AVALIAÇÃO DO QUADRO ERITROCITÁRIO E DO METABOLISMO DE FERRO DE ANIMAIS SUBMETIDOS A TRATAMENTO COM SULFATO DE MANGANÊS

Nas tabelas 22, 23 e 24 estão retratadas as médias dos componentes do eritrograma, exame coproparasitológico e metabolismo de ferro de ovelhas que receberam, via oral, diariamente 4 gramas de Sulfato de Manganês, durante 100 dias.

A análise das tabelas permitiu afirmar que houve redução do número de hemácia em 1,64 x106 hemacias/mm3, redução em 5,9 % no hematócrito e de 2,3 g/dL na taxa de hemoglobina. A anemia desses animais foi do tipo normocícito e normocrômico e os teores séricos de ferro foram significativamente menores nas colheitas realizadas com 60 e 80 dias após o inicio do uso do manganês como antagonista da absorção do ferro.

Tabela 22 - Eritrograma de ovinos submetidos a tratamento com sulfato de manganês para antagonizar absorção de ferro – Pirassununga - 2013

abcd letras diferentes na mesma coluna, denotam presença de diferença estatística significante: * - Teste de Duncan (p≤0,05); ** - Teste de Kruskal-Wallis (p ≤ 0,0)

Hemacias** (X106/mm3) Hemoglobina** (g/dL) Hematócrito** (%) VCM*(µ3) HCM** (pg) CHCM**(%) Antes 8,72 ± 2,07 a _{10,17 ± 2,29} a _{30,61 ± 5,86} a _{35,76 ± 4,68} a _{11,69 ± 0,86} a _{33,07 ± 2,90} a

30 Dias após Início do

Tratamento 8,451 ± 1,73 ab 9,54 ± 1,99 a 29,33 ± 4,88 ab 35,28 ± 5,03 a 11,26 ± 0,67 b 32,36 ± 2,72

a

45 Dias após Início do

Tratamento 7,98 ± 1,49 abc 8,68 ± 1,96 b 27,39 ± 4,68 b 34,8 ± 5,63 a 10,75 ± 0,83 c 31,49 ± 3,20 a

60 Dias após Início do

Tratamento 7,84 ± 1,29 bcd 8,61 ± 1,67 bc 26,92 ± 4,02 bc 34,67 ± 4,24 a 10,89 ± 0,67 BC 31,75 ± 3,00 a

80 Dias após Início do

Tratamento 7,219 ± 1,27 cd 7,840 ± 1,64 c 24,32 ± 4,38 cd 33,91 ± 4,30 a 10,74 ± 0,78 c 32,18 ± 3,10 a

100 Dias após Início do

Tabela 23 - Média de ovos de Trichostrongyloidea por grama de fezes de ovinos submetidos a tratamento com sulfato de manganês para antagonizar a absorção de ferro – Pirassununga - 2013

OPG

Antes 2755 ± 1982 a

30 Dia após Início do

Tratamento 2920 ± 2003 a

45 Dias após Início

do Tratamento 3430 ± 1668 a

60 Diasapós Início do

Tratamento 3360 ± 1602 a

80 Diasapós Início do

Tratamento 3840 ± 2502 a

100 Dias após Início

do Tratamento 2680 ± 1735 a

abcde - letras diferentes na mesma coluna, denotam presença de diferença estatística significante: * - Teste de Duncan (p≤0,05); ** - Teste de Kruskal-Wallis

Tabela 24 – Concentração de ferro sérico, capacidade total de ligação do ferro e índice de saturação da transferrina de ovinos submetidos a tratamento com sulfato de manganês para antagonizar a absorção de ferro – Pirassununga - 2013 Ferro (µg/dL) Capacidade Total de Ligação Ferro (µg/dL) IST (%) Antes 159,80 ± 60,64 ab 292,50 ± 42,42 a 53,80 ± 16,94 a 30 Dias

após Início do Tratamento 146,66 ± 54,83

ab _{322,76 ± 34,46} b _{46,27 ± 18,17} ab

45 Dias

após Início do Tratamento 150,76 ± 67,62 ab 328,96 ± 42,46 b 47,31 ± 24,27 ab

60 Dias

após Início do Tratamento 97,29 ± 38,02 c 357,09 ± 28,92 c 27,93 ± 12,07 c

80 Dias

após Início do Tratamento 123,52 ± 48,91 bc 312,42 ± 22,46 ab 39,32 ± 14,17 b

100 Dias

após Início do Tratamento 172,80 ± 63,23

a _{318,20 ± 28,89} b _{55,17 ± 22,16} a

abcde letras diferentes na mesma coluna, denotam presença de diferença estatística significante: * - Teste de Duncan (p≤0,05); ** - Teste de Kruskal-Wallis (p ≤ 0,0)

5 DISCUSSÃO

Ao compulsar-se a literatura sobre anemia de pequenos ruminantes foi descrita, em associação a verminose de pequenos ruminantes por Haemonchus contortus, a ocorrência de anemia macrocítica (GARCIA et al., 1983; ABBOTT; PARKINS; HOLMES, 1988), anemia normocítica e normocrômica (GARCIA et al., 1983; ABBOTT; PARKINS; HOLMES, 1984; FARIA JUNIOR et al., 2002) ou hipocrômicas (GARCIA et al., 1983).

As discrepâncias relacionadas à classificação do tipo de anemias observadas na literatura compulsada podem ser justificadas como inerentes a fase de evolução do processo anêmico. Em processos agudos com grave perda de sangue, a medula óssea estimulada pela condição anêmica libera grande quantidade de células jovens e imaturas com maior volume corpuscular médio determinando macrocitose. Conforme o processo cronifica-se, ocorre hiperplasia medular compensatória da anemia, retorna o tecido mieloide a liberar eritrócitos maturos, ocorrendo, então, normocitose e normocromia. Caso o processo de espoliação determinada pelo endoparasita se prolongue e resulte em perdas continuadas de sangue poderá ocorrer depleção das reservas de ferro e conseqüentemente a anemia torna-se hipocrômica e, finalmente, microcítica.

Apesar da existência de animais cuja anemia foi classificada como macrocítica e de animais cuja anemia foi classificada como do tipo microcítica e hipocrômica, verificou-se, que em termos médios, o predomínio da ocorrência de anemia do tipo normocítico e normocrômico nas verminoses dos ovinos, criados no Estado de São Paulo. Os resultados obtidos na presente pesquisa não puderam estabelecer uma relação do tipo de anemia com a intensidade do processo anêmico.

Esses resultados indicam que a instalação do processo anêmico dos ovinos relacionados à verminose gastrintestinal tem evolução que permite a hiperplasia da medula e que as reservas de ferro, mesmo que diminuídas, não determinam grau extremo de depleção dos estoques de ferro que poderiam determinar anemia microcítica e hipocromica. Possivelmente, a depleção das reservas de ferro a um grau extremo estejam relacionadas a carga parasitária, a fatores individuais que favoreçam ou inibam a absorção do ferro e ao sistema de semi-extensivo de criação de ovinos no Estado de São Paulo, no qual os animais tem acesso a pastos e podem por meio da ingestão de terra suprir parcialmente ou totalmente as suas necessidades de ferro.

Considera-se que a deficiência primária de ferro em ruminantes adultos não é comum em nosso país, pois o solo e as pastagens brasileiras são ricos nesse elemento (TOKARNIA; DÖBEREINER; PEIXOTO, 2000). Somente nos bezerros, a deficiência primária de ferro é considerada importante e frequentemente associada como causa determinante das anemias observadas nos neonatos (BIRGEL, 1972; TENNANT, 1975; HIDIROGLOU, 1980). Segundo Birgel (1999), a carência de ferro na alimentação ocorre, particularmente, nos animais lactentes, pois além do leite ser um alimento pobre em ferro existe nessa fase da vida um balanço negativo, pois os bezerros nascem com uma pequena reserva de ferro que é rapidamente consumida, sendo este elemento considerado como de fundamental importância na dieta de animais jovens durante o período de rápido crescimento (HIDIROGLON, 1980).

Nas perdas crônicas de sangue, a anemia desenvolve-se lentamente e as reservas corporais de ferro podem ficar esgotadas (DUNCAN; PRASSE; MAHAFFEY, 1994). A ação hematófaga do Haemonchus contortus se assemelha aos processo anêmico crônicos, sendo estimado que cada parasito deste gênero suga 0,05 ml de sangue por dia (RUAS; BERNE, 2001). A análise dos resultados da presente pesquisa demonstrou que os teores séricos de ferro e índice de saturação da transferrina nos animais com anemia intensa e moderada são significativamente menores, enquanto os valores de Capacidade Total de Ligação de Ferro, que refletem os teores séricos de transferrina, não sofreram variações significativas. Considerando-se que não existe deficiência de ferro primária em animais adultos, esses dados indicam que existe na anemia verminótica balanço negativo de ferro, sendo a capacidade de absorção de ferro menor do que a quantidade de ferro que é espoliado pelos vermes hematófagos.

Em grupo de animais por nós acompanhados, nos quais havia predomínio de infecção por Haemonchus contortus, com opg que variaram entre 4.783 ± 4.342 e 9.848 ±10.650 opg, submetidos a restrição alimentar, no qual cada animal recebia 0,5 Kg de feno de coast-cross, durante o período de 90 dias não desenvolveram anemia na intensidade esperada. Os resultados apresentados nessa dissertação mostram que a redução de 4 % nos valores de hematócrito e de 0,9 g/dL nas taxa de hemoglobina não foi estatisticamente significante. A análise dos teores séricos de ferro, da capacidade total de ligação de ferro e do índice de saturação de ferro não sofreram variações durante o processo de restrição alimentar. Nesse mesmo período observou-se que os valores de albumina diminuíram de forma significativa em 0,46 g/dL. Verificou-se, ainda, que a restrição alimentar determinou significativa diminuição nos valores dos ácidos graxos não esterificados e da glicemia.

Apesar de ovinos submetidos a dietas com pouca proteina serem mais sensíveis a infecção experimental por Haemonchus contortus (BRICARELLO et al., 2005), os resultados por nós obtidos sugerem que a existência de déficit energético e proteico não potencializou a anemia dos animais e deveria ser vista como uma somatória da ação simultânea de duas enfermidades: verminose e desnutrição. A desnutrição proteico-energética tem sido associada à anemia em humanos (BARROS, 2007), camundongos (BARROS, 2007) e cordeiros (BORELLI et al., 2007), sendo descrito anemia do tipo normocícito e normocrômico com diminuição do número de reticulócitos. Na anemia de animais subnutridos não foi observado redução dos teores séricos de ferro e foi sugerido que a anemia observada era causada pela alteração na capacidade de proliferação e maturação da célula progenitora, resultando em inefetiva eritropoiese (BORELLI et al., 2007).

Os resultados por nós obtidos indicam que os animais foram capazes de manter a homeostase no metabolismo de ferro, possivelmente por que tinham acesso a piquetes com terra.

Ovelhas, alimentadas ad libitum com feno de coast cross, que receberam diariamente 4 gramas de Sulfato de Manganes pelo período de durante 100 dias, apresentaram redução de 1,64 x106 hemacias/mm3, de 5,9 % no hematócrito e de 2,3 g/dL na taxa de hemoglobina. A anemia desses animais foi do tipo normocícito e normocrômico e os teores séricos de ferro foram significativamente menores nas colheitas realizadas com 60 e 80 dias após o inicio do uso do manganês com antagonista de absorção de ferro.

Os animais continuarão a receber o sulfato de manganês até completarem 150 dias de administração, entretanto, um deles, que apresentou anemia intensa foi retirado do grupo experimental. Esse animal recebeu durante 45 dias, diariamente, 10 gramas de sulfato de ferro por via oral. Observou-se neste animal, que permanece infectado (não recebeu vermífugo), recuperação da sua crase sanguínea, com valores de hemácias aumentando de 5,48 para 8,74 x106 hemácias/mm3, hemoglobina de 4,9 para 9,2 g/dL; hematócrito de 14,9 para 27,3 %, VCM de 27,3 para 31,3 µ3 e HCM de 8,9 para 10,5 pg. Os teores séricos de ferro aumentaram de 105,8 µg /dL para valores que oscilaram entre 141,2 e 338,2 µg /dL.

Os dados obtidos até agora com o uso de manganês sugerem que a resposta ao processo anêmico dos animais com verminose gastrintestinal, bem como o fenômeno de resiliência nas verminoses gastrintestinais poderiam estar associadas ao metabolismo de ferro e à maior capacidade de captação e absorção de ferro. O manejo dos animais ou ao ambiente em que são criados seriam importantes fatores a serem considerados, pois as reservas de ferro, em situações nas quais os terrenos sejam arenosos ou animais criados confinados poderiam

ser insuficientes para contrapor a depleção de ferro pelos vermes hematófagos. Afora isso haveriam fatores individuais relacionados a eficiência no aproveitamento do ferro alimentar. Camundongos deficientes de hepcidina desenvolveram sobrecarga de ferro, especialmente no fígado, pâncreas e coração (GROTTO, 2008). Por outro lado animais que superexpressavam a hepcidina apresentavam anemia microcitca e hipocromica ao nascimento e morriam rapidamente (GROTTO, 2008). Em situações de anemia e hipóxia há inibição da expressão da hepcidina, visando maior absorção de ferro pelos enterócitos e maior exportação de ferro do sistema reticuloendotelial e enterócitos, aumentado a disponibilidade de ferrro para a eritropiese (GROTTO, 2008).

A avaliação da repercussão do estado anêmico/ verminose gastrintestinal sobre o leucograma evidenciou normoleucocitemia com existência de linfopenia e eosinopenia, podendo ser observado em animais com hematócrito menor do que 15 % a ocorrência de neutrofilia sem desvio a esquerda. Em ovelhas não infectadas observou-se valores de linfócitos maiores do que nos infectados.

Observou-se linfopenia absoluta que aumentou conforme maior era a intensidade do processo anêmico e ocorria inversão do padrão leucocitário, que passa de predominantemente linfocitário para neutrofílico. Essa inversão acentua-se a medida que o processo anêmico torna-se mais intenso. Nos ovinos com hematócrito maior do que 30 % observou-se que 26,3 % (10/38) dos animais apresentavam quadro leucocitário predominantemente neutrofílico, enquanto nos animais com hematócrito variando entre 25 e 30 % o percentual de animais com quadro neutrofílico era de 43,9 % (18/41). Nos animais com anemia leve esse percentual era de 63,9 % (34/54), nos animais com anemia moderada o percentual foi de 61,9 % (13/21), enquanto nos animais com anemia grave o padrão leucocitário foi neutrofílico em 84,6 % (11/13) dos animais examinados. Encontra-se na literatura datada da década de 60, uma referencia sobre aumento do número relativo de neutrófilos associado à diminuição do número relativo de linfócitos sem alterações no número total de leucócitos em casos de verminose gastrintestinal experimental causada por Trichostrongylus colubriformis (GALLAGHER, 1963). Entretanto ao analisar os resultados apresentados por Gallagher (1963) verificou-se que esse autor não observou inversão do padrão leucocitário, ou seja, o quadro leucocitário de animais com tricostrongilíase permanecia linfocitário.

Apesar dos mecanismos de imunidade ao parasitismo por Haemonchus contortus ainda não estarem completamente elucidados, pesquisas tem demonstrado o envolvimento dos linfócitos Th2 CD4+ na resposta imune a infecções parasitárias por nematódeos (Amarante; Amarante, 2003). Estudos realizados com canulação do abomaso evidenciaram a participação

de linfócitos agindo diretamente na mucosa afetada (SCHALLIG, 2000), a ativação e proliferação dos leucócitos, em especial os linfócitos (VEER et al., 2007) e significativa correlação inversa entre a contagem de linfócitos T na mucosa abomasal e a fecundidade, tamanho e a sobrevivência da fêmea adulta de Haemonchus contortus (ROWE et al., 2008). Esses fatos permitem supor que a diminuição do número de linfócitos circulantes seria conseqüência da sua provável migração para a mucosa abomasal.

Ocorrência de eosinofilia na mucosa abomasal e intestinal foi observada nas infecções por parasitas gastrintestinais e associada a maior resistência as infecções parasitárias. Correlacionou-se a ocorrência do aumento do número de eosinófilos circulantes com baixos valores de opg nas fezes de ovinos e relacionou-se esse fenômeno com maior resistência animal a infecção parasitária (HOHENHAUS et al., 1998).

Os resultados obtidos na presente pesquisa evidenciaram que a eosinopenia aumentou conforme aumentava a intensidade do processo anêmico e que o número absoluto de eosinóficos era menor nos animais infectados. Comparando-se os resultados obtidos em ovinos com aqueles referidos em caprinos por Muller et al. (2011) verifica-se que existem diferenças importantes entre o leucograma de ovinos e caprinos infectados por vermes gastrintestinais. Eosinofilia em caprinos ocorreu de forma esporádica quer nos animais sadios quer naqueles com verminose gastrintestinal, sendo observado valores absolutos de eosinófilos maiores do que 500 células/mm³ em menos de 5 % dos caprinos examinados (MULLER et al., 2011). Nos ovinos observou-se que 22,8 % (38/167) dos animais apresentava número absoluto de eosinófilos variando entre 500 e 1.000 celulas/mm³ e 16,8 % (28/167) apresentavam eosinofilia, ou seja, número absoluto de eosinóflos maior do que 1000 células/ mm³.

Outra diferença no leucograma de ovinos e caprinos infectados por Haemonchus contortus foi observado na resposta neutrofílica, pois nos ovinos infectados por vermes hematófagos, a neutrofilia foi observada somente no grupo de animais com anemia intensa.

Em caprinos com verminose gastrintestinal, a neutrofilia sem desvio a esquerda era mais evidente e observada, também, no grupo de animais com anemia leve e moderada, sendo que sua intensidade aumentava proporcionalmente ao aumento da gravidade da anemia (MULLER et al., 2011).

Durante a análise dos resultados obtidos, surgiu a dúvida se a resposta hematológica observada (neutrofilia e linfopenia) seria decorrente propriamente a verminose ou ao processo anêmico. Os resultados obtidos nos grupos de animais submetidos a perda aguda de sangue e perda crônica de sangue, contribuem para esclarecer a questão.

A ocorrência de neutrofilia durante os processos anêmicos por perda sangüínea puderam ser observados de forma transitória no grupo de animais submetidos a sangria aguda, enquanto nos animais submetidos a perda crônica de sangue esse fenômeno não ocorreu. Em animais pesando entre 50 e 60 Kg, nos quais foi retirado no intervalo de 12 horas cerca de 2.000 ml de sangue, seguido de reposição do volume com solução fisiológica, apresentaram evidente neutrofilia sem desvio a esquerda, sendo que a inversão da relação entre neutrófilos e linfócitos permaneceu durante 7 dias. Em cordeiros, observou-se que elevações do número total de leucócitos, neutrófilos e monócitos, com a inversão da relação entre neutrófilos e linfócitos e com a redução dos eosinófilos coincidiram com as maiores as maiores concentrações de cortisol (FONTEQUE, 2005), devendo essas alterações serem creditadas ao desvio do compartimento marginal de neutrófilos para o compartimento circulante (JAIN, 1993). Mesmo nas infecções graves por vermes hematógafos, nas quais existissem de 2000 a 5000 Haemonchus contortus, as perdas sanguíneas diárias oscilariam entre 100 e 250 ml, não permitindo caracterizar perda aguda de sangue.

Ao analisar-se o número de leucócitos e de neutrófilos em animais submetidos a perda crônica de sangue observou-se leucopenia por neutropenia associado a linfopenia e eosinopenia. Esses resultados evidenciam que as alterações no leucograma de animais com anemia verminótica não se devem somente a perda crônica de sangue, pois se por um lado a linfopenia e eosinopenia poderiam ser creditados ao processo anêmico, por outro a normoleucocitemia e valores de neutrófilos dentro da normalidade ou aumentados (como observado nos ovinos com anemia grave) não puderam ser associados com as perdas de sangue crônicas.

A suposição que o estado anêmico associado às verminoses gastrintestinais causariam menor oxigenação da região centro-lobular dos lóbulos hepáticos determinando processo degenerativo e/ou de necrose hepatocelular com comprometimento da função do órgão (MacLACHLAN; CULLEN, 1998) não pode ser demonstrada, pois a análise dos resultados de AST e GGT, bem como os teor sérico de bilirrubina total não sofreram variações em função dos grupos experimentais. Ao consultar a literatura sobre as possíveis inter-relações da função hepática e as anemias verminóticas, observa-se que o assunto foi pouco estudado, sendo encontrada somente a pesquisa de Faria et al. (2002) que também não conseguiram demonstrar a presença de lesão hepática que seria provocada pela hipóxia decorrente da anemia verminótica. Diante dos resultados obtidos poder-se-ia formular hipótese que nos animais com anemia verminótica as lesões não comprometeram mais que um terço do fígado ou seriam lesões sub-agudas, nas quais os valores das enzimas não se alteraram ou já

regressaram aos seus valores normais, não permitindo que por meio da bioquímica sangüínea ser efetuado o diagnóstico da hepatopatia. Para demonstrar se existe inter-relações entre as anemias verminóticas e a ocorrência de lesões hepáticas será necessário a utilização de outros métodos de diagnóstico como a ultra-sonografia e a biopsia hepática.

A principal alteração do perfil metabólico dos ovinos com verminose gastrintestinal foi a diminuição dos teores séricos de colesterol. Segundo Kaneko, Harvey e Bruss (2008), as quantidades de colesterol presentes refletem o acetil-CoA disponível para a geração de energia, oriundo basicamente da ingestão de comida. Em momentos de diminuição de ingestão de alimentos, há diminuição da liberação de insulina e de leptina e aumento de glucagon e AMPc, ou seja, em situações em que o organismo está em fosforilação, a produção de colesterol fica comprometida (KANEKO; HARVEY; BRUSS, 2008).

A associação entre baixos valores de colesterol e a ocorrência de distúrbios da reprodução foi descrita por Arosh et al. (1998) que verificaram níveis de colesterol significativamente menores para o grupo de fêmeas bovinas considerados inférteis. As explicações dessa associação estariam relacionadas ao fato do colesterol ser um precursor de hormônios esteróides como a progesterona, o estrógeno e a testosterona (KANEKO; HARVEY; BRUSS, 2008) ou ainda no fato que os baixos níveis de colesterol poderiam afetar a qualidade dos oócitos (KRUIP et al., 1996).

Encontra-se na literatura diversas referências correlacionando negativamente os teores séricos de colesterol, os teores plasmáticos de lipoproteínas com a infiltração gordurosa do fígado, ou seja, naqueles animais com significativa esteatose hepática observou-se que os valores séricos ou plasmáticos de colesterol e de lipoproteínas são baixos (VAN DEN TOP et al., 1995). Em seu livro sobre patologia animal, Santos (1979) afirma que nas anemias a gordura permanece nas células hepáticas, sem ser utilizada, acumulando-se progressivamente e ocasionando, dessa maneira, lipidose hepática. Apesar de não termos observado macroscopicamente a ocorrência de esteatose hepática nos animais com verminose necropsiados, existe a necessidade de avaliar por meio de biopsia hepática as possíveis inter- relações entre a esteatose hepática e os teores séricos de colesterol em animais com verminose gastrintestinal.

A glicemia dos animais com verminose gastrintestinal diminuiu com o aumento da intensidade da anemia, porém no grupo com anemia intensa observou-se hiperglicemia. Em três dos 13 animais apresentavam glicemia maior do que 100 mg/dL. Talvez, essa alteração bioquímica seja uma demonstração que pode ocorrer durante os processos graves de verminose distúrbios do metabolismo da glicose, com aumento da neoglicogênese em

resposta ao aumento de secreção de glicocorticóides ou dificuldades no aproveitamento da glicose como reflexo da diminuição dos níveis plasmáticos de insulina associado a menor ingestão de alimentos.

Os valores do betahidroxibutirato mantiveram-se dentro de valores de normalidade, indicando que não houve aumento da produção de corpos cetônicos, bem como a cetôgenese alimentar manteve-se inalterada. Este fato é indicativo que, mesmo com a diminuição da ingestão de alimentos, os processos fermentativos do rúmen não foram afetados pela verminose gastrintestinal, uma vez que durante a fermentação de carboidratos o acetato e o butirato, são convertidos em acetoacetato e β-HBO durante a absorção pelo epitélio ruminal,