão em esteira e, noestudo de Cichalewski et al.,26 _{foi feito 45 minutos após uma}

auladeeducac¸ãofísica.Poroutrolado,ambasaspesquisas nãoidentificaramrelac¸ãodoBIEcomIMC.

Não foramencontradosestudosanteriores que avalias-sem a frequênciados polimorfismos ADRB2 em indivíduos comesemBIE.Nestapesquisa,afrequênciadoaleloGly16

foide62,5%e30,7%paraoaleloGlu27.Aproporc¸ãodo pri-meirofoimaiselevadadoqueemestudofeitoemasmáticos queencontrou46,6%.8_{Entretanto,ésemelhanteaos}

acha-dosparaapopulac¸ãoemgeral(61%).27_{Afrequênciadoalelo}

Glu27foisemelhanteentreosestudos.8,27

EstudofeitoporSnyderetal.28_{observou,emadultos}

sau-dáveis,que aqueles com o genótipoArg16Arg e Gly16Gly

têmrespostas similaresàbroncodilatac¸ãoduranteo exer-cício. Entretanto,após o término da prova,os indivíduos homozigotos para o alelo Arg16 retornam de forma mais rápidaaosvaloresbasaisaosercomparadoscomos homo-zigóticosGly16.Osautoresjustificamtal achadopor uma possíveldessensibilizac¸ãodogeneADRB2nessapopulac¸ão. Essesresultadosdiferemdosencontradosnesteestudo,no qualnãosenotaramdiferenc¸asnafrequênciaentreos genó-tipos,oquepoderealmenteconfirmarnãohaverinfluência dessegenenosindivíduoscomBIE.

Os polimorfismos do gene ADRB2 podemestar relacio-nadoscom a asma principalmente por estar associados a maiorsensibilidadenasviasaéreas.8_{Ahiper-responsividade}

osindivíduoscommaiorresponsividadeaotesteprovocado por metacolina apresentavam polimorfismo no códon 16. OBIEpodeserconsideradocomoumarespostaexacerbada dasviasaéreas.1 _{Assim,esperava-seque ospolimorfismos}

apresentasseminfluênciana respostabroncoconstritoraao exercício,oqueacabounãoocorrendo.

O desenho transversal doestudo limita asrelac¸õesde casualidade entre as variáveis. Outra questão a destacar como fator limitante é o baixo número de participan-tes para as análises de polimorfismos genéticos, o que leva à interpretac¸ão cautelosa dos achados da pesquisa. Sugerem-seestudoscommaiornúmerodeindivíduospara confirmaraassociac¸ãoentreapresenc¸adoaleloGly16ea manifestac¸ãodeBIE.Hánecessidadedenovasinvestigac¸ões comocontroledaslimitac¸õescitadasecomousoda espi-rometrianostempos3;5;1015e30minutosapóstestede broncoprovocac¸ãoporexercício,paraevitarpossíveiserros dediagnósticodoBIE.

Conclui-sequeapresenc¸adepolimorfismosassociadosao aleloGlu27eaosgenótiposArg16GlyeGln27Glunão influen-ciounamanifestac¸ãodeBIE.Porém,atendênciaestatística observadapara uma maiorfrequência do aleloGly16 nos indivíduoscomapresenc¸adeBIEpodeserconsideradaum indíciodainfluênciadepolimorfismosnogeneADBR2noBIE emadolescentes.

Financiamento

Fundac¸ãoAraucária,processon◦_19.281.

Conflitos

de

interesse

Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresse.LFAé pesquisadoradaFundac¸ãoAraucária,LRSébolsistade dou-toradodaCapes,WALébolsistadedoutoradodoCNPq,CRC eNLsãobolsistasdeprodutividadedoCNPq.

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