TÂNIA MARIA VULCANI DE FREITAS
PERFIL DE EXPRESSÃO DOS GENES
MYC, MYCN,
TERT, ASPM
E
PRAME
EM MEDULOBLASTOMA
Orientadora: Profª Drª Silvia Regina Caminada de Toledo
TÂNIA MARIA VULCANI DE FREITAS
PERFIL DE EXPRESSÃO DOS GENES
MYC, MYCN,
TERT, ASPM
E
PRAME
EM MEDULOBLASTOMA
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Título de Doutor em Ciências pelo programa de pós –graduação em Morfologia e Genética.
Orientadora: Profª Drª Silvia Regina Caminada de Toledo
Vulcani-Freitas, Tânia Maria
Perfil de expressão dos genes MYC, MYCN, TERT, ASPM e PRAME
em Meduloblastoma, São Paulo, 2010. p.62
Tese de Doutorado – Displina de Genética - Departamento de Morfologia e Genética - Universidade Federal de São Paulo, Escola Paulista de Medicina.
Orientadora: Profª. Drª. Sílvia Regina Caminada de Toledo.
UNIVERSIDADE FEDERAL PAULISTA
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA E GENÉTICA
Chefe do Departamento de Morfologia e Genética
Profª Drª Sima Godosevicius Katz
Coordenador do Curso de Pós-Graduação em Morfologia e Genética
Profª Drª Janete Maria Cerutti
Chefe da Disciplina de Genética
TÂNIA MARIA VULCANI DE FREITAS
PERFIL DE EXPRESSÃO DOS GENES
MYC, MYCN, TERT,
ASPM
E
PRAME
EM MEDULOBLASTOMA
Orientador
Profª. Drª. Sílvia Regina Caminada de Toledo
Membros da banca examinadora
Profª. Drª Marília de Arruda Cardoso Smith
Profª. Drª Suzana Malheiros
Profª. Drª Carmen Sílvia Bertuzzo
Profª. Drª Maria Isabel de Souza Aranha Melaragno
Suplentes
Prof. Dr. Oswaldo Keith Okamoto
Prof. Dr. Luiz Gonzaga Tone
Curso de Pós-Graduação em Morfologia e Genética da Universidade Federal de São Paulo.
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho:
Aos meus pais (in memorian), Luiz e Ignez, com todo amor, carinho, admiração e eterna
saudade e;
“O valor das coisas não está no tempo em que elas duram, mas na intensidade com que
acontecem. Por isso existem momentos inesquecíveis, coisas inexplicáveis, e pessoas
incomparáveis”
AGRADECIMENTOS
Inicialmente quero agradecer aos meus pais (in memorian) , Luiz e Ignez, pelo imenso amor que sempre me deram, pelo apoio e incentivo em todos os anos de estudo, e por me ensinarem valores essenciais que foram alicerce para me tornar o que sou hoje.
Aos meus amores, Renato e Luiza, por todo amor e carinho, pelo apoio, compreensão, motivação e por fazer todos os dias da minha vida mais felizes.
Ao meu querido irmão, Bruno, pelo companheirismo, amizade e pelos momentos de desabafo.
À minha orientadora, Profª Drª Sílvia Regina Caminada de Toledo, pela oportunidade, compreensão e paciência.
Às minhas queridíssimas amigas do laboratório de Genética do Instituto de Oncologia Pediátrica (IOP) – GRAACC/ UNIFESP: Carolina (Caruuulina), Daniela (Dani), Francine (Fran), Juliana (Ju Loira), Michele (Mi) e Patrícia (Paty) pela amizade que sempre levarei comigo, pelo apoio, companheirismo e momentos de descontração fora e dentro do laboratório.
Aos colegas do laboratório de Genética do Instituto de Oncologia Pediátrica (IOP) – GRAACC/ UNIFESP Indhira, Robson, Gabriela e Fernando pela colaboração e momentos de descontração.
Às doutoras Nasjla Saba-Silva e Andréa Cappellano por toda atenção, paciência e disponibilidade com que sempre me receberam.
À Dra Suzana Malheiros, pela atenção, presteza e carinho com que sempre me tratou.
Ao grupo da Pesquisa Clínica do IOP - GRAACC/ UNIFESP, em especial a Ana Helena, Mariana e Carolina, pela grande ajuda, pela paciência e presteza.
Ao grupo de Fisioterapeutas, Fonaudiólogas e Terapeutas Ocupacionais do IOP - GRAACC/ UNIFESP, em especial a Walkiria, Flávia, Liliana pelo carinho e atenção que sempre me deram e pelo trabalho, com dedicação e carinho, que fazem pelo bem estar e reabilitação dos pacientes.
A todos os profissionais e voluntários do IOP - GRAACC/ UNIFESP pela dedicação e carinho com que cuidam dos pacientes, e por terem contribuído de alguma forma para realização desse trabalho.
Agradeço ao IOP (Instituto de Oncologia Pediátrica) – GRAACC (Grupos de Apoio a Adolescentes e Crianças com Câncer) pela oportunidade.
Às meninas da Disciplina de Genética do Depto de Morfologia e Genética pela receptividade e atenção com que sempre me receberam.
Às minhas amigas Joana e Juliana pelo apoio, companheirismo, incentivo, amizade e momentos de descontração.
À minha amiga, mais do que sobrinha, minha irmã, e eterna bixete, Michelli Arantes, pela amizade, apoio, por sempre estar presente na minha vida tanto nos momentos bons quanto ruins, e pelos momentos de diversão.
Agradeço a CAPES e a FAPESP pela contribuição financeira através da bolsa de doutorado e para o desenvolvimento deste trabalho, respectivamente.
Agradeço a Genesis Genetics Brasil, especialmente Dr Péricles Assad Hassun Filho, pela amizade, por ter acreditado em mim e ter permitido que eu finalizasse este trabalho.
E, finalmente, agradeço todos àqueles que de alguma forma contribuíram direta ou indiretamente para a conclusão desse trabalho.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS...xii
LISTA DE ABREVIATURAS...xiii
RESUMO...xiv
1 INTRODUÇÃO ...1
1.1 Origem ...1
1.2 Epidemiologia...3
1.3 Histopatologia...3
1.4 Classificação ...4
1.5 Apresentação Clínica ...5
1.6 Prognóstico ...6
1.7 Tratamento...6
1.8 Predisposição Genética ...8
1.9 Genética do desenvolvimento e progressão do meduloblastoma ...8
2 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...16
3 OBJETIVOS ...24
3.1 Objetivo geral ...24
3.2 Objetivos específicos ...24
4 MATERIAIS E MÉTODOS...25
4.1 Pacientes ...25
4.2 Extração de RNA e síntese de cDNA...25
4.3 PCR quantitativo em tempo real...26
4.4 Análise estatítica ...26
5 RESULTADOS ...27
5.1 Manuscrito 1: Submetido à revista Journal Pediatric Hematology/Oncology ...27
5.2 Manuscrito 2: Submetido à revista Childs Nervous System ...41
5.3 Manuscrito 3: Submetido à revista Arquivos de Neuro-Psiquiatria...51
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE ABREVIATURAS
ASPM abnormal spindle-like microcephaly associated
CGI camada germinal interna EGL camada granular externa FCE fluido cerebroespinhal IGL camada germinal interna
LCE líquido cérebro espinhal M doença metastática
MYC avian myelocytomatosis viral oncogene homolog
MYCN avian myelocytomatosis viral-related oncogene, neuroblastoma-derived PCG células precursoras de células granulares
PNET tumor neuroectodérmico primitivo
PRAME preferentially expressed antigen of melanoma
RM ressonância magnética SHH Sonic Hedgehog
SNC sistema nervoso central
TERT transcriptase reversa da telomerase
WHO World Health Organization
RESUMO
1 INTRODUÇÃO
Meduloblastoma é o tumor maligno cerebral mais comum em crianças, compreendendo 20% dos tumores primários de sistema nervoso central (SNC) e 40% dos tumores de origem cerebelar da infância (Pizzo & Poplack, 2007). Em 1925, Bailey e Cushing descreveram pela primeira vez o meduloblastoma como um tumor de origem primitiva que surge na fossa posterior de crianças mais jovens. Geralmente, o meduloblastoma surge a partir do vermis cerebelar no topo do quarto ventrículo e somente uma pequena porção de crianças mais velhas apresenta desenvolvimento desse tumor no hemisfério cerebelar (Bailey et al, 1995; Pizer & Clifford, 2008). Resultado de sua semelhança histológica com outros tumores de SNC, alguns autores criaram o termo: tumor neuroectodérmico primitivo (PNET) que incluem o meduloblastoma (80% dos PNET) e os tumores que ocorrem na região supratentorial do cérebro (Hart & Earle, 1973; Gilbertson & Ellison, 2008; Pizer & Clifford, 2008).
O meduloblastoma é um tumor com tendência metastática e pode apresentar doença disseminada, ao diagnóstico, na via do fluido cerebroespinhal (FCE), em 11-43% dos casos, e em 5% dos casos há evidências de metátases fora do FCE sendo ossos e medula óssea (estágio M4) os sítios mais comuns, justificando 80% das metástases extraneurais (Pizzo & Poplack, 2007; Crawford et al, 2007, Pizer & Clifford, 2008). A maioria dos tumores metastáticos e recorrentes é resistente as abordagens terapêuticas atuais (Grotzer et al, 2009). Aproximadamente 10 a 15% dos pacientes morrem da doença em dois anos após o diagnóstico, enquanto 60% deles são curados (Polkinghorn et al, 2007).
1.1 Origem
cerebelar, as células precursoras de células granulares (PCG) interagem com as células de Purkinje. Após esse evento, PCG migram através das células de Purkinje para a camada germinal interna (CGI) onde interrompem seu ciclo celular e se diferenciam em células granulares maduras, que são as células neuronais mais abundantes no cerebelo (Figura 1). Tumores embrionários, como meduloblastoma, surgem através de alterações nesse processo de desenvolvimento normal.
O meduloblastoma se origina, na maioria das vezes, a partir de resíduos do neuroectoderma primitivo no teto do quarto ventrículo, algumas vezes invadindo através do epêndima, o assoalho do ventrículo para o dentro do tronco cerebral. Menos comumente o tumor surge no hemisfério cerebelar (Raffel, 2004)
através da camada de Purkinje indicam a migração das PCGs. Figura traduzida de: Grimmer & Weiss, 2006.
1.2 Epidemiologia
Segundo dados do registro de tumores do sistema nervoso central dos Estados Unidos, a incidência de meduloblastoma em pacientes até 19 anos atinge 0,48 (sexo feminino) a 0,75 (sexo masculino) por 100.000 pacientes por ano.O meduloblastoma ocorre na primeira década de vida com dois picos de incidência entre três e quatro anos; e oito e nove anos de idade, embora também possa ocorrer em adultos com incidência inferior a 1% dos tumores de SNC (Crawford et al, 2007; Pizer & Clifford, 2008). Entre os jovens adultos (20-34 anos) sua incidência é mais alta 0,17-0,19 por 100.000 pacientes por ano (Crawford et al, 2007; Smee & Williams, 2008), declinando progressivamente para 0,05 por 100.000 pacientes por ano em grupos de 65-74 anos (Smee & Williams, 2008). Em todos os grupos, indivíduos do sexo masculino são mais freqüentemente afetados do que do sexo feminino, com índice de 1,7:1, respectivamente (Crawford et al, 2007; Pizer & Clifford, 2008; Smee & Williams, 2008) e, esses tumores são 1,75 vezes mais comuns em pessoas brancas do que em negras (Crawford et al, 2007).
1.3 Histopatologia
dos casos, respectivamente. (Eberthart et al, 2002 ; McManamy et al, 2007; Gilbertson & Ellison, 2008; Pizer & Clifford, 2008). Alguns tumores podem apresentar histologia mista por possuírem características histológicas sobrepostas, por isso são denominados meduloblastomas de grandes células/ anaplásico, sendo as duas variantes relacionadas à prognóstico desfavorável (Gilbertson & Ellison, 2008; Takei et al, 2009; von Hoff et al, 2010).
Figura 2: Variantes histológicas de meduloblastoma. (a) Meduloblastoma clássico. (b) Meduloblastoma nodular/desmoplásico. (c) Meduloblastoma anaplásico. (d) Meduloblastoma de grandes células. Anaplasia caracteriza outras regiões desta variante. Figura resumida e traduzida de: Gilbertson & Ellison, 2008.
1.4 Classificação
cirurgia) (Pizer & Clifford, 2008). São considerados pacientes de alto risco, aqueles com idade superior ou igual a três anos com evidência de metástase no líquido cérebro espinhal (LCE) (M1-M3) e/ou ressecção incompleta, e idade inferior a três anos ao diagnóstico (Pizer & Clifford, 2008).
A classificação de Chang et al (1969) é usada para doença metastática (M). Neste sistema, há necessidade da análise do LCE e imagem por ressonância magnética (RM) do cérebro e da espinha dorsal (Crawford et al, 2007, Pizer & Clifford, 2008). A avaliação de LCE para doença disseminada é fundamental, pois até 10% dos adultos e 30% de crianças apresentam doença disseminada (Packer et al, 2003). O estágio M0 significa que não há evidência de doença disseminada, enquanto M1 indica que há células malignas no LCE. Pacientes com doença metastática observada em RM são classificados como M2-M3, sendo M2 (cérebro) e M3 (espinha) (Chang et al, 1969; Crawford et al, 2007, Pizer & Clifford, 2008) e, finalmente, M4 determina doença disseminada em região extraneural, a qual é geralmente encontrada em crianças e em menos que 5% dos pacientes com meduloblastoma (Pizer & Clifford, 2008).
Atualmente, avanços nos estudos desses tumores têm permitido melhorar o prognóstico de eventos clínicos baseado na expressão de alguns genes. Isso também induz a uma nova e confiável classificação terapêutica pois reúne várias informações: achados clínicos e subtipos histológicos assim como perfis de expressão gênica e protéica. Tudo isso é utilizado em planejamentos de tratamento mais específicos, para os pacientes com meduloblastoma (Pizer & Clifford, 2008, Takei et al, 2009).
1.5 Apresentação Clínica
semanas (Pizer & Clifford, 2008). Envolvimento da lateral do cerebelo é raro em crianças quando comparadas aos adultos (10% vs 50%) e pode induzir à ataxia apendicular mais óbvia e dismetria. O lobo floculonodular é afetado, ocasionalmente, resultando em desequilíbrio e alteração no movimento ocular (Crawford et al, 2007). Exame de fundo de olho pode detectar papiloedema que são comuns em pacientes com pressão intracraniana por isso deve ser realizado em todas as crianças que apresentam sinais e sintomas que implicam em lesões de fossa posterior (Crawford et al, 2007). Além disso, Halperin et al (2000) demonstraram que há uma relação inversa entre a duração do sintoma e o estágio do meduloblastoma. Ocasionalmente, os pacientes podem apresentar dores nas costas ou fraqueza de membros inferiores como manifestações de metástases espinhais (Pizer & Clifford, 2008).
1.6 Prognóstico
Os eventos gerados em crianças com meduloblastoma estão intimamente ligados à idade do paciente e extensão da doença ao diagnóstico. O pior prognóstico observado em crianças mais jovens está, associado aos efeitos da radioterapia resultado das severas seqüelas neurológicas do tratamento em cérebro jovem em desenvolvimento (Pizer & Clifford, 2008). Os estágios M1, M2 e M3 conferem piores prognósticos, no entanto M2 e M3 são os mais críticos (Pizer & Clifford, 2008). Entretanto crianças menores que 3 anos e com M1 devem ser consideradas de alto risco e com progressão da doença, por isso devem ser tratadas similarmente àquelas com doença em M2 e M3 (Sanders et al, 2008).
1.7 Tratamento
cinco anos de crianças com idade superior a três anos sem doença disseminada fica entre 75 e 90% (Packer et al, 1999; Rood et al, 2004).
Pacientes com ressecção subtotal, especialmente biópsias, possuem prognóstico menos favorável que aqueles que tiveram ressecção completa ou próxima disso (Albright et al, 1996). Entretanto, 20% dos pacientes, principalmente crianças mais jovens, sofrem com um problema pós-operatório chamado síndrome da fossa posterior (mutismo acinético) que é caracterizado por mutismo, fraqueza dos membros, mudanças de personalidade, movimentos involuntários e paralisia do nervo cranial (Pizer & Clifford, 2008).
A radioterapia crânio-espinhal permanece como o tratamento mais efetivo para o meduloblastoma. Pacientes, com idade entre três e 21 anos sem doença disseminada, tratados com radioterapia tem sobrevida superior a 80% em três anos (Macdonald, 2008). Entretanto, há uma resistência em irradiar crianças muito jovens, especialmente às menores de três anos, por causar seqüelas neurológicas em cérebro jovem em desenvolvimento (Macdonald, 2008; Pizer & Clifford, 2008).
Frente aos danos causados pela radioterapia, a quimioterapia como única opção de tratamento tem sido extensivamente adotada em crianças com menos de três anos e em alguns casos em crianças com menos de seis anos (Macdonald, 2008). Porém, a quimioterapia tem sido relativamente desapontadora, resultando, no controle da doença, somente em 20 a 30% dos pacientes (Macdonald, 2008). Desse modo, tem sido sugerido por alguns centros de estudos o tratamento combinado de radio e quimioterapia, com a irradiação de forma moderada e intensa (Gulino, 2008). Em um desses estudos, houve uma significante melhora com sobrevida livre de evento em três anos de 74% nos casos de pacientes com meduloblastoma de baixo risco, quando comparados aqueles somente tratados com radioterapia (64%) (Pizer & Clifford, 2008).
1.8 Predisposição Genética
Apenas uma pequena porção de meduloblastoma, menos de 5%, estão associados à predisposição familial (Pizer & Clifford, 2008). Nesses casos, o meduloblastoma surge como característica da síndrome de Li-Fraumeni, síndrome de Gorlin (1-2% dos pacientes) e síndrome de Turcot ( 40% dos pacientes) (Crawford et al, 2007, Pizer & Clifford, 2008). Essas síndromes são causadas por mutações nos genes TP53, PTCH e MLH1, respectivamente (Gilbertson & Ellison, 2008; Macdonald, 2008; Pizer & Clifford, 2008). Os genes MLH1 e PTCH representam componentes chaves das vias de sinalização celular Wnt/Wingless (WNT) e Sonic Hedgehog (SHH), respectivamente. Essas duas vias são essenciais no desenvolvimento cerebelar e neural normal e são ativadas de forma anormal em meduloblastoma.
1.9 Genética do desenvolvimento e progressão do meduloblastoma
O meduloblastoma é um tumor geneticamente heterogêneo. Várias alterações citogenéticas e moleculares associadas a essa neoplasia já foram descritas e muitas podem ajudar na melhoria da estratificação da doença e no desenvolvimento de novos caminhos terapêuticos. O modelo hipotético da patogênese do meduloblastoma consiste em eventos primeiramente de iniciação em que estão incluídos SHH, Wnt/Wg, Notch e, subsequentemente, eventos de progressão tumoral em que estão alterações do cromossomo 17, amplificação de MYC/MYCN, TERT e outros (Korshunov et al, 2008).
meduloblastoma clássico, pode servir como indicador de bom prognóstico. Uma vez que a -catenina, marcador de ativação dessa via, atua como marcador independente de bom prognóstico atingindo 90% de sobrevida global (Pizer & Clifford, 2008).
Outra via, tão importante quanto as duas anteriores, é a Notch. Assim como as SHH e Wnt/Wg, ela também possui função importante no desenvolvimento embrionário (Crawford et al, 2007). Notch é um receptor altamente conservado que medeia a sinalização intercelular entre células adjacentes. Está envolvido no destino da determinação e no padrão de formação durante o desenvolvimento, na proliferação e sobrevivência celular (Guessous et al, 2008). Existem quatro membros da família Notch, Notch 1, 2, 3 e 4. Notch-1 é mais expresso em células pós divisão celular; e Notch-2, que é detectado em células progentitoras proliferativas em meduloblastoma e está relacionado a um pior prognóstico para esses pacientes (Crawford et al, 2007, Guessous et al, 2008). Notch1 e 2 possuem efeitos opostos no crescimento do meduloblastoma (Guessous et al, 2008). A expressão truncada de ambos, constitutivamente, ativa Notch1 e Notch2 em linhagens celulares de tumores cerebrais embrionários, incluindo o meduloblastoma, causando efeitos antagônicos no crescimento tumoral (Guessous et al, 2008).
Quanto ao aspecto citogenético, as alterações cromosômicas mais comuns são: perda da heterozigose do braço curto do cromossomo 17 (17p), que ocorre individualmente ou em associação com ganho de 17q (isocromossomo 17q presente em 30-50% dos casos) (Kagawa et al, 2006; Pizer & Clifford, 2008; Pfister et al, 2009; Takei et al, 2009). Outras alterações menos comuns, mas também muito observadas são: perda dos cromossomos 8, 9, 10q, 11, 16q, ganho do cromossomo 7 (cada um em mais de 20% dos casos) (Kagawa et al, 2006; Pizer & Clifford, 2008). Deleções de 6q ou monossomia do cromossomo 6 também são observadas e são associadas com bom prognóstico (Pfister et al, 2009).
A amplificação gênica e o aumento de expressão de alguns oncogenes também estão presentes em meduloblastoma e, estão associados a um pior prognóstico. Entre eles, encontramos os membros da família MYC (MYCN, MYC e MYCL), principalmente,
MYC e MYCN; o receptor de tirosina quinase, ERBB2; transcriptase reversa da telomerase
um novo gene, ASPM, em linhagens de células neuroepiteliais transformadas e tumores, vem chamando atenção (FISH et al, 2006).
ERBB2 é um membro da família de receptor de fator de crescimento epidermal, também conhecido como HER2/neu. Ele está expresso em até 86% dos meduloblastomas e sua expressão está associada a um pior prognóstico e a presença de metástase. O aumento de sua expressão induz a migração celular e aumenta a expressão de genes prometastáticos em meduloblastoma (Guessous et al, 2008). Os fatores de transcrição,
OTX1 e OTX2, são essenciais para o desenvolvimento cerebelar. O aumento de expressão de OTX2 foi identificado em meduloblastoma anaplásico de grandes células, sugerindo um potencial alvo para terapias gênicas (Di et al, 2005). Outro estudo correlacionou a expressão de OTX1 com o subtipo de meduloblastoma desmoplásico e
OTX2 com subtipo clássico, onde a expressão foi observada em 80% dos casos (de Haas et al., 2006).
A) MYC/MYCN
Geralmente, membros da família MYC estão envolvidos no desenvolvimento de muitos tumores humanos, pois estão desregulados no processo tumorigênico. MYC pode ser ativado de forma alterada por amplificação gênica (Nesbit et al, 1999), translocação cromossômica e rearranjo do DNA (Janz, 2006), aumento da regulação transcricional (Henderson et al, 2002) e mutação de ponto (Pasqualucci et al, 2001), todos induzem o aumento da expressão constitutiva do oncogene.
Em meduloblastoma, a expressão de MYC é observada em até 64% dos casos (Guessous et al, 2008), porém sua amplificação (MYC ou MYCN) tem sido considerada evento incomun (< 10-15%) nessa neoplasia (Aldosari et al, 2002; Guessous et al, 2008; Pizer & Clifford, 2008; Takei et al, 2009). Em pacientes de alto risco este índice sobe para 17% de amplificação (Eberhart et al, 2002). A expressão elevada de MYC nesses tumores pode ocorrer sem a amplificação do oncogene (Kagawa et al, 2006). Estudo em 2009 demonstrou que aproximadamente 64% dessa neoplasia apresentaram nível-baixo de número de cópias de MYC (> 2 e < 5 cópias), principalmente, nas variantes clássicas e nodulares (Takei et al, 2009). Nesse mesmo estudo, observou-se um aumento na sobrevida de pacientes com menor do que cinco vezes número de cópias desse oncogene (Takei et al, 2009).
Eberhart et al (2004) investigaram a expressão de MYC e MYCN em MB e verificaram a expressão de 31% e 68%, desses oncogenes, respectivamente. Tanto a expressão quanto a amplificação desses oncogenes têm sido associadas a prognóstico desfavorável e, principalmente, observada no subtipo anaplásico/ grandes células (Eberhart et al, 2004; Kagawa et al, 2006; Stearns et al, 2006; Guessous et al, 2008; Pizer & Clifford, 2008). Aldosari et al (2002) observaram que a amplificação concomitante de
A amplificação de MYCN (mapeado em 2p24) comprovou ser um fator prognóstico independente para identificação de rápida progressão tumoral e indicação de prognóstico ruim independente da idade ou estágio clínico da doença ao diagnóstico (Brodeur et al, 1984; Seeger et al, 1985; Look et al, 1991; Yoshimoto et al, 1999). Além disso, MYCN é regulado positivamente pela via SHH e media os efeitos da ativação dessa mesma via na proliferação de células precursoras granulares cerebelares (Kenney et al, 2003; Oliver et al, 2003; Eberhart et al, 2004). Amplificação de MYCN e mutações em SHH são eventos relativamente comuns em meduloblastoma e sugestão de Browd et al (2006) é que ambos agem sinergicamente para promover a formação desse tumor, já que amplificação de
MYCN sozinho não seria suficiente para que o processo de tumorigênese fosse iniciado.
MYC, localizado em 8q24.12-q24.13, também coopera com SHH pois aumenta a tumorigenicidade de células precursoras presentes no cerebelo ao nascimento, podendo assim dar origem ao meduloblastoma (Rao et al, 2003).
O aumento de expressão e a atividade de MYC em meduloblastoma estão associados primeiramente com progressão e agressividade tumoral, embora alguns estudos com outros tumores já tenham demonstrado que somente o aumento de expressão deste oncogene já é capaz de induzir a transformação tumoral como foi visto em linfomas (Adams et al, 1985; Jamerson et al, 2004). Em outros casos, como em câncer de mama, ele está associado à agressividade mas é insuficiente para causar a tumorigênese, sozinho (Stearns et al, 2006). Outros genes e vias podem, juntamente com MYC, desempenhar função na progressão de meduloblastomas, tais como TERT, OTX2,
ERBB2, etc (Stearns et al, 2006). Embora, vários trabalhos associem a expressão de MYC com agressividade tumoral, os genes alvos de MYC e o mecanismo que faz com que ele torne o meduloblastoma mais agressivo ainda não estão bem explicados (Guessous et al, 2008).
B) TERT
TERT, localizado em 5p15.33, possui íntima associação com a telomerase e sua expressão é elevada em células tumorais apesar de silenciosa na maioria das células humanas, o que resulta no encurtamento telomérico progressivo em cada divisão celular, induzindo a senescência replicativa (Drissi et al, 2001; Kyo et al, 2008). Basicamente, a superação da erosão dos telômeros, denominada crise, acontece com a ativação da expressão de TERT ou de vias alternativas que permitem o alongamento telomérico (Drissi et al, 2001). Para alguns tipos celulares, basta apenas a expressão ectópica de
TERT para escapar da senescência e da crise, o que induziria a imortalização celular (Drissi et al, 2001).
Embora TERT não seja um oncogene clássico, está envolvido em vários processos oncogênicos, promovendo a tumorigênese, regulação transcricional, reparo de DNA, e ativação de amplificação gênica (Yoshimoto et al, 2006). Em muitos tumores, a atividade anormal da telomerase, presente em aproximadamente 90% dos cânceres humanos (Kyo et al, 2008), sustenta o crescimento tumoral pois possibilita a quebra do bloqueio replicativo com o encurtamento dos telômeros, aumentando o potencial proliferativo celular. Esta função da telomerase a destaca para ser utilizada em diagnóstico e como alvo ativo em estratégias de tratamento (Kyo et al, 2008; Flores et al, 2006) e também faz com que ela esteja associada a eventos clínicos desfavoráveis (Fan et al, 2003). Há estudos que revelam que a telomerase pode aumentar a proliferação e sobrevida celular independente do comprimento telomérico (Flores et al, 2009).
Um dos fatores reguladores da ativação de TERT é o gene MYC. Muitos estudos têm revelado que MYC é capaz de ativar a transcrição de TERT, através da ligação de MYC no sítio E-boxes (CACGTG) localizado na região promotora de TERT (Kyo et al, 2008). Por isso, o oncogene MYC tem sido considerado regulador chave da transcrição de
Tumores cerebrais foram um dos primeiros sistemas nos quais a atividade da telomerase foi relacionada com a malignidade (Didiano et al, 2004; Kotoula et al, 2004). Sua atividade foi identificada em glioblastoma, astrocitoma anaplásico, oligodendroglioma e meningioma (Didiano et al, 2004). Em meduloblastoma, Yoshimoto et al (2006), sugiram que a amplificação de TERT estaria associada à agressividade e progressão desse tumor. Não somente a amplificação desse gene, mas também sua expressão elevada ou mesmo o aumento da atividade da telomerase estão relacionados com fatores clínicos em vários tipos de tumores incluindo tumor de Wilms, linfoma, câncer de mama, câncer de pulmão de células pequenas e carcinoma urotelial (Fan et al, 2003).
C) ASPM
O gene ASPM (abnormal spindle-like microcephaly associated), localizado no cromossomo 1, em 1q31, desempenha função muito importante na neurogênese e proliferação celular durante o desenvolvimento cerebral. Além de estar envolvido na formação apropriada de forma central e simétrica dos fusos mitóticos em células de mamíferos (Kouprina et al, 2004; Fish et al, 2006; Hagemann et al, 2008), mutação nesse gene é a causa mais comum de microcefalia primária em humanos, indicando uma função direta na regulação do tamanho do córtex cerebral (Zhang et al, 2003; Kouprina et al, 2004). Enquanto a expressão reduzida de ASPM está correlacionada com o aumento da instabilidade cromossômica, o aumento de sua expressão está associado a linhagens de célulares transformadas e tumores (Hagemann et al, 2008). Dois grupos em 2005 demonstraram que ASPM está expresso em todas as linhagens celulares transformadas e também em vários tecidos fetais (Kouprina et al, 2005; Roads et al, 2005). Todos esses achados sugerem que ASPM desempenha importante função na progressão e na proliferação celular, no desenvolvimento embrionário e na tumorigênese.
D) PRAME
No intuito de criar terapias mais efetivas e menos tóxicas, recentes avanços no campo da imunologia têm oferecido novos caminhos para o tratamento de tumores, incluindo meduloblastoma, tornando o tratamento menos complicado e agressivo, como exemplo as imunoterapias (Oba-Shinjo et al, 2008).
A imunoterapia, em casos de tumores pediátricos de sistema nervoso central, é uma opção de tratamento atraente devido a sua leve toxicidade, e porque o sistema imune de crianças é mais potente e flexível do que de adultos (Mackal et al, 1995; Heitger et al, 2000).
Os antígenos tumorais, tais como PRAME (preferentially expressed antigen of
melanoma), representam alvos ideais para as imunoterapias devido à baixa ou ausência de expressão em tecidos normais e sua extensa presença em vários tumores. Entretanto, é raro encontrar antígeno adequado para tratamento mais específico.
PRAME foi descoberto em melanoma e é responsável por desencadear resposta imune mediada por células T citotóxicas por linfócitos autólogos (Ieda et al, 1997). Além disso, é frequentemente expresso em vários tumores sólidos incluindo neuroblastoma e medulloblastoma (Oberthuer et al, 2004; Epping et al, 2006) . Em neuroblastoma, a expressão de PRAME é muito comum e sua surpexpressão está associada com avanço da doença e prognóstico desfavorável.
Assim, mediante estudos realizados com PRAME no laboratório de Genética em outros tipos tumorais, concomitante às análises feitas neste trabalho, realizamos estudos com PRAME em meduloblastoma.
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3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Analisar a expressão gênica de ASPM, MYC, MYCN e TERT genes envolvidos no desenvolvimento e na progressão de meduloblastomas, e de PRAME, gene que codifica antígeno tumoral que pode ser ideal em imunoterapia, com a finalidade de identificar marcadores tumorais que possam ser utilizados como alvos terapêuticos em tratamentos mais específicos.
3.2 Objetivos específicos
1) Investigar a expressão de genes envolvidos na progressão de tumor: MYC, MYCN e
TERT em amostras de fragmentos tumorais de meduloblastoma em crianças;
2) Verificar a associação da expressão de cada um dos genes acima citados, individualmente, com parâmetros clínicos dos pacientes;
3) Verificar a associação da expressão concomitante dos genes acima citados com parâmetros clínicos dos pacientes;
4) Investigar a expressão do gene associado com desenvolvimento tumoral ASPM em amostras de fragmentos tumorais de meduloblastoma em crianças;
5) Verificar a associação da expressão de ASPM com parâmetros clínicos dos pacientes;
6) Investigar a expressão do gene que codifica antígeno tumoral PRAME em amostras de fragmentos tumorais de meduloblastoma em crianças;
4 MATERIAIS E MÉTODOS
Os materiais e métodos descritos a seguir foram os mesmos para os três trabalhos que foram realizados.
4.1 Pacientes
Foram analisadas 37 amostras de fragementos de meduloblastomas provenientes de pacientes com média de idade de oito anos, atendidos pelo Instituto de Oncologia Pediátrica (IOP)/ Grupo de Apoio ao Adolescente e Criança com Câncer (GRAACC)- Unifersidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Termo de consentimento foi obtido de todos os pacientes e arquivados de acordo com a Universidade (CEP/UNIFESP N° 1120/01). Todos os pacientes foram classificados segundo a Organização Mundial de Saúde (WHO- World Health Organization), sendo que M (estágio metastático), inclui M0, pacientes sem doença metastática; M1, pacientes com células malignas no líquido cérebro espinhal; M2, pacientes com células malignas no cérebro; M3, pacientes com células malignas na espinha; e por último M4, pacientes com células malignas na região extraneural (osso e medula óssea).
4.2 Extração de RNA e síntese de cDNA
4.3 PCR quantitativo em tempo real
Os oligonucleotídeos para os genes estudados nos três trabalhos foram desenhados em Software Primer Express da Applied Biosystems, garantindo que sequências forward e reverse fossem construídas em exóns diferentes. Depois de desenhandos, os primers eram colocados no BLAST para conferir a especificidade do gene total das sequências escolhidas como primers. A reaçãode amplificação de PCR quantitativa em tempo real e a análise dos dados foram realizados no ABI Prism 7500 Sequence Detector System da Applied Biosystems. Cada amostra de cDNA foi misturada a 12µl de mastermix (SYBR Green PCR Máster mix, Applied Biosystems). As condições de ciclagem consistiam em dois passos simples de 50°C e 95°C por 2min e 10min, respectivamente, seguindo por 40 ciclos para mplificação de 95°C por 15s e 60°C por 1min para anelamento e elongação. Todos os experimentos foram realizados em triplicata para todos os genes estudados e também o gene endógeno. Para cada sequência, uma curva padrão foi cosntruída a fim de determinar a sensibilidade do teste. A partir dos dados foi obtida a média em cada reação. A expressão reltiva foi automaticamente calculada e analisada de acordo com o método 2- Ct, descrito previamente. HPRT foi usado como gene housekeeping a fim de padronizar seu nível de expressão relativa com os níveis de expressões relativas dos três genes estudados. Controle com duas amostras de tecido cerebral normal foi incluído em cada reação de amplificação tão bem como RNA de referência. A eficiência da PCR dos genes estudados eram de 95%.
4.4 Análise estatítica
para analisar as expressões gênicas e as variáveis clínicas. Dados categóricos foram estudados por Qui-quadrado e Exato de Fisher aplicando o software VassarStats. Em todos os casos, p<0.05 foi considerado como estatisticamente significante.
5 RESULTADOS
Com o objetivo de ordenar os assuntos abordados, apresentamos nosso estudo na forma de trabalhos científicos.
5.1 Manuscrito 1: Submetido à revista Journal Pediatric Hematology/Oncology
Combining MYC, MYCN and TERT gene expression profiles and clinical
parameters in medulloblastomas
Tânia Maria Vulcani-Freitas1,3; Njasla Saba-Silva, 1; Andréa Cappellano, 1; Sérgio Cavalheiro2; Sílvia Regina Caminada de Toledo1,3.
1Institute of Pediatric Oncology (GRAACC), Pediatric Department – Federal University of
São Paulo, São Paulo, Brazil; 2Neurology and Neurosurgery Department – Federal University of São Paulo, São Paulo, Brazil; 3Morphology and Genetic Department – Federal University Of São Paulo, São Paulo, Brazil
Silvia Regina Caminada de Toledo Rua Botucatu, 743, 8° andar
Vila Clementino, São Paulo-SP, Brazil CEP: 04023-062
silviatoledo@graacc.org.br Telephone: 551150808582 Fax: 551150808480
ABSTRACT
To investigate the expression of genes MYC, MYCN and TERT in tumor fragments of pediatric medulloblastoma and correlate gene expression profiles with clinical parameters. Analysis of gene expression was performed by quantitative PCR real time in 37 tumor samples and correlated with clinical and pathological data. All 37 samples overexpressed
MYCN gene (p= 0.001), 95% and 84% of the samples overexpressed TERT and MYC, respectively (p<0.0001). Twenty nine (78%) of all samples had concomitant high expression of MYC, MYCN and TERT genes together. Seventeen (59%) were high-risk classification, 10 (34%) were metastatic (M+) stage, two (7%) were anaplastic or large-cell/anaplastic subtype, eight (28%) of patients relapsed, beyond thirteen (45%) suffered partial surgical resection. and fourteen (48%) died. We found correlation between MYC,
MYCN and TERT expression (p<0.0001). The identification of a subgroup with concomitant overexpression of the three investigated genes suggests the possibility of using more than one aspect of molecular indicative of unfavorable prognosis that characterizes the group with poor outcome. However, in future this may be enhanced by targeted therapy for the product TERT as proposed in some neoplasms. The identification of molecular events in the medulloblastoma categorization aims to help at-risk groups moving towards individualized medicine.
INTRODUCTION
Medulloblastoma (MB) is the most common malignant solid tumors of central nervous system (CNS) in the childhood and comprises 15-20% of brain tumors of infancy 1,2. Usually, this neoplasm occurs in people under 18 years1 and has two peaks of
incidence between 3 and 4 years and 8 and 9 years old3. The 5-year survival rate after the diagnosis for these children is around 50-60%4. Despite its sensibility to no-specific therapeutic as chemotherapy and radiotherapy, the treatment is very aggressive and frequently results in neurological development and growth deficit, and endocrine dysfunction 2,3.
Currently, the most of main researches aim to understand the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of MB. Many molecular and histopathological biomarkers have been proposed in order to facilitate improved patient management and disease outcome, through the identification of prognostic factors that can guide new therapies, since the aggressiveness of treatments remain associated with poor survival in high-risk disease group (e.g, infant or metastatic disease) and it have a negative impact on long-term survivals5. These studies recognized characteristic cytogenetic or molecular abnormalities in medulloblastoma which can be used as targets in strategies for development of more individualized therapies based on disease-risk and for development of novel therapeutic approaches targeted against specific molecular defects, in order to increase survival and reduce the late effects.
expression plays a key role in cancer-specific telomerase activation, important enzyme to carcinogenesis and cellular immortalization12, 14. The increased activity of telomerase is associated with poor clinical outcomes15.
MYC and TERT are closely correlated. MYC has been considered very important regulator of TERT transcription in the carcinogenesis12, inducing telomerase activity by transcriptional activation of TERT16. As telomere length is a limiting factor in the replicative life span of a cell17, 18, an important function of MYC, during cell proliferation, is maintenance of chromosomal integrity by stimulation of telomerase activity. Thus, increased MYC expression is correlated with increasing TERT RNA expression and telomerase activity19.
Therefore, in order to investigate the association of MYC, MYCN and TERT genes expression profiles with prognosis in MB patients, we investigated the expression profiles of these genes, and correlated with clinical aspects.
MATERIALS AND METHODS
Patients
We selected 37 MBs samples from patients attending the Pediatric Oncology Institute (IOP)/Grupo de Apoio ao Adolescente e a Criança com Câncer (GRAACC) – Federal University of São Paulo (UNIFESP) - Brazil. Informed consent was obtained from all patients/guardians according to the University’s IRB (CEP/UNIFESP Nº0155/06). All MB patients were classified according to the WHO (World Health Organization), as follows: M stage include M1 (tumor cells identified by cerebrospinal fluid (CSF) cytology only), M2 (intracranial metastatic tumor detectable by computed tomography (CT) or magnetic resonance imaging (MRI) and M3 (spinal metastatic tumor detectable by CT myelography or spine MRI)21.
RNA extraction and cDNA synthesis
Amplification Grade (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). The concentration of RNA was
determined by spectrophotometry and total RNA integrity was monitored by visualization of ribosomal RNAs (28S and 18S) on 1.0% agarose gel. One microgram of total RNA derived from 37 MB samples was reverse-transcribed using the SuperScript III Reverse Transcriptase Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) according to the manufacturer’s instructions.
Quantitative Real-Time RT-PCR
Oligonucleotides for MYC, MYCN, TERT and HPRT were designed using Primer Express Software from Applied Biosystems (Foster City, CA, USA), warranting that forward and reverse sequences were in different exons. We conducted a BLAST search to confirm the total gene specificity of the nucleotide sequences chosen for primers. Real-time PCR amplification and data analysis were performed using the ABI Prism 7500 Sequence Detector System Applied Biosystems (Foster City, CA, USA). Each cDNA sample was mixed with 12µl of Mastermix (SYBR® Green PCR Master Mix, Applied Biosystems).
Cycling conditions consisted of two singles steps at 50°C and 95°C for 2min and 10min respectively, followed by 40 cycles of amplification at 95°C for 15s and at 60°C for 1min for annealing and elongation. Experiments were performed in triplicate for both target genes and the endogenous gene. For each sequence, a standard curve was constructed to determine the assay sensitivity. The data were averaged from the values obtained in each reaction. Relative expression was automatically calculated and analysed according to 2- Ct method, described previously22. HPRT (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase) was used as a housekeeping gene in order to standard its relative expression levels with relative expression levels of three genes studied. A no-template control was included in each amplification reaction as well as a reference RNA. The PCR efficiencies of the four genes were comparable ( 95%).
Statistical Analysis
follow-up and relapse. Overall survival was defined as the time from diagnosis until date of either the more recent follow-up or death. Overall survival was generated by applying the Kaplan-Meier method. The t test was used to analyze the gene expression of each gene studied. The Kruskal-Wallis and Mann-Whitney tests were used to analysis the relationship between gene expressions and clinical characteristics. Categorical data were studied using Chi-Square and Fisher's exact test applying software VassarStats (Website for Statistical Computation). In all cases, p<0.05 was considered statistically significant.
RESULTS
All clinical variables are summarized in Table 1. The median age of patients was 8 years (range 5 months to 18 years old). Stages M1, M2 and M3 were included in just one group named M+ 32% (n=12). In the M+ stage was: 68% (n=25) stage M0, 6% (n=2) stage M1, 13% (n=5) stage M2 and 13% (n=5) M3. Eighteen of 37 patients died from disease or resulting complications from therapy and 19 patients were disease-free or in treatment. The most of our samples was classic MB (92%).
MYC was overexpressed in 30 (81%) samples, median 9.2 (p<0.0001) (cutoff 2.0). By analyzing the clinical characteristics of these samples, we observed that 18/30 (60%) were high-risk, two (7%) were anaplastic or large-cell/anaplastic subtype, nine (30%) were relapsed, 15 (50%) died, 11 (37%) were metastatic (M+) stage, beyond that 13 (43%) suffered partial resection of tumor. No statistical association was found between clinical features and MYC overexpression. MYCN was highly expressed in all MB samples, median 31 (p=0.0018) (cutoff 2.0). MYCN overexpression was significantly correlated with died patient group (p=0.008).
TERT overexpression was detected in 35 (95%) samples, median 322, (p=0.0110) (cutoff 2.0). By analyzing the clinical characteristics of these samples, 20/35 (57%) were high-risk, three (9%) were anaplastic or large-cell/anaplastic subtype, eight (23%) were relapsed, 17 (49%) were death, 11 (31%) were all metastatic (M+) stage, beyond that 16 (46%) suffered partial resection of tumor.
Twenty nine (78%) of all samples showed concomitant high expression of MYC,
subtype, eight (28%) of patients relapsed, beyond 13 (45%) suffered partial surgical resection and 14 (48%) died. Statistical analyses found correlation between MYC, MYCN and TERT expression (p<0.0001) (figure 1). However, we not found any relationship between the expression of all three genes studied and the clinical aspects of patients. The results of MYC, MYCN and TERT expression levels from each patient, together with their clinical characteristics are summarized in figure 2. No significant association in MYC,
MYCN and TERT expression and Kaplan- Meier survival curves.
DISCUSSION
Medulloblastoma is the most common solid tumor in children1. In spite of the sophisticated techniques of neurosurgery, radiotherapy and chemotherapy, this tumor has a high mortality rate3,4. Furthermore, the most of the survivors suffer a lost of normal-appearing white matter, an associated decline in intellectual function, growth deficit, and endocrine dysfunction2, 23-27. Usually, the method for stratification of patients between standard and high risk groups is based on age, metastatic stage at diagnosis, and, some studies extent of surgical resection 28-30. Moreover, in order to define different prognostics, histological subtypes are evaluated also24.
Recently, many studies evaluate the significance of molecular prognostic makers in MB children survival. Together, the molecular information and conventional diagnostic would identify patients with aggressive tumors for whom therapies more intensified would be appropriate, those who would survive with less toxic therapies of reduced intensity24. Since MB is heterogeneous disease at histopathological and molecular level, aggressiveness and response to treatment of tumors vary widely from individual to individual5, 31.
We analyze three of genes related with the molecular pathogenesis of MB: MYC,
unusual event (<10-15%) in this tumor2, 6-8 and this rate increases up to 17% in high-risk patients9.
In our study, we observed MYC overexpression in 81% of all samples while others studies reported 64%6. Similarly, MYCN was overexpressed in all our samples and rates higher than 68% found by Eberhart et al (2004)9. However, we did not find any association between MYC expression and clinical parameters. Additionally, we found statistical correlation between MYCN overexpression and died patient group (p=0.008). Moreover, we found a correlation tendency between relapsed patients and MYCN increased expression (p=0.0632).
In the meantime, many types of tumor present abnormal telomerase activity in about 90% of the cases12. This maintains tumor growth and increase potential proliferative cell12, 40, which also allow that telomerase be associated with dismal clinical outcomes15.
Therefore, we verify their expression and correlated with clinical aspects, individually and associated with each other. Our studied showed TERT overexpression in 95% of samples. It was much higher than reported by Fan et al (2003) that showed 42%15. Despite of increased expression, we just found correlation between TERT expression and relapse (p<0.05). There was statistical significance between the expression of the three genes studied (p<0.0001), however any association was found between concomitant expression of the genes and the clinical features evaluated. Nevertheless, due to the important roles played by these three genes in the tumorigenesis process, the presence of overexpression profiles could be collaborating for a poor clinical outcome.
The correlation between TERT mRNA expression and telomerase activity is not stronger enough42. This can be partly due to post-translation modification but also results of the formation of splice variants. There are, at least, four of these variants that can likely to alter protein activity43, 44. Although MYC has direct action in the TERT promoter region, the TERT control is undoubtedly very complex and likely a number of other transcription factors influence its expression12, 45. Hence, we could not find any association between
