CENTRO DE AQUICULTURA DA UNESP
DIFERENCIAÇÃO GONADAL EM
Piaractus mesopotamicus
Roosevelt Passos Barbosa
Engenheiro de Pesca
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP
CENTRO DE AQUICULTURA DA UNESP
DIFERENCIAÇÃO GONADAL EM
Piaractus mesopotamicus
Roosevelt Passos Barbosa
Orientador: Dr. Sergio Ricardo Batlouni
Coorientador: Dr. Rafael Yutaka Kuradomi
Dissertação
apresentada
ao
Programa de Pós-Graduação em
Aquicultura do Centro de Aquicultura
da UNESP – CAUNESP, como parte
dos requisitos para obtenção do título
de Mestre.
Barbosa, Roosevelt Passos
B238d Diferenciação gonadal em Piaractus mesopotamicus / Roosevelt Passos Barbosa. – – Jaboticabal, 2015
viii, 42 p. : il. ; 29 cm
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Centro de Aquicultura da UNESP, 2015
Orientador: Sergio Ricardo Batlouni Coorientador: Rafael Yutaka Kuradomi
Banca examinadora: George Shigueki Yasui, Laura Satiko Okada Bibliografia
1. Pacu. 2. Gônada. 3. Sexo. 4. Histologia I. Título. II. Jaboticabal-Centro de Aquicultura da UNESP.
CDU 639
“É muito melhor arriscar coisas grandiosas, alcançar triunfos e glórias, mesmo expondo-se a derrota, do que formar fila com os pobres de espírito que nem gozam muito nem sofrem muito, porque vivem nessa penumbra cinzenta que não conhece vitória nem derrota.”
Theodore Roosevelt
“Porque a sabedoria serve de defesa, como de defesa serve o dinheiro; mas a excelência do conhecimento é que a sabedoria dá vida ao seu possuidor.”
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA ... v
AGRADECIMENTOS ... vi
APOIO FINANCEIRO ... viii
RESUMO ... 1
ABSTRACT ... 3
INTRODUÇÃO ... 4
Aspectos gerais da espécie ... 7
Determinação sexual e diferenciação gonadal ... 9
MATERIAL E MÉTODOS ... 12
Animais e condições de cultivo ... 12
Parâmetros físicos e químico da água ... 12
Coletas Amostrais ... 12
Microscopia de luz ... 13
Avaliação histológica e classificação das amostras ... 13
RESULTADOS ... 15
Parâmetros físicos e químicos da água ... 15
Avaliação macroscópica das gônadas ... 15
Avaliação histológica das gônadas ... 16
Gônadas Indiferenciadas ... 16
Ovário ... 20
Análise dos Dados Biométricos ... 23
DISCUSSÃO ... 27
DEDICATÓRIA
A Minha mãe, Maria José, pelo amor que dedicou e continua a dedicar a mim e meus filhos, abrindo mão de muitas coisas em meu favor, suportando trabalho árduo, noites em claro, dor e saudade para que através dos meus sonhos pudesse realizar os dela.
A Minha tia Maria Alice, por ter se predisposto a deixar planos e projetos pessoais e me acompanhar nessa jornada, sendo para mim e para os meus filhos a segunda mãe.
A meus filhos, Rian e Renan, por me tornarem pai, o título mais nobre e honrado que um homem pode ter, e por serem minha motivação de buscar sempre o melhor.
AGRADECIMENTOS
A Deus, o pelo cuidado de um pai amoroso, me conduzindo e purilando meus planos e projetos tornando em algo maior e mais brilhante do que planejei.
A minha família, em especial meu pai Raimundo e irmãos Robson e Célio pelo apoio incondicional. Aos meus tios, tias e primos (são tantos que não cabe nesta página) agradeço a torcida e palavras de incentivo.
A minha noiva Márcia, que mesmo suportando a saudade e a distância nunca deixou de me incentivar e me trazer conforto pelas palavras.
Ao Prof. Dr. Sérgio Ricardo Batlouni, pela amizade, paciência e confiança. Agradeço a oportunidade que sempre manteve disposta e o conhecimento compartilhado. Foi uma honra ter sido seu orientado.
Ao Dr. Rafael Yutaka Kuradomi, pela coorientação, desafios e cobranças que contribuíram para minha formação.
Aos doutores membros da banca George Shigueki Yasui e Laura Satiko Okada Nakaghi pelas contribuições para o enriquecimento deste trabalho.
Aos amigos do laboratório, Thiago, Patrick, Guilherme, Valéria e Daniel pela amizade, convívio e companheirismo. Sem a ajuda de vocês não teria conseguido.
Aos servidores do CAUNESP, Valdecir, Márcio Reche, David, Veralice e Silvia que de forma direta contribuíram para a realização deste trabalho.
Aos amigos da Igreja Adventista Central de Jaboticabal, Natanael, Dani, Bia, Jaza e Mary pela receptividade, acolhida, prestatividade e socorro. Deus lhes dê em dobro toda a ajuda que prestaram a mim e minha família.
Aos meus tios Almiro e Regiane, ao amigo Rajon e a cunhada Simone, pela hospitalidade e apoio logístico durante as viagens.
Aos colegas de trabalho e amigos do Instituto Federal do Amazonas (IFAM), Profa. Sandra Darwich, Profa. Doraneide Tahira, Profa. Maria Célia, Profa. Idarclei e Alba, pelo incentivo e apoio. Esta vitória é mais um gol a vários pés.
Ao Programa de Pós-Graduação em Aquicultura e ao Centro de Aquicultura da UNESP, pela oportunidade e pela formação.
APOIO FINANCEIRO
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ), bolsa de Mestrado de Março/2013 – Janeiro/2014. Processo n° 131296/2013-2.
DIFERENCIAÇÃO GONADAL EM Piaractus mesopotamicus
RESUMO
observamos apenas uma correlação positiva e esperada entre a idade e comprimento e peso.
GONADAL DIFFERENTIATION IN Piaractus mesopotamicus
ABSTRACT
This study aimed to determine and characterize the beginning of pacu (Piaractus mesopotamicus) gonadal differentiation process and to evaluate in young individuals the association between phenotypic sex with Total Biomass (TB) and Total Length (TL) to obtain subsidies for specific approaches such as sexual inversion and basic information about gonadogenesis for this species. To do this, we obtained the pacu fingerlings in the Fish Reproduction Laboratory in the Aquaculture Center at UNESP/Jaboticabal (CAUNESP). We kept the fingerlings in ponds dug 200 m² into CAUNESP and treated them with commercial diet (32.0% crude protein) and subjected them to 5 samples with approximate range of 30 days. We euthanized 51 individuals for gonads removal, being fixed in Karnovsky solution, included in historesin and stained with HE for histological analysis by light microscopy. In this study, the water physical and chemical parameters were among considered adequate for the species development. We observed that the huge heterogeneity in size among the P. mesopotamicus juvenile of the same age is not due to sexual dimorphism or sexual differentiation, once the results of the histological analysis revealed that even before the differentiation we had already observed this size disparity. Although quiescent and late, the cellular activities occurred similarly to other neotropical teleosts. In the sample period (299 days) we found only undifferentiated gonads and ovaries. The analysis in light microscopy indicates that the differentiation for female (TL = 10.03 ± 0.12 and TB = 18.21 ± 1.22) begins in between the 123 and 150 days after hatching (DAH). However, in the 150th DAH there still were undifferentiated gonads (TL = 9.55 ± 0.65 and TB= 15.25 ± 3.51). The female gonad differentiation in this specie occurs before the male one, because during the analysis period we did not find testicles differentiation. The labile period for this species is starting from 123 to 150 after hatching. We observed that the variation in length and weight of the sampled animals is not associated with gonadal differentiation, i.e., the larger individuals are not dominant phenotypic females or males. Moreover, we only observed a positive and expected correlation among age, length and weight.
INTRODUÇÃO
Aliar estratégias de aumento de produtividade no setor primário e conservação ambiental é um desafio compartilhado por todas as nações ao traçarem planos de segurança alimentar sob o rótulo “sustentabilidade” (FAO, 2014). Neste cenário a aquicultura desponta como uma das mais viáveis soluções para produção de proteína animal. Juntamente com a pesca extrativista, a aquicultura é responsável pela produção de 17% da oferta mundial de toda a proteína animal (FAO, 2014) e é 7 vezes maior do que o agronegócio da carne bovina (Matias, 2011). Em 2012, movimentou um mercado de 137,7 bilhões de dólares e há projeções que indicam um crescimento no setor da ordem de 62% no ano de 2030 (Matias, 2011).
Segundo as últimas estatísticas disponíveis globalmente, recolhidas pela Organização das Nações Unidas para a Agricultura e Alimentação (FAO) e apresentadas na última edição de “O Estado da Pesca e da Aquicultura no Mundo” (FAO, 2014), a produção pesqueira a nível mundial bateu um recorde histórico, com 158 milhões de toneladas em 2012 (cerca de 10 milhões de toneladas a mais do que em 2010). Deste total, 91,3 milhões de toneladas são oriundas da pesca extrativista e 66,6 milhões da aquicultura, o que representa um crescimento anual de 6,2%, que é superior ao crescimento da população humana que atualmente é de 1,6% ao ano. O relatório aponta o rápido crescimento da aquicultura e a participação dos pequenos produtores como fatores responsáveis por este aumento (FAO, 2014). Oitenta e seis por cento da produção mundial de pescado de 2012 (Mais de 136 milhões de toneladas) se destinaram ao consumo humano direto, enquanto que 21,7 milhões de toneladas restantes foram destinadas a produtos não alimentares (FAO, 2014).
O Brasil também é citado no relatório da FAO como um dos países com aumento significativo na produção pesqueira mundial. Em termos de pesca extrativista em águas continentais (água doce), o Brasil é o maior produtor do continente americano, ocupando 10a posição no ranking mundial com uma
produção de 266.042 toneladas em 2012. Já em termos de produção aquícola, o Brasil saiu da 17a posição em 2009, com produção de 415.649 toneladas (MPA,
colocação global com 707.461 toneladas em 2012, o que representa 1,1% da produção mundial (FAO, 2014).
Frente a crescente e contínua demanda, a aquicultura oferece um enorme potencial para responder à procura por alimentos associada ao crescimento da população global, visto que o consumo per capita mundial de peixe aumentou de 9,9 kg na década de 60 para 19,2 kg em 2012 (FAO, 2014). Entretanto, o relatório Estado Mundial da Pesca e Aquicultura (FAO, 2014) adverte que, para continuar a crescer de maneira sustentável, é necessário a gestão sustentável e socioeconomicamente sensível dos recursos hídricos. Por isso a FAO tem promovido o “crescimento azul” tendo como base o documento proposto em 1995 intitulado “Código de Conduta da Pesca Responsável” (FAO, 1995) que estabelece diretrizes e incentiva o uso responsável dos recursos aquáticos e a conservação dos habitats, como forma de garantir o crescimento econômico e a segurança alimentar de forma a reduzir a pobreza.
Dentre outras recomendações sugeridas pela FAO podemos destacar a introdução uma maior diversidade de espécies com potencial zootécnico e o desenvolvimento de sistemas e práticas melhorem a produtividade e mitiguem os impactos ambientais decorrentes da atividade aquícola. No quesito diversidade de espécies com potencial zootécnico, o Brasil é bem servido. A ictiofauna brasileira está entre as mais ricas e diversificadas do planeta com cerca de 39 famílias, 517 gêneros e mais de 2.500 espécies (Géry, 1969 apud Fittkau, et al., 1960; Britski & Figueiredo, 1972; Buckup et al., 2007). A rica ictiofauna, associada ao enorme potencial hídrico e climático, destaca o Brasil como um dos países de maior potencial para a expansão da aquicultura (Godinho, 2007). Embora boa parte da produção brasileira concentre-se no cultivo de espécies exóticas como a tilápia (Oreochromis niloticus), em torno de 46 % (MPA, 2011), o cultivo de espécies nativas tem ganhado espaço e despertado interesse por parte dos produtores e dos órgãos governamentais através de linhas de financiamento e apoio ao desenvolvimento de pesquisa (MPA, 2011).
crescimento, qualidade e aproveitamento de carcaça (Cecareli et al., 2000; Bazzoli, 2003). Dados do Censo Aquícola Nacional 2008 (MPA, 2013), revelam que foram identificadas 7.060 unidades produtivas que cultivavam pelo menos uma espécie do grupo dos “redondos”. Do grupo de espécies classificadas como peixes redondos, merecem destaque o tambaqui (Colossoma macropomum), pacu (Piaractus mesopotamicus), pirapitinga (Piaractus brachypomus) e os híbridos tambacu (C. macropomum x P. mesopotamicus), tambatinga (C. macropomum x P. brachypomus) e patinga (P. mesopotamicus x P. brachypomus). Dentre os redondos, o pacu desponta no cenário nacional como uma das principais espécies cultivadas e a segunda espécie com maior número de ocorrências em propriedades aquícolas brasileiras, com mais de 2.212 unidades produtivas (Urbinati et al., 2010; MPA, 2013).
No que se refere ao desenvolvimento de sistemas e adoção de práticas zootécnicas com fins de aumento de produtividade, são comuns o uso de técnicas de melhoramento animal, manipulação gênica, controle de temperatura, foto período em ambiente de confinamento, alimentação direcionada e automatizada, sistema de manejo, reprodução assistida ou manipulada, porém não são as únicas etapas de interferência humana nas práticas zootécnicas com finalidade de ganhos econômicos. Há também, apesar de restrito às algumas espécies, a manipulação sexual (Mei and Gui, 2015). Este recurso, após o conhecimento prévio sobre os processos que envolvem a determinação sexual, é muito utilizado em espécies de interesse econômico, fazendo-se uso de técnicas na diferenciação sexual para o gênero que apresente melhor desempenho zootécnico (Luo et al., 2011; Mei and Gui, 2015).
A aplicação de técnicas de inversão sexual é praticamente inexplorada em espécies nativas (Nunes e Amaral, 2007; Valentin, 2013), porém, estudos sobre a diferenciação sexual das espécies neotropicais são necessárias para subsidiar abordagens específicas para as espécies nativas como o pacu (P. mesopotamicus),
que apresenta particular importância para aquicultura brasileira (Urbinati, et al.,
2010; Criscuolo-Urbinati et al., 2012; MPA, 2013).
Aspectos gerais da espécie
O pacu é também conhecido pelas sinonímias pacu-caranha, caranha e pacu-guaçu (Urbinati et al., 2010) era identificado anteriormente como Colossoma mitrei, posteriormente, foi verificado que a mesma espécie já havia sido descrita por Holberg alguns anos antes, passando para denominação atual, Piaractus mesopotamicus Holberg, 1887 (Britski et al., 2007). A espécie é originária das bacias do Prata, Paraná, Paraguai e Uruguai (Castagnolli, 1992; Resende, 2003; Urbinati et al., 2010), possui ampla distribuição geográfica na América do Sul. O pacu possui a seguinte classificação taxonômica:
Reino: Animalia
Filo: Chordata
Subfilo: Vertebrata
Infrafilo: Gnathostomata
Superclasse: Osteichthyes
Classe: Actinopterygii
Subclasse: Neopteryggi
Infraclasse: Teleostei
Superordem: Ostariophysi
Ordem: Characiformes Família: Characidae
Subfamília: Myleinae
Espécie: Piaractus mesopotamicus (Holberg, 1887).
Esta espécie caracteriza-se como um caracídeo de grande importância comercial (Severi et al., 1999; Abimorad et al., 2008; Jomori et al., 2008), com cabeça relativamente pequena (Graça e Pavanelli, 2007) e corpo alto, arredondado e robusto, com dorso cinza escuro e ventre amarelado e levemente comprimido (Britski et al., 2007). Apresenta fecundação externa, desova total e atinge sua maturidade sexual por volta dos 3 anos de idade podendo se reproduzir até aos 8 anos de idade (Ferraz de Lima et al., 1984; Vazzoler et al., 1997). A taxa de fecundidade absoluta pode variar entre 297.308 e 377.643 ovócitos.L-1 quando
mantido em cativeiro durante o 1° período reprodutivo (Romagosa et al., 1990). De ambientes lóticos e semi-lóticos (Agostinho et al., 2004), o pacu realiza longas migrações, conhecidas popularmente por “piracema” na direção das cabeceiras dos rios para se reproduzir no período de compreende os meses de outubro a março (primavera/verão no hemisfério sul), quando as temperaturas e índices pluviométricos estão mais altos (Urbinati et al., 2010).
Possui boca terminal e duas séries de dentes molariformes multicuspidados, especialmente adaptada para quebrar e esmagar frutos e sementes que compõem a sua alimentação na fase adulta (Resende et al., 1998). Apesar de sua dieta ser predominantemente vegetariana, pode ser classificado como onívoro, pois é oportunista em função da sazonalidade dos rios explorando uma enorme variedade de alimentos como folhas, caules, flores, frutos, sementes, vegetais e insetos (HAHN, et al., 2004).
Pela sua importância na aquicultura nacional (MPA, 2013) e internacional (Gelman et al., 2004; FAO, 2012), o pacu tem se destacado como a mais estudada entre todas as espécies nativas de peixes de águas interiores. Trabalhos relacionados com a nutrição (Abimorad et al., 2007; Abimorad et al., 2008), sanidade (Martins, 1998; Martins et al., 1999), fisiologia (Gazola and Borella, 1997; Kalinin et al., 2000; Panepucci et al., 2001), reprodução (Marques and Godinho, 2004; Cruz-Landim et al., 2005; Costa and Mateus, 2009; Criscuolo-Urbinati, et al.,
estudos sobre a determinação sexual e manipulação do sexo para esta espécie são praticamente inexistentes.
Determinação sexual e diferenciação gonadal
Estudos sobre os processos de determinação sexual e mecanismos de diferenciação sexual bem como sua aplicação na manipulação sexual em peixes tiveram início no final da década de 30 e início da década de 40 (Yamamoto, 1969). Os resultados obtidos nesses trabalhos além de propiciarem informações sobre os mecanismos genéticos da diferenciação sexual, também demonstraram as potencialidades de suas aplicações em espécies economicamente importantes, onde os cultivos monosexuais são vantajosos.
Determinação sexual e diferenciação sexual são termos semelhantes que são muitas vezes confundidos ou mal empregados. Conceitualmente, o termo determinação sexual descreve os processos genéticos e ambientais ou a combinação de suas variáveis que influenciam a diferenciação sexual, enquanto que a diferenciação sexual pode ser definida como os processos fisiológicos que conduzem ao desenvolvimento de um testículo e um ovário ou ambos (hermafroditismo) a partir de uma das gônadas indiferenciadas (Devlin and Nagahama, 2002).
Em vertebrados gonocóricos, ou seja, apresenta sexos separados, os mecanismos de determinação sexual podem ser agrupados em dois: determinação sexual genética (DSG) e determinação sexual por influência ambiental (DSA) (Shen and Wang, 2014). No mecanismo DSG, típico dos vertebrados superiores como as aves e mamíferos, o sexo é determinado no momento em que ocorre a concepção e conduzido através dos sistemas cromossômicos sexuais tais como XX/XY, ZZ/ZW e XX/X0. Por outro lado, o mecanismo DAS, normalmente encontrado em peixes e répteis, associado a condição gonocorística dos Teleostei, resulta em um evento mais plástico e complexo (Yamamoto, 1969).
momento durante o desenvolvimento gonadal, através de sinalizações químicas desencadeadas por diferentes fatores ambientais, a gônada diferencia-se em ovário ou testículo (Crews and Bull, 2008). Em várias espécies de peixes, apesar de possuírem cromossomos sexuais, seu sexo não é determinado geneticamente, ou seja, um indivíduo pode ter cromossomos sexuais masculinos, no entanto, influencias ambientais podem desencadear processos fisiológicos que resultem em ovários (Patiño et al., 1996; Baroiller et al., 1999). Podemos citar como exemplo desta interferência ambiental no processo de determinação sexual em espécies DSA, a relação temperatura-aromatase. A atividade da aromatase, a principal enzima envolvida no processo de determinação sexual, pode ser reduzida ou ampliada mediante a modulação da temperatura (Conover and Heine, 1987; Hattori
et al., 2007; Rougeot et al., 2008; Selim, et al., 2009; Blázquez and Somoza, 2009). Além da temperatura, podemos relacionar outros fatores ambientais que podem influenciar a determinação sexual, tais como o pH (Roemer and Beisenherz, 1996), interações sociais (Francis and Barlow, 1993), nível de cortisol (Hattori et al., 2009) e hipóxia (Shang et al, 2006).
Nesta plasticidade dos mecanismos que envolvem a determinação sexual dos teleósteos é que residem as vantagens da diversidade de técnicas de manipulação sexual em peixes tais como a manipulação cromossômica (Tsukamoto and Rigolino, 1993; Luo et al., 2011; Mei and Gui, 2015) e intervenção hormonal (Phelps et al., 1995; Carrasco et al., 1999; Piferrer, 2001).
Apesar do P. mesopotamicus ser bastante conhecido no meio acadêmico e apresentar vantagens econômicas, anteriormente mencionadas, trabalhos que correlacionem vantagens zootécnicas e cultivo monosexo com fins de aumento de produtividade desta espécie são inexistentes. Embora existam evidencias claras de que os dados biométricos de fêmeas de pacu sexualmente maduras capturadas na natureza (Costa and Mateus, 2009), ou mantidas em viveiros de piscicultura (Kuradomi, 2013) indiquem superioridade de massa e comprimento à dos machos, além de estudos de outras espécies, que apontam superioridade de tamanho e peso às fêmeas nativas (Imsland et al., 1997; Godinho, 2007) como o cachara (Pseudoplatystoma fasciatum) (Valentin, 2013), o lambari (Astyanax scabripinnis) (Navarro et al., 2006) e o jundiá (Rhamdia quelen) (Nunes e Amaral, 2007), não podemos explicar se a grande disparidade de tamanho no mesmo lote, mantidos sob mesmas condições de cultivo, está relacionada a um gênero, e se caso esteja, se a mesma diferença se mantem nítida no momento de abate do pacu.
MATERIAL E MÉTODOS
Animais e condições de cultivo
Larvas de pacu produzidos no Laboratório de Reprodução de Peixes do Centro de Aquicultura da UNESP/Jaboticabal (CAUNESP) em dezembro de 2012 segundo protocolo de reprodução induzida por Zaniboni-Filho e Weingartner (2007) e tratamento larval inicial seguido por Hainfellner et al. (2012). Após 40 dias os juvenis foram transferidos para viveiros escavados de 200m2 e alimentados 2 vezes
ao dia até a saciedade (totalizando 2,0% da biomassa do plantel ao dia) com ração comercial contendo: 32,0% de proteína bruta, 7,0% extrato etéreo, 5,0% matéria fibrosa, 7,0% cinzas, 1,2% cálcio, 0,6% fósforo. A vazão e renovação da água foi constante.
Parâmetros físicos e químico da água
Quinzenalmente e a cada coleta foram registrados os seguintes parâmetros de qualidade de água: pH, oxigênio dissolvido, condutividade e temperatura. Os parâmetros foram aferidos pelos aparelhos da Yellow Spring Incorporation modelo YSI 55 e YSI 63.
Coletas Amostrais
Os protocolos experimentais foram submetidos e aprovados pelo Comitê de Ética e Bem-Estar de Animais (CEBEA) da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV), UNESP, Jaboticabal, SP, Brasil (protocolo n° 025447/13). Durante o período experimental foram realizadas coletas regulares a cada 30 ou 50 dias aproximadamente. Os animais foram submetidos a um jejum de 24 horas, aproximadamente 20 exemplares foram escolhidos aleatoriamente e, em seguida, aproximadamente 15 eram aleatoriamente separados, individualmente eutanasiados em overdose de benzocaína (etil-aminobenzoato) na proporção de 500mg.L-1. Destacamos que, apesar de serem sacrificados aproximadamente 15
Microscopia de luz
Após a fixação, as amostras foram incluídas em historesina (kit Leica HistoResin), emblocadas na posição longitudinal para obtenção de cortes semi-seriados de 2 µm de espessura em micrótomo Leica RM2245 e corados com Hematoxilina-Eosina. As análises foram executadas em fotomicroscópio Leica DM 4000 LED acoplado a uma câmera e do software Leica Applicatiion Suit (LAS).
Avaliação histológica e classificação das amostras
As gônadas foram caracterizadas quantos aos componentes somáticos (como células somáticas intragonadais e componentes do tecido conjuntivo) e germinativos. Foram classificados como indiferenciados (I1) os tecidos gonadais que apresentaram apenas células germinativas primordiais (CGPs) e ausência de células germinativas masculinas ou femininas (detectáveis por microscopia de luz). Classificações intermediárias (I2 e I3) foram adotadas para designar gradações dos tecidos gonadais indiferenciados com idades avançadas que sofreram alterações estruturais como, o aumento de tamanho e formato das CGPs e disposição das células somáticas, mas que não apresentavam estruturas semelhantes à de ovários ou testículos. Os indivíduos foram classificados como ovário (F), quando a observação de oócito em estágio de crescimento primário foi possível.
Análise dos dados biométricos
Após a classificação sexual por meio da histologia, os dados foram categorizados segundo o seu padrão morfológico (I1, I2, I3 e F) com seus respectivos dados biométricos e distribuídos em classes de BT e CT. Para comparar os dados biométricos entre as gônadas e entre os grupos indiferenciadas e diferenciadas, os dados foram submetidos ao Teste T ao nível de significância de 5%, com o objetivo de resumir valores de mesma natureza e sua significância hipotética, com as seguintes hipóteses de nulidade (ho) para os períodos amostrais
em que ocorreram a presença de mais de um padrão morfológico de gônadas (150, 233 e 299 dias após eclosão):
1) Não existe diferença significativa entre a biomassa total de indivíduos indiferenciados e biomassa total de indivíduos diferenciados;
RESULTADOS
Parâmetros físicos e químicos da água
Os dados médios obtidos para viveiros escavados foram: pH (7,65 ± 0,10), oxigênio dissolvido (4,14 ± 0,32 mg.L-1), condutividade (100,57 ± 2,67 μS.cm-1) e
temperatura (24,29 ± 0,86ºC).
Avaliação macroscópica das gônadas
Macroscopicamente as gônadas indiferenciadas apresentam-se em pares como estruturas translúcidas, filiformes, alongadas por toda cavidade celomática desde a papila urogenital até a vesícula gasosa. Estas se localizavam paralelas ao eixo longitudinalmente ao corpo, dorsalmente ao intestino e ventralmente ao rim (Figura 1).
Figura 1: Fotografia das gônadas indiferenciadas de P. mesopotamicus, com idade de 123 dias, comprimento total = 15,5 cm e biomassa total = 85,81 g. Gônadas indicadas por setas em vermelho e destacadas pela coloração amarela propiciada pela solução de Bouin; vg = vesícula gasosa.
Avaliação histológica das gônadas
As análises e classificação das gônadas foram só possíveis a partir de 96 dias após eclosão (DAE), sendo considerado como início das coletas. As coletas se estenderam até o 299 DAE. As gônadas foram classificadas por meio da microscopia de luz segundo o padrão morfológico e categorizadas em Indiferenciados (I1), subdivisões de indiferenciados segundo as alterações estruturais (I2), (I3) e ovários (F), conforme demonstrado na tabela 1.
Tabela 1: Classificação histológica das gônadas de juvenis de Piaracatus mesopotamicus.
DAE Classificações Histológicas n
I1 I2 I3 F
96 13 0 0 0 13
123 12 0 0 0 12
150 0 1 1 3 5
233 3 3 1 3 10
299 1 4 1 5 11
n 29 8 3 11 51
DAE=dias após eclosão; I1= gônada indiferenciada; I2=gônada indiferenciada com padrões morfológicos de células somáticas e células germinativas primordiais alterados e desorganizados; I3=gônadas com células somáticas e células germinativas primordiais de maiores volumes organizados em cordões curtos próximos a vasos sanguíneos; F=ovário.
Gônadas Indiferenciadas
Foram observadas que as gônadas aos 96 DAE apresentavam predominância de células somáticas (CS) e algumas células germinativas primordiais (CGPs) (Figura 2A-D).
Figura 2: Caracterização de tecido gonadal indiferenciados encontrados aos 96 DAE do Piaractus mesopotamicus. A) Células Germinativas Primordiais isoladas e dispersas. Células Somáticas se apresentando de duas formas, com núcleo achatado e com núcleo mais ovalado apresentando um ou dois nucléolos; B) Células germinativas primordiais em formato mais alongado e em formato mais ovalado. Presença de vasos sanguíneos. C) Células Somáticas se posicionando ao redor das Células Germinativas Primordiais; D) Detalhe dos grânulos do citoplasma intensamente corados por HE. CGP=Célula Germinativa Primordial; CS=Célula Somática; VS=Vaso sanguíneo. Escala indicada. Coloração Hematoxilina+eosina.
As CGPs apresentaram formato ovalado (Figura 2A-D), relativamente grandes de núcleo evidente e ocuparam uma parte considerável do seu volume, apresentaram um nucléolo.
Figura 3: Caracterização de gônadas indiferenciadas encontradas aos 123 DAE do Piaractus mesopotamicus. E) Agrupamento de CGPs (delimitado pela linha vermelha); F) Detalhe da célula somática em formato triangular dividindo a CGP; G) disposição da CGP em cordões, as CS se aglomerando ao redor das CGPs; H) CGP com dois nucléolos e formato mais circular, CS com núcleo triangular se interpondo entre as CGPs. CGP=Célula Germinativa Primordial; CS=Célula Somática. Escala indicada. Coloração Hematoxilina+eosina.
a identificação por microscopia de luz, definida na metodologia, a distinção de oogônias das espermatogônias ou estruturas características da formação dos mesmos.
O segundo subgrupo de indiferenciados (I3) apresentava maior número relativo e aparente de células germinativas primordiais, dispostas em cordões contínuos e curtos (Figura 4A, 4C) e formato mais arredondado (Figura 4B, 4C). Estes cordões foram encontrados sempre próximos a vasos sanguíneos (Figura 4c, 4D). Foi observado que os cordões curtos são formados por células somáticas com núcleo triangular, delimitando de forma rudimentar estruturas com arranjos tubulares compostas por uma ou mais células (Figura 4B, 4D).
Da mesma forma que o padrão de indiferenciados I2, este padrão foi observado até o fim das coletas, aos 299 DAE.
Ovário
As gônadas diferenciadas em ovários só foram assim classificadas quando foi possível a identificação de oócitos em crescimento primário (ocp) aos 150 DAE (Figura 5B). Além dos oócitos em crescimento primário, foi possível o reconhecimento de oócitos profásicos iniciais (opi) em diferentes estágios de desenvolvimento, os quais eram identificáveis apenas por características nucleares (Figura 5D). Foram observados a coexistência de diferentes fases celulares num mesmo cisto germinativo tais como oogônias (og) e oócitos em prófase inicial (opi) (Figura 5C-D).
Quanto as alterações da estrutura externa da gônada, foi possível observar pequenas projeções ovarianas (po) a partir da túnica albugínea em direção a cavidade ovariana (Figura 5B).
Análise dos Dados Biométricos
As médias dos dados biométricos estão apresentados na Tabela 2 e representados graficamente na Figura 7, na qual foi observado que os valores foram semelhantes (p>0,05) para BT e CT ao longo do período amostral (233 e 299).
Tabela 2: Resultados das médias biométricos e classificação gonadal dos juvenis de Piaractus mesopotamicus.
Letras minúsculas sobrescritas indicam as diferenças significativas entre os grupos na mesma coleta (p<0,05). DAE= dias após eclosão; BT=biomassa total; CT=comprimento total; N=número amostral das gônadas. Médias EP.
Variáveis Indiferenciado Diferenciado
96 DAE 123 DAE 150 DAE 233 DAE 299 DAE 96 DAE 123 DAE 150 DAE 233 DAE 299 DAE BT (g) 8,03 1,76a 17,14 6,37a 15,25 3,51 19,92 2,83a 42,51 7,99a - - 18,21 1,22 32,62 12,12a 45,30 9,98a
CT (cm) 7,19 0,50a 8,83 0,71a 9,55 0,65 10,17 0,48a 13,03 0,65a - - 10,03 0,12 11,40 1,45a 13,42 0,82a
As análises do teste t (α=0,05) para comparação de biomassa total e comprimento total das gônadas indiferenciadas e diferenciadas indicam pela aceitação da hipótese de nulidade, ou seja, o teste estatístico aplicado aos três períodos DAE (233 e 299) confirmou que não existem diferenças significativas para biomassa total e comprimento total, confirmando a hipótese de nulidade. Entretanto o teste t revelou diferenças significativas dos dados biométricos dentro da mesma amostragem. (Tabela 2).
A frequência relativa (%) observada indica que até aos 123 DAE, a frequência de gônadas indiferenciadas é de 100%. Só a partir do 150º DAE há a ocorrência de gônadas diferenciadas em ovário (F) e gônadas com padrões morfológicos alterados (I2 e I3). Foi observado a ocorrência de gônadas indiferenciadas (I1) em DAE posteriores a diferenciação de gônadas em ovários, embora em uma frequência menor que os outros padrões morfológicos (Figura 8).
Os dados foram submetidos a análise simultânea de correlação de Pearson, e foi verificado correlações moderadas entre os dados biométricos (BT e CT) com a diferenciação sexual, ao passo que houve uma correlação mais pronunciada entre a variável DAE com a diferenciação sexual (Tabela 3).
Tabela 3: Matriz com resultado da correlação de Pearson
Coeficientes BT-Dif. Sex. CT-Dif. Sex. DAE-Dif. Sex.
r (Pearson) 0,4036 0,5462 0,6027
(p) 0,0033 0,0000 0,0000
DAE= dias após eclosão; BT = biomassa total; CT = comprimento total; Dif. Sex. = diferenciação sexual; N = número amostral; r (Pearson) = Coeficiente de correlação de Pearson; IC 95% = intervalo de confiança; R2 = correlação linear; p = significância estatística.
DISCUSSÃO
Neste estudo, observamos que em Piaractus mesopotamicus as variáveis biométricas não são fatores importantes na identificação do estágio de desenvolvimento gonadal, ou mesmo exerçam alguma influência na diferenciação sexual. As correlações apontaram que o processo de diferenciação sexual possui associação moderada com biomassa e comprimento, mas foi mais acentuada com a idade.
Diversos tipos de processo natural de diferenciação gonadal tem sido descrito para os teleósteos. Yamamoto (1969) verificou que em truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) o período de diferenciação sexual corresponde ao final da absorção do saco vitelino e início da alimentação exógena. Já em
que com o tempo de desenvolvimento. Pospisil e Smisek (1971, apud Billard and Marcel, 1986, p. 102-103) afirmam que a diferenciação gonadal em
Cyprinus carpio ocorre apenas em 7 a 10 meses de vida e não depende da temperatura da água, porém Davies e Takashima (1980, apud Billard and Marcel, 1986, p. 103) afirmam que o processo de diferenciação não é completado até aos 4 meses de vida e este tempo de diferenciação varia conforme a temperatura da água. Esta condição assemelha-se com a que foi observada neste estudo, para P. mesopotamicus, os dados biométricos revelam que a diferenciação provavelmente não depende do tamanho e a identificação de ovários apenas a partir dos 150 dias após eclosão (DAE).
Embora estudos com viés ecológico abordem o tema de forma mais genérica, como os de Nikolsky (1963) e Helfman et al. (2009) que afirmam que as diferenças sexuais no tamanho corporal sejam a forma mais frequente de dimorfismo sexual entre os peixes, e outros expliquem que a razão deste dimorfismo seja estratégia reprodutiva, ou seja, nas fêmeas, o tamanho maior de fêmeas é favorecido porque aumenta a fecundidade, enquanto que o tamanho nos machos é afetado pela seleção sexual, sendo que os machos maiores desfrutam de certa vantagem reprodutiva (Greenwood; Wheeler, 1985; Parker, 1982; Shine, 1990), os mesmos não explicam a disparidade de tamanho em larvas pós-flexão e em juvenis de P. mesopotamicus. Observamos que antes mesmo da diferenciação sexual (150 DAE), já haviam diferentes classes de tamanho com uma heterogeneidade de até 30 vezes entre os indivíduos indiferenciados pertencentes ao mesmo lote e capturados na mesma coleta. Por outro lado, dados biométricos de indivíduos mais “velhos”, ou seja, coletados em DAE posterior ao momento da diferenciação ovariana, revelaram a ocorrência tanto de indivíduos fêmeas como de indivíduos indiferenciados numa mesma classe de tamanho, ou seja, não houve predominância de gênero correlacionado com comprimento total e biomassa total. Portanto, os chamados juvenis de “cabeceira” não estão associados a um gênero específico para a espécie P. mesopotamicus.
como o medaka (Satoh and Egami, 1972), Truta-arco-iris (Hurk and Slof, 1981; Lebrun et al., 1982) e piau branco (Alves and Godinho, 1987). Embora no presente estudo, as atividades celulares das células somáticas (CS) e CGPs terem se mostrado mais quiescentes aos 96 DAE, a morfologia e o arranjo das células somáticasao redor das CGPs, ocorreram de forma similares ao já descrito para outras espécies (Yamamoto and Onozato, 1965; Alves and Godinho, 1987). Também foi perceptível neste estudo, a mudança gradativa na morfologia das CGPs, de estruturas ovais ou elípticas para formato mais circular a medida do desenvolvimento gonadal, semelhante ao observado por Mazzoni et al. (2010).
Aos 123 DAE, foram observados um aumento no tamanho das gônadas, possivelmente resultado promovido pelo início das divisões mitóticas das CGPs, o que ocorre comumente em gônadas antes que se diferenciem em ovários (Nakamura et al., 1998). As CGPs passam a ser vistas de maneira contínua e em agrupamentos chamados cordões contínuos tal como também observado por Meijide, et al. (2005). Apesar de serem observados a evolução gradativa das CS e CGPs, em P. mesopotamicus, não foi possível a identificação de estruturas secundárias nas gônadas que indicassem alguma diferenciação, igualmente como ocorrido em Oryzias latipes (Satoh and Egami, 1972) e diferentemente ao observado em Odontesthes bonariensis (Strussman
et al., 1996b), Cyprinus carpio (Mazzoni, 2009) e Pseudoplatystoma fasciatum
(Valentin, 2013). Este padrão morfológico gonadal foi encontrado ao longo de todo o período amostral, sendo em sua ocorrência absoluta entre os tecidos amostrado aos 96 e 123 DAE. Nas demais amostragens, apesar de terem ocorrido em menor frequência, ainda figuraram entre as maiores classes de comprimento.
2001). Após a identificação dos oócitos em estágio de crescimento primário foi possível identificar com segurança as oogônias, que, estavam coexistindo com outros oócitos em estágio profásico na mesma gônada. As características morfológicas dos oócitos em crescimento primário, oócitos em estágios profásicos, cistos germinativos e estruturas externas como lamelas ovígeras e túnica albugínea estavam de acordo com os descritos por Grier et al. (2000). Os ovários foram predominantemente frequentes em relação aos demais padrões morfológicos a partir dos 150 DAE até o final do período amostral aos 299 DAE.
Apesar de indícios de diferenciação testicular como disposição das CGPs de forma mais desorganizada e em menor número comparados ao ovário e formação de pequenos cordões contendo CGPs alocados próximos a vasos sanguíneos, não foram observados espermatócitos ou características estruturais tais como reentrâncias ou formação de lobos testiculares. Portanto não foi possível definir o momento de diferenciação testicular. As gônadas que apresentaram estas características foram categorizadas como gradações de gônadas indiferenciadas, embora encontradas em menor frequência, foram encontradas a partir dos 150 DAE e recorrentes até os 299 DAE.
Entende-se por período lábil, o período crítico da determinação sexual, período em que se inicia mudanças estruturais a nível celular controlados por fatores genéticos, fisiológicos e hormonais (Somoza et al., 2002; Fernandino et al., 2008) desencadeados por fatores ambientais tais como temperatura e condições de cultivo (Baroiller et al., 1999; Azuma et al., 2004). Os dados obtidos pelas análises histológicas deste estudo, indicam que o período lábil para o P. mesopotamicus é entre 123° e o 150° dia após eclosão. Período este considerado mais eficiente para adoção de protocolos de inversão sexual, pois as gônadas indiferenciadas apresentam maior capacidade de resposta (Piferrer, 2001; Marlatt et al., 2006).
temperatura da água do viveiro se apresentou favorável para o cultivo de pacus, mantendo-se dentro dos níveis recomendados para espécie (Saint-Paul, 1989; Borghetti and Canzi, 1993). Portanto, as variáveis ambientais não foram fatores influenciadores nos resultados deste estudo.
As informações obtidas neste estudo preenchem lacunas até então abertas sobre o momento da diferenciação ovariana do P. mesopotamicus, bem como aponta para a inexistência de predominância de tamanho relacionado a um gênero antes e logo depois a diferenciação gonadal nesta espécie. Estas informações, importantes também para pesquisa básica, lançam bases para trabalhos de inversão sexual para esta espécie. No entanto há a necessidade da continuação e aprofundamento do conhecimento com intuito de definir o momento de diferenciação testicular, identificar cromossomos sexuais envolvidos no processo de diferenciação e investigar a atuação genes autossômicos no processo de diferenciação.
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