ESTUDO EXPERIMENTAL SOBRE POSSÍVEL ATIVIDADE DA VIOLETA DE
GENCIANA NA PROFILAXIA DA TRANSMISSÃO DA TOXOPLASMOSE POR
TRANSFUSÃO DE SANGUE
Pedro Luiz Silva P I N T O ( 1 ) , Vicente AMATO NETO ( 2 ) , Maria Irma Seixas DUARTE ( 3 ) , José Xavier COTRIM ( 4 ) , Antonio Augusto Baillot MOREIRA ( 5 ) , Eunice José de SANT'ANA U ) e Rubens CAMPOS (6)
R E S U M O
D e v i d o a evidências sugestivas da possibilidade d e t r a n s m i s s ã o da t o x o p l a s ¬ m o s e p o r transfusão d e sangue, o s autores se p r o p u s e r a m avaliar o p a p e l pre-v e n t i pre-v o da pre-v i o l e t a de genciana, à semelhança d o que j á é estabelecido p a r a a doença de Chagas. O e x p e r i m e n t o e m c a m u n d o n g o s r e v e l o u a ação profilática da v i o l e t a d e genciana quando a d i c i o n a d o a o sangue a ser transfundido na con-centração d e 1/1000 e p e r m a n ê n c i a p o r 48 h o r a s na geladeira.
I N T R O D U Ç Ã O
E x i s t e m evidências sugestivas da possibil i d a d e d e t r a n s m i s s ã o da infecção p e possibil o T o x o -plasma g o n d i i através da h e m o t e r a p i a 6 , 2 , 1 0 , 1 4 . A p r o p ó s i t o , salientamos a parasitemia, obser-v a d a e x p e r i m e n t a l m e n t e e t a m b é m no h o m e m , s o b r e t u d o n o estádio a g u d o da doença, m e s m o e m pacientes clinicamente assintomáticos e que p o d e p e r m a n e c e r p o r m u i t o s m e s e s 3,6,7,9,5. D e v e ser l e m b r a d o que tal p r o t o z o á r i o j á f o i d e m o n s t r a d o n o sangue de d o a d o r e s assinto-m á t i c o s W e que os t r o f o z o í t o s d o t o x o p l a s assinto-m a s o b r e v i v e m e m sangue h u m a n o citratado p o r até 50 d i a s4
.1 4
. H á relatos d e que pacientes s u b m e t i d o s à terapia imunossupressora adqui-r e m t o x o p l a s m o s e atadqui-ravés da tadqui-ransfusão de l e u c ó c i t o s1 1
.1 2
. Configura-se, p o r t a n t o , o risco d e aquisição da doença, através d e transfusão de sangue total ou de seus d e r i v a d o s , c o m
m a i o r g r a v i d a d e p a r a os pacientes c o m doenças malignas ou e m terapia imunossupressora.
M i c r o r g a n i s m o s presentes, transitória ou duradouramente, no sangue d e indivíduos que p o d e m tornar-se d o a d o r e s , de m o d o geral são aptos a m o t i v a r e m infecções nos r e c e p t o r e s . D e n t r e estes, os m a i s e m f o c o são aqueles res-ponsáveis pela doença d e Chagas, hepatites p o r vírus B , n ã o A n ã o B , m a l á r i a e a sífilis, m a s é i m p e r i o s o n ã o esquecer d e outros, particu-l a r m e n t e o T . g o n d i i . A particu-l é m disso, c o n v é m re-m e re-m o r a r que n ã o é i re-m p o s s í v e l o core-mpareci- compareci-m e n t o , a S e r v i ç o s d e H e compareci-m o t e r a p i a , para doa-ção, de indivíduos c o m t o x o p l a s m o s e inaparen-te ou oligossintomática, r e c e n t e m e n t e adquiri-da.
Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Laboratório de Investigação Médica — Parasitologia
(1) Biomédico. Membro do Laboratório de Investigação Médica — Parasitologia
(2) Proíessor-titular de Clínica de Doenças Infecciosas e Parasitárias, da Faculdade de Medicina. Chefe do Labora-tório de Investigação Médica — Parasitologia
(3) Professora-assistente-doutora de Patologia, da Faculdade de Medicina (4) Técnico de Laboratório, pela Faculdade de Medicina
(5) Professor-assistente-doutor de Clínica de Doenças Infecciosas e Parasitárias, da Faculdade de Medicina. Membro do Laboratório de Investigação Médica — Parasitologia
A a d i ç ã o d e v i o l e t a d e genciana a o sangue de d o a d o r e s p a r a e l i m i n a ç ã o d o T r y p a n o s o m a cruzi é, desde há m u i t o , recurso c o n s a g r a d o no q u e tange à p r o f i l a x i a da veiculação transfu-sional desta p r o t o z o o s e8. C o n s i d e r a n d o q u e esta tática j á m e r e c e utilização efetiva, inter-p r e t a m o s c o m o c o n v e n i e n t e tentar v e r i f i c a r se
ela é capaz d e opor-se à c o n t a m i n a ç ã o hemo-terápica da infecção t o x o p l a s m ó t i c a .
M A T E R I A L E M É T O D O S
C a m u n d o n g o s albinos, c o m d o i s m e s e s d e i d a d e e a p r o x i m a d a m e n t e 25 g, p r o c e d e n t e s d o B i o t é r i o da F a c u l d a d e d e M e d i c i n a d a Univer-sidade de S ã o P a u l o , f o r a m distribuidos e m oi-to g r u p o s e x p e r i m e n t a i s ( I a V I I I ) .
Cada g r u p o era constituído p o r 12 animais, sendo cada c a m u n d o n g o i n o c u l a d o p o r v i a in-t r a p e r i in-t o n e a l c o m 0,5 m l d e sangue h u m a n o associado o u não a d e t e r m i n a d o s c o m p o n e n t e s , c o n f o r m e especificações a b a i x o :
G r u p o I : sangue, 50.000 t r o f o z o í t o s d e T . gon-dii, v i o l e t a de genciana 1/1 000, permanên-cia p o r 24 h o r a s n a geladeira.
G r u p o I I : sangue, 50.000 t r o f o z o í t o s d e T . gon-dii, v i o l e t a d e genciana a 1/1 000, permanên-cia p o r 48 h o r a s e m geladeira.
G r u p o I I I : sangue, 50.000 t r o f o z o í t o s d e T . gon-dii, v i o l e t a d e genciana 1/4 000,
permanên-cia d e 24 h o r a s na geladeira.
G r u p o I V : sangue, 50.000 t r o f o z o í t o s d e T . gon-dii, v i o l e t a de genciana 1/4 000, p e r m a n ê n c i a p o r 48 h o r a s e m g e l a d e i r a .
G r u p o V : sangue, 50.000 t r o f o z o í t o s d e T . gon-dii, p e r m a n ê n c i a p o r 24 h o r a s na geladeira. G r u p o V I : sangue, 50.000 t r o f o z o í t o s d e T .
gon-dii, p e r m a n ê n c i a p o r 48 horas na geladeira. G r u p o V I I : sangue, v i o l e t a de genciana 1/4 000,
p e r m a n ê n c i a p o r 24 horas na geladeira. G r u p o V I I I : sangue, p e r m a n ê n c i a p o r 24
ho-ras na geladeira.
A o sangue adicionou-se C P D ( c i t r a t o , fos-f a t o e d e s t r o s e ) , c o s t u m e i r a m e n t e u t i l i z a d o e m S e r v i ç o s de H e m o t e r a p i a , sendo o m e s m o es-t o c a d o e m geladeira à es-t e m p e r a es-t u r a de 4°C.
Os t r o f o z o í t o s f o r a m o b t i d o s à p a r t i r d o l í q u i d o p e r i t o n e a l d e c a m u n d o n g o s inoculados
p r e v i a m e n t e c o m a cepa N d e T . g o n d i i , conf o r m e m e t o d o l o g i a descrita p o r S I L V A & C A -M A R G O 1 3
.
A v i o l e t a d e genciana, f o r n e c i d a p e l a Divisão d e F a r m á c i a d o H o s p i t a l das Clínicas ( V i o -leta d e genciana 0,5 g, s o l u ç ã o d e glicose a 5% e m água destilada, q.s.p. 100 m l ) de pro-cedência alemã, adquirida da f i r m a "Labor¬ max".
Seis animais de cada g r u p o f o r a m sacri-ficados c o m 3, 6 e 15 dias a p ó s o início d o e x p e r i m e n t o , s e n d o e n t ã o feita a pesquisa d e parasitas n o l í q u i d o p e r i t o n e a l e c o l h i d o frag-m e n t o s teciduais de f í g a d o , p u l frag-m ã o e sistefrag-ma n e r v o s o central para e x a m e h i s t o p a t o l ó g i c o . O s f r a g m e n t o s d e t e c i d o f o r a m p r o c e s s a d o s p e l o s m é t o d o s habituais pana o b t e n ç ã o d e prepara-dos h i s t o l ó g i c o s , os quais f o r a m c o r a d o s pela hematoxilina-eosina.
Os d e m a i s animais d e cada g r u p o ( 6 ) f o r a m a c o m p a n h a d o s para a o b s e r v a ç ã o d e m o r talidade, p o r u m p e r í o d o de até 30 dias, p r o -cedendo-se à p r o c u r a de parasitas no l í q u i d o peritoneal naqueles q u e i a m a ó b i t o .
Os animais infectados que s o b r e v i v e r a m a p ó s o s 30 dias f o r a m e n t ã o sacrificados, efe-t u a n d o s e a pesquisa d e parasiefe-tas n o l í q u i d o peritoneal e c o l h i d o o s f r a g m e n t o s d e t e c i d o p a r a e x a m e h i s t o p a t o l ó g i c o . C o m o e x t r a t o de c é r e b r o desses animais s o b r e v i v e n t e s f o r a m feitas subinoculações e m o u t r o s c a m u n d o n g o s
( d o i s p a r a cada g r u p o ) sendo estes sacrifica-dos após d e z dias de o b s e r v a ç ã o . N e l e s f o r a m pesquisados parasitas n o l í q u i d o p e r i t o n e a l e colhidos f r a g m e n t o s d e fígado, p u l m ã o e sis-t e m a n e r v o s o , p a r a e x a m e h i s sis-t o p a sis-t o l ó g i c o .
R E S U L T A D O S
N a T a b e l a I estão expressos o s resultados da pesquisa de parasitas no l í q u i d o p e r i t o n e a l e n o s tecidos, assim c o m o as alterações histo-p a t o l ó g i c a s eshisto-pecíficas; na T a b e l a I I estão re-gistrados os dados d e m o r t a l i d a d e .
Estas e r a m representadas p o r áreas d e necro-se d o s hepatócitos que e r a m circundadas p o r infiltrado m o n o n u c l e a r c o m n u m e r o s o s para-sitas f a g o c i t a d o s p o r m a c r ó f a g o s . O infiltrado m o n o n u c l e a r t a m b é m c o m p r o m e t i a os espaços portais, o n d e o p a r a s i t i s m o era poucoi freqüen-te. A s células d e K u p f f e r e s t a v a m hipertrofia-das e hiperplasiahipertrofia-das e p o r vezes f a g o c i t a n d o o t o x o p l a s m a ( F i g . 1 ) . O e n v o l v i m e n t o pul-m o n a r restringiu-se à o c o r r ê n c i a d e p e q u e n o s focos d e i n f i l t r a d o m o n o n u c l e a r septal e / o u p e r i b r ô n q u i c o , n ã o t e n d o sido n o t a d o parasi-t i s m o . N ã o f o r a m o b s e r v a d o s quaisquer alparasi-te- alte-rações n o sistema n e r v o s o central. T o d o s os animais desses g r u p o s q u a n d o o b s e r v a d o s e m relação a m o r t a l i d a d e , f o r a m a ó b i t o entre o 7.° e 8.° dias, d e n o t a n d o a g r a v i d a d e da infec-ção, assim transmitida.
A adição ao sangue d e v i o l e t a d e genciana na c o n c e n t r a ç ã o d e 1/4 000 ( g r u p o s I I I e I V ) não alterou significativamente o c o m p o r t a m e n -to da infecção, p o i s os parasitas e s t i v e r a m pre-sentes no l í q u i d o intraperitoneal e n o s t e c i d o s . N o entanto a hepatite t o x o p l a s m ó t i c a apresen-t o u m e n o r inapresen-tensidade c o m lesões necróapresen-ticas, m e n o s extensas e p a r a s i t i s m o m a i s b a i x o .
A m o r t a l i d a d e nesses grupos t a m b é m f o i m u i t o elevada, 100% e 67%, r e s p e c t i v a m e n t e , e m b o r a o c o r r e n d o entre o 8." e 10.° dias p a r a o g r u p o I I I ( t e m p o de c o n t a t o c o m a v i o l e t a de 24 h o r a s ) e entre o 10.° e 12.° dias p a r a o
g r u p o I V ( t e m p o d e c o n t a t o c o m a v i o l e t a d e 48 h o r a s ) .
A c o n c e n t r a ç ã o de violeta de genciana d e 1/1000, 24 ou 48 horas de c o n t a t o ( g r u p o s I e I I ) d e t e r m i n o u o d e s a p a r e c i m e n t o dos para-sitas n o l í q u i d o intraperitoneal e nos tecidos, não o c o r r e n d o t a m b é m as lesões hepáticas
agu-das g r a v e s que c a r a c t e r i z a r a m a hepatite to-x o p l a s m ó t i c a . N o f í g a d o f o r a m e n c o n t r a d o s apenas discreto infiltrado m o n o n u c l e a r p o r t a l e h i p e r t r o f i a e hiperplasia discreta e difusa das células d e K u p f f e r . O a c o m p a n h a m e n t o p o r 30 dias desses animais m o s t r o u m o r t a l i d a d e de 50% n o g r u p o I e de 17% n o g r u p o I I , repre-sentado p e l a m o r t e dé 1 a n i m a l no 14.° dia, sendo n e g a t i v a a pesquisa de parasitas.
A s subinoculações d e triturado d e sistema n e r v o s o a p a r t i r d e c a m u n d o n g o s sobreviven-tes não d e t e r m i n o u alterações n o sistema ner-voso, f í g a d o ou p u l m õ e s , não s e n d o t a m b é m de-tectados parasitas n o l í q u i d o p e r i t o n e a l ou n o s tecidos ( c i s t o s ou p s e u d o c i s t o s ) .
D I S C U S S Ã O
O s c a m u n d o n g o s inoculados c o m sangue e t o x o p l a s m a d e s e n v o l v e r a m q u a d r o histopatológ i c o d e hepatite ahistopatológuda histopatológ r a v e c o m extensas z o -nas de necrose d o f í g a d o e p a r a s i t i s m o impor-tante. O s parasitas e s t a v a m t a m b é m presentes n o l í q u i d o intraperitoneal. A m o r t a l i d a d e d o s
a n i m a i s foi de 1QQ1
*-, o c o r r e n d o entre o 7." e 8."
dias, o q u e reflete a g r a v i d a d e da i n f e c ç ã o as-sim transmitida.
A violeta d e genciana adicionada a o sangue, na c o n c e n t r a ç ã o de 1/1 000 e respeitada a per-manência na geladeira por 48 horas, opôs-se a transmissão da infecção p e l o T . gondii a ca-m u n d o n g o s . O s parasitas e s t a v a ca-m ausentes n o líquido p e r i t o n e a l e n o s tecidos, não sendo
ob-servadas a l t e r a ç õ e s hepáticas agudas. O en-c o n t r o de d i s en-c r e t o infiltrado i n f l a m a t ó r i o por-tal e discreta hipertrofia e hiperplasia das células de K u p f f e r d e v e m refletir aspecto rea-cional hepático a o material inoculado, eventual-m e n t e parasitas eventual-m o r t o s . A o c o r r ê n c i a de ape-nas u m ó b i t o t a r d i o (14." d i a ) a p ô s inocula-ç ã o , a nosso v e r n ã o resultou d e i n f e c inocula-ç ã o toxo-plasmòtica. p o r q u e n ã o f o r a m encontrados
pa-rasitas n o l i q u i d o intraperitoneal ou n o s teci-d o s .
A c o n c e n t r a ç ã o m e n o r de violeta de gen-ciana ( 1 / 4 000) não foi suficiente para prote-g e r os animais da i n f e c ç ã o t o x o p l a s m ó t i c a , p o i s
o s parasitas f o r a m identificados n o l i q u i d o pe-ritoneal. o c o r r e n d o n o fígado hepatite toxoplas-m ó t i c a especifica, se b e toxoplas-m q u e de toxoplas-m e n o r in-tensidade que aquela o b s e r v a d a n o s animais inoculados s e m a d r o g a ,
A a p r e c i a ç ã o histopatológica d o s diferentes g r u p o s não indicou nos p u l m õ e s a existência de p n e u m o n i t e intersticial aguda t o x o p l a s m ó t i c a . N e s t e s ó r g ã o s , a presença d e discreto infiltra-d o mononuclear p e r i b r ô n q u i c o , não t e m l i g a ç ã o c o m a i n f e c ç ã o t o x o p l a s m ó t i c a ou q u a l q u e r ou-tra p r o v i d ê n c i a pertinente a o estudo. T a l al-teração é vista c o m freqüência, c o m o depen-dente de p r o c e d i m e n t o s relacionados c o m a manutenção d o s animais ou d e seu p r ó p r i o c o m p o r t a m e n t o .
a p r e s e n ç a d e p s e u d o c i s t o s o u d e c i s t o s teci-duais t o x o p l a s m ó t i c o s , m e s m o n o s ¡animáis q u e f o r a m sutainoculados c o m t r i t u r a d o d e c é r e b r o
d e c a m u n d o n g o s s o b r e v i v e n t e s .
E m face d o s c o n h e c i m e n t o s até a g o r a dis-p o n í v e i s a c r e d i t a m o s q u e n ã o está i n d i c a d a sis-t e m a sis-t i c a m e n sis-t e , n o s B a n c o s d e S a n g u e , sis- tria-g e m r o t i n e i r a d e d o a d o r e s b a s e a d a n a p r o c u r a d e a n t i c o r p o s anti-T. g o n d i i . M e l h o r seria re-s e r v a r a f e i t u r a d e p r o v a re-s o r o l ó g i o a ere-sclarece- esclarece-d o r a p a r a a s e l e ç ã o esclarece-d e esclarece-d o a esclarece-d o r e s e s c o l h i esclarece-d o s p a r a f o r n e c i m e n t o d e sangue t o t a l ou d e seus d e r i v a d o s d e s t i n a d o s a d o e n t e s i m u n o s s u p r i m i -d o s . N e s s e s casos s e r i a -d e g r a n -d e u t i l i -d a -d e a a d i ç ã o da v i o l e t a d e g e n c i a n a a o sangue a ser t r a n s f u n d i d o , f a c e a o r i s c o r e p r e s e n t a d o p e l a a q u i s i ç ã o d e t o x o p l a s m o s e p o r estes p a c i e n t e s .
S U M M A R Y
E x p e r i m e n t a l study o n t h e p o s s i b l e p r o f i l a t i c a c t i o n o f t h e g e n t i a n ' s v i o l e t i n t h e t o x o p l a s m a
t r a n s m i s s i o n t h r o u g h b l o o d transfusion.
T h e A u t h o r s p r o p o s e d a study f o r the eva-l u a t i o n o f t h e p r e v e n t i o n o f t o x o p eva-l a s m o s e t r a n s m i s s i o n t h r o u g h b l o o d transfusion b y t h e gentian's v i o l e t as has b e e n m a d e f o r Chagas's D i s e a s e . E x p e r i m e n t s w i t h m i c e s h o w e d that the gentian's v i o l e t a d d e d t o t h e b l o o d in the c o n c e n t r a t i o n o f 1/1000 k e e p e d in r e f r i g e r a t o r f o r 48h p r e v e n t s t h e t r a n s m i s s i o n .
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