MARIANA FEITOSA CAVALHEIRO
Como o alumínio influencia o metabolismo e o
crescimento da raiz de Citrus limonia?
Rio Claro 2015
Como o alumínio influencia o metabolismo e o crescimento da raiz de
Citrus limonia
?
Orientador: GUSTAVO HABERMANN
Co-orientadora: CAROLINA DE MARCHI SANTIAGO DA SILVA
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - Câmpus de Rio Claro, para obtenção do grau de Bacharela em Ciências Biológicas.
Cavalheiro. - Rio Claro, 2015 23 f. : il., figs., tabs.
Trabalho de conclusão de curso (bacharelado - Ciências Biológicas) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Rio Claro
Orientador: Gustavo Habermann
Coorientador: Carolina de Marchi Santiago da Silva 1. Fisiologia vegetal. 2. Estresse abiótico. 3. Limão Cravo. 4. SAUR. 5. Auxina. I. Título.
tóxico às plantas de interesse agronômico, como o limoeiro Cravo (Citrus limonia),
afetando principalmente seu crescimento radicular . O presente estudo avaliou como o Al influencia as raízes de C. limonia, visando correlacionar a concentração
endógenea de IAA, a expressão dos genes SAUR X10A e SAUR 15A e a inibição do crescimento radicular. As plantas foram submetidas à hidroponia em diferentes
concentrações de Al na solução nutritiva (0, 370 µM, 740 µM, 1110 µM, e 1480), tendo seu crescimento avaliado semanalmente em um período de dois meses. Além disso, as soluções contrastantes tiveram a expressão gênica e a concentração endógenea de IAA avaliados utilizando qRT-PCR e GC-MS, respectivamente. O tratamento com Al inibiu o crescimento radicular das plantas, além de alterar a concentração de IAA nas raízes (apresentou-se algumas vezes maior nas primeiras semanas em relação ao controle, havendo um decaimento e igualação na concentração hormonal de ambos os tratamentos) e inibir a expressão dos genes SAUR. A inibição do crescimento radicular pode ser atribuida à uma mudança de padrão e acumulação do ácido indol-acético (IAA) no ápice da raiz, provocada pela alteração na distribuição das proteínas de transporte. Concomitantemente, proteínas da família SAUR (small auxin-up RNA) têm suas expressões gênicas induzidas em presença de IAA e estão relacionadas à acidificação do apoplasto: a queda na atividade da H+-ATPase provoca a altereção do pH nesta região prejudicando a
alongação da célula via crescimento ácido. Embora haja uma mesma quantidade de IAA na raiz, os genes SAUR são reprimidos na condição de estresse pelo Al,
indicando que a inibição do crescimento radicular em C. limonia deve ocorrer em
resposta a um conjunto de fatores.
2 MATERIAL E MÉTODOS...6
2.1 Condições do cultivo...6
2.2 Crescimento das raízes...7
2.3 Determinação da concentração endógena de IAA...7
2.4 Expressão gênica...8
2.5 Forma de Análise dos Resultados...9
3 RESULTADOS...10
3.1 O alumínio inibiu o crescimento das raízes de C. limonia...10
3.2 Expressão gênica...11
3.2.1 Primers obtidos para amplificação dos genes GAPC2, EFα, SAUR X10A e SAUR 15A...11
3.2.2 Os genes SAUR X10A e SAUR X15A são reprimidos na presença de Al após 60 dias de tratamento...13
3.3 Concentração de IAA para os tratamentos 0 e 1480 µM de Al são as mesmas após 30 dias...14
4 DISCUSSÃO...16
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS...20
1 INTRODUÇÃO
O crescimento e o desenvolvimento das raízes são de extrema importância para o estabelecimento da planta no meio, uma vez que as raízes estão associadas à sobrevivência da planta, fixação ao substrato e sustentação da parte aérea (RAVEN et al., 2007), armazenamento de reservas, biossíntese de hormônios (citocininas e auxinas) (PERILLI; DI MAMBRO; SABATINI, 2012), além de absorção de água e nutrientes (KRAMER; BOYER, 1995). Portanto, o crescimento das raízes é fundamental para o desenvolvimento normal das plantas.
Quarenta por cento dos solos agriculturáveis são ácidos (pH < 5,0), sendo que na América do Sul, 60% dos solos têm pH abaixo de 4,0 (VON UEXKÜLL; MUTERT, 1995) Em solos nestas condições, aluminosilicatos são ionizados e o alumínio passa à forma ionizada (Al3+), que é tóxica à maioria das plantas (ULRICH,
1986), em especial àquelas de interesse agronômico, sensíveis ao Al por apresentarem baixa taxa de crescimento radicular, além de formação de rupturas nas paredes celulares de algumas células próximas ao ápice da raiz (KOPITTKE; BLAMEY; MENZIES, 2008). Tais características diminuem a capacidade de
estabelecimento das plantas em solos álicos (ricos em Al tóxico), reduzindo suas produtividades.
Uma das espécies com produtividade reduzida em solos com Al é o limoeiro ‘Cravo’ (Citrus limonia cv. Cravo), com grande interesse comercial, pois é uma espécie que serve como base aos porta-enxertos utilizados na citricultura brasileira. Apesar das controvérsias na literatura, estudos apontam que essa espécie é sensível ao Al (PEREIRA et al., 2003; SANTOS et al., 1999)
a expansão celular pode ser prejudicada por elevadas concentrações de etileno e baixa biossíntese ou distribuição ineficiente de IAA na raiz (MUDAY; RAHMAN; BINDER, 2012).
O IAA exerce papel importante na regulação da expressão de diversos genes que regulam respostas fisiológicas (HAGEN et al., 2010), dentre eles os genes da família SAUR (small auxin-up RNA), pois estes possuem regiões promotoras na qual o IAA se liga, tendo suas expressões induzidas rapidamente (MCCLURE et al., 1989; SPARTZ et al., 2014). Tais genes desempenham papeis importantes no alongamento das células, via crescimento ácido, pois atuam na redução da atividade das fosfatases, permitindo a ativação da H+-ATPase presente na membrana
plasmática (SPARTZ et al., 2014), o que resulta na acidificação do apoplasto.
Os genes SAUR podem estar sujeitos diretamenteà ação do Al, uma vez que uma queda da atividade da bomba de H+ foi relatada na presença desse metal,
seguido de uma inibição do crescimento das raízes em Cucubita pepo (AHN et al.,
2002). Ou a relação entre os genes SAUR e Al seja indireta, através de alterações na síntese e/ou distribuição do IAA como mediador.
2 MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados 164 indivíduos de limoeiro C. limonia, com 90 dias de idade. As plantas foram separadas em cinco grupos com diferentes concentrações de Al na solução nutritiva de cultivo. Durante 60 dias, foi observado o crescimento das raízes e a coletadas amostras para quantificação de IAA. Ao término do período proposto para o experimento, foram coletadas amostras para análise da expressão de genes em resposta à auxina (SAUR X10A e SAUR 15A).
Foram utilizados 12 indíviduos para analisar a expressão gênica no ápice radicular, 40 indíviduos para avaliar o crescimento das raízes e outros 56 indivíduos para verificar a concentração de IAA no ápice da raiz.
2.1 Condições do cultivo
As plantas foram submetidas a cinco diferentes tratamentos testados: 0; 370 µM; 740 µM; 1110 µM; e 1480 µM de Al na solução. A solução de nutrientes utilizada no experimento é baseada em balanceamento de macro e micronutrientes, e foi especialmente desenvolvida para estudos de toxicidade de Al, de forma a não haver precipitação deste metal (FURLANI; FURLANI, 1988). Assim, a solução continha a concentração nominal de macronutrientes (em mM): NO3- 0.96; NH4+ 0.41; P, 0.013; K+, 0.86; Ca2+, 1.43; Mg2+, 0.33; S, 0.22 e de micronutrientes (em μM): Cl-, 214.1; Fe (EDTA), 23.3; B, 8.33; Mn2+, 2.91; Zn2+, 0.76; Cu2+, 0.32 e Mo2+, 0.31. A
solução foi mantida em pH 4, oxigenada diariamente, sendo corrigida (com NaOH e/ou HCl 0,1 N), semanalmente, durante o período de dois meses. A cada 15 dias durante esse período, foi realizada a troca completa da solução de nutrientes, evitando a queda de condutividade elétrica (mS), em mais de 50% na solução.
As plantas foram fixadas em orifícios de placas de Isopor, com o auxílio de
2.2 Crescimento das raízes
Neste experimento, oito plantas foram separadas para cada um dos cinco tratamentos, utilizando 40 indivíduos ao todo. O comprimento foi avaliado semanalmente, durante o período de dois meses, com o uso de uma régua milimetrada e apenas o eixo da raiz principal foi considerado para medição.
2.3 Determinação da concentração endógena de IAA
Para este experimento, foram utilizados 112 indíviduos de C. limonia, que
foram divididos em dois grupos, submetidos apenas aos tratamentos mais contrastantes (0 e 1480 µM de Al). Por sua vez, os dois grupos foram divididos em sete subgrupos de acordo com os dias sob tratamento, com oito plantas cada: 1 dia após o plantio (DAP); 3 DAP; 5 DAP; 7 DAP; 15 DAP; 30 DAP; e 60 DAP. Nos dias
de coleta (de acordo com o DAP) oito plantas do grupo controle (0 µM Al) e oito plantas do tratamento com Al (1480 µM Al) tiveram seus meristemas apicais lavados e removidos. Imediatamente após a remoção, as amostras de raiz foram tratadas criogenicamente a fim de cessar a atividade metabólica. As amostras foram acondicionadas em tubos do tipo ‘eppendorf’ de 5 mL, e armazenadas em ultra freezer (-80ºC). As amostras foram processadas sob a orientação do Prof. Dr. Eduardo Purgatto, do Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, em laboratório de pesquisa de sua responsabilidade.
Para realizar a quantificação da concentração de auxina endógena nos ápices radiculares, foi utilizada a técnica de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-MS) (CHEN et al., 1988)
Para a purificação de cada amostra, foram utilizadas em média 420 µg de massa fresca do ápice radicular, a qual foi homogeneizada na proporção de 1 ml de isopropanol para ácido acético (95:5, v/v), com 1 µg de [2H
5]-IAA (D-IAA) como
surrogate (adicionado para quantificar as perdas durante o processo). As amostras
2.4 Expressão gênica
Para a análise quantitativa da expressão dos genes, o RNA total foi extraído do ápice radicular de seis indivíduos de cada um dos tratamentos mais contrastantes, 0 e 1480 µM de Al.
Após 60 dias de tratamento, o RNA total foi extraído das pontas das raízes utilizando o mini kit DNeasy plant (Qiagen, Hilden, Germany). As amostras foram enviadas para a empresa BGI Tech Solutions (Hong Kong, China), as quais foram sequenciadas por sequenciamento de nova geração (NGS), utilizando a plataforma Illumina HiSeq2000. Através a análise comparativa do transcriptoma os únicos genes diretamente relacionados à auxina que tiveram expressão gênica alterada pelo tratamento com Al foram os genes SAUR, por isso foram selecionados para
análise quantitativa de expressão os genes SAUR X10A e SAUR 15A. A co-orientadora do projeto desenhou novos primers baseados nas sequências específicas dos genes para quantificar a expressão gênica através da técnica de qRT-PCR.
O RNA total (2µg) foi tratado com DNase TURBO sem RNase (Ambion, Carlsbad, USA), e posteriormente transcrito reversamente o cDNA com o auxílio do primer oligo-dT e a enzima Super Script II, de acordo com o protocolo do fabricante (Life Technologies, Carlsbad, USA).
Diluições seriadas (fator de diluição 5x) de DNA genômico foram amplificadas com os conjuntos de primers dos genes SAUR X10A e SAUR 15A e mais dois primers para os genes de referência otimizados a partir dos propostos por Mafra et al. (2012) - (Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPC2) e fator de elongação alfa (EFα) para analisar a eficiência de amplificação durante a análise de qPCR.
Tanto para a análise de eficiência quanto para a quantificação propriamente dita foi usado o reagente GoTaq qPCR Master Mix (Promega, Madison, USA), com fluoróforo SYBR Green e ROX como referência passiva. Os ciclos de amplificação
foram de 95°C por 5 min (1 ciclo), 95°C por 10 s, 57°C por 30 s, 72°C por 30 s (40
ciclos), seguidos por análise de curva de melting (aumento de 1% na temperatura,
2.5 Forma de Análise dos Resultados
2.5.1 Crescimento das raízes
Uma análise estatística foi aplicada para todos os tempos a partir de 21 DAP, uma vez que havia pouquíssima diferença entre os comprimentos inicias e o comprimento em centímetros das raízes nas duas primeiras semanas de tratamento
(7 e 14 DAP). Foi aplicado o teste de Análise de Variância, com teste de Tukey (∝ =
5%) a posteriori.
2.5.2 Concentração de auxina
Os dados foram submetidos ao teste de Shapiro-Wilk, com o teste de
variância one way ANOVA, e Tukey (∝ = 5%) a posteriori.
2.5.3 Expressão gênica
Os valores de Ct (Cycle threshold) foram normalizados, correspondendo ao ΔCt (Equação 1), enquanto que os valores de ΔΔCt (Equação 2) correspondem à variação dada pela exposição à solução com 1480 µM Al3+ frente a exposição à 0 µM
Al3+.
Equação 1: Equação 2:
ΔCt=Ct gene alvo-
(
Ct GAPC2+Ct EFα2
)
ΔΔCt=ΔCt tratamento- ΔCt controle
3 RESULTADOS
3.1 O alumínio inibiu o crescimento das raízes de C. limonia
A presença de Al na solução nutritiva influenciou negativamente o crescimento das raízes de C. limonia (Figura 1), sendo que o crescimento é dose-dependente até
a concentração de 740 µM (Figura 2). O teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade, revelou que o tratamento 0 µM de Al foi contrastante com os demais desde o início das análises estatísticas (21 DAP). O tratamento com 370 µM diferiu das concentrações de 1110 e 1480 µM de Al em 35 DAP, e estabeleu-se de fato diferente de 740 µM de Al em 42 DAP. Não houve diferença significativa no
crescimento das raízes entre os tratamentos com concentrações de 740, 1110 e 1480 µM de Al em nenhum dos tempos analisados. Tais resultados corroboram parcialmente à hipótese de que quanto mais houvesse Al no meio, menor seria o crescimento.
Figura 1- Raízes de C. limonia ao final do experimento, evidenciando a diminuição no crescimento radicular causada pelo Al. Da esquerda para a direita: 0, 370, 740, 1110 e 1480
DAP
0 7 14 21 28 35 42 49 56
C re sc im e nt o a cu m ul a d o d a s ra íz e s (c m ) 0 5 10 15
0 µM de Al 370 µM de Al 740 µM de Al 1110 µM de Al 1480 µM de Al
Figura 2 – Crescimento acumulado das raízes de C. limonia sob diferentes tratamentos com Al para diferentes dias após o plantio (DAP). Os pontos demarcados representam a média das amostras para cada tratamento, as barras representam o desvio padrão.
3.2 Expressão gênica
3.2.1 Primers obtidos para amplificação dos genes GAPC2, EFα, SAUR X10A e SAUR 15A.
Os primers para os genes normalizadores (GAPC2 e fator elongação alfa – Efα), foram otimizados a partir do trabalho Mafra et al. (2012). Para os genes de interesse (SAUR X10A e SAUR 15A) os primers foram desenhados a partir da análise dos resultados obtidos pelo Sequenciamento de Nova Geração (dados não mostrados). Suas eficiências de amplificação foram acima de 90%, com R² igual ou maior que 0,995 (Tabela 1), seguindo o que é proposto pelo MIQE guidelines
Tabela 1 - Primers utilizados no processo de amplificação dos genes GAPC2, EFα, SAUR X10A e SAUR 15A, com as suas respectivas eficiências e R².
Gene Primer Foward Primer Reverse Eficiência(%) R²
GAPC2 TCCTATGTTTGTTGTGGGTG GGTCATCAAACCCTCAACAA 97,24 0,998
Efα TCAGGCAAGGAGCTTGAGAAG GGCTTGGTGGGAATCATCTTAA 100,04 0,998
SAUR
X10A TGGGTTCACAACTCACAAGC TGAACAATACCAGGCAAACG 91,71 0,995
SAUR 15ª AGGCGTGCTCTTATGGTTTC TTCTGAAAGGATGGGTGCTT 91,55 0,999
No processo de amplificação, tanto os genes de interesse quanto os genes normalizadores apresentaram coerência entre as diluições, como exemplifica a Figura 3.
Figura 3 - Relação entre o número de ciclos de amplificação do gene SAUR 15ª com o nível de fluorescência emitida (ΔRn). O limiar (0.017824), é calculado pelo software, indicando o limiar do ciclo (Cycle threshold – Ct), em cada uma das diluições, demonstrando a relação proporcional entre as diferentes diluições utilizadas no processo de amplificação.
Figura 4 – Curva de melting do gene SAUR X10A com um único pico, indicando que a amplificação não apresenta formação de produtos inespecíficos.
3.2.2 Os genes SAUR X10A e SAUR X15A são reprimidos na presença de Al após 60 dias de tratamento
A análise da expressão gênica realizada após 60 dias de tratamento, revelou diferenças significativas ao nível de 5% entre os tratamentos 0 e 1480 µM de Al tanto para SAUR X10A, (p=0,0021), e SAUR 15A (p<0,0001). A presença de Al resultou numa menor expressão gênica de ambos os genes (Figura 5).
Figura 5 – Expressão relativa dos genes SAUR X10A e SAUR 15A em condições de 0 e 1480 µM de Al. As barras representam o desvio padrão.
3.3 Concentração de IAA para os tratamentos 0 e 1480 µM de Al são as mesmas após 30 dias
Ambos os tratamentos apresentaram uma maior concentração de IAA nos primeiros dias após o plantio (DAP), apresentando um pico no quinto e no sétimo dia para 0 e 1480 µM de Al, respectivamente, seguido de uma queda e estabilização na concentração (Figura 6). Entretanto, na primeira quinzena do experimento, as amostras tratadas com Al demonstraram alguns pontos com concentração de IAA maior do que as amostras não tratadas, sendo esses: 3 DAP (p=0,021), 7 DAP (p<0,001), e 15 DAP (p=0,03). Os valores alcançados a partir do trigésimo dia de experimento não demonstraram diferenças significativas entre os tratamentos de 0 e 1480 µM de Al (p=1,000), e entre os DAPs 30 e 60 (p=1,000).
SAUR X10A SAUR 15A
E xp re ss ã o g ê ni ca r e la tiv a ( m R N A c o nt ro le ) 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14
DAP
1 3 5 7 15 30 60
Á ci d o -i nd o l-a cé tic o ( µ g /g d e m a ss a fr e sc a ) 0 2 4 6 8
0 µM de Al 1480 µM de Al
Figura 6 – Concentração de IAA no ápice radicular durante os 60 dias de tratamento. Os pontos representam as médias das amostras colhidas de acordo com dias após o plantio (DAP).As barras representam o desvio padrão amostral, e os asteriscos diferenças significativas entre os dois tratamentos em um determinado DAP.
*
4 DISCUSSÃO
A inibição do crescimento radicular de C. limonia induzida pelo Al pode estar
relacionada a curto prazo (entre 3 e 15 DAPs), a uma grande concentração de IAA na raiz, e a longo prazo (de 30 a 60 DAPs), à repressão da expressão dos genes SAUR X10A e SAUR 15A. Além disso, a inibição do crescimento das raízes pelo Al é dose-dependente até 740 µM de Al na solução, após isso provavelmente ocorre a saturação das ligações de Al com a matriz péctica.
A análise de concentração de IAA livre no ápice radicular se fez necessária uma vez que este hormônio é necessário para elongação e divisão celular, mas grandes concentrações acarreta a inibição do crescimento das raízes (TAIZ; ZEIGER, 2009), e já foram apontadas como um dos fatores de inibição do crescimento radicular causadas pelo Al (YANG et al., 2014). A técnica de CG-MS foi relatada como uma boa opção para fazer a avaliação da concentração de auxina livre em diferentes tecidos vegetais (CHEN et al., 1988; LUDWIG-MUELLER; GEORGIEV; BLEY, 2008), com alta confiabilidade dado o uso do padrão interno deuterado [2H
5]-IAA.
A técnica de qRT-PCR é uma ferramenta amplamente utilizada para quantificar a expressão gênica de diversos sistemas biológicos, e que necessita de genes normalizadores para calcular a expressão relativa, uma vez que esses não apresentam flutuações em suas expressões (NASCIMENTO; SUAREZ; PINHAL, 2010). No trabalho de Mafra et al. (2012), os genes GAPC2 e EFα e foram reportados como ótimos genes normalizadores em citros. Entretanto, modificações
núcleo celular e competem pelo alvo (LI et al., 1994), e em Arabidopsis, SAUR 10 e SAUR 15 são induzidos pela auxina (PAPONOV et al., 2008). Estudos mais recentes, com SAUR 19, apontam a relação da família com a acidificação do apoplasto, pois se ligam às fosfatases, diminuindo a atividade dessas e, consequentemente, ativando a H+-ATPase (SPARTZ et al., 2014), o que pode estar
relacionado com a inibição de crescimento.
A inibição do crescimento é um importante parâmetro avaliado em estudos que abordam a toxicidade do Al em diferentes espécies de plantas (HORST; WANG; ETICHA, 2010), sendo que trabalhos com C. limonia testando o crescimento
radicular sob tratamentos com Al já foram reportados anteriormente (NOGUEIRA et al., 1989; PEREIRA et al., 2003). Contudo, estudos que correlacionam o crescimento das raízes, a concentração endógenea de IAA no ápice radicular e a expressão de genes induzidos pela auxina não foram anteriormente reportados para essa espécie.
O Al inibiu o crescimento das raízes de C. limonia. A diferença significativa
encontrada entre o tratamento controle para todas as concentrações de Al testadas indicam que o Al interferiu negativamente no crescimento radicular dessas amostras, resultados que concordam com aqueles apresentados por Nogueira et al. (1989); Pereira et al., (2003) Além disso, a análise estatística revelou que o crescimento das raízes de C. limonia pelo Al é dose-dependente até 740 µM de Al na solução, o que corrobora parcialmente a hipótese proposta de que o crescimento radicular descresce em função do aumento de Al no meio. Para as concentrações testadas no presente estudo, essa relação era esperada pelo menos até a concentração 400 µM de Al (PEREIRA et al., 2003), sendo que a diferença não significativa do crescimento das raízes nos tratamentos de 740, 1110 e 1480 µM de Al talvez seja explicada pela saturação dos sítios de ligação do Al no apoplasto, que são as carboxilas livres negativamente carregadas da matriz de pectina nas quais o Al se liga fortemente (HORST; WANG; ETICHA, 2010).
como uma das causas da inibição do crescimento das raízes. Entretanto, há uma diminuição significativa na concentração de IAA constatada no tratamento de 1480 µM de Al, 30 dias após o início do tratamento, que se torna equivalente à concentração das amostras controles.
Após 60 dias, os genes SAUR X10A e SAUR 15A são reprimidos na presença de Al. A expressão desses genes está relacionada à extrusão de prótons na membrana plasmática da célula vegetal (SPARTZ et al., 2014), e a consequente acidificação do apoplasto, proporcionando condições ideais para ação de enzimas que atuam na extensibilidade da parede celular (BENJAMINS; MALENICA; LUSCHNIG, 2005). Logo, as amostras tratadas com Al apresentaram um menor crescimento radicular em função da queda de bomba de H+. Ahn et al. (2002) já
haviam reportado uma queda na atividade de extrusão H+ como um dos fatores de
inibição radicular provocada por Al, entretanto foi proposto que essa queda de atividade se dava em função da ligação direta do Al com a porção c-terminal da H+
-ATPase (AHN et al., 2001). Neste trabalho, os resultados discutidos apontam que provavelmente os genes SAUR medeiam essa resposta, relacionando Al à extrusão de prótons.
A variação da expressão gênica do tratamento frente ao grupo controle (ΔΔCt) de SAUR X10A e SAUR 15A não apresentaram diferenças estatísticas, embora tal resultado possa estar comprometido em função do baixo poder de realização (p<0,80). Este resultado era esperado, uma vez que os dois genes pertencem a uma família altamente conservada, com a mesma região promotora induzida pelo IAA e atuação em um mesmo alvo (LI et al., 1994).
Os genes AUX1, PIN1 e PIN2 foram induzidos pela presença de Al (Sun et al., 2010). Estes genes estão envolvidos no transporte polar de auxina, indicando que a presença de Al na forma tóxica Al3+ altera esta distribuição hormonal, resultando em
diminuição do crescimento radicular. No presente trabalho, a análise comparativa do transcriptoma por sequenciamento de nova geração não apresentou grandes diferenças na expressão dos genes AUX e PIN no grupo controle frente ao tratamento com Al. Embora não se tenha encontrados esses genes relacionados ao transporte de IAA utilizando o Sequenciamento de Nova Geração (dados não
mostrados), foram identificados duas sequências homólogas a genes induzidos por IAA em soja (Glycine max L.), SAUR X10A e o SAUR 15A (MCCLURE et al., 1989), que se mostraram, em um primeiro momento, promissores para explicar como o IAA, sob a ação do Al, interfere no crescimento ácido. Embora a análise da expressão dos genes SAUR X10A e SAUR 15A não seja por si só suficiente para explicar o mecanismo relacionado entre a concentração de IAA e a acidificação do apoplasto sob o estresse de Al, a supressão desses genes confirmou ser mais um dos mecanismos pelo qual o Al promove a inibição do crescimento da raiz.
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O presente estudo demonstra que C. limonia é sensível ao Al, porque tem o crescimento de suas raízes inibido devido à presença desse metal no meio. Um dos fatores de inibição pode ser relacionado ao aumento na concentração de auxina nas primeiras semanas de tratamento, sendo que essa concentração decai e iguala-se ao tratamento controle após 30 dias. Embora a concentração de IAA seja a mesma para o tratamento com Al e o controle após 60 dias, os genes SAUR têm sua expressão reprimida pela presença de Al no meio, e este fato relaciona-se ao decréscimo da atividade da H+-ATPase e, consequentemente, aumento o pH no
apoplasto, prejudicando o funcionamento das proteínas relacionadas à expansão celular, outro fator apontado como causa da inibição do crescimento radicular.
Sabe-se que a toxicidade do Al está relacionada à interferência do transporte de proteínas que regulam a redistribuição de IAA na raiz, sugerindo que regiões
promotoras de poucas células são alcançadas pelo IAA, o que explicaria a diferença na expressão dos genes SAUR nos dois tratamentos. Investigações mais detalhadas devem ser realizadas utilizando marcadores moleculares de IAA para avaliar a sua distribuição no ápice da raiz, além de identificar genes de C. limonia responsáveis pelo transporte de IAA para elucidar essa questão.
O uso de uma escala menor para medir o crescimento radicular nos primeiros dias de tratamento (milímetros ao invés de centímetros), seria fundamental para identificar a concentração ótima em que as raízes de C. limonia crescem e assim conseguir realizar uma análise precisa de correlação entre esse parâmetro e a concentração de Al.
REFERÊNCIAS
AHN, S. J. et al. Aluminum inhibits the H+ -ATPase activity by permanently altering the plasma membrane surface potentials in squash roots. Plant Physiology, v. 126, n. August, p. 1381–1390, 2001.
AHN, S. J. et al. Aluminium-induced growth inhibition is associated with impaired efflux and influx of H + across the plasma membrane in root apices of squash (Cucurbita pepo). Journal of Experimental Botany, v. 53, n. 376, p. 1959–1966, 2002.
BENJAMINS, R.; MALENICA, N.; LUSCHNIG, C. Regulating the regulator : the control of auxin transport. BioEssays, v. 27, p. 1246–1255, 2005.
BUSTIN, S. A. et al. The MIQE guidelines:Minimum Information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry, v. 55, n. 4, p. 611–622, 2009.
CHEN, K. et al. A rapid and simple procedure for purification of indole-3- acetic acid prior to GC-SIM-MS analysis. Plant Physiology, v. 86, p. 822–825, 1988.
FURLANI, A. M. C.; FURLANI, P. R. Composição e pH de soluções nutritivas para estudos fisiológicos e seleção de plantas em condições adversas. Boletim Técnico
Campinas: IAC, v. 121, p.21-26.,1988.
HAGEN, G.; GUILFOYLE, T. J.; GRAY, W. M., 2010. Auxin signal transduction. In Davies P.J. (ed), Plant hormones: biosynthesis, signal transduction, action! 3rd Edition, Kluwer Academic: Boston, p.282-303, 2010.
HORST, W. J.; WANG, Y.; ETICHA, D. The role of the root apoplast in aluminium-induced inhibition of root elongation and in aluminium resistance of plants: A review.
Annals of Botany, v. 106, n. 1, p. 185–197, 2010.
IENNE, S. et al. Auxin production by the plant trypanosomatid Phytomonas serpens and auxin homoeostasis in infected tomato fruits. Parasitology, v. 141, n. 10, p. 1299–1310, 2014.
KERBAUY, G.B. Fisiologia Vegetal. 2 Ed. Guanabara Koogan, 2008. 472p.
KRAMER, P. J; BOYER, J.S. Roots and root systems. In: (Eds) Water relations of plants and soils. Academic Press, San Diego, p. 115-166, 1995.
KOPITTKE, P. M.; BLAMEY, F. P. C.; MENZIES, N. W. Toxicities of soluble Al, Cu, and la include ruptures to rhizodermal and root cortical cells of cowpea. Plant and Soil, v. 303, n. 1-2, p. 217–227, 2008.
LI, Y. et al. An auxin-inducible element in soybean SAUR Promoters. Plant Physiology, v. 106, p. 37–43, 1994.
LUDWIG-MUELLER, J.; GEORGIEV, M.; BLEY, T. Metabolite and hormonal status hairy root cultures of Devil’s claw (Harpagophytum procumbens) in flasks and in a bubble column bioreactor. Process Biochemistry, v. 43, p. 15–23, 2008.
MAFRA, V. et al. Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions. PLoS ONE, v. 7, n. 2, p. e31263, 9 fev. 2012.
MCCLURE, B. A et al. Transcription, organization, and sequence of an auxin-regulated gene cluster in soybean. The Plant cell, v. 1, n. 2, p. 229–239, 1989a.
MCCLURE, B. A. et al. Transcription, organization , and sequence of an auxin-regulated gene cluster in Soybean. The Plant Cell, v. 1, p. 229–239, 1989b.
MUDAY, G. K.; RAHMAN, A.; BINDER, B. M. Auxin and ethylene: collaborators or competitors? Trends in plant science, v. 17, n. 4, p. 181–95, abr. 2012.
NASCIMENTO, S.; SUAREZ, E. R.; PINHAL, M. A. D. S. Tecnologia de PCR e RT-PCR em tempo real e suas aplicações na área médica. Rbm, v. 67, p. 7–19, 2010.
NOGUEIRA, S. DOS S. S. et al. Comportamento de porta-enxertos de citros em presença do alumínio. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 24, n. 6, p. 3–8, 1989.
PAPONOV, I. A. et al. Comprehensive transcriptome analysis of auxin responses in Arabidopsis. Molecular Plant, v. 1, n. 2, p. 321–337, 2008.
PEREIRA, W. E. et al. Growth of citrus rootstocks under aluminum stress in hydroponics. Scientia Agricola, v. 60, n. 1, p. 31–41, 2003.
PERILLI, S.; DI MAMBRO, R.; SABATINI, S. Growth and development of the root apical meristem. Current opinion in plant biology, v. 15, n. 1, p. 17–23, fev. 2012.
NORMANLY, J.; SLOVIN, J. P.; COHEN, J. D. Auxin biosynthesis and metabolism. In Davies P.J. (ed), Plant hormones: biosynthesis, signal transduction, action! 3rd Edition, Kluwer Academic: Boston, p.36-62, 2010.
RAVEN, P.H.; EVERT, R.F. & EICHHORN, S.E. Biologia Vegetal (7a ed), Editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2007.
SPARTZ, A. K. et al. SAUR inhibition of PP2C-D phosphatases activates plasma membrane H+-ATPases to promote cell expansion in Arabidopsis. The Plant Cell, v. 26, p. 2129–2142, 2014.
SUN, P. et al. Aluminium-induced inhibition of root elongation in Arabidopsis is mediated by ethylene and auxin. Journal of Experimental Botany, v. 61, n. 2, p. 347–356, 2010.
TAIZ, L.; ZEIGER, E. Fisiologia vegetal. 4.ed. Porto Alegre: Artmed, 2009. 819p.
ULRICH, B. Natural and anthropogenic components of soil acidification. Z. Pflanzenernaehr. Bodenk, v. 149, p. 702-717, 1986.
VON UEXKÜLL, H. R.; MUTERT, E. Global extent, development and economic impact of acid soils. Plant and Soil, v. 171, n. 1, p. 1–15, 1995.
YANG, Z. et al. TAA1-regulated local auxin biosynthesis in the root-apex transition zone mediates the aluminum-induced inhibition of root growth in Arabidopsis. The Plant Cell, v. 26, p. 2889–2904, 2014.
