Características Imuno-Histoquímicas de Trombos Coronarianos de Pacientes com Infarto do Miocárdio com Elevação de ST e Diabetes Mellitus: Estudo Piloto.

Artigo Original

RESUMO

Introdução: No contexto do infarto agudo do miocárdio, o diabetes mellitus está associado à maior mortalidade. O obje­ tivo deste estudo foi avaliar se existem, entre os diabéticos, pe culiaridades no processo de aterotrombose que poderiam estar implicadas em maior risco para tal desfecho. Métodos: Estudo piloto, proveniente de coorte de pacientes com diagnóstico de infarto agudo do miocárdio com elevação do segmento ST sub metidos à intervenção coronária percutânea primária e à tromboaspiração. Foram estudadas variáveis clínico­laboratoriais de cada caso. Os trombos foram analisados quanto às carac­ terísticas histopa tológicas e às expressões imuno­histoquímicas de CD34, CD61 e fator VIII. Resultados: Foram incluídos os primeiros dez pacientes portadores de diabetes mellitus com material disponível para análise, pareados por idade, sexo e tempo de evolução do infarto com dez pacientes sem dia ­ be tes mellitus. Não houve associação significativa entre as ex pressões imuno­histoquímicas de CD34, CD61 e fator VIII com relação às variáveis histopatológicas, laboratoriais e clí­ nicas estudadas, inclusive com relação à presença de dia betes mellitus. Conclusões: Em análise preliminar, não foi possível demonstrar diferença significativa quanto à expressão da ati vidade de células endoteliais, da função plaquetária e da ati vação da cascata de coagulação entre trombos de pacientes com e sem o diagnóstico de diabetes mellitus submetidos à intervenção coronariana primária.

DESCRITORES: Infarto do miocárdio. Diabetes mellitus. Trom bo se coronária. Imuno­histoquímica. Intervenção coronária per cutânea.

ABSTRACT

Immunohistochemical Characteristics of Coronary Thrombi in Patients with ST-Elevation Myocardial

Infarction and Diabetes Mellitus: Pilot Study Background: Diabetes mellitus is associated with increased mor tality rates in the setting of acute myocardial infarction. The aim of this study was to evaluate whether there are peculiari­ ties in the atherothrombotic process that might be implicated in increased risk for this outcome in patients with diabetes. Me thods: Pilot study in a cohort of patients with ST­elevation acute myocardial infarction undergoing primary percutaneous coronary intervention and aspiration thrombectomy. Clinical and laboratory variables were evaluated in all of the cases. Thrombi were analyzed for histopathological features as well as immunohistochemical expression of CD34, CD61 and factor VIII. Results: Our sample included the first ten diabetic patients with material available for analysis, who were matched according to age, gender and time elapsed since myocardial infarction with ten patients without diabetes. There was no significant association between the immunohistochemical expression of CD34, CD61 and factor VIII with other histopathological, clinical and laboratory variables, including the presence of diabetes mellitus. Conclusions: In this preliminary analysis, it was not possible to demonstrate any significant difference in the expression of endothelial cell activity, platelet function and activation of the coagulation cascade between thrombi of patients with and without diabetes undergoing primary coronary intervention.

DESCRIPTORS: Myocardial infarction. Diabetes mellitus. Co ronary thrombosis. Immunohistochemistry. Percutaneous coronary in­ tervention.

Instituto de Cardiologia/Fundação Universitária de Cardiologia, Porto Alegre, RS, Brasil.

Correspondência: Alexandre Schaan de Quadros. Instituto de Cardiolo­ gia do Rio Grande do Sul – Unidade de Pesquisa – Avenida Princesa Isabel, 370 – Santana – CEP: 90620­001 – Porto Alegre, RS, Brasil E­mail: alesq@terra.com.br.

Recebido em: 10/3/2014 • Aceito em 18/5/2014

Características Imuno-Histoquímicas de

Trombos Coronarianos de Pacientes com

Infarto do Miocárdio com Elevação de ST e

Diabetes Mellitus

_{: Estudo Piloto}

A

doença arterial coronariana (DAC) é a maior causa de morte em nível mundial, sendo que a maio ria dos eventos adversos está associada à ocorrência do infarto agudo do miocárdio (IAM).1 _Com a otimização das terapias antitrombóticas e de reperfu­ são, tem sido observada a diminuição da mortalidade do IAM com supradesnivelamento do segmento ST (IAMCST).2 _{No entanto, são necessários esforços para} aprimorar o manejo dessa condição, já que altas taxas de mortalidade ainda têm sido relatadas.3 _{Na maioria} dos casos, o IAMCST é causado pela ruptura de placas ateroscleróticas vulneráveis, associadas à atividade in­ fla matória e a um endotélio disfuncional. A placa rota é o gatilho para a ativação e agregação plaquetárias, e para a formação de trombina, culminando na oclusão total da artéria coronária pelo trombo.4

A intervenção coronariana percutânea primária (ICPp) é considerada o método de reperfusão prefe­ rencial no IAM.5 _{Nos últimos anos, a técnica de} trom boaspiração adjunta tem sido crescentemente uti lizada, com melhora dos resultados angiográficos e dos desfechos clínicos em alguns estudos.6 _Além disso, a retirada do trombo permitiu uma nova linha de investigação a respeito da análise da morfologia, histologia e fatores associados a diferentes tipos de trombo.7­9 _{Variáveis como cor vermelha e a cronologia} do trombo foram associadas à maior mortalidade,10,11 mas o papel fisiopatológico dos diferentes constituin tes dele ainda é pouco estudado.

A análise imuno­histoquímica dos trombos aspira­ dos pode ser uma ferramenta complementar importante na busca dessas respostas. A expressão da atividade de células endoteliais, da função plaquetária e da ativa­ ção da cascata de coagulação pode ser estimada pela expressão imuno­histoquímica dos antígenos CD34, CD61 e fator VIII, respectivamente.12-15 _{No cenário do} IAMCST, poucos estudos avaliaram o perfil imuno­his­ toquímico de trombos intracoronarianos in vivo e sua correlação com variáveis clínicas.13­16 _{Nesse contexto,} é conhecida a importância do diabetes mellitus (DM), seja por aumentar o risco de DAC e trombose, seja por estar associado à maior mortalidade no IAMCST.17,18 No entanto, existem dúvidas sobre esse risco ser me­ diado por diferenças nos processos fisiopatológicos de aterotrombose ou pelo aumento de comorbidades associadas ao DM. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a expressão imuno­histoquímica dos antígenos CD34, CD61 e fator VIII em trombos coronários de pacientes portadores de DM com IAMCST.

MÉTODOS

Pacientes

Trata­se de um estudo piloto proveniente de uma amostra de pacientes consecutivamente internados em nossa instituição com o diagnóstico de IAMCST entre dezembro de 2010 e novembro de 2012. IAMCST foi definido como dor torácica em repouso com duração

superior a 30 minutos associada à elevação do seg­ mento ST de pelo menos 1 mm em duas derivações contíguas no plano frontal, ou de no mínimo 2 mm no plano horizontal, ou associada a novo bloqueio de ramo esquerdo. Foram excluídos pacientes com tempo de evolução superior a 12 horas, idade menor do que

18 anos ou que se recusaram a participar do estudo.

Todos os participantes forneceram consentimento livre e esclarecido por escrito. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto de Car­ diologia, Fundação Universitária de Cardiologia, em Porto Alegre (RS).

Características clínicas e seguimento

Todos os pacientes foram avaliados prospectiva­ mente quanto às suas características clínicas e demo­ gráficas por um dos investigadores. As variáveis clínicas, laboratoriais e angiográficas foram registradas em um banco de dados específico. Durante a internação, os par ticipantes do estudo foram acompanhados diaria­ mente por um dos investigadores, para verificação de eventos intra­hospitalares. Após a alta hospitalar, os pacientes foram contatados por telefone ou atendidos ambulatorialmente, para verificação dos desfechos.

Procedimentos de intervenção coronária percutânea

Na admissão hospitalar, todos os pacientes r e ce be ­ ram 300 mg de aspirina e 300 a 600 mg de clo pidogrel. Para a realização do procedimento de ICPp, foram ad­ ministrados 60 a 100 U/kg de heparina não fracionada. Os procedimentos de ICPp foram realizados conforme preconizado na literatura.19,20 _{As decisões quanto a aspec­} tos técnicos do procedimento, como via de acesso (radial ou femoral), proceder ou não à tromboaspiração, tipo e número de stents, e uso de inibidores de glicoproteína IIb/IIIa ficaram a critério dos operadores. Com relação à tromboaspiração, três diferentes cateteres foram usados: Export (Medtronic Vascular Inc, Santa Rosa, CA, Estados Unidos), Diver (Invatec, Bres cia, Itália), ou Pronto (Vas cular Solutions, Minneapolis, MN, Estados Unidos). Em todos os casos, as aspirações foram feitas antes da insuflação do balão, com mais de uma passagem pelo sítio de oclusão. O sangue aspirado e o material intracoronariano foram retidos em um filtro.

Análise dos trombos

recentes são caracterizados por apresentarem fibrina, leucócitos e hemácias. Trombos com foco de lise são caracterizados pela ocorrência da apoptose dos leucóci­ tos. Já os trombos em organização são caracterizados pela formação de tecido conjuntivo frouxo.7

Para o estudo imuno­histoquímico, foram obtidos cortes histológicos de três micrômetros de espessura, os quais foram alocados em lâminas silanizadas. Para proceder à técnica de imuno­histoquímica, cada lâ­ mina foi submetida à desparafinização do material, com uso de xilol e hidratação dos cortes com etanol. A recuperação antigênica foi realizada em forno de micro­ondas, com solução de ácido cítrico 10 mM/pH 6,0, em dois ciclos de 9 minutos cada, em potência de

750 W. O bloqueio da peroxidase endógena foi feito

com o uso de água oxigenada a 3% (10 volumes). O anticorpo primário foi diluído em solução de albumina a 1% e azida sódica a 0,1% em PBS (sigla do inglês phosphate­buffered saline), incubado em câmara úmida, por 30 minutos a 37°C, com posterior permanência do

material em refrigeração a 4°C por 18 horas. O anti­ corpo secundário biotinilado foi incubado em câmara úmida a 37°C, por 30 minutos, assim como o complexo estreptavidina­biotina­peroxidase (StreptABC). O substra to cromogênico utilizado foi a diaminobenzidina 60 mg% em PBS e, como contracoloração, usou­se a hematoxi­ lina de Harris. Foram utilizados os seguintes anticorpos (Dako Corporation ou Novocastra): CD34, CD61 e fator

de Von Willebrand (fator VIII). Em todos os casos, foi

formado um painel imuno­histoquímico. A expressão obtida pelas células sanguíneas e/ou componentes do espécime foi revelada pela presença de coloração marrom em diferentes áreas da amostra. Considerou­se expressão positiva forte a reação imuno­histoquímica exibindo forte e difusa coloração marrom em várias cé lulas do tecido analisado. Definiu­se como expressão positiva moderada a reação imuno­histoquímica exibindo coloração marrom moderadamente intensa (“marrom mais claro”) em algumas células do tecido analisado.

Análise estatística

Os dados foram analisados no software Statistical Package for the Social Science (SPSS) para Windows,

considerando­se significativos valores com p < 0,05.

As variáveis quantitativas foram expressas como média ± desvio padrão ou mediana e intervalos interquartis

(25 a 75%). As variáveis categóricas foram expressas

como frequência absoluta e relativa, analisadas pelo teste qui­quadrado ou exato de Fisher. A infiltração celular foi analisada por meio de uma escala semiquantitativa.

RESULTADOS

No período do estudo, 310 pacientes foram subme­ tidos à tromboaspiração com sucesso (fluxo TIMI 3 e recuperação de trombos). Nesta análise, foram incluídos os primeiros dez pacientes portadores de DM com ma­ terial disponível para análise, que foram pareados por idade, sexo e tempo de infarto com dez pacientes sem

DM. Em ambos os grupos, 60% da amostra pertencia

ao sexo masculino, com idades de 55 ± 6 anos e 56,5 ± 5,8 anos, e medianas do tempo de evolução do IAM de 3,9 horas (2,0 a 9,0 horas) e 3,7 horas (2,8 a 9,3

horas), respectivamente.

O perfil histopatológico está demonstrado na Tabela 1 e o imuno­histoquímico na Tabela 2. Com relação à expressão de CD34, houve tendência da associação com presença de fibrina no trombo e maiores níveis séricos de fibrinogênio. Não houve associação com outras caracte­ rísticas clínicas, laboratoriais ou histoló gicas (Tabela 3).

A associação entre a expressão dos anticorpos CD61

e fator VIII e as variáveis analisadas (Tabelas 4 e 5) não

apresentou diferenças estatisticamente significativas, a não ser por tendência de associação entre a expressão dos anticorpos CD61 e a presença de hemácias no trombo.

DISCUSSÃO

Neste estudo piloto, não foi verificada associação significativa entre a expressão imuno­histoquímica das proteínas CD34, CD61 e fator VIII com relação às va­ riáveis histopatológicas, laboratoriais e clínicas es tuda das, inclusive com relação à presença de DM. Houve, contu­ do, tanto tendência à associação da expressão de CD34 com o conteúdo de fibrina no trombo e maiores níveis de fibrinogênio sérico, quanto tendência à associação de expressão de CD61 com a presença de hemácias.

TABELA 1

Características histopatológicas dos trombos dos pacientes estudados

Caso Tipo de trombo

Leucócitos (%)

Fibrina (%)

Hemácias (%)

1 Com foco de lise 10 40 50

2 Com foco de lise 5 90 5

3 Em organização 5 70 25

4 Em organização 15 65 20

5 Recente 20 70 10

6 Recente 5 45 50

7 Recente 10 50 40

8 Em organização 5 90 5

9 Recente 30 50 20

10 Recente 30 50 20

11 Em organização 10 80 10

12 Com foco de lise 10 60 30

13 Recente 5 35 60

14 Em organização 10 50 40

15 Recente 10 45 45

16 Em organização 5 50 15

17 Recente 35 50 15

18 Recente 5 60 35

19 Com lise 10 50 40

TABELA 2 Painel imuno-histoquímico

Caso

Diabetes

mellitus CD34 Fator VIII CD61

1 Não Positivo Positivo, forte Positivo, forte 2 Sim Negativo Positivo, forte Positivo, forte 3 Não Positivo Positivo, forte Positivo, forte 4 Não Positivo Positivo, forte Positivo, forte 5 Não Negativo Positivo, forte Positivo, forte 6 Sim Negativo Positivo, forte Positivo, forte 7 Não Negativo Positivo, forte Positivo, forte 8 Sim Negativo Positivo, forte Positivo, forte 9 Não Positivo Positivo, forte Positivo, forte 10 Não Positivo Positivo, forte Positivo, forte 11 Não Positivo Positivo, forte Positivo, forte

12 Não Negativo Positivo,

moderado

Positivo, moderado 13 Não Positivo Positivo, forte Positivo, forte 14 Sim Positivo Positivo, forte Positivo, forte 15 Sim Positivo Positivo, forte Positivo, forte 16 Sim Negativo Positivo, forte Positivo, forte 17 Sim Positivo Positivo, forte Positivo, forte 18 Sim Positivo Positivo, forte Positivo, forte 19 Sim Positivo Positivo, forte Positivo, forte

20 Sim Positivo Positivo,

moderado

Positivo, forte

TABELA 3

Associação entre a expressão de CD34 e variáveis clínico-laboratoriais e histológicas

Expressão de CD34/variável Valor de p

Tipo de trombo 0,77

Cor do trombo 0,53

Volume do trombo 0,33

Presença de leucócitos 0,19

Presença de fibrina 0,06

Presença de hemácias 0,08

Diabetesmellitus _0,64

Hipertensão arterial sistêmica 0,53

Índice de massa corporal 0,69

Tabagismo 0,78

HDL colesterol 0,96

Colesterol total 0,12

PCR ultrassensível 0,66

Triglicerídeos 0,79

Fibrinogênio 0,07

Clopidogrel 0,64

Inibidor de glicoproteína IIb/IIIa 0,16 HDL: lipoproteína de alta densidade; PCR: proteína C-reativa.

TABELA 4

Associação entre a expressão de CD61 e variáveis clínico-laboratoriais e histológicas

Expressão de CD61/variável Valor de p

Tipo de trombo 0,21

Cor do trombo 0,37

Volume do trombo 0,69

Presença de leucócitos 0,57

Presença de fibrina 0,19

Presença de hemácias 0,06

Diabetes mellitus _0,86

Hipertensão arterial sistêmica 0,21

Índice de massa corporal 0,16

Tabagismo 0,28

HDL colesterol 0,28

Colesterol total 0,27

PCR ultrassensível 0,35

Triglicerídeos 0,27

Fibrinogênio 0,26

Clopidogrel 0,74

Inibidor de glicoproteína IIb/IIIa 0,58 HDL: lipoproteína de alta densidade; PCR: proteína C-reativa.

TABELA 5

Associação entre a expressão de fator VIII e variáveis clínico-laboratoriais e histológicas

Expressão de fator VIII/variável Valor de p

Tipo de trombo 0,51

Cor do trombo 0,15

Volume do trombo 0,49

Presença de leucócitos 0,28

Presença de fibrina 0,59

Presença de hemácias 0,19

Diabetes mellitus 0,58

Hipertensão arterial sistêmica 0,37

Índice de massa corporal 0,14

Tabagismo 0,71

HDL colesterol 0,44

Colesterol total 0,26

PCR ultrassensível 0,37

Triglicerídeos 0,26

Fibrinogênio 0,22

Clopidogrel 0,75

Inibidor de glicoproteína IIb/IIIa 0,36 HDL: lipoproteína de alta densidade; PCR: proteína C-reativa.

histopatológico, de maneira a aumentar a sensibilidade para reconhecimento dos componentes formadores do trombo, seja em nível vascular ou cavitário, utilizando espécimes extraídos cirurgicamente ou provenientes de autópsia.12,21 _{Estudos dessa natureza, feitos em pacientes} com diagnóstico de síndromes coronarianas agudas, in vivo, são escassos na literatura.13,15,16,22

Ikuta et al.22_{, comparando material extraído de in­} divíduos com angina estável versus indivíduos com an­ gina instável, constataram maiores agregação e ativação plaquetárias no segundo grupo, vistas, respectivamente, pela imunoexpressão aumentada de glicoproteína IIb/IIIa (p < 0,0005) e P-selectina (p < 0,0001). Foi identi­ ficada, ainda, maior concentração de neutrófilos nas placas dos pacientes instáveis. Em outro estudo, que ava liou trombos em contexto de IAMCST tratado por re perfusão mecânica, foi demonstrada correlação nega­ tiva do conteúdo plaquetário com o tempo decorrido desde o início da dor. Além disso, a taxa de células com expressão para CD34 teve correlação positiva com reestenose no seguimento (coeficiente de correlação = 0,76; p = 0,01).13

Em estudo recente, que ressaltou a potencial apli­ ca bilidade prática de um maior conhecimento da cons tituição dos trombos, Sambola et al.15 _{avaliaram a} carga trombótica aspirada de dez pacientes submetidos à ICPp, comparando a dez pacientes submetidos à ICP de resgate após resposta inefetiva à tenecteplase. Nos pacientes do último grupo, foram detectados níveis superiores de fibrina (p = 0,016), P­selectina (p = 0,03)

e fator de von Willebrand (p = 0,03).

Apesar de evidências indicarem reatividade pla ­ que tária e coagulabilidade aumentadas, bem como fi brinólise comprometida em pacientes com DM tipo 2,23 _{o perfil imuno­histoquímico dos nossos pacientes} diabéticos não foi diferente daquele dos não diabéticos, mesmo pareando os grupos para fatores confundido res importantes, como idade, sexo e tempo de evolução do IAMCST. Nossos achados foram, ainda, de encontro aos resultados de Yamashita et al.,16 _{que chegaram a} um nú mero significativamente menor de células CD34 po sitivas nos trombos de pacientes portadores de DM tipo 2. Acredita­se que esse grupamento celular possa coibir a formação e facilitar a organização do trombo, de forma que sua escassez possa impactar negativamente no prognóstico. Ademais, não foram verificadas quais­ quer associações, com relevância estatística, entre os antígenos CD34, CD61 ou fator VIII e outras variáveis clínicas ou constituintes do trombo.

A principal limitação deste estudo piloto foi seu nú mero amostral reduzido, o que pode ter contribuído para a ausência de diferença entre os grupos. Por outro lado, a divulgação desses resultados pode alertar outros pesquisadores e intervencionistas para a importância das análises imuno­histoquímicas em trombos coronarianos de pacientes com IAMCST.

CONCLUSÕES

Concluímos que, nesta análise preliminar, não foi pos sível demonstrar diferença significativa quanto à expressão da atividade de células endoteliais, da função plaquetária e da ativação da cascata de coagu la ção, entre trombos de diabéticos e não diabéticos sub metidos à intervenção coronariana primária como tratamento de infarto agudo do miocárdio com elevação do seg­ mento ST.

CONFLITO DE INTERESSES

Não há.

FONTE DE FINANCIAMENTO

Este trabalho foi financiado pelo Instituto de Car­ diologia/Fundação Universitária de Cardiologia (IC/FUC), em Porto Alegre (RS), por meio do Fundo de Apoio do IC/FUC à Ciência e a Cultura (FAPICC).

AGRADECIMENTOS

Agradecemos aos colegas Alexandre Azmus, André Mânica, Carlos Cardoso, Cláudio Vasques de Moraes, Cláu ­ dio Ramos de Moraes, Cristiano Cardoso, Flavio Leboute, Henrique Gomes, Julio Teixeira, La Hore Ro drigues, Luis Maria Yordi, Mauro Moura e Rogerio Sar mento­Leite, pela participação na execução dos pro cedimentos de in tervenção coronária percutânea primária.

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