Estudo da anemia em ovinos decorrente a verminose gastrintestinal

(1)

Estudo da anemia em ovinos decorrente à

verminose gastrintestinal

(2)

DANIELA BECKER BIRGEL

Estudo da anemia em ovinos decorrente a verminose

gastrintestinal

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências

Departamento:

Clínica Médica

Área de concentração:

Clínica Veterinária

Orientador:

Prof. Dr. Eduardo Harry Birgel Junior

Coorientador:

Prof. Dr. Fernando José Benesi

(3)

DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO

(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)

T.2762 Birgel, Daniela Becker

FMVZ Estudo da anemia em ovinos decorrente a verminose gastrintestinal / Daniela Becker Birgel. -- 2013.

118 f. : il.

Tese (Doutorado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Clínica Médica, São Paulo, 2013.

Programa de Pós-Graduação: Clínica Veterinária.

Área de concentração: Clínica Veterinária.

Orientador: Prof. Dr. Eduardo Harry Birgel Junior.

Coorientador: Prof. Dr. Fernando José Benesi.

(4)

(5)

FOLHA DE AVALIAÇÃO

Autor: BIRGEL, Daniela Becker

Título: Estudo da anemia em ovinos decorrente a verminose gastrintestinal.

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências

Data: ______/______/_________

Banca Examinadora:

Prof. Dr. ____________________________________________________________

Instituição: ________________________Julgamento:_________________________

Prof. Dr. ____________________________________________________________

(6)

Ao meu marido, Eduardo, quem acreditou que tudo fosse dar certo e dar tempo,

mesmo em muitas dificuldades, companheiro de todas as horas e momentos e

tantas e tantas noites e finais de semana na USP se dedicando aos animais.

Obrigada por todo carinho e amor.

Aos meus filhos, Beatriz, Isabelle e Henrique, vocês sempre participaram de

tudo, com alegria e empolgação. Obrigada pelo companheirismo, noites e finais de

semana na USP, obrigada pela torcida que tudo daria certo, obrigada pela meta:

-

“Mamãe, termina logo o doutorado para podermos ter o nosso cachorro”. Vocês

são muito preciosos e importantes, realmente amo vocês e estar ao lado de vocês.

(7)

Dedico este trabalho...

A minha mãe, Vera, e minha sogra, Alice, exemplo de mulheres fortes que me estimularam e

me apoiaram para que nunca desistisse, principalmente na principal dificuldade da mulher

moderna, conciliar bem o seu papel de mãe e profissional. Em tantos momentos que pensei

não ser possível, vocês me estimularam a seguir em frente. Obrigada pela confiança e

exemplo.

Ao meu pai, Jayme, exemplo de pessoa calma, cuidadosa e forte. Obrigada pela confiança e

presença em minha vida.

Ao meu sogro, Eduardo, obrigada pelo exemplo, carinho e confiança.

Aos meus queridos avós, Clara Eufride, José Becker e Paschoalina, obrigada pelo carinho,

pelo amor e por tudo que significam em minha vida.

Aos meus queridos irmãos, Julio César e Thales, cunhadas, Cynthia e Heloisa, e cunhado,

Eduardo, como é bom ter vocês em minha vida!

Aos queridos Antônio Augusto, Maria Gabriela, Letícia e Leonardo, durante o mestrado

vocês eram crianças, agora são jovens estudando e buscando seus objetivos. Acreditem em

suas capacidades e sigam em frente, mas cuidem bem do principal alicerce, a família!

As queridas sobrinhas Julia e Carolina, como é bom ter vocês na família!

(8)

Dedico este trabalho...

Ao Prof. Wanderley Pereira de Araujo, meu primeiro orientador, muito obrigada

por tudo!

(9)

Agradecimentos

Muitas pessoas me ajudaram na execução e conclusão desse trabalho, tanto para

formação das minhas bases profissionais, como execução, finalização e

viabilização deste trabalho.

Há todos meu muito obrigada!!!

Obrigada, aos meus professores de graduação

Obrigada, aos meus professores de pós-graduação

Obrigada, aos colegas de pós graduação

Obrigada, aos colegas de trabalho

Obrigada, as bolsistas de pré iniciação científica, Jennyfer e Joyce

Obrigada, aos bolsistas de capacitação e de iniciação científica, Pedro, Aline,

Karina, Tainan e Alois

Obrigada, aos estagiários, Vivian e Luan

Obrigada a Rosângela, que tanto cuidou das minhas preciosidades enquanto

estive trabalhando nesta pesquisa

Obrigada às amigas, Andrea, Camila e Daniela, que me ajudaram buscando as

crianças na escola quando eu não podia

Obrigada aos pós-graduandos, Paulo, Flávio e Eduardo, por cuidar dos animais

quando me ausentava

Obrigada, Vanessa, Melina e Raquel, vocês fizeram a diferença nos momentos

finais, nunca vou esquecer pela ajuda e disposição.

(10)

As Atitudes Mentais são mais Importantes que a Capacidade Mental

“ Tudo, na sua vida, depende da sua atitude. A felicidade não depende de coisas à sua volta, mas da sua atitude. É uma lei que importa recordar. As nossas atitudes controlam as nossas vidas. São uma força secreta a labutar vinte e quatro horas por dia, para o bem ou para o mal. É importante sabermos como domesticar e controlar essa grande força. As atitudes mentais são mais importantes que a capacidade mental. As atitudes afetam o corpo; criamos um clima dentro de nós e à nossa volta com as nossas atitudes. Tenha uma atitude agradável, afetuosa e amistosa.

Séneca, o sábio romano, afirmou:

- «Um homem pode governar o mundo inteiro e continuar infeliz, se não sentir que é supremamente feliz».

Que beleza existe no mundo em que vive? Ora bem, é tão belo como a sua atitude mental. Resolva ter uma atitude feliz, confiante, enérgica, positiva, entusiástica. A disposição interior, mais que qualquer outra coisa, pode dar a perspectiva adequada e a faculdade para resolver qualquer situação. Cada pessoa tem uma tendência para uma atitude construtiva ou negativa. Manter pensamentos positivos requer vigilância constante e desenvolvimento do

caráter através do estudo e da experiência.”

(11)

[Study of anemia in sheep due to gastrointestinal nematode parasites]. 2013. 118 f. Tese (Doutorado em Ciências) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2013.

A anemia por verminose nos ovinos é do tipo normocítico e normocrômico. O estado anêmico decorrente da verminose gastrintestinal determinou normoleucocitemia com existência de linfopenia e eosinopenia, podendo ser observado em animais com hematócrito menor do que 15 % a ocorrência de neutrofilia sem desvio a esquerda. Observou-se inversão do padrão leucocitário, que passou de linfocitário para neutrofílico. Os teores séricos de ferro e índice de saturação da transferrina nos animais com anemia intensa e moderada são significativamente menores, enquanto os valores de Capacidade Total de Ligação de Ferro não sofreram variações significativas. Observou-se hipoproteinemia, hipoalbuminemia e menor concentração de colesterol sérico em animais classificados como intensamente anêmicos e moderadamente anêmicos. Afora essa alteração, os resultados obtidos para a função hepática, função renal e lipidograma indicam alterações de menor importância e mostram que os ovinos apresentam grande capacidade de manter a sua homeostase. O processo anêmico agudo não determinou modificações no pH, pO2, pCO2, HCO3- e lactato sanguíneo, indicando que não

houve hipóxia tecidual. Independentemente da intensidade da anemia, os animais foram capazes de minimizar ou prevenir os efeitos da hipóxia por meio do aumento da sua frequência cardíaca. Neutrofilia transitória foi observada no grupo de animais submetidos à sangria aguda, enquanto nos animais submetidos à perda crônica de sangue esse fenômeno não ocorreu. Ao se analisar o número de leucócitos e de neutrófilos em animais submetidos à perda crônica de sangue, observou-se leucopenia por neutropenia associado a linfopenia e eosinopenia. Esses resultados evidenciam que as alterações no leucograma de animais com anemia verminótica não se devem somente a perda crônica de sangue, pois os valores de leucócitos e neutrófilos dentro da normalidade ou aumentados (como observado nos ovinos com anemia grave) não puderam ser associados com a perda de sangue crônica.

(12)

ABSTRACT

BIRGEL, D. B. Study of anemia in sheep due to gastrointestinal nematode parasites.

[Estudo das anemias em ovinos decorrente a verminose gastrintestinal]. 2013. 118f Tese (Doutorado em Ciências) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2013.

The anemia caused by nematode parasites in sheep is normocytic and normochromic. The total number of leukocytes did not change. The anemic state due to gastrointestinal parasitism determined lymphopenia anda monocytosis and can be observed in animals with packed cell volume less than 15% neutrophils without the occurrence of a left shift.It was observed a change of the pattern leukocyte count, which becoming mostly neutrophilic. The levels of serum iron and transferrin saturation index in animals with moderate and severe anemia are

significantly lower, while the values of capacity total iron binding didn’t show significant

variation. It was observed significant lower levels of total serum protein, serum albumin and serum cholesterol in animals classified as strongly anemic and moderately anemic. Aside from this change, the results obtained for liver function, renal function and lipidic profile indicate minor changes and shown that sheep have a great capacity to maintain the homeostasis. The acute anemic process not determined changes in pH, pO2, pCO2, HCO3- and

lactate, indicating no tissue hypoxia. Regardless of the intensity of anemia, the animals were able to minimize or prevent the effects of hypoxia by increasing the heart rate. Transient neutrophilia was observed in the group of animals subjected to acute bleeding, while in animals subjected to chronic blood loss this phenomenon did not occur. When analyzing the number of leukocytes and neutrophils in animals subjected to chronic blood loss, there was decrease on the number of neutrophils associated with a decreas on the number of lymphocyte and eosinophils. These results show that changes in leukocyte counts in anemic animals with worm infection due not only to chronic blood loss, because the values of leukocytes and neutrophils normal or increased (as observed in sheep with severe anemia) could not be associated with chronic blood loss.

(13)

1 INTRODUÇÃO ... 13

2 REVISÃO DE LITERATURA ... 16

3 MATERIAL E MÉTODOS ... 23

4 RESULTADOS ... 42

5 DISCUSSÃO ... 101

6 CONCLUSÕES ... 110

(14)

1 INTRODUÇÃO

Com rebanho nacional estimado em 17 milhões de cabeças, a ovinocultura vem vivenciando um incremento na sua atividade nas últimas décadas, alcançando destaque cada vez maior na pecuária brasileira, participando da produção pecuária familiar e comercial, sobretudo, de carne e lã. Entre os animais de médio porte, os ovinos assinalaram maior crescimentono panorama da pecuária nacional no ano de 2011 (IBGE, 2011).

O Estado de São Paulo possui mais de 450.000 cabeças, o maior rebanho ovino da região Sudeste, sendo ele voltado principalmente para a produção de carne, em detrimento a outros produtos como a lã (IBGE, 2011).

A queda do preço da lã nos mercados internacionais, ocasionou mudança no perfil produtivo no qual os animais lanados começaram a ser substituídos por ovinos voltados para produção de carne. Esta mudança ocasionou o desenvolvimento da ovinocultura em varias regiões que não possuíam esta tradição (MARTINS, 2006).

Dentre os ovinos voltados à produção de carne, a raça Santa Inês, selecionada no Brasil, é considerada mais tolerante às verminoses que outras raças exóticas, tornando-se, portanto, de grande interesse zootécnico (ROCHA; AMARANTE; BRICARELLO, 2006; SILVA, 2010). Devido a sua rusticidade, maior resistência a doenças e não apresentar estacionalidade reprodutiva, os deslanados, dentre eles o Santa Inês e suas cruzas, representam 61,5 % dos ovinos criados no país (MALHADO et al., 2009).

O aumento de produção e da produtividade animal são os maiores focos na pecuária comercial. Para tanto, existe a necessidade da melhora na sanidade dos rebanhos com o implemento de medidas que permitam o diagnóstico, tratamento e prevenção de enfermidades responsáveis por grandes prejuízos econômicos. Dentre essas doenças, merecem destaque particular, as verminoses gastrintestinais, que ao acometer os ovinos, causam redução de produtividade, mortalidade e perdas econômicas (GENNARI; AMARANTE, 2006).

(15)

Na região sudeste do Brasil, os nematódeos de maior importância para os pequenos ruminantes são: Haemonchus contortus, Trichostrongylus colubriformis, Strongyloides spp.,

Cooperia curticei e Oesophagostomum columbianum (AMARANTE et al., 1997;

AMARANTE et al., 2004), sendo que pelas condições climáticas, considera-se que o

Haemonchus contortus desempenha papel principal (VIEIRA BRESSAN et al., 1995; LOPES

et al.,1997). Em pesquisa realizada no Estado de São Paulo, Faria Junior e colaboradores (2002) verificaram que 64% das larvas cultivadas e identificadas em amostras de fezes obtidas de animais com verminose eram deste gênero de parasita.

O Haemonchus contortus, localizado no abomaso, é um parasito hematófago, portanto

causador de perdas sanguíneas, que levam a quadros de anemia e hipoproteinemia, resultando em diminuição da produção e, em casos graves, em morte. Em infestações nas quais este parasita é único ou majoritário, não se constata animais com diarreia (MOLENTO et al., 2004).

Atualmente, o controle de nematódeos gastrintestinais em ovinos baseado apenas no uso de anti-helmínticos tem se mostrado ineficaz. Fatores como o equilíbrio entre hospedeiro e parasita estão sendo considerados, bem como a busca por raças e indivíduos naturalmente mais resistentes à infecção (GENNARI; AMARANTE, 2006).

Geralmente, as infecções por parasitas são mistas, causando um somatório dos efeitos patogênicos de cada uma das espécies que infectam o animal. Em consequência à infecção por nematóides gastrintestinais, os principais sinais clínicos apresentados pelos ovinos são anemia, edema submandibular, diarreia e inapetência (GENNARI; AMARANTE, 2006).

Entre 1999 e 2003, segundo Gregory e Benesi (2006), 15,82% (90/569) dos atendimentos de ovinos realizados no Serviço de Clínica de Bovinos e Pequenos Ruminantes da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP, foram decorrentes de estados anêmicos associados a verminoses gastrintestinais.

Para o diagnóstico laboratorial da verminose, o exame mais utilizado, porém com significativa margem de variação, é o que determina a quantidade de ovos por grama de fezes (OPG), baseado na técnica de Gordon e Whitlock modificada (UENO; GONÇALVES, 1998) realizado antes e/ou após o tratamento com anti-helmínticos. Um método hoje muito utilizado nos rebanhos para indicar o tratamento para verminose gastrintestinal é o Famacha®, baseado no diagnóstico do mais frequente e preocupante sintoma, a anemia.

(16)

que 1500, vários animais não apresentaram sintomas de anemia, sugerindo uma maior capacidade de alguns animais em suportar altas cargas parasitárias, sendo denominados resilientes.

Devido à importância da verminose para a criação de ovinos e aos prejuízos econômicos associados principalmente à anemia justificam-se pesquisas que detalhem mais esse sintoma, sendo assim, estabeleceram-se como objetivos:

a) Avaliar o quadro eritrocitário e o metabolismo de ferro de acordo com a gravidade do estado anêmico e

(17)

2 REVISÃO DE LITERATURA

A anemia pode ser definida pela diminuição do número de eritrócitos, da concentração de hemoglobina e do volume globular. Esta condição possivelmente leva a diminuição do suprimento de oxigênio ao organismo, o que pode gerar hipóxia tecidual. As causas principais de anemia são a perda sanguínea, a destruição eritrocitácia e diminuição da eritropoiese (FELDMAN et al., 2000).

A ação dos nematoides gastrointestinais pode ocasionar dois processos: anemia e hipoproteinemia. A anemia é causada principalmente pela ação hematófaga do Haemonchus

contortus, já que cada adulto chega a expoliar 0,08mL de sangue por dia (GARCIA;

D’ANGELINO, 1985). Blood et al. (1988) ressaltam que a ingestão de grandes quantidades

de larvas de Haemonchus contortus pode levar a haemoncose hiperaguda em cordeiros,

ocorrendo, em sete dias, morte súbita. As infestações crônicas, envolvendo números menores de helmintos, determinam, segundo Ruas e Berne (2001), alterações caracterizadas por anorexia, menor ganho de peso, emagrecimento progressivo, ausência de diarreia, sendo o sintoma mais evidente a anemia.

Segundo Benesi (1985) as manifestações sintomáticas da anemia são variáveis e dependentes da etiologia e patogênese do processo, do grau/intensidade da anemia, das alterações do volume total de sangue circulante e das exigências e/ou manejo a que estão

sujeitos os animais afetados. De acordo com Garcia e D’Angelino (1985) as manifestações

sintomáticas são determinadas pela hipóxia tecidual que se instala e agrava o quadro, pois toda atividade eritropoiética fica diminuída pela depressão medular. Nestes casos, mucosas pálidas são frequentemente encontradas. Segundo Faria Junior et al. (2002), em caprinos acometidos por intensa helmintose gastrintestinal (mais de 2.000 ovos por grama de fezes) a presença de mucosas esbranquiçadas foi observada em 23,33% dos animais e ocorrência de edemas em 3,33% das cabras examinadas.

Para prevenir ou diminuir a hipóxia, o organismo ativa os chamados mecanismos compensatórios, que atuam em diversas funções e órgãos como na respiração, coração e medula óssea (BENESI, 1985; BIRGEL, 1999).

As adaptações respiratórias caracterizam-se por aumento da frequência respiratória, devido a concentração aumentada de gás carbônico (CO2) circulante, respiração superficial,

dispneia e por redução da afinidade da hemoglobina pelo oxigênio (O2), o quepermite uma

(18)

As compensações cardíacas se revelam por um aumento de rendimento cardíaco, determinando maior velocidade de circulação e menos extração de O2 em cada circulação.

Quando a concentração de hemoglobina cai, abaixo dos 50% do valor normal, pode ocorrer aumento da frequência cardíaca. Estas alterações podem dar origem a extremidades frias e taquicardia com sopros cardíacos sistólicos (BENESI, 1985; BIRGEL, 1999).

As adaptações vasculares objetivam a diminuição do tempo de circulação e o aumento da perfusão seletiva, através do desvio do sangue de áreas não vitais para as vitais, como diminuição da circulação cutânea e renal para favorecer o cérebro, miocárdio e músculos (BENESI, 1985; BIRGEL, 1999).

As adaptações eritropoiéticas, reconhecidas como o verdadeiro mecanismo compensatório, visam o aumento da produção de eritrócitos. A hipóxia tecidual leva à produção de eritropoetina e esta estimula a eritropoiese (BENESI, 1985). Veng-Pedersen et al. (2002) realizaram sangrias em ovinos adultos jovens e observaram rápida elevação da eritropoietina plasmática, que alcançou valores máximos de três a oito dias após os procedimentos. A presença de reticulócitos na circulação sanguínea ocorreu em 12 horas até 1 dia e meio após as sangrias.

Segundo Birgel (1999), após perda de sangue por hemorragia e/ou hemólise intensa, há diminuição do volume total de sangue, com compensação rápida por aumento do volume plasmático, restaurando a volemia. O hemograma revela intensa diminuição dos valores hematológicos (contagem de hemácias, hematócrito e dosagem de hemoglobina). O exame do aspecto das hemácias, em esfregaços sanguíneos corados pela técnica de Rosenfeld, é extremamente válido para estabelecero prognóstico, uma vez que a presença de sinais regenerativos (policromatofilia, ponteado basofílico, corpúsculos de Howell-Jolly, dentre outros) mostram adequada respostado organismo (GARCIA; D’ANGELINO, 1985).

A medula óssea, estimulada pela condição anêmica, libera grande quantidade de células jovens e imaturas, que possuem maior volume corpuscular médio determinando macrocitose. Após a hiperplasia medular compensatória da anemia, o tecido mieloide retorna a liberar eritrócitos maturos, ocorrendo, então, normocitose e normocromia (BIRGEL, 1999).

A contagem de reticulócitos auxilia na verificação da intensidade da resposta medular ao processo anêmico e até para o esclarecimento da possível etiologia do processo (MEYER; HARWEY, 1998).

(19)

eritróide nos processos anêmicos, a evolução das anemias e a eficácia da terapia. O aumento do número de reticulócitos é intenso nas hemorragias agudas e de menor magnitude nas crônicas e pode ser persistente nas anemias hemolíticas. Um aumento no número é sinal de eritroregeneração e bom prognóstico (BENESI, 1985). A presença de reticulócitos é observada a partir do terceiro dia da perda de sangue (MEYER; HARWEY, 1998).

Caso o processo de espoliação determinada pelo endoparasita se prolongue e resulte em perdas intensas e continuadas de sangue, poderá ocorrer a depleção das reservas de ferro e consequentemente a anemia torna-se hipocrômica e, finalmente, microcítica (BIRGEL, 2000). Na opinião de Birgel (1999), as anemias microcíticas, quer sejam hipocrômicas ou não, são as formas clínicas mais frequentemente diagnosticadas nos pequenos ruminantes.

Segundo Birgel (1999) as anemias microcíticas e hipocrômicas podem ser diferenciadas em duas formas: microcíticas ferroprivas e microcíticas não ferroprivas. Nas primeiras, além das características hematimétricas, observam-se uma significativa diminuição das concentrações plasmáticas de ferro; ao passo que nas não ferroprivas a sideremia se encontra na amplitude de variação fisiológica. Nas anemias não ferroprivas, os estados de sub-nutrição, que determinam déficit proteico, impedirão a formação da hemoglobina por não haver condições de síntese da globulina.

As anemias microcíticas não ferroprivas de origem constitucional são hemoglobinopatias primárias e relacionam-se a herdabilidade de fatores que determinam formação de hemoglobinas anormais e com ações fisiológicas deficientes. Descreveu-se em caprinos e ovinos, diferentes tipos de hemoglobinas, porém ainda não foi elucidado, definitivamente, a influência desses tipos de hemoglobina nas condições de saúde desses animais (BIRGEL, 1999).

Al- Quaizy et al(1987) verificaram que ovinos da raça Awassi infestados com 500 larvas de Haemonchus contortus por Kg de peso vivo desenvolveram anemia a partir do

décimo primeiro dia pós-infecção, sendo que os valores do volume globular diminuíram de 29,5%, no dia da infestação experimental, para 15,5%, no vigésimo dia após o início do experimento.

A ocorrência de anemia macrocítica ABBOTT; PARKINS; HOLMES, 1984) ou de anemia normocítica e normocrômica (ABBOTT; PARKINS; HOLMES, 1984; FARIA JUNIOR et al., 2002) foram relatadas em ovinos infectados por Haemonchus contortus. Em

(20)

Em pesquisa desenvolvida por Faria Junior et al.(2002), foram utilizados 90 animais adultos, naturalmente infectados, divididos em três grupos de 30 animais cada, sendo: grupo I de zero a 500 OPG; grupo II de 501 a 2.000 OPG e grupo III maior que 2.000 OPG. Os autores observaram que caprinos acometidos por intensa helmintose gastrintestinal (mais de 2.000 OPG), apresentavam importantes alterações no seu eritrograma com a ocorrência de anemia normocítica e normocrômica, diminuição do número de hemácias e do volume globular. Os teores de hemoglobina foram significativamente menores nos grupos II e III.

A maior parte do ferro no organismo, aproximadamente 80%, é destinada à função eritrocítica, presente no eritrócito em forma de hemoglobina. O restante deste mineral está distribuído no organismo na mioglobina (3%), nos locais de estoque, como ferritina e hemossiderina (15%) e em várias enzimas (catalases, citocromos, peroxidases) numa pequena quantidade (1%) (HAYS; SWENSON, 1996).

Os resultados obtidos por Ashmead (2001), mostram que a suplementação oral de ferro em doses diárias ou doses altas intermitentes aumentam a sua biodisponibilidade com conseqüente aumento na resposta eritropoiética em monogástricos. Hurtado, Claussen e Scott (1999), concluíram que a suplementação semanal de ferro oral em indivíduos anêmicos levou a um aumento nos níveis de hemoglobina e volume corpuscular médio (VCM), indicando aumento na resposta medular. Da mesma forma, a utilização de ferro dextrano, na forma injetável, melhora a resposta reticulocitária em cordeiros anêmicos (ROCHA et al., 2007). Este aumento na resposta medular ocorre, pois a quantidade de ferro liberado para o eritrócito imaturo é diretamente dependente da concentração do ferro sérico, que é melhorado pela suplementação com este mineral (SCHOOL; JOHNSON, 2000).

O leucograma é influenciado pelo cortisol na medida em que este atua sobre a medula óssea. O cortisol promove a liberação dos neutrófilos do compartimento de estocagem da medula óssea causando, portanto, elevação de leucócitos circulantes. Aqueles já presentes na circulação diminuem a expressão de moléculas de adesão na superfície, reduzindo sua ligação com células endoteliais o que contribui para o aumento no compartimento circulante (FELDMAN et al., 2000). Segundo Feldman et al. (2000), o cortisol induz redução dos eosinófilos sanguíneos por inibir a eosinopoiese na medula óssea e/ou migração destas células para outros tecidos como o baço e os linfonodos.

(21)

apresentaram maiores contagens de eosinófilos séricos, tiveram suas contagens de ovos para

Hemonchus contortus diminuídas.

A hipoproteinemia, que ocorre pela ação dos nematoides gastrointestinais é causada por distúrbios na digestão e absorção normal dos nutrientes. Com a conseqüente queda da pressão oncótica do sangue, nota-se o extravasamento de plasma no interstício orgânico, na tentativa de recuperação da pressão normal. Este extravasamento pode causar anasarca, ascite e edema submandibular. O estado geral do animal se deteriora e nota-se perda de peso, pelos arrepiados e sem brilho, apatia, anorexia, hipotonia ou atonia ruminal e, raramente, diarréia

(GARCIA; D’ANGELINO, 1985).

O edema que se instala nos quadros de hemoncose ocorre por consequência da hipoproteinemia e hipoalbuminemia, enquanto a anemia é causada principalmente pela ação hematófaga do Haemonchus contortus (ABBOTT; PARKINS; HOLMES, 1984; GARCIA;

D’ANGELINO, 1985; ABBOTT; PARKINS; HOLMES, 1988).

Deve ser destacado que nos estados anêmicos, principalmente naqueles com perda aguda de sangue, pode ocorrer uma menor oxigenação da região centro-lobular dos lóbulos hepáticos determinando processo degenerativo e/ou de necrose hepatocelular com comprometimento da função do órgão (MACLACHLAN; CULLEN, 1998). Apesar desta possibilidade, os resultados das dosagens séricas de aspartato-amino-transferase (AST) e gamaglutamil-transferase (GGT) obtidos em pesquisa realizada por Faria Junior et al.(2002) não conseguiram demonstrar a presença de lesão hepática que seria provocada pela hipóxia decorrente da anemia verminótica.

Fonteque (2005) induziu anemias agudas através de sangrias e observou diminuição de eritrócitos, da concentração de hemoglobina, do volume globular e da concentração de proteína plasmática total. Este autor verificou a recuperação da anemia 28 dias após a segunda sangria. A perda aguda de sangue determinou a elevação de leucócitos, neutrófilos, monócitos, inversão da relação neutrófilo:linfócito, redução de eosinófilos, elevação de cortisol, porém, os teores de lactato, uréia, creatinina, AST e GGT, não sofreram alterações.

(22)

A anemia também pode causar alcalose respiratória decorrente da hiperventilação prolongada. A compensação da alcalose respiratória é realizada por diminuição na reabsorção de bicarbonato renal o qual se acumula na urina, levando o organismo a reter também cloreto aumentando a eletroneutralidade (ORTOLANI, 2003).

Além das alterações eritropoieticas o parasitismo gastrintestinal causa também alterações no consumo e digestão dos alimentos. Ovinos parasitados podem reduzir o consumo de alimentos ou até, em casos mais graves, chegar à completa anorexia. O parasitismo no abomaso causa alterações de pH e estas podem determinar menor absorção de elementos como o cobre (BORBA, 1996). Przemeck (2003) estudando a infecção por

Ostertagia circumcincta em cordeiros encontrou aumento de pH abomasal logo nos primeiros

dias do parasitismo (5 a 10 dias).

Nos ruminantes, grande parte da energia utilizada no seu metabolismo é obtida de ácidos graxos voláteis (acetato, propionato e butirato) provenientes da fermentação ruminal, sendo que a síntese de glicose a partir dos ácidos graxos voláteis é dependente do perfeito funcionamento do fígado, uma vez que este órgão é o regulador da concentração de glicose no sangue e da oferta de glicose aos tecidos, sendo essencialmente o único local para a gliconeogênese (formação de glicose a partir de compostos carbônicos), ainda que exista uma pequena contribuição do córtex renal (HERDT, 2000).

O butirato é convertido no epitélio ruminal em betahidroxibutirato (β-HBO), e quando

adentra a corrente sanguínea, pode ser utilizado como energia ou fonte de ácidos graxos de cadeia longa (KANEKO; HARVEY; BRUSS, 2008). Normalmente, o β-HBO plasmático provém da fermentação ruminal uma vez que os ruminantes diferem, entre outros aspectos, dos demais monogástricos na medida em que grandes quantidades de corpos cetônicos alimentares são liberados na veia porta (MARUTA, 2005).

(23)

colesterol, sintetizado e catabolizado no fígado é precursor de hormônios esteróides, vitamina D, ácidos biliares, e é constituinte de membranas celulares e micelas biliares (KANEKO; HARVEY; BRUSS, 2008).

O principal substrato para a formação do colesterol, como no caso dos ácidos graxos de cadeia longa, é a acetil-CoA. Em casos de ingestão de alimento, aumento de insulina, aumento da leptina (CHILLIARD et al., 2001; CHILLIARD et al., 2005), baixo glucagon, ou seja, quando o organismo está em desfosforilação (menor consumo de ATP), a produção do colesterol é estimulada. Em momentos de inanição fisiológica (periparto) ou patológica (doença), que levam o organismo a fosforilação, a produção de colesterol fica comprometida, fenômeno que também é observado com aumentos nas quantidades de glicocorticóides, endógenos ou exógenos (KANEKO; HARVEY; BRUSS, 2008).

Ácidos graxos de cadeia longa liberados do tecido adiposo durante a lipólise circulam como ácidos graxos não esterificados (NEFA) cuja concentração no sangue reflete a magnitude da mobilização do tecido adiposo (PULLEN et al.,1989), portanto com o aumento do balanço energético negativo, que pode ocorrer na diminuição de consumo alimentar, mais ácidos graxos não esterificados são liberados do tecido adiposo, aumentando a sua concentração no sangue.

A função renal deve ser acompanhada, pois a perda de volemia determina uma diminuição da filtração glomerular. Neste sentido, os testes de função renal são úteis para monitorar o tratamento das anemias. (KANEKO; HARVEY; BRUSS, 2008).

O catabolismo de proteínas gera amônia, que é utilizada como substrato pelo fígado para sintetizar ureia. A uremia pode ser alterada pela síntese de ureia nos hepatócitos e/ou pela sua taxa de eliminação renal. A taxa de eliminação da ureia depende da filtração glomerular e da reabsorção deste elemento nos túbulos renais KANEKO; HARVEY; BRUSS, 2008).

(24)

3 MATERIAL E MÉTODOS

A parte experimental desta pesquisa foi dividida em dois momentos: um momento de observação a campo em que ovelhas foram examinadas e selecionadas e delas colhido material para exame e outro em que as ovelhas foram mantidas em baias e piquetes no campus da USP de Pirassununga para desenvolvimento de parte experimental relacionada a perda aguda e perda crônica de sangue, efeito da restrição alimentar no hemograma e na bioquímica sanguínea de ovinos com infecção moderada por nematóides e efeito do sulfato de manganês como antagonista de absorção do ferro.

3.1 ANIMAIS UTILIZADOS PARA AVALIAÇÃO DO QUADRO ERITROCITÁRIO E DA REPERCUSSÃO DO ESTADO ANÊMICO NO LEUCOGRAMA E NO PERFIL BIOQUÍMICO DECORRENTES À VERMINOSE GASTRINTESTINAL

Para a realização desta pesquisa foram utilizados 167 ovinos, fêmeas, mestiças ½ sangue da raça Santa Inês oriundos de cinco propriedades com histórico de problemas de verminose gastrintestinal causadas principalmente por Haemonchus spp.

As cinco propriedades rurais apresentavam manejo semelhante, no qual os animais eram soltos no pasto pela manhã e no final do dia eram reunidos em local coberto e neste momento fornecido silagem, com sal mineral e água à vontade.

A seleção dos animais foi realizada por meio de exame clínico através da inspeção da coloração da mucosa ocular que era classificada pelo método Famacha®. Para garantir a homogeneidade dos animais avaliados foram utilizados somente ovelhas com mais de 24 meses de vida e descartados aqueles cujo estado anêmico fosse decorrente à anemias hemolíticas, como observado na intoxicação por cobre, ou em que a verminose gastrintestinal estivesse associada a outras enfermidades.

(25)

gênero Haemonchus spp. A coprocultura foi realizada no Instituto Biológico utilizando-se

pool de fezes de animais da mesma propriedade.

Baseado na magnitude das diminuições do hematócrito e de acordo com as recomendações de Benesi (1985), as anemias foram classificadas segundo a sua intensidade em anemias de grau leve - quando as diminuições forem de até 1/3 dos valores mínimos normais de hematócrito, sendo assim entre 21 e 25 % de hematócrito; anemia moderada - quando as reduções forem de 1/3 a 1/2 dos valores mínimos normais, sendo assim entre 16% e 20% de hematócrito e anemia intensa - quando as diminuições forem maiores que a 1/2 dos valores mínimos normais, com hematócrito igual ou menor que 15%. A seguir foram constituídos os grupos de animais de acordo com a intensidade de anemia: animais sem anemia, anemia de grau leve, anemia moderada e anemia intensa (Quadro 1). Os animais sem anemia, utilizados como grupo controle, foram divididos em dois grupos, o primeiro com valores de hematócrito maiores do que 30 % e o segundo com valores de hematócrito entre 25 e 30%.

Quadro 1 – Animais utilizados para avaliar o quadro eritrocitário, o metabolismo de ferro e avaliar a repercussão do estado anêmico no leucograma, na função hepática, na função renal, no lipidograma e nos teores sérico de glicose, lactato e cobre

Grupos Intensidade da anemia Número de _animais

1 ovinos sem anemia: com hematócrito maior do 30 % 38

2 ovinos sem anemia: com hematócrito variando entre 25 e 30% 41

3 ovinos com anemia leve: com hematócrito variando entre 21 e 25% 54

4 ovinos com anemia moderada: com hematócrito variando entre 15 e 20 % 21

5 ovinos com anemia intensa com hematócrito igual ou menor a 15% 13

(26)

3.2 ANIMAIS UTILIZADOS PARA AVALIAÇÃO DO QUADRO ERITROCITÁRIO E DA REPERCUSSÃO DO ESTADO ANÊMICO NO LEUCOGRAMA, NO PERFIL BIOQUÍMICO E NO EQUILÍBRIO ÁCIDO-BÁSICO DECORRENTE À PERDA SANGUÍNEA AGUDA

Foram utilizadas 9 ovelhas de mais de 24 meses de idade, mestiças meio sangue Santa Inês, pesando entre 50 e 60 kg, com bom estado geral, valores normais de hematócrito, hemácias e hemoglobinas e exame coproparasitológico negativo. As ovelhas foram mantidas no campus da USP em Pirassununga, estabulados em baias concretadas com acesso a solário e alimentadas no cocho duas vezes ao dia com feno de capim Coast – Cross (Cynodon

dactylon), água à vontade e sem acesso a sal mineral. Sete dias antes do início da sangria

foram vermifugadas utilizando-se 20 mg/kg de albendazole via oral.

Neste estudo procurou-se promover a perda de sangue aguda, dentro do período de 12 horas, de forma que os valores de hematócrito, hemoglobina e hemácia fossem reduzidos a menos da metade dos valores mínimos normais para a espécie, alcançando por volta de 15 % de hematócrito, 4,5 x 106 hemácias por mm3 e 4,5 g/dL de hemoglobina.

A sangria foi realizada por punção da veia jugular externa garroteada utilizando-se agulha 40x16 heparinizada ligada a equipo heparinizado que depositava o sangue retirado em proveta graduada. Inicialmente retirava-se 1000 mL de sangue e imediatamente era fornecido 1000 mL de solução fisiológica. Após 30 minutos da reposição da volemia, era realizado hemograma para avaliar a intensidade da anemia provocada. A seguir nova sangria era realizada, na qual retirava-se entre 250 e 500 mL antes de repor a volemia com a mesma quantidade de solução fisiológica. Dentro do período máximo de 12 horas foram feitas repetidas sangrias e hemogramas até que o número de hemácias, taxa de hemoglobina e valores de hematócrito decrescerem para metade dos valores mínimos normais para a espécie.

Considerando que o volume de sangue corpóreo representa 8 % do peso vivo, para produzir o quadro experimental proposto, retirou-se cerca de 50 % do total do volume de sangue corpóreo, o que representou cerca de 2000 ml de sangue.

(27)

Nestes momentos era realizado o exame físico das ovelhas através da aferição das funções vitais: temperatura, freqüência cardíaca, freqüência respiratória e movimento ruminal, inspeção da coloração da mucosa ocular classificada pelo método Famacha® e a inspeção da condição corporal por meio de palpação da região lombar, segundo técnica descrita por Russel (1984), que atribuem valores de 0 a 5 (0 = caquético, 1 = magro, 2 = regular, 3 = bom, 4 = gordo e 5 = muito gordo) para o escore de condição corporal inspeção da condição corporal classificando-as de condição corporal 1 (extremante magra) a 5 (obesa). Colhia-se sangue para hemograma, análises bioquímicas e hemogasometria, bem como fezes eram colhidas para exame coproparasitológico, com a finalidade de monitorar a condição de não parasitados por nematódeos da superfamília Trichostrongyloidea.

3.3 ANIMAIS UTILIZADOS PARA AVALIAÇÃO DO QUADRO ERITROCITÁRIO E DA REPERCUSSÃO DO ESTADO ANÊMICO NO LEUCOGRAMA E NO PERFIL BIOQUÍMICO DECORRENTES À PERDA SANGUÍNEA CRÔNICA EM ANIMAIS SEM VERMINOSE GASTRINTESTINAL

Foram utilizadas 8 ovelhas de mais de 24 meses de idade, mestiças meio sangue Santa Inês, com bom estado geral, valores normais de hematócrito, hemácias e hemoglobina e exame coproparasitológico negativo. As ovelhas foram mantidas no campus da USP em Pirassununga, estabulados em piquete de terra batida com 300 m2 de área e alimentadas no cocho duas vezes ao dia com feno de capim Coast – Cross (Cynodon dactylon) com água à

vontade e sem acesso a sal mineral. Sete dias antes do início da sangria foram vermifugadas utilizando-se 20 mg/kg de albendazole via oral.

Neste estudo procurou-se promover a perda de sangue crônica, dentro de aproximadamente sessenta dias, de forma que os valores de hematócrito, hemoglobina e hemácia fossem reduzidos a menos da metade dos valores mínimos normais para a espécie, alcançando por volta de 15 % de hematócrito, 4,5 x 106 hemácias por mm3 e 4,5 g/dL de hemoglobina.

(28)

Inicialmente retirou-se 100 mL de sangue por animal por dia durante sete dias, após esse período foi realizado o hemograma e optou-se por diminuir a quantidade de sangue retirada para que não fosse provocada rápida diminuição nos constituintes figurados sanguíneos. Semanalmente era colhido sangue para hemograma e bioquímica sanguínea, bem como a cada 21 dias foi realizado exame coproparasitológico comprovando a manutenção no estado de não parasitados por nematódeos da superfamília Trichostrongyloidea. A quantidade de sangue retirada diariamente está detalhada no quadro 2 abaixo:

Quadro 2 – Descrição da quantidade de sangue retirada por dia para provocar anemia por perda sanguínea crônica

Semana Quantidade de sangue retirada por dia Quantidade de sangue retirada por semana

1º semana 100 mL 700 mL

2° semana 50 mL 350 mL

Fonte: (BIRGEL, D. B., 2013)

Ao término da nona semana (63 dias) foi retirado o total de 7.210 mL de sangue por animal, sendo necessário mais dois dias, retirando 200 ml de sangue por dia, para que 6 ovelhas apresentassem decréscimo dos valores de hematócrito, hemácia e hemoglobina para metade dos valores mínimos normais para a espécie. Para obtermos o mesmo resultado em outras duas ovelhas, continuou-se retirando 200 ml de sangue, além dos 63 dias, por mais dez dias, totalizando 73 dias de sangria e volume de sangue igual a 9.210 mL.

(29)

Nestes momentos era realizado o exame físico das ovelhas através da aferição das funções vitais: temperatura, freqüência cardíaca, freqüência respiratória e movimento ruminal, inspeção da coloração da mucosa ocular classificada pelo método Famacha® e inspeção da condição corporal por meio de palpação da região lombar, segundo técnica descrita por Russel (1984), que atribuem valores de 0 a 5 (0 = caquético, 1 = magro, 2 = regular, 3 = bom, 4 = gordo e 5 = muito gordo) para o escore de condição corporal. Colhia-se sangue para hemograma e análises bioquímicas, bem como fezes eram colhidas para exame coproparasitológico, com a finalidade de monitorar a condição de não parasitados por nematódeos da superfamília Trichostrongyloidea.

3.4 ANIMAIS UTILIZADOS PARA AVALIAR O EFEITO DA RESTRIÇÃO ALIMENTAR NOS PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS, BIOQUÍMICOS E COPROPARASITOLÓGICOS

Entre fevereiro e agosto de 2012, foram mantidas 12 ovelhas, mestiças meio sangue Santa Inês, com verminose gastrintestinal, na qual predominava Haemonchus contortus, em

piquete de 300 m2 de terra batida, dentro da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de

Alimentos-USP Pirassununga. Nesse piquete, o único alimento recebido era feno de Coast – Cross (Cynodon dactylon) e água à vontade. Não recebiam sal mineral. Nos meses de abril,

maio e junho de 2012, reduziu-se a quantidade fornecida de feno em 50% da quantidade inicial. As ovelhas que recebiam diariamente 1 kg de feno por ovelha passaram a receber 500g de feno por animal.

3.5 ANIMAIS UTILIZADOS PARA AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA ADMINISTRAÇÃO VIA ORAL DO SULFATO DE MANGANÊS COMO ANTAGONISTA DA ABSORÇÃO DE FERRO NO ERITROGRAMA E NO METABOLISMO DE FERRO

(30)

consideradas resilientes por apresentarem infecção por nematódeos de mais de 1000 opg e não apresentarem anemia. Os animais foram mantidos em baias de concreto e diariamente era fornecido via oral 4 gramas de Sulfato de Manganês, como antagonista de absorção de ferro, durante 100 dias. O sulfato de manganês era fornecido diluído em água utilizando uma seringa.

Os animais eram alimentados com feno de Coast – Cross (Cynodon dactylon) e tinham

acesso livremente à água. Não recebiam suplementação mineral.

3.4 COLHEITA DE SANGUE

As amostras de sangue foram colhidas por punção da veia jugular externa, com agulha descartável 25x28 mm, em três tubos plásticos preparados para a colheita de sangue á vácuo

(Sistema Vacutainer). O tubo contendo 7,2 mg de K2 EDTA como anticoagulante (tubo de tampa roxa) e com vácuo suficiente para aspirar 4 ml de sangue era destinado à determinação do hemograma. O tubo sem anticoagulante e com gel ativador de coágulo (tubo de tampa amarela) era destinado à obtenção do soro para as análises bioquímicas e o tubo com 6 mg de fluoreto de sódio (agente anti glicolítico) e EDTA como anticoagulante (tubo de tampa cinza) foi destinado à obtenção do plasma e com ele determinação da concentração de glicose.

O sangue após a colheita era mantido sob refrigeração até o momento da realização dos exames, sempre concluídos antes de decorridas oito horas de conservação.

(31)

3.5 AVALIAÇÃO DA HEMOGASOMETRIA:

O sangue para a gasometria foi colhido em seringas específicas heparinizadas com Ca balanceado da marca Monovette® Sarstedt.

Inicialmente, utilizando scalp 25G, puncionava-se a artéria carótida no terço final do pescoço e localizada bem próxima à veia jugular, esperava-se o preenchimento do scalp pelo sangue arterial. Com o scalp preenchido, acoplava-se a seringa e delicadamente puxava-se o êmbolo permitindo o preenchimento pelo sangue e a não formação de bolhas. Ao preencher mais do que 1 ml retirava-se o scalp, delicadamente homogenizava a amostra com as mãos e retirava-se todo ar, vedando a seringa com sua tampa plástica. O sangue venoso era colhido por punção jugular com agulha 25X8 acoplada na seringa Monovette®, com a seringa preenchida repetia-se o mesmo procedimento citado acima.

O sangue era rapidamente analisado no local utilizando hemogasômetro portátil i-STAT 1® (empresa Abbott) e cartuchos i-i-STAT® EG7+ que consistem de um chip biossensor eletroquímico que realiza determinações à 37ºC para pH, pCO2 (pressão parcial de dióxido de carbono em mmHg), pO2 (pressão de oxigênio em mmHg), Na (sódio em mMol/L), K (potássio em mMol/l), iCa (cálcio ionizado em mMol/l) e Hematócrito. A partir dessas determinações o sistema calcula valores para o HCO3 (bicarbonato em mmol/L), o TCO2 (Dióxido de Carbono Total em mmHg), BE ( excesso ou déficit de bases no sangue em mMol/L), SO2 (saturação de oxigênio em %) e hemoglobina (g/dL). O pH, pCO2 e pO2 são convertidos para a temperatura do animal.

3.6 AVALIAÇÃO DO HEMOGRAMA

A determinação do número de hemácias, do hematócrito, dosagem de hemoglobina e número total de leucócitos foram realizadas no contador automatizado BC-2800 Vet Mindray®. Esse equipamento utiliza o método de impedância para mensuração das hemácias e leucócitos e os métodos colorimétricos para determinação da hemoglobina.

(32)

VCM=Ht X 10 He HCM = Hb x 10 He CHCM = Hb x100 Ht

Com o sangue “in natura” foram distendidos dois esfregaços sanguíneos destinados à

contagem diferencial de leucócitos. Esses esfregaços, após secarem, foram corados utilizando-se o corante de Routilizando-senfeld.

Corante de Rosenfeld: 0,97 g --- Giemsa em pó 0,53 g --- May Grunwald 1000 ml --- Metanol p.a.

Técnica utilizada:

 Cobrir o esfregaço com 1 ml de corante de Rosenfeld

 Aguardar 3 minutos

 Acrescentar em gotas 2 ml de água destilada fervida

 Homogeneizar

 Aguardar 13 minutos

 Lavar com água destilada fervida

 Secar o esfregaço

Técnica padronizada para os animais por Birgel (1982).

Em cada esfregaço sanguíneo foram avaliados aspectos morfológicos e tintoriais das hemácias bem como a ocorrência de sinais de policromasia (eritroblastos, células basófilas, ponteado basófilo nas hemácias, corpúsculos de Howell-Joly e anéis de Cabot.) que, juntamente com a contagem de reticulócitos, permitem avaliar a resposta da eritropoiese aos estímulos, determinando se a anemia é degenerativa ou regenerativa.

(33)

Complementando a avaliação do hemograma foi realizado a contagem manual de reticulócitos colocando partes iguais (50uL) do corante Azul de Cresil Brilhante (Laborclin®) e do sangue em tubo de vidro. Essa mistura foi incubada em banho-maria por 20 minutos a 37°C e, após, distendido dois esfregaços e rapidamente secados. Os esfregaços eram contra-corados com corante de Rosenfeld e analisado no microscópio óptico em aumento de 1000X, contando-se 1000 hemácias e dentre essas as que foram corados fragmentos de RNA, os reticulócitos. O resultado foi expresso em número absoluto de reticulócitos (FERNANDEZ;GRINDEM, 2000).

3.7 AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO HEPÁTICA

3.7.1 Determinação dos teores séricos de proteína total

A determinação dos teores séricos de proteína total foi feita pelo método do biureto, de acordo com a técnica preconizada por Gornall et al. (1949) e modificada por Strufaldi (1987), com leitura da coloração da reação utilizando-se comprimento de onda de 550nm em Analisador Bioquímico Automático da marca Randox Daytona® - Randox Laboratories, Reino Unido utilizando-se kit comercial da marca Randox® referência TP4001. O princípio desta técnica baseia-se na reação entre os tripeptídeos, polipeptídeos e proteínas existentes no soro sanguíneo com íons de cobre presentes no reativo de biureto, em meio alcalino, formando um complexo de coloração violeta, cuja intensidade é diretamente proporcional à concentração de proteína presente na amostra, sendo os resultados expressos em g/dL.

3.7.2 Determinação dos teores séricos de albumina

(34)

baseia-se na reação entre a albumina, presente na amostra, e o verde de bromocresol, em meio ácido, originando um complexo cuja intensidade de coloração é diretamente proporcional à concentração de albumina presente na amostra e os resultados expressos em g/dL.

3.7.3 Determinação dos teores séricos de globulinas e da relação albumina/globulinas

A determinação dos teores séricos de globulinas foi obtida pela subtração dos teores séricos de proteína total e albumina, sendo os valores expressos em g/dL. Com a determinação dos teores séricos de globulinas, dividia-se a albumina pela globulinas obtendo a relação entre as variáveis.

3.7.4 Determinação da atividade sérica da aspartato-aminotransferase (AST)

A atividade enzimática sérica da aspartato-aminotransferase foi determinada segundo metodologia cinética otimizada em conformidade com o European Comitee for Clinical Laboratory Standards (ECCLS), em Analisador Bioquímico Automático da marca RX Daytona® - Randox Laboratories, Reino Unido, utilizando-se kit comercial da marca Randox® referência AS3804.

O princípio do método está baseado na ação catalítica da AST sobre o 2-oxoglutarato, originando glutamato e oxalacetato, sendo este último convertido a L-malato pela enzima malato-desidrogenase e, nesta reação acoplada, ocorre simultaneamente, a oxidação de NADH para NAD+, ocasionando diminuição na quantidade de NADH e o desenvolvimento de coloração quantificada em 340nm a uma temperatura igual a 25C, cuja intensidade é diretamente proporcional à atividade de AST presente na amostra (SCHIMID; FOSTNER, 1986) e expressas em U/L.

3.7.5 Determinação da atividade sérica da gama glutamiltransferase (GGT)

(35)

Laboratory Standards (ECCLS), em Analisador Bioquímico Automático da marca RX Daytona® - Randox Laboratories, Reino Unido, utilizando-se kit comercial da marca Randox® referência GT3817.

Segundo essa técnica, a enzima gama-glutamiltransferase cataliza a transferencia do resíduo gama-glutamil da L-gama-glutamil-3-carboxi-4-nitrobenzoato para glicilglicina e a quantidade de 3-carboxi-4nitroanilina formada na reação é diretamente proporcional à atividade enzimática existente na amostra. Na realização desta prova quantificou-se o aumento da densidade óptica em 405nm, sendo os resultados expressos em U/L e

considerando a temperatura de reação para expressão dos valores igual a 25C.

3.7.6 Determinação da atividade sérica da creatina quinase (CK)

A atividade enzimática sérica da creatina-quinase foi determinada segundo metodologia cinética otimizada preconizada pelo Deutsche Gesellschaft fur Klinische Chemie, em Analisador Bioquímico Automático da marca RX Daytona® - Randox Laboratories, Reino Unido, utilizando-se kit comercial da marca Randox® referência CK NAC 110.

O princípio do método está baseado na ação catalítica da CK sobre a creatina fosfato e ADP, originando creatina e ATP; durante a ocorrência desta reação outras duas reações ocorrem simultaneamente, dando origem a NADPH que confere cor ao composto, cuja intensidade, determinada utilizando-se comprimento de onda igual a 340nm, é diretamente proporcional a atividade de CK existente na amostra (SCHIMID; FOSTNER, 1986), sendo os resultados expressos em U/L e a temperatura de reação considerada para a expressão deste valor igual a 25C.

3.7.7 Determinação das bilirrubinas séricas

(36)

bilirrubinas total e direta, feita com kit de Bilirrubina da marca Randox® referência BR3807 para bilirrubina direta e referência 3859 para Bilirrubina Total.

O método fundamenta-se na reação das bilirrubinas, especificamente com o ácido sulfanílico diazotado, produzindo um pigmento vermelho (azobilirrubina). A bilirrubina conjugada (bilirrubina direta) reage com o diazoreativo e, para obter-se a reação completa, permitindo a determinação de toda bilirrubina presente no soro sanguíneo (bilirrubina total), emprega-se um acelerador aquoso de benzoato de cafeína. A bilirrubina livre (indireta) é calculada por diferença entre os valores determinados para as bilirrubinas total e direta. As leituras das reações coloridas foram realizadas com espectrofotômetro, em 530nm de comprimento de onda e os resultados expressos em mg/dL.

3.8 AVALIAÇÃO DO LIPIDOGRAMA

3.8.1 Determinação dos teores séricos de colesterol

A determinação dos teores séricos de colesterol foi quantificada por metodologia enzimática colorimétrica em Analisador Bioquímico Automático da marca RX Daytona® - Randox Laboratories, Reino Unido, utilizando-se kit comercial da marca Randox® referência CH3810, conforme método descrito por Allain et al. (1974).

O princípio do método está baseado na ação das enzimas colesterol-esterase e colesterol-oxidase sobre o colesterol, originando um composto intermediário e água oxigenada. Na presença de peroxidase, a água oxigenada formada na reação anterior, reage com 4-arnino-antipirina e fenol dando origem a um complexo que desenvolve coloração, cuja intensidade medida em comprimento de onda igual a 500nm mantém relação direta com a quantidade de colesterol presente na amostra, sendo os resultados expressos em mg/dL.

3.8.2 Determinação dos teores séricos de triglicérides

(37)

Randox Laboratories, Reino Unido, utilizando-se kit comercial da marca Randox® referência TR3823, conforme técnica descrita por Fossati et al. (1982).

O princípio do método está baseado na hidrólise dos triglicérides pela ação da enzima lipase liberando glicerol; a ação da enzima glicerol-quinase e glicerol-fosfato-oxidase sob o glicerol formado na reação anterior, promove a formação de peróxido de hidrogênio e este por sua vez, sofre ação da peroxidase, produzindo quinolaimina que desenvolve coloração, cuja intensidade medida em comprimento de onda igual a 500nm, mantém relação direta com a quantidade de triglicérides presente na amostra, sendo os resultados expressos em mg/dL.

3.8.3 Determinação dos teores séricos de acidos graxos não esterificados (NEFA)

A determinação dos teores séricos de ácidos graxos não esterificados (NEFA) foi quantificada por metodologia enzimática colorimétrica em Analisador Bioquímico Automático da marca RX Daytona® - Randox Laboratories, Reino Unido, utilizando-se kit comercial da marca Randox® referência FA115.

O principio do método está baseado na ação das enzimas acil-CoA-sintetase na presença de ATP e cofatores sobre os ácidos graxos não esterificados, originando acil-CoA, AMP e Ppi; a acil-Coa é oxidada dando origem a peróxido de hidrogênio que age favorecendo a reação de N-etil-N-(2hidroxi-3-sulfopropil)-m-tosluidina com 4-aminoantipirina, presentes no reagente, dando origem a um complexo que desenvolve coloração púrpura, cuja intensidade medida em comprimento de onda igual a 550nm mantém relação direta com a quantidade de NEFA presente na amostra, sendo os resultados expressos em mol/L.

3.8.4 Determinação dos teores séricos de beta-hidroxibutirato

(38)

O principio do método está baseado na oxidação de D-3-hidroxibutirato em acetoacetato pela enzima desidrogenase 3-Hidroxibutirato. Concomitantemente com esta oxidação o cofator NAD+ é reduzido a NADH dando origem a coloração, cuja intensidade medida em comprimento de onda igual a 340nm mantém relação direta com a quantidade de beta-hidroxibutirato presente na amostra, sendo os resultados expressos em mg/dL.

3.9 DETERMINAÇÃO DOS TEORES PLASMÁTICOS DE GLICOSE

Para a determinação dos teores plasmáticos de glicose foi utilizado o método descrito por Barhan et al. (1972), em Analisador Bioquímico Automático da marca RX Daytona® - Randox Laboratories, Reino Unido, utilizando-se kit comercial da marca Randox® referência GL3815.

O princípio do método está baseado na oxidação da glicose em ácido glicurônico e peróxido de hidrogênio pela enzima glicose-oxidase; na presença de peroxidase o peróxido de hidrogênio, formado na reação anterior, reage com a 4-aminofenazona e com o 2,4-diclofenol, produzindo um corante quinoneiminico de coloração rósea, cuja intensidade mantém relação direta com a quantidade de glicose presente na amostra, sendo a leitura da coloração realizada utilizando comprimento de onda igual a 505nm e os resultados expressos em mg/dL.

3.10 AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO RENAL

3.10.1 Determinação dos teores séricos de uréia

A determinação dos teores séricos de uréia foi realizada por meio de método cinético enzimático, sendo a leitura da reação obtida pelo analisador bioquímico automático RX Daytona ® - Randox Laboratories, Reino Unido utilizando-se kit comercial da marca Randox® referência UR3825.

(39)

glutamato. A diminuição da concentração de NADH2 pode ser medida por espectrofotometria

utilizando comprimento de onda igual a 340 nm, sendo sua diminuição proporcional à concentração de uréia na amostra. Os resultados foram expressos em mg/dL.

3.10.2 Determinação dos teores séricos de creatinina

A determinação dos teores séricos de creatinina foi realizada por método colorimétrico e sua intensidade de cor processada pelo Analisador Bioquímico Automático da marca RX Daytona® - Randox Laboratories, Reino Unido, utilizando kit comercial da marca Randox® referência CR3814.

A reação da creatinina em solução alcalina com o picrato, origina um complexo de cor, cuja intensidade, determinada utilizando-se comprimento de onda igual a 340nm, é diretamente proporcional a atividade de creatinina existente na amostra, sendo os resultados expressos em mg/dL.

3.11 DETERMINAÇÃO DOS TEORES SÉRICOS DE LACTATO

O teor sérico de lactato foi obtido por determinação enzimática, correlacionando a ação catalítica da Lactato Oxidade que é diretamente proporcional à quantidade de lactato na amostra. A leitura por espectrofotometria utilizando comprimento de onda igual a 340 nm, foi realizada pelo Analisador Bioquímico Automático da marca RX Daytona® - Randox Laboratories, Reino Unido, utilizando kit comercial da marca Randox® referência LC3980. Os resultados foram expressos em mg/dL.

3.12 DETERMINAÇÃO DO TEOR SÉRICO DE FERRO (FS), CAPACIDADE TOTAL DE LIGAÇÃO DO FERRO À TRANSFERRINA (CTLF OU TIBC) E ÍNDICE DE SATURAÇÃO DA TRANSFERRINA (IST)

(40)

reação obtida pelo analisador bioquímico automático RX Daytona ® - Randox Laboratories, Reino Unido, utilizando kit comercial da marca Randox® referência SI250. Nesta determinação, o pH ácido do reagente tampão libera o ferro sérico que está ligado à transferrina sob a forma férrica. Há liberação do ferro férrico que é, então, reduzido para a forma ferrosa pela hidroxilamina. O ferro na forma ferrosa reage com o reativo Ferene(cromógeno) formando um complexo de cor azul. A absorbância da coloração desse complexo é lida utilizando-se comprimento de onda igual a 595 nm, sendo o resultado proporcional à concentração sérica de ferro na amostra. A presença de tiuréia na solução tampão suprime qualquer interferência do ferro.

Em pH alcalino os receptores não ocupados de transferrina podem ligar-se com o ferro na forma ferrosa. A adição de ferro não ligado à transferrina neste pH, reage com o Ferene e forma uma cor. A absorbância da coloração desse complexo ferro-Fereneé lida utilizando-se comprimento de onda igual a 595 nm, sendo o resultado inversamente proporcional à quantidade de receptores não ocupados. A capacidade total de ligação do ferro a transferrina (CTLF ou TIBC) é a soma da concentração sérica de ferro e a quantidade adicional de ferro necessária para saturar o sítio não ligado de transferrina (UIBC).

Os resultados do Ferro Sérico (FS), da Capacidade Total de Ligação do Ferro à transferrina (CTLF)foram expressos em ug/dL.

A percentagem de saturação da transferrina foi obtida através do cálculo da proporção entre a concentração de Fe (FS) e a Capacidade Total de Ligação do Ferro à transferrina (CTLF) e multiplicado por 100. Seguindo a equação abaixo:

ISF = _FS_ X 100 CTLF

3.13 DETERMINAÇÃO DOS TEORES SÉRICOS DE COBRE

(41)

Analisador Bioquímico Automático da marca RX Daytona® - Randox Laboratories, Reino Unido, utilizando kit comercial da marca Randox® referência CU2340. Os resultados foram expressos em ug/dL.

3.14 EXAME COPROPARASITOLÓGICO E COPROCULTURA

A contagem no número de ovos de nematóides gastrintestinal foi realizada pela técnica de Gordon e Whitlock modificada utilizando solução hipersaturada de cloreto de sódio, sendo a contagem do número de ovos por grama de fezes realizada em Câmara de Macmaster, de acordo com as recomendações de Ueno e Gonçalves (1998). Os ovos encontrados foram diferenciados e classificados como pertencentes à superfamília Trichostrongyloidea, aos gêneros Strongyloides, Nematodirus e Trichuris, sendo registrados a ocorrência de ovos pertencentes ao gênero Moniezia e oocitos do gênero Eimeria sp.

Para identificação dos parasitas, principalmente, da superfamília Trichostrongyloidea

foi realizada a coprocultura conforme a técnica de Roberts e O’Sullivan descrita por Ueno e

Gonçalves (1998).

3.15 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os valores da média aritmética e desvio padrão foram calculados utilizando o procedimento Means do SAS versão 9.2 (SAS/STAT, SAS Institute Inc., Cary, NC).

Os testes de normalidade dos resíduos foram realizados utilizando-se o Teste Shapiro-Wilk e para homogeneidade das variâncias utilizou-se o Guide Data Analise do SAS. Dados

que não preencheram os pressupostos para a análise de variância (distribuição normal e homocedasticidade das variâncias) foram transformadas em conformidade e novamente analisados.

(42)

por utilizar o teste paramétrico de Duncan, com nível de 5% de significância (p0,05), conforme recomenda Sampaio (1998).

(43)

4 RESULTADOS

Os resultados apresentados na presente pesquisa serão em seguida documentados e ilustrados através de gráficos e tabelas.

4.1 AVALIAÇÃO DO QUADRO ERITROCITÁRIO E DA REPERCUSSÃO DO ESTADO ANÊMICO DECORRENTES À VERMINOSE GASTRINTESTINAL

4.1.1 Eritrograma

Nos gráficos 1 a 6 e tabela 1 foram apresentados as médias e desvios padrão do número de hemácias, concentração de hemoglobina, hematócrito e os índices hematimétricos absolutos de ovinos sem anemia e com três diferentes intensidades de anemia, permitindo a caracterização de cada sub-grupo.

As médias de número de hemácias, concentração de hemoglobina e hematócrito por grupo foram estatisticamente diferentes confirmando as diferenças da intensidade da anemia observadas nos subgrupos.

Em termo médios, a análise dos resultados dos índices hematimétricos absolutos permitiram caracterizar a anemia como normocítica e normocômica independente da intensidade do processo anêmico.

(44)

Gráfico 1 - Número de Hemácias de ovinos distribuídos segundo a intensidade da anemia – Pirassununga - 2013

Fonte: (BIRGEL, D. B., 2013)

abcde - letras diferentes significam diferença estatística significante

Gráfico 2 - Concentração de Hemoglobina de ovinos distribuídos segundo a intensidade da anemia –

Pirassununga – 2013

Gráfico 3 – Hematócrito de ovinos distribuídos segundo a intensidade da anemia – Pirassununga – 2013

3,4 5,6 7,3 8,8 10,7 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 Anemia Intensa Anemia Moderada Anemia Leve Sem Anemia 25%<Ht≤30% Sem Anemia Ht>30% H em ac ia s (x 10 6/m m 3) 1,01a

1,01 b

1,26 d

1,15 c

1,76 e

3,81 6,22 8,32 10,20 12,00 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 Anemia Intensa Anemia Moderada Anemia Leve Sem Anemia 25%<Ht≤30% Sem Anemia Ht>30% H em og lo bi na (g /d L ) 1,76e 1,55d 0,96 c 0,87 b 0,97a 12,0 18,5 23,6 28,0 36,0 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 Anemia Intensa Anemia Moderada Anemia Leve Sem Anemia 25%<Ht≤30% Sem Anemia Ht>30% H em at óc ri to (% ) 2,70a

1,53 b

1,28 c

1,45 d