NELSON ALESSANDRETTI DE MELLO LEMOS
EXPRESSÃO DE zif-268 DURANTE A AQUISIÇÃO, EVOCAÇÃO E EXTINÇÃO
DE UMA MEMÓRIA AVERSIVA
NELSON ALESSANDRETTI DE MELLO LEMOS
EXPRESSÃO DE zif-268 DURANTE A AQUISIÇÃO, EVOCAÇÃO E EXTINÇÃO DE UMA MEMÓRIA AVERSIVA
Dissertação apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte para obtenção do título de Mestre em Psicobiologia.
Orientador: Dr. Sidarta Ribeiro
Co-orientadores: Dra. Regina Helena da Silva e Dr. Marco Aurélio de Moura Freire.
Dedico este trabalho ao amor da mulher que, por inúmeras vezes, sacrificou os próprios sonhos e suprimiu os próprios desejos pela sua família: minha mãe, Maria Terezeinha Alessandretti Lemos.
Minha eterna gratidão pelo seu apoio e incentivo que me permitiu percorrer a trilha árdua, inóspita e muitas vezes não-reconhecida da ciência. Nesse longo caminho foram muitas as quedas, mas sua mão sempre esteve lá por mim. Tive cansaço e me deste água, tive frio e me acalentaste, tive incerteza e me deste segurança. Fiquei na escuridão e me trouxeste luz
A realização desse meu sonho que aqui se concretiza, saiba, só foi possível por sua causa.
AGRADECIMENTOS
A minha mãe, Maria Terezinha Alessandretti Lemos, a quem este trabalho é dedicado, por todo o apoio que recebi para seguir meu amor pela pesquisa;
Ao meu ex-orientador, Dr. Fernando Mazzili Louzada, sem o qual eu não estaria desenvolvendo esse trabalho em Natal;
Ao meus mestres, Dr. Sidarta Ribeiro, Dra. Regina Helena da Silva e Dr. Marco Aurélio Freire, pela paciência com minhas inquietudes e pela ajuda constante em gerar, analisar e discutir os dados científicos;
Ao amigo Prof. Dr. John Fontenelle Araújo, por ter tão bem me acolhido em sua terra e pelas valiosas discussões científicas e sobre a vida;
Aos amigos e colegas, Cristiano Simões e Marco Freire, pelas intermináveis horas que passamos juntos no calor da batalha, sempre unidos. Um por todos e todos por um...;
Ao Dr. Ernesto Saias Soares, pela rotina de Matlab usada na quantificação do material histológico;
Ao amigo Jean Faber, pela ajuda na análise estatítica;
Ao amigo e colega Flávio Freitas, pelas elucubrações científicas sobre a memória e por artigos científicos estratégicos para a elaboração desse trabalho;
À Dra. Alessandra Ribeiro, pela ajuda nos experimentos e gráficos, além do apoio moral de que “vai dar tudo certo”.
Aos amigos Joanilson Guimarães e Antônio Pereira Jr., pela ajuda em selecionar o material reagido e por dicas preciosas;
Aos queridos alunos, Luane Ferreira e Fernando Tollendal, pela valiosa ajuda com os experimentos;
E, finalmente, ao grande amigo Marcelo Barauce, pelos chats de madrugada ao longo dos experimentos e que, mesmo a distância, sempre apoiou meu trabalho.
VI A parte experimental da presente Dissertação foi desenvolvida no Laboratório de Neurobiologia Celular do Instituto Internacional de Neurociências de Natal Edmond e Lily Safra (IINN-ELS), sob orientação dos Professores Dr. Sidarta Ribeiro. e Dr. Marco Aurélio Freire.
SUMÁRIO
RESUMO ... XI
ABSTRACT ... XII
1. INTRODUÇÃO ... 01
1.1. Memória ... 01
1.2. Hipocampo ... 05
1.3. Genes Imediatos ... 10
1.4. Paradigma Comportamental ... 12
2. OBJETIVO ... 14
3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 15
3.1. Sujeitos Experimentais ... 15
3.2. Modelo Experimental ... 16
3.3. Desenho Experimental ... 17
4. RESULTADOS ... 21
4.1. Resultados Comportamentais ... 21
4.1.1. APRENDIZADO ... 21
4.1.2. ANSIEDADE ... 24
4.1.3. ATIVIDADE MOTORA ... 26
4.2. Resultados da Expressão Gênica ... 27
5. DISCUSSÃO ... 32
5.1. Ansiedade ... 32
5.2. Expressão Gênica no Hipocampo ... 35
5.3. Estrutura Hipocampal e a Memória ... 37
5.4. Considerações Técnicas ... 39
6. CONCLUSÃO ... 40
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 41
ANEXO I: ROTINA DE MATLAB PARA QUANTIFICAÇÃO POR DENSITOMETRIA ÓPTICA ... 44
ANEXO II: COMUNICAÇÕES CIENTÍFICAS APRESENTADAS EM CONGRESSO ... 49
ANEXO III: PROCEDIMENTOS PARA O PREPARO DAS SOLUÇÕES ... 54
Tampão fosfato 0,2 M ... 40
Solução salina 0,9% ... 41
Tampão fosfato salina 0,1 M ... 42
Paraformaldeído a 4% (pH 7,2-7,4) ... 43
VIII
LISTA DE FIGURAS
Fig. 1.1 Esquema da formação hipocampal ... 07
Fig. 1.2 Histologia em Nissl (cresil violeta) do hipocampo dorsal ... 09
Fig. 3.1 Desenho experimental ... 18
Fig. 3.2 Quantificação da imunohistoquímica para Zif-268 através de software desenvolvido em Matlab ... 20
Fig. 4.1 Dinâmica comportamental do experimento ... 22
Fig. 4.2 Tempo total de permanência no braço aversivo ... 23
Fig. 4.3 Tempo total de permanência nos braços abertos ... 24
Fig. 4.4 Diferença nos níveis de ansiedade entre as fases durante o treino (TR) e o teste (TE) ... 25
Fig. 4.5 Atividade exploratória ... 26
Fig. 4.6 Fotos representativas da expressão hipocampal de Zif-268 ... 28
Fig. 4.7 Reatividade de Zif-268 para cada sub-área hipocampal ... 29
Fig. 4.8 Quantificação da expressão protéica de Zif-268 nas áreas hipocampais ... 30
Fig 4.9 Expressão de Zif-268 em cada sub-área hipocampal ...
LISTA DE TABELAS
X
LISTA DE ABREVIATURAS
%TAB Tempo de permanência relativo nos braços abertos
%TAV Tempo de permanência no braço aversivo em relação ao braço não-aversivo
AMPA Ácido alfa-amino-3-hidroxy-5-metil-4-isoxazolepropionico
AV Braço aversivo
CA1 Corno Amonis 1
CA3 Corno Amonis 3
DAB 3,3’ diaminobenzidina
GD Giro denteado
GI Genes Imediatos
gPRE Grupo Pré-exposição
gTEev Grupo Teste evocação
gTEex Grupo Teste extinção
gTEnev Grupo Teste não-evocação
NAV Braço não-aversivo
NMDA Ácido N-metil-D-aspártico
PLD Potenciação de longa-duração
PRE Pré-exopisção
TE Teste
TF Tampão fosfato
RESUMO
No paradigma comportamental da esquiva discriminativa, as memórias de curto e de longo prazo têm sido extensivamente estudadas tanto comportamental quanto farmacologicamente. O objetivo do presente estudo foi avaliar, usando o modelo supracitado, a expressão hipocampal de zif-268 – gene imediato dependente de cálcio implicado em processos de plasticidade sináptica – ao longo das diversas etapas da formação da memória, como aquisição, evocação e extinção. O aparato comportamental consistiu de um labirinto em cruz elevado modificado, com seus braços fechados dispostos em “L”. Uma pré-exposição ao labirinto foi feita com os animais usando os quatro braços fechados, com duração de 30 minutos, seguida de um treino e de um teste, cada qual com duração de 10 minutos. O intervalo entre as sessões foi de 24 horas. Durante o treino, um estímulo aversivo (luz e ruído intensos) era acionado sempre que os animais entravam em um dos braços fechados (braço aversivo). A aquisição, retenção e extinção da memória foram avaliados pelo percentual de tempo total gasto explorando o braço aversivo. Os parâmetros avaliados (tempo nos braços e distância total percorrida) foram registrados por um software de rastreamento de animais (Anymaze, Stoelting, USA). O aprendizado durante o treino foi estimado pelo decréscimo do tempo gasto explorando o braço aversivo. Uma hora após o início de cada sessão, os animais foram anestesiados com uma overdose de tiopental sódico (i.p.) e perfundidos com solução salina heparinizada 0.9% seguida de paraformaldeído a 4%. Os encéfalos foram crioprotegidos com solução de sacarose a 20%, separados em três blocos e congelados. O bloco do meio, contendo o hipocampo, foi seccionado a 20 µm no plano coronal e as secções resultantes foram então submetidas à imunohistoquímica para zif-268. Nossos resultados evidenciam um aumento da expressão de zif-268 no giro denteado (GD) durante as etapas de evocação e extinção. Há uma participação distinta do GD durante a evocação e extinção da memória, mas não durante a aquisição. Além disso, todas as áreas hipocampais (CA1, CA3 e GD) apresentam uma elevação da expressão de zif-268 durante o processo de extinção.
XII
ABSTRACT
In the behavioral paradigm of discriminative avoidance task, both short and long-term memories have been extensively investigated with behavioral and pharmacological approaches. The aim of the present study was to evaluate, using the abovementioned model, the hippocampal expression of zif-268 – a calcium-dependent immediate early gene involved with synaptic plasticity processes – throughout several steps of memory formation, such as acquisition, evocation and extinction. The behavioral apparatus consisted of a modified elevated plus-maze, with their enclosed arms disposed in “L”. A pre-exposure to the maze was made with the animals using all arms enclosed, for 30 minutes, followed by training and test, during 10 minutes each. The between sections interval was 24h. During training, aversive stimuli (bright light and loud noise) were activated whenever the animals entered one of the enclosed arms (aversive arm). Memory acquisition, retention and extinction were evaluated by the percentage of the total time spent exploring the aversive arm. The parameters evaluated (time spent in the arms and total distance traveled) were estimated with an animal tracking software (Anymaze, Stoelting, USA). Learning during training was estimated by the decrease of the time spent exploring the aversive arm. One hour after the beginning of each section, animals were anaesthetized with sodium-thiopental (i.p.) and perfused with 0.9% heparinized saline solution followed by 4% paraformaldehyde. Brains were cryoprotected with 20% sucrose, separated in three blocks and frozen. The middle block, containing the hippocampus, was sectioned at 20 µm in the coronal plane and the resultant sections were submitted to zif-268 immunohistochemistry. Our results show an increased expression of zif-268 in the dentate gyrus (DG) during the evocation and extinction stages. There is a distinct participation of the DG during the memory evocation, but not during its acquisition. In addition, all hippocampal regions (CA1, CA3 and DG) presented an increased zif-268 expression during the process of extinction.
1. INTRODUÇÃO
1.1 Memória
A memória é uma função bastante complexa que depende de diversas estruturas neuro-anatômicas. O estudo da memória teve um avanço importante com o famoso caso clínico do paciente H.M., relatado por Scoville e Milner (Scoville & Milner, 2000), no qual descrevem que uma ablação bilateral de parte do lobo temporal medial em humanos elimina a capacidade de reter novas memórias episódicas. O caso do paciente H.M. forneceu evidências valiosas sobre o papel do hipocampo e a existência de tipos diferentes de memória, quais sejam a episódica (fatos, lugares, pessoas, eventos) e a de procedimento (sequências motoras etc.), sendo que apenas a primeira está relacionada ao hipocampo. Embora a memória seja exaustivamente estudada a ponto de conhecermos seus detalhes comportamentais, eletrofisiológicos e bioquímicos (9076 artigos com a palavra chave memory publicados entre 2007-2008, segundo o site Pubmed [www.pubmed.org]), muitas de suas etapas e propriedades ainda não foram compreendidas.
2 alta, persistindo por horas, dias ou semanas, conforme o estímulo aplicado. Esse resultado fundamentou a PLD como uma hipótese explicativa para o fenômeno da memória (Bliss & Lomo, 1973). Para que haja indução dessa “memória” da estimulação elétrica, é necessária a ativação dos receptores do ácido N-metil-D-aspártico (NMDA) (Bliss & Collingridge, 1993). Isso causará um influxo de cálcio que ativará uma cascata bioquímica, levando a um aumento da quantidade de um outro tipo de receptor, o do ácido alfa-amino-3-hidroxy-5-metil-4-isoxazolepropionico (AMPA). Esses processos são relativamente bem conhecidos, e uma série de intervenções farmacológicas já foram realizadas no modelo da PLD (Izquierdo & Medina, 1995). Recentemente, Whitlock e colaboradores (Whitlock et al., 2006) demonstraram que o aprendizado é capaz de induzir um estado de PLD no hipocampo de ratos.
A evocação por sua vez seria o resgate dessas memórias, a lembrança (Squire & Kandel, 1999). Esse estágio é fundamental para garantir a adaptação e sobrevivência do indivíduo no meio, fazendo com que um determinado animal evite uma área de predadores e saiba onde há comida abundante, por exemplo.
Finalmente, a extinção consiste na inibição ativa da evocação de uma memória, sendo importante para atribuir um novo significado a um ambiente sempre em mudança e para “descartar” memórias indesejadas (Izquierdo & Cammarota, 2004).
Ao contrário da aquisição, a extinção é ainda pouco entendida. Trabalhos mostram que a extinção parece se comportar como um novo aprendizado, dependendo de receptores NMDA e de diversas estruturas encefálicas como a amígdala basolateral, a formação hipocampal e o córtex pré-frontal medial. Uma proposta de circuito para a extinção de memórias aversivas poderia envolver o córtex pré-frontal e a amígdala, sendo que o primeiro diminuiria a resposta da última (Cammarota et al., 2005).
1.2 Hipocampo
Já foi brevemente comentado no tópico anterior que o hipocampo é uma estrutura fundamental para a formação da memória, especificamente para os processos que envolvem a memória explícita. Essa estrutura se localiza no lobo temporal medial em humanos e recebe seu nome devido a sua semelhança morfológica com um cavalo marinho (do grego hippos, cavalo, e kampos, monstro marinho). Já no rato, o hipocampo se estende rostralmente dos núcleos septais até o córtex temporal, caudalmente (Shepherd, 1998).
Conforme descrito no tópico anterior, o caso do paciente H.M. consagrou o hipocampo como uma estrutura relacionada à memória. Entretanto, essa estrutura tem sido estudada há muito tempo e até o início da década de 30 o hipocampo era considerado pelos neuroanatomistas como sendo parte do sistema olfatório. Isso se devia provavelmente à impressão que esta estrutura é especialmente grande em espécies macrosmáticas (espécies cuja mucosa olfativa e bulbo são marcadamente desenvolvidos), tais como roedores e insetívoros noturnos. No entanto, nestes animais, os tamanhos absolutos das estruturas olfatórias no cérebro são bastante reduzidas (Andersen et al., 2006). Diversas outras funções têm sido descritas para o hipocampo, como a identificação de respostas espaciais (O'Keefe & Dostrovsky, 1971) e tácteis (Pereira et al., 2007). Estudos fisiológicos à parte, o hipocampo também foi estudado para, por exemplo, identificar as sinapses excitatórias e inibitórias (Andersen et al., 2006).
6 célebre Textura do Sistema Nervoso do Homem e dos Vertebrados (Cajal, 1995) descreveu o hipocampo como sendo dividido em duas regiões distintas: uma rica em células, localizada próximo ao giro denteado, chamada regio inferior e uma mais distal, com menor quantidade de células, chamada de regio superior. Posteriormente, Rafael Lorente de Nó (Lorente de Nó, 1934) dividiu o hipocampo em três campos distintos, chamados de áreas CA3, CA2 e CA1. Os campos CA3 e CA2 de Lorente de Nó correspondem ao regio inferior de Cajal, enquanto CA1 corresponde ao regio superior (Shepherd, 1998).
O fluxo de informação ao longo da formação hipocampal segue o seguinte esquema geral: diversas aferências sensoriais chegam no córtex entorrinal, o qual projeta para o giro denteado. Por sua vez, o GD irá enviar informação para CA3, daí para CA2 e finalmente CA1, que fecha essa alça projetando novamente para o córtex entorrinal. Enquanto o GD é a porta de entrada de informação no hipocampo (embora projeções diretas para CA1 e CA3 também existam), CA1 faz o papel de saída, enviando a informação ali processada para diversas áreas, como o córtex pré-frontal, a amígdala, hipotálamo, entre outras.
Fig. 1.1 – Esquema da formação hipocampal. (A-B) Projeções de cada sub-área do hipocampo para outras regiões dentro da estrutura.
10
1.3 Genes Imediatos
De maneira geral, os genes imediatos (GI) são expressos de maneira rápida e transiente após a estimulação da célula (com o pico de expressão variando de acordo com o gene em questão), servindo como bons mapeadores de ativação neuronal.
A escolha do zif-268 se justifica devido ao seu envolvimento em processos relacionados à plasticidade sináptica e aprendizado. É sabido, por exemplo, que a ausência de zif-268 (como no caso de camundongos nocautes para o gene) impede a ocorrência de PLD tardio (Jones et al., 2001) e que controla a expressão das sinapsinas I e II (Thiel et al., 1994; Petersohn et al., 1995), uma família de proteínas fundamental no controle da disponibilização vesículas sinápticas para exocitose (Rosahl et al., 1995). Esse gene também foi utilizado para investigar o envolvimento de áreas extra-hipocampais na formação de memórias aversivas, como o córtex cingulado anterior (Frankland et al., 2004). Para uma revisão sobre o assunto, veja Knapska & Kaczmarek (Knapska & Kaczmarek, 2004).
Os efeitos do bloqueio da expressão de zif-268 já foram verificados tanto na PLD quanto na tarefa de reconhecimento de objetos, inviabilizando a potenciação e a evocação de memória. Esses fatos são fortes evidências do papel plástico desse gene na formação de memórias (Jones et al., 2001; Bozon et al., 2003).
12
1.4 Paradigma Comportamental
Como alternativa ao modelo da esquiva inibitória, foi desenvolvido um outro paradigma para estudar os processos moleculares e eletrofisiológicos relacionados à extinção da memória. A esquiva discriminativa no labirinto em cruz elevado foi validada como um novo modelo para o estudo da interação entre memória e ansiedade (Silva & Frussa-Filho, 2000; Silva et al., 2004; Kameda et al., 2007).
Nesse modelo, o aprendizado e a retenção de longa duração foram estudados através de uma extensa abordagem farmacológica. Um resultado importante envolvendo esse modelo diz respeito à existência de um nível ótimo de ansiedade para que ocorra o aprendizado, tendo em vista que tanto manipulações farmacológicas ansiolíticas (diminuem a ansiedade) quanto ansiogênicas (aumentam a ansiedade) trazem déficits na retenção de memória, mas a administração de ambas surte um efeito nulo (Silva & Frussa-Filho, 2000).
O uso de estímulos pouco aversivos (luz e som, ao invés de choque nas patas) viabiliza a tarefa como um bom modelo para o estudo da aquisição e extinção rápida da memória, além de possibilitar a avaliação do comportamento do animal ao longo das sessões de treino através de uma curva de aprendizado, o que não é possível na esquiva inibitória.
Uma grande vantagem do uso da esquiva discriminativa sobre os outros modelos apresentados, a esquiva inibitória e o reconhecimento de objetos, é que ela se presta ao estudo simultâneo da interação entre memória e emoção. Sabemos que alterações nos níveis de ansiedade podem regular a eficiência do aprendizado de uma tarefa, de modo que os extremos acarretam em déficit, ou seja, há um nível ótimo de ansiedade que é necessário para que o aprendizado ocorra normalmente (Silva & Frussa-Filho, 2000).
14
2. OBJETIVOS
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Sujeitos Experimentais
Foram utilizados ratos Wistar machos (250-300g), divididos em 5 grupos: pré-exposição (gPRE), treino (gTR), teste (gTE), teste com extinção (gTEex) e teste com evocação apenas (gTEev). Os animais foram mantidos em ciclo claro escuro de 12:12 controlado por um temporizador, com o início da fase clara as 6:00 h, em estantes com exaustão e temperatura controlada (22±3 oC) e ração e água ad libitum.
Grupo Experimental
gPRE gTR gTE gTEex gTEev
Fase Escura Clara
n 3 3 2 2 2
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3.2 Modelo Experimental
3.3 Desenho Experimental
18 De modo a viabilizar a avaliação da expressão protéica de Zif-268, o intervalo entre as sessões foi de 24 h, de modo a separar temporalmente cada estágio e evitar a sobreposição de informações distintas, como aquisição e evocação, por exemplo.
Devido a um provável efeito ansiolítico da fase escura, os resultados do grupo Teste contrastaram fortemente com os resultados previamente obtidos nesse paradigma durante a fase clara (Silva & Frussa-Filho, 2000; Silva et al., 2004; Kameda et al., 2007). Por esse motivo, o experimento foi repetido na fase clara. Além disso, a expressão de Zif-268 após a extinção da memória (a qual ocorre em média a partir do terceiro minuto do teste) poderia se sobrepor à ativação resultante da evocação da mesma. Para descontar tais efeitos, foram selecionados animais cujo perfil
comportamental revelou uma evocação pura (nenhuma entrada em AV). Os valores da quantificação do grupo que apresentou extinção foram subtraídos do grupo de evocação pura para se ter um perfil da ativação referente apenas à extinção.
Os animais foram eutanasiados uma hora após o início da exposição ao labirinto, usando uma mistura gasosa de oxigênio e isoflurano a 5%, seguida de uma superdosagem de tiopental sódico (Crisália, Brasil) (50mg). A perfusão se deu pela passagem sistêmica de salina heparinizada a 0,9% aquecida seguida de paraformaldeído a 4% resfriado. Após a craniotomia o cérebro foi armazenado durante 24 h em uma solução de tampão fosfato 0,1M (TF), seguida de 24 h em sucrose a 20% e então foi separado em 3 blocos distintos (anterior, médio e posterior, cujos limites anatômicos são o quiasma ótico e o início do cerebelo) que foram congelados em um meio de congelamento (Tissue Tek, Sakura, Japão) usando uma mistura de gelo seco e etanol absoluto para garantir o congelamento rápido e homogêneo do tecido. Uma vez congelado, o material foi seccionado a 20 µm e montado a seco diretamente em
20 3,3’ diaminobenzidina (DAB) (Sigma Company, EUA) e 0.4% de níquel para revelar a marcação.
A quantificação do material foi realizada por densitometria óptica, através de uma rotina desenvolvida em Matlab (The Mathworks, Inc., EUA) (ver figura A1 nos anexos). Foram avaliadas as regiões CA1, CA3 e GD, utilizando três secções de lâminas distintas para cada animal, com uma amostragem de 10 pontos por região . Os valores obtidos para as áreas investigadas foram normalizados segundo a fómula N = (A - SB) / (A + SB), onde N corresponde à normalização, A é cada um dos pontos da área de interesse e SB é o valor médio da substância branca (Freire et al., 2007).
4. RESULTADOS
4.1 Resultados Comportamentais
4.1.1 APRENDIZADO
Em termos comportamentais, o aprendizado foi verificado comparando-se – através de uma ANOVA de medidas repetidas e posteriores testes-t pareados, ambos os valores de p corrigidos para o número de comparações – as médias do tempo de permanência em AV em relação ao NAV (%TAV) de PRE contra as demais sessões (TR e T1). A Figura 3.1 ilustra a dinâmica do experimento para cada grupo experimental (gPRE, gTR, gTEnev, gTEev e gTEex), através de um gráfico contínuo de todas as sessões.
A análise dos testes-t pareados para os tempos totais mostram que o treino foi capaz de promover uma diminuição da exploração do braço aversivo quando comparado com a pré-exposição, demonstrando que houve aprendizado (p<0,05 e p<0,001 para os grupos gTR e gTEev respectivamente).
22
O grupo gTEex reteve a memória durante os 3 primeiros minutos do teste, após os quais iniciou um processo de extinção. Já o grupo gTEev evocou a tarefa sem a extinguir, evitando o braço aversivo durante toda a duração do experimento.
24 4.1.2 ANSIEDADE
O tempo de permanência relativa do animal nos braços abertos (%TAB) serve para estimarmos a ansiedade do animal. Nenhuma diferença significativa foi encontrada nos grupos para o tempo total por sessão ao longo do experimento (Fig. 4.3), indicando que não ocorreu habituação aos braços abertos ao longo das sessões.
Um efeito importante da fase na qual o experimento foi realizado ocorre sobre a ansiedade. Durante a fase escura, a ansiedade do animal esta diminuída em relação à fase clara. Acredita-se que isso esteja modulando o comportamento do animal e causando o padrão observado nas medidas de TAV durante o teste na fase escura (gTEnev).
26 4.1.3 ATIVIDADE MOTORA
A atividade motora do animal, medida pela distância total percorrida, diminui a medida que o experimento progride, mostrando com isso uma habituação ao labirinto (Fig. 3.1.3.1).
4.2 Resultados da Expressão Gênica
Padrões diferenciados da expressão protéica de Zif-268 foram identificados ao longo do hipocampo para cada uma das etapas de processamento da memória (Fig. 4.5). Para melhor perceber as diferenças de reatividade em cada área (CA1, CA3 e GD), um aumento de 40x é mostrado na figura 4.6.
A quantificação da expressão protéica de zif-268 ao longo das diferentes áreas hipocampais pode ser vista na figura 4.6. Já a figura 4.7 mostra a expressão de zif-268 ao longo das sessões do experimento. Uma outra maneira de se avaliar as diferenças em cada sub-área hipocampal é através da comparação de índices dos valores quantificados CA1/CA3, CA1/GD e CA3/GD (Fig. 4.9).
28
30
Fig. 4.9 – Expressão de Zif-268 em cada sub-área hipocampal ao longo das sessões. CA1 (A) não varia sua expressão no decorrer dos processos mnemônicos ao passo em que CA3 (B) e GD (C) têm sua expressão máxima durante a extinção.
Teste-t das sessões contra PRE, *** p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05. Barras de erro mostrando o erro padrão.
32
5. DISCUSSÃO
5.1. Ansiedade
caro-escuro e a ansiedade. Na fase escura, a ansiedade do animal estaria grandemente diminuída (condições mais favoráveis para a espécie) e isso estaria modulando o comportamento, fazendo com que o rato ignore a possível presença do estímulo aversivo (relativamente fraco) durante a sessão de teste, não se tratando, portanto, de um efeito amnésico.
Para testar essa hipótese, duas estratégias poderiam ser aplicadas. A primeira consiste de um experimento comportamental, no qual os animais seriam treinados em uma fase e testados na outra, de forma que um rato treinado na fase escura deveria ter um bom desempenho comportamental durante o teste realizado na fase clara. Uma segunda alternativa consiste em dar a um grupo de ratos uma droga ansiogênica, como a cafeína, durante o teste realizado na fase escura. De acordo com nossa proposta, o resultado esperado deveria ser uma redução do tempo gasto explorando o braço aversivo em ambas as situações, mostrando claramente o efeito fase-dependente sobre a ansiedade.
Essa modulação da ansiedade pela fase do ciclo claro-escuro permanece controversa. Alguns estudos utilizando o labirinto em cruz elevado mostram um efeito importante da intensa iluminação sobre o aumento da ansiedade (Griebel et al., 1993), ao passo em que outros autores não encontraram nenhuma relação entre intensidade luminosa ou ritmos circadianos sobre quaisquer medidas de ansiedade, (Jones & King, 2001). Esse mesmo trabalho também avaliou a relação entre intensidade luminosa e atividade locomotora, de forma que baixa intensidade luminosa provoca um aumento geral da atividade locomotora.
5.2. Expressão Gênica no Hipocampo
Considerando agora nosso segundo resultado – o da expressão gênica de zif-268 – encontramos padrões diferenciados de expressão gênica nas áreas avaliadas (CA1, CA3 e GD), corroborando então a existência de diferenças funcionais entre as sub-regiões hipocampais ao longo do processo de consolidação mnemônica, como uma maior participação de CA3 durante a etapa de aquisição da memória (Gilbert et al., 2001; Lee & Kesner, 2004 ).
É interessante notar que, seja em termos qualitativos ou quantitativos, não foram detectadas diferenças entre os grupos não-evocação e evocação. Aqui, duas hipóteses se aplicam. Primeiro, o método de quantificação utilizado pode não ser sensível a uma variação sutil. Esse tópico será retomado mais adiante. Segundo, esse fato poderia ser um substrato biológico para apoiar a idéia de que o grupo não-evocação, na verdade, evoca a memória, mas resolve ignorar o engrama de advertência em relação ao braço aversivo.
5.3. Estrutura Hipocampal e a Memória
Se considerarmos a conectividade intrínseca do hipocampo, os dados sugerem uma diferença fisiológica entre as sub-áreas hipocampais. Isso se deve ao fato de que o giro denteado, área que recebe projeções maciças do córtex entorrinal (para onde as informações sensoriais convergem), não está ativado durante a primeira etapa da formação da memória (aquisição).
A área que parece estar mais relacionada com a aquisição é CA3, que do ponto de vista morfológico, também recebe projeções diretas do córtex entorrinal, embora em menor número (Shepherd, 1998), justificando a presença de plasticidade nessa área sem no entanto induzir síntese protéica no GD, área aparentemente pouco relevante para a codificação inicial da memória.
5.4. Considerações Técnicas
Uma questão importante a ser considerada é o método utilizado para quantificar o material. A densitometria óptica é um método padrão para se avaliar preparações de hibridização in situ, as quais, diferente da imunohistoquímica, têm como alvo o RNAm ao invés de proteínas. Assim, a ausência de background torna esse método bastante sensível às diferenças de intensidade da reação em diferentes áreas. No caso da imunohistoquímica, o método mais comumente aplicado é a contagem estereológica de células, que permite estimar a quantidade de células ativas por região. Assim, é possível que uma mudança nessa metodologia permita apurar com mais detalhes os resultados até o momento obtidos em termos quantitativos, embora evidentemente as diferenças qualitativas devem permanecer.
40
6. CONCLUSÃO
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Andersen P, Morris R, Amaral D, Bliss T, & O'Keefe J (2006) The Hippocampus Book 1st ed. Oxford University Press, USA.
Bliss TV & Collingridge GL (1993) A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature 361:31-9
Bliss TV & Lomo T (1973) Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J Physiol 232:331-56
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44
ANEXO I:
function AcquireSamples(NrSamples,Labels,WindowSideInPixels,SaveFileName)
%
% FileName - is a string with the name of the text file (example: "Files1.txt") % which has the names of the figure that will be sequentially opened.
% For each of these figures, the user will click at specific locations (see below)
% NrSamples is a (1xn) vector. Each position will have how many samples % will be taken from each file by the user (by clicking in appropriate locations % of the picture). For example, if NrSamples=[8 6 8], then for each picture % the user will be asked to click 8 consecutive times over one brain
% structure, then 6 times over a second brain structure, then 8 times over % the third brain structure.
% Labels is a cell array (ex: {'WM','CA1','DG'}) in which the names of the % structures over which the user has clicked will be stored.
% WindowSideInPixels is the size, in pixels, of a square window centered on % the location where the user has clicked.
% Data{File}{Location}
% FileList=textread(FileName,'%s');
% instead of doing this, we can make a list of all the .jpg files in the current % directory and then go through them
Files=dir; JPGFiles={}; Count=1;
for i=1:length(Files)
if length(Files(i).name)>4 % it's '*.jpg' and therefore length>4
if strcmp(lower(Files(i).name(end-2:end)),'jpg')==1 JPGFiles{Count}=Files(i).name;
Count=Count+1; end
end end
% Determining which of the
WMIndex=find(strcmp(lower(Labels),'wm'));
colores=[1 0 0;0 1 0;0 0 1;1 1 0; 0 1 1;1 0 1; 0.5 1 0.5; 0 0.5 1; 1 0.5 0];
46 disp(['Opening file: ' JPGFiles{FileIndex}])
MatFig=open(JPGFiles{FileIndex}); MatFig=getfield(MatFig,JPGFiles{FileIndex}(1:end-4)); FigHandle=imagesc(MatFig); colormap(gray) LocationCount=1;
while LocationCount<=length(NrSamples)
% for LocationCount=1:length(NrSamples)
disp(['File: ' JPGFiles{FileIndex} ' - Acquiring Samples for location: ' Labels{LocationCount} ])
% count=1;
% while count<=NrSamples(Location) % for Sample=1:NrSamples(Location)
[X,Y]=ginput(NrSamples(LocationCount));
% X is columns and Y is rows
X=round(X); Y=round(Y); Xmin=round(X-WindowSideInPixels/2); Xmin=max([Xmin ones(length(Xmin),1)],[],2); Xmax=round(X+WindowSideInPixels/2); Xmax=min([Xmax size(MatFig,2)*ones(length(Xmax),1)],[],2); Ymin=round(Y-WindowSideInPixels/2); Ymin=max([Ymin ones(length(Ymin),1)],[],2); Ymax=round(Y+WindowSideInPixels/2); Ymax=min([Ymax size(MatFig,1)*ones(length(Ymax),1)],[],2); h=[];
for square=1:length(Xmin)
h(square)=line([Xmin(square) Xmin(square) Xmax(square) Xmax(square) Xmin(square)],...
[Ymin(square) Ymax(square) Ymax(square) Ymin(square) Ymin(square)]);
set(h(square),'Color',colores(LocationCount,:)) end
Answer = input('Did you click in the right places(y/n)? ','s'); if strcmp(lower(Answer),'y')
% Storing the data in the
Samples=[];
for i=1:length(Xmin)
Samples(:,:,i)=MatFig(Ymin(i):Ymax(i),Xmin(i):Xmax(i),1); end
% taking the mean of the samples
MeansSample=squeeze(mean(mean(Samples,1),2)); % storing these points
Data{FileIndex}{LocationCount}=MeansSample;
% storing also the points at which the values were taken
% for future perusal
Locations{FileIndex}{LocationCount}=[Y X]; LocationCount=LocationCount+1; else
for i=1:length(h) delete(h(i)) end
end
end% This is after we've collected all the points for all the locations in each picture
% Now we're going to normalize the values in Data{FileIndex}, by
% using the values of location 'WM' (white matter)
% q=(a-b)/(a+b), where
% q= normalized brightness value
% a= brightness value of desired location
% b= average WM (White Matter) brighness
% WMIndex % has to be calculated
WMBrightness=mean(Data{FileIndex}{WMIndex});
for Location=1:length(Data{FileIndex}) % going through all the locations, including the reference one (indexed by WMIndex)
48 save(SaveFileName,'NrSamples','Labels','WindowSideInPixels','Data','Locations','Norm Data','JPGFiles') FileHandle=fopen([SaveFileName '.txt'],'w');
% writing the data in a file
for FileIndex=1:length(NormData) NormData{FileIndex}{Location} fprintf(FileHandle,'\n'); fprintf(FileHandle,'%s\t',JPGFiles{FileIndex});
for Location=1:length(NormData{FileIndex}) fprintf(FileHandle,'\n');
fprintf(FileHandle,'%s\t',Labels{Location});
ANEXO II:
50 LEMOS, N. A. M. ; GALLI, M. ; SILVA, R. H. ; RIBEIRO, S. Aversive extinction differences after training and retraining sessions on the discrimintative avoidance task.
In: 2nd Neuroscience Symposium of the International Institute for Neuroscience of Natal, 2007, Natal. Annals of 2nd Neuroscience Symposium of the International Institute for Neuroscience of
Natal, 2007. v. 2. p. 301.
LEMOS, N. A. M. ; GALLI, M. ; SILVA, R. H. ; RIBEIRO, S. . Extinção da tarefa após o treino e o retreino da tarefa de esquiva discriminativa. In: II Reunião Regional da Fesbe, 2007, Recife. Anais da II Reunião Regional da Fesbe, 2007. p. 10.034.
Objetivo: The plus-maze discriminative avoidance task has been validated as a new model to study memory and anxiety. In this paradigm, learning and long-term retention have been extensively studied. Here we focused on adapting this model for short intervals between sessions (1 hour), introducing re-training and re-testing sessions to study memory extinction and re-acquisition. Another aim was to enable further experimentation in animals chronically implanted with intracranial electrode arrays.
Métodos e Resultados: Our modified plus-maze has its enclosed arms disposed in “L”. At the beginning of each session, animals (n=9) were placed in a box for 1 hour. Pexposure to the apparatus was performed with all arms closed. Training, test1, test2, re-training, re-test1 and re-test2 sessions followed. All sessions lasted 10 minutes. During training and re-training sessions, aversive stimuli (bright light and loud noise) were delivered whenever an animal entered one of the enclosed arms (aversive arm). The experiment was performed during the dark phase of the light/dark cycle. Acquisition, retention and extinction were evaluated by the percent of the total time spent in the aversive arm. Number of entries and time spent in each arm were registered by an animal tracking software (Anymaze, Stoelting, USA). Learning in the training session was estimated as the decrease in time spent in the aversive arm. Our results show that memory extinction occurred at test and test phases, being less robust after re-training. Total entries decreased along the sessions, indicating habituation.
52 LEMOS, N. A. M. ; FREIRE, M. ; NICOLESIS, M. A. L. ; SILVA, R. H. ; RIBEIRO, S. . Immediate Early Gene Expression During the Acquisition, Extinction and Re-Acquisition of an Aversive Memory. In: XXII Reunião Anual da Fesbe, 2007, Águas de Lindóia. Anais da XXII Reunião Anual da Fesbe,
2007. p. 05.152.
Objetivo: The plus-maze discriminative avoidance task with re-training and re-test sessions is a good model to investigate memory acquisition, extinction and re-acquisition. Calcium-dependent immediate early genes (IEGs) involved in synaptic plasticity, such as zif-268 and c-fos, can be used to assess brain sites where learning occurs. Here we set out to investigate the dynamics of calcium-dependent IEG expression during different learning/unlearning phases of the plus-maze discriminative avoidance task.
Métodos e Resultados: Animals were pre-exposed to the maze with all four arms closed to habituate responses to novelty and thus decrease basal levels of IEG expression. Training, test1, test2, re-training, re-test1 and re-test2 sessions were investigated (session duration = 10 min). Experiments were performed during the dark phase of the light/dark cycle, with a 24 hours interval between sessions. During training and re-training sessions, aversive stimuli (bright light and loud noise) were presented whenever an animal entered one of the enclosed arms (aversive arm). At the end of target sessions, animals were placed back in their home cages and perfused after additional 50 minutes with phosphate-saline buffer and 4% paraformaldehyde. The tissue was then frontally sectioned at 20 µm in a cryostat and submitted to immunohistochemistry for zif-268 and c-fos. Our preliminary results show that cells in the CA1 field of the hippocampus – but not in other hippocampal regions - were strongly labeled for zif-268 and c-fos during the training. Such labeling decreased across the subsequent sessions.
Conclusões: The data suggest that the CA1 field of the hippocampus encodes aversive memories created during the plus-maze discriminative avoidance task.
LEMOS, N. A. M. ; FREIRE, M. ; NICOLESIS, M. A. L. ; SILVA, R. H. ; RIBEIRO, S. . Immediate Early Gene Expression During the Acquisition, Extinction and Re-Acquisition of an Aversive Memory. In: XXII Reunião Anual da Fesbe, 2007, Águas de Lindóia. Anais da XXII Reunião Anual da Fesbe,
LEMOS, N.A.M., FREIRE, M.A.M., FERREIRA, L.F., NICOLELIS, M.A.L., SILVA, R.H., RIBEIRO, S. Expressao do gene imediato Zif-268 durante a aquisicao, evocacao e extincao de uma memoria aversiva. In: III Reunião Regional da Fesbe, 2007, Recife. Objetivos: No paradigma comportamental da esquiva discriminativa, as memórias de curto e de longo prazo têm sido extensivamente estudadas tanto comportamental quanto farmacologicamente (J. Neurosci. Meth. 102: 117, 2000). O objetivo do presente estudo é avaliar, usando o modelo supracitado, a expressão hipocampal de Zif-268 – gene imediato dependente de cálcio implicado em processos de plasticidade sináptica – ao longo das diversas etapas da formação da memória, como aquisição, evocação e extinção.
Métodos e resultados: O aparato comportamental consiste de um labirinto em cruz elevado modificado, com seus braços fechados dispostos em “L”. Uma pré-exposição ao labirinto foi feita com os animais (n=3/grupo) usando os quatro braços fechados, com duração de 30 minutos, seguida de um treino e de um teste, cada qual com duração de 10 minutos. O intervalo entre as sessões foi de 24 horas. Durante o treino, um estímulo aversivo (luz e ruído intensos) era acionado sempre que os animais entravam em um dos braços fechados (braço aversivo). A aquisição, retenção e extinção da memória foram avaliados pelo percentual de tempo total gasto na exploração do braço aversivo. Os parâmetros avaliados (tempo nos braços e distância percorrida) foram registrados por um software de rastreamento de animais (Anymaze, Stoelting, USA). O aprendizado durante o treino foi estimado pelo decréscimo do tempo gasto na exploração o braço aversivo. Uma hora após o início de cada sessão, os animais foram anestesiados com uma overdose de tiopental (i.p.) e perfundidos com solução salina heparinizada 0.9% e paraformaldeído a 4%. Os encéfalos foram crioprotegidos com solução de sacarose a 20%, separados em três blocos e congelados. O bloco do meio, contendo o hipocampo, foi seccionado a 20 µm no plano coronal e as secções resultantes foram então submetidas à imunohistoquímica para Zif-268. Nossos resultados mostram um aumento da expressão de Zif-268 no giro denteado (GD) durante as etapas de evocação e extinção.
54
ANEXO III:
Tampão fosfato 0,2 M
Tampão utilizado, após diluição, para a preparação de fixadores e para a lavagem dos cortes antes dos procedimentos histoquímicos.
Substâncias necessárias:
• Água destilada;
• Sódio fosfato monobásico monohidratado - NaH2PO4H2O: composto I; • Sódio fosfato bibásico heptahidratado - NaH2PO47H2O: composto II;
Procedimentos:
Dissolvem-se 7,5 g do composto I em 250 mL de água destilada e 53 g do composto II em 1000 mL de água destilada. A seguir, misturam-se as duas soluções quando ambas estiverem homogêneas. Após isso, ajusta-se o pH da solução resultante, caso este esteja fora da faixa 7,2-7,4, utilizando hidróxido de sódio (NaOH) ou ácido clorídrico (HCl).
56
Solução salina 0,9%
Solução utilizada para a lavagem do tecido cerebral durante a perfusão e para a preparação do tampão fosfato salina (utilizado em imunohistoquímicas).
Substâncias necessárias:
• 9 g de cloreto de sódio - NaCl; • 1000 mL de água destilada;
Procedimentos:
Tampão fosfato salina 0,1M
Esta solução é utilizada nos procedimentos de imunohistoquímica.
Substâncias necessárias:
• 1000 mL de tampão fosfato 0,1M; • 9 g de cloreto de sódio - NaCl;
Procedimentos:
58
Paraformaldeído a 4% (pH 7,2-7,4)
Fixador utilizado para a preservação do tecido cerebral durante a perfusão.
Substâncias necessárias:
• 40 g de paraformaldeído;
• 500 mL de água destilada a 70ºC; • Hidróxido de sódio (NaOH); • 500 mL de tampão fosfato 0,2 M;
Procedimentos:
Cresil violeta
Solução utilizada para a realização da coloração de Nissl em fatias de tecido nervoso.
Substâncias necessárias:
• 520 mL de água destilada; • 1,2 g de violeta de cresila em pó; • 10 mL de ácido acético a 10%;
Procedimentos:
Aquece-se a água destilada à 37ºC. A seguir, adiciona-se o cresil violeta e coloca-se a solução obtida em agitação suave e constante. Após isso, filtra-se a solução e acrescenta-se o ácido acético a 10%. A solução resultante deve ser acondicionada em recipiente fosco ou protegida da luz com papel laminado.
