UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Programa de pós-graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia
EFEITOS ANTI-INFLAMATÓRIO E ANTITUMORAL DOS
CONSTITUINTES DE
Qualea grandiflora
NO TUMOR DE
EHRLICH
Marcela Bassi Quilles
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Programa de pós-graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia
EFEITOS ANTI-INFLAMATÓRIO E ANTITUMORAL DOS
CONSTITUINTES DE
Qualea grandiflora
NO TUMOR DE EHRLICH
Doutoranda:
Marcela Bassi Quilles
Orientadora
: Profa. Dra. Iracilda Zeppone Carlos
Outubro 2013
Tese apresentada ao Programa em Biociências e Biotecnologia Aplicas à Farmácia (área de Imunologia), da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual Paulista, como requisito parcial para
A Deus, que desde o início dessa caminhada, Tu estavas presente. Vitórias foram conquistadas. Derrotas foram superadas. Amizades foram criadas. Conhecimentos foram adquiridos. ..e agora que alcancei meu objetivo, venho lhe agradecer humildemente a vitória desse momento. Obrigada Senhor !
Agradeço a minha mãe, amigos e ao meu marido, que sempre estiveram ao meu lado Agradeço pelo seu apoio quando mais precisei de paciência, compreensão, atenção e amor. Esta conquista sem dúvida também é de vocês. Obrigada por tudo!!!
A minha Querida orientadora Iracilda Zeppone Carlos, pela confiança depositada e pela paciência dispensada. Obrigada !
Aos colegas de trabalho que fizeram os momentos difíceis mais agradáveis com palavras de conforto e ânimo, e por toda ajuda para término deste trabalho.
A Marisa Campos Polesi Placeres por toda a ajuda e amizade.
RESUMO
% de inibição. A análise histológica tumoral demonstrou elevado pleomorfismo celular, estroma escasso, infiltrado composto predominantemente por células mononucleares além de numerosas figuras mitóticas em diversas regiões. Quanto às análises sobre a presença do numero de mitoses por campo, houve significativa inibição das mitoses com os tratamentos realizados se comparado com o controle PBS. Por fim a determinação da angiogênese nos tumores mostrou que não houve diferença estatística entre a droga padrão TX e os tratamentos com os derivados de Q. grandiflora, no entanto os tumores tratados com o controle PBS apresentaram grande aumento de proliferação de vasos se comparado às substâncias testadas. Baseados nesses resultados foi possível verificar uma importante atividade anti-inflamatória e antitumoral do uso dos constituintes de Q. grandiflora frente a droga padrão padrão TX, principalmente o EH.
ABSTRACT
control. Finally the determination of angiogenesis in tumors showed no statistical difference between the TX and the standard drug treatments derivatives of Q. grandiflora, however the tumors treated with PBS control showed a large increase in vessel proliferation compared to the tested substances. Based on these results we observed a significant anti-inflammatory activity and the use of antitumor constituents of Q. grandiflora against standard drug TX standard, especially the EH.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Árvore de Qualea grandiflora... 40
Figura 2: Viabilidade de macrófagos e células tumorais de Ehrlich frente ao extrato
hexânico (EH)... 53
Figura 3: Viabilidade de macrófagos e células tumorais de Ehrlich frente a fração
terpênica (FT)... 54
Figura 4: Viabilidade de macrófagos e células tumorais de Ehrlich frente ao β-
sitosterol (BS)... 56
Figura 5: Viabilidade de macrófagos e células tumorais de Ehrlich frente ao taxol
(TX)... 58
Figura 6: Produção de fator de crescimento vascular endotelial nas células tumorais
de Ehrlich expostos as substâncias... 60
Figura 7: Porcentagem de células em apoptose no tumor de Ehrlich pelo teste de
ANEXINA V... 62
Figura 8: Porcentagem de células em apoptose no tumor de Ehrlich pelo teste de
ANEXINA V... 63
Figura 9: Porcentagem de células em apoptose no tumor de Ehrlich pelo teste de
TUNEL ... 6364
Figura 10: Porcentagem de células em apoptose no tumor de Ehrlich pelo teste de
TUNEL... 65
Figura 11: Produção de óxido nítrico em macrófagos peritoneais estimulados com
LPS e expostos as substâncias... 66
Figura 12: Inibição da produção de TNF-α em macrófagos peritoneais estimulados
com LPS e expostos as substâncias... 67
Figura 13: Inibição da produção de IL-1 em macrófagos peritoneais estimulados com
LPS e expostos as substâncias... 68
com LPS e expostos as substâncias... 69
Figura 15: Inibição da produção de IL-6 em macrófagos peritoneais estimulados com
LPS e expostos as substâncias... 71
Figura 16: Inibição do crescimento tumoral de Ehrlich após os diferentes
tratamentos... 72
Figura 17: Análise Macroscópica do tumor de Ehrlich ... 6373
Figura18: Microscopia do tumor de Ehrlich... 74
Figura 19:Análise microscópica do tumor de Ehrlich... 75
Figura 20: Quantidade de células em mitose nos tumores após os diferentes
tratamentos... 77
Figura 21: Grau de angiogênese tumoral dos tumores após os diferentes
Tabela 1. Viabilidade celular após o tratamento com diferentes concentrações de
EH...55
Tabela 2. Viabilidade celular após o tratamento com diferentes concentrações de
FT...54
Tabela 3. Viabilidade celular após o tratamento com diferentes concentrações de
BS...56
Tabela 4. Viabilidade celular após o tratamento com diferentes concentrações de
TX...58
Tabela 5. Produção de VEGF nas células tumoral de Ehrlich...40
Tabela 6. Produção de NO em macrófagos peritoneais ativados com LPS...66
Tabela 7. Produção de citocinas em macrófagos peritoneais ativados com LPS (0,5µg/mL) e expostos ao EH, FT, BS e TX, concentrações expressa em pg/mL ...71
LISTA DE ABREVIATURAS
°C graus Celsius
µg Microgramas
µL Microlitros
µmols Micromols
ANOVA Análise de variância
BS Β-sitosterol
BSA Bovine serum albumin
CO2 Dióxido de carbono
COX-2 Ciclo-oxigenase-2 DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucleico
ELISA Enzyme linked immunosorbent assay
EH Extrato Hexânico
FT Fração Terpênica
FITC Isotiocianato de fluoresceína HIF-1α Hypoxia-inducible factor 1-alpha iNOS/NOS2 Óxido nítrico sintetase induzível IC50 Concentração inibitória de 50%
IFN- Interferon-gama IL-1β Interleucina 1 beta IL-6 Interleucina 6 IL-12 Interleucina 12
KeE Hiperplasia de células endoteliais
KxX Citologia endotelial
LPS Lipopolissacarídeo
MAGS Sistema de gradação para angiogênese por microscopia
mL Mililitros
MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7 MDA-MB-23 Human breast carcinoma cells
MTT brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2-5-difeniltetrazólico NaCl Cloreto de sódio
NaNO2 Nitrito de sódio
NaOH Hidróxido de sódio
NCTC-132 Natioml Collection of Type Cultures NH4Cl Cloreto de amônio
NHCO3 Bicarbonato de sódio
ng/mL Nanogramas por mililitro
NK Natural killer
Nm Nanometro
NO Óxido nítrico
NOS Óxido nítrico sintetase
PBS Solução salina tamponada com fosfatos pH Potencial hidrogeniônico
PMA Acetato de forbol miristato
RPMI-1640 Roswell Park Memorial Institute (meio de cultura – série 1640) ROI Intermediários reativos do oxigênio
T47D Human ductal breast epithelial tumor cell line
Th1 Tipo de linfócito T helper Th2 Tipo de linfócito T helper TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
TUNEL Terminal deoxynucleotidyl transferase
UV Ultravioleta
SUMÁRIO RESUMO
ABSTRACT
LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS CAPÍTULO 1
1. INTRODUÇÃO.... 23
1.1 Câncer de mama... 25
1.2 Tumor de Ehrlich... 26
1.3 Imunologia Tumoral... 27
1.4 Qualea grandiflora... 32
2. OBJETIVO... 36
2.1 Gerais... 36
2.2 Específicos... 36
3. MATERIAIS E MÉTODOS... 37
3.1 Delineamento experimental... 37
3.2 Obtenção do extrato bruto e fração terpênica de Qualea grandiflora... 38
3.3 Obtenção das Soluções a serem utilizadas nos Ensaios Biológicos... 38
3.4 Animais... 38
3.5 Obtenção de macrófagos do exsudato peritoneal... 39
3.6 Linhagem celular tumoral utilizada e manutenção do tumor de Ehrlich in vivo.. 40
3.7 Inoculação das células tumorais para formação do tumor sólido... 40
3.8 Obtenção das células tumorais de Ehrlich para os ensaios in vitro... 41
3.9 Avaliação da citotoxicidade em cultura de macrófagos... 41
3.10 Avaliação da citotoxicidade em linhagem tumoral de Erhlich... 42
3.11 Análise da angiogênese pela dosagem de VEGF por Teste Imunoenzimático (ELISA)... 43
3.12 Determinação da ocorrência de apoptose em células tumorais por TUNEL... 43
3.13 Determinação da ocorrência de apoptose em células tumorais por Anexina V... 44
3.14 Determinação de Óxido Nítrico (NO)... 45
3.15 Obtenção dos sobrenadantes das culturas de macófagos peritoneais... 46
3.16 Determinação das citocinas TNF-α, IL-1, IL-12 e IL-6... 47
3.17 Protocolo Terapêutico... 48
3.18 Grupos de Estudo... 49
3.19 Avaliação do volume e inibição tumoral... 49
3.20 Análise Histopatológica dos Tumores... 50
3.21 Determinação da presença de mitoses... 50
3.22 Análise da angiogênese pelo Sistema de Gradação para Angiogênese por Microscopia (MAGS)... 50
3.23 Análise dos Resultados... 51
Ehrlich pela técnica de MTT (MOSSMAN, 1983)... 52 4.2 Determinação da produção do fator de crescimento vascular endotelial (VEGF)... 59 4.3 Quantidade de células apoptóticas nos tumores ANEXINA V e TUNEL... 61 4.4 Determinação da inibição de óxido nítrico (NO)... 65 4.5 Determinação da inibição de TNF-α... 67 4.6 Determinação da inibição de IL-1... 68 4.7 Determinação da inibição de IL-12... 69 4.8 Determinação da inibição de IL-6... 70 4.9 Determinação do volume tumoral... 72 4.10 Análise macroscópica e microscópica do tumor... 72 4.11 Determinação de mitoses nos tumores... 75 4.12 Determinação do grau de angiogênese nos tumores... 76
5. DISCUSSÃO... 78
6. CONCLUSÕES... 89
7. REFERÊNCIAS... 91 CAPÍTULO 2
1. INTRODUÇÃO
Uma das maiores causas de morte por câncer se deve ao câncer de mama, mais comum do que o câncer de colo e de útero é relativamente raro antes dos 35 anos, acima desta faixa etária sua incidência cresce rápida e progressivamente. Estatísticas indicam aumento de sua incidência tanto nos países desenvolvidos quanto nos em desenvolvimento. No Brasil, segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA), 52.680 novos casos de câncer de mama foram estimados para 2012 valendo para 2013, com um risco de 52 casos a cada 100 mil mulheres (INCA, 2013).
Diversos modelos experimentais, utilizando linhagens de células tumorais humanas ou murinas, têm sido usados na pesquisa de novos medicamentos para o tratamento dos mais diversos tipos de cânceres, dentre eles o tumor de Ehrlich. (DAWE, 1982; MEI et al., 2012; PEREIRA et al., 2013; SARASWATI et al., 2013).
Nos tratamentos geralmente utilizados incluem a cirurgia, radioterapia e a quimioterapia que são extremamente agressivas podendo até mesmo provocar efeitos deletérios às células do sistema imunológico essenciais ao desenvolvimento de uma resposta imune efetiva (MALIK et al., 2009; FRAZIER et al., 2010). Desta maneira, existe um interesse crescente na descoberta de novos medicamentos destinados ao combate seletivo às células tumorais associados à atividade imunomodulatória (ISRAILIDES et al., 2008; DOUKAS, et al., 2012; CARLI et al., 2013; QUILLES et al., 2013).
contexto, a resposta imunológica é de fundamental importância no desenvolvimento e/ou erradicação de tumores.
Sendo o grande alvo deste estudo, Qualea grandiflora Mart. (Vochysiaceae), popularmente conhecida como pau-terra, pau-terra-do-campo ou ariauá segundo Lorenzi (2002) é uma árvore do cerrado brasileiro de aproximadamente 12 metros de altura, com caule de até 40 cm de diâmetro.
Estudos realizados em nosso laboratório, financiados pelo temático Biota-FAPESP, através de triagem in vitro da atividade farmacológica do extrato clorofórmico de Qualea sp. mostraram que a planta apresenta características anti-inflamatórias através da inibição expressiva da produção dos mediadores imunológicos NO, IL-1 e IL-12 pelos macrófagos peritoneais murinos ativados com LPS e apresenta potencial tóxico às células tumorais (CARLI et al., 2013).
1.1 Câncer de mama
De acordo com o a Organização Mundial da Saúde (OMS) estima-se que, no ano 2030 ocorrerá 27 milhões de novos casos de câncer, sendo 17 milhões de mortes. No Brasil, as estimativas para os anos de 2012 e 2013 apontam a ocorrência de aproximadamente 518.510 casos novos de câncer, sendo um total de 257.870 casos novos para o sexo masculino e 260.640 para o sexo feminino. Confirma-se a estimativa que o câncer da pele do tipo não melanoma (134.000 casos novos) será o mais incidente na população brasileira, seguido pelos tumores de próstata (60.000), mama feminina (53.000), cólon e reto (30.000), pulmão (27.000), estômago (20.000) e colo do útero (18.000) (INCA, 2013).
O câncer de mama, relativamente raro antes dos 35 anos de idade, podem levar alterações na autoimagem, perda funcional, mudanças de nível psíquico, emocional e social nas mulheres acometidas por este (MAKLUF et al., 2006). A doença muitas vezes proporciona uma perda de papéis relacionada ao trabalho, à família e à sexualidade(REDIVO et al., 2008).
O câncer é caracterizado por um acúmulo de alterações genéticas, conferindo à célula a propriedade de evasão dos mecanismos de controle homeostáticos, garantindo sua própria sobrevivência e proliferação (HAHN & WEINBERG, 2002; LEROI et al., 2003). Para o seu surgimento se faz necessário que ocorra todo um processo composto de várias etapas, denominado carcinogênese. O processo de carcinogênese pode ser dividido em quatro fases: iniciação, promoção, manutenção e progressão (FARBER, 1984; CHAMMAS, 2005).
complementares geralmente são necessários, como a radioterapia, quimioterapia e hormonioterapia o que aumenta a possibilidade de cura, e baseiam-se na busca por destruição das células neoplásicas, que têm como característica o fato de se dividirem muito mais rápido que a maioria das células normais. Contudo, podem ocorrer efeitos secundários importantes naquelas células normais de crescimento rápido, como as gastrointestinais, capilares e as do sistema imunológico, causando diarréia, náuseas, vômitos, alopecia e maior suscetibilidade às infecções (MALIK et al., 2009; FRAZIER et al., 2010).
Devido à relativa semelhança entre células malignas e normais do corpo, o grande desafio para o tratamento de cânceres é a distinção entre essas células, desta maneira, existe um interesse crescente na descoberta de novos medicamentos destinados ao combate seletivo às células tumorais (ISRAILIDES et al., 2008; DOUKAS, et al., 2012; QUILLES et al., 2013).
1.2 Tumor de Ehrlich
O tumor de Ehrlich foi descrito por Ehrlich em 1905 (EHRLICH & APOLANT, 1905) e classificado em 1906, como um adenocarcinoma mamário espontâneo de camundongo fêmea. Inicialmente, o tumor foi mantido experimentalmente sob a forma sólida, sendo transplantado em animais da mesma espécie. Somente em 1932, com Loewenthal & Jahn, descreveram pela primeira vez que células obtidas do tumor de Ehrlich, quando implantadas na cavidade peritoneal de camundongos eram capazes de crescer em suspensão e em fluido ascítico (LOEWENTHAL & JAHN, 1932).
animais (GUERRA, 1983). Sendo assim, devido a suas características e fácil manuseio experimental, o tumor de Ehrlich tem sido extensamente aplicado para a chamada oncologia experimental, um ramo da oncologia dedicado ao desenvolvimento dos chamados tumores transplantáveis ou transmissíveis, procurando melhorar o conhecimento das neoplasias que afetam o homem e até mesmo os animais (DAWE, 1982;MEI et al., 2012; PEREIRA et al., 2013; SARASWATI et al., 2013).
Este tumor tem sido utilizado como um modelo para vários estudos, tais como a influência do estresse sobre câncer (PALERMO-NETO et al., 2001, PALERMO-NETO et al., 2003), resposta imunológica ao tumor (SEGURA et al. 2000; PINTO, 2003), efeito antiangiogênico e antiproliferativo (KUMAR et al., 2009; ISLAM, et al., 2012 CHOUGULE et al., 2013), marcadores de proliferação celular (SILVA et al., 2006), na avaliação do crescimento tumoral sob o efeito de toxinas (MADY, 2002), extratos vegetais (RAJESHKUMAR et al., 2002; RADHIKA at al., 2012), drogas antiinflamatórias e agentes proteicos (PAL et al., 2001; KAR et al., 2012), neurotransmissores (MONSHKOV et al., 2013).
1.3 Resposta imunológica e evolução tumoral
O sistema imunológico tem um papel importante na prevenção do desenvolvimento tumoral, sendo capaz de reconhecer os antígenos tumorais, promovendo a morte de células neoplásicas e rejeição tumoral (ABBAS et al., 2003).
naturais (NK- do inglês, Natural Killer) em cânceres gástricos ou colorretais está associado a um melhor prognóstico (COCA et al., 1997; ISHIGAMI et al., 2000). Entretanto, estudos populacionais revelam que pacientes que mantêm um estado inflamatório crônico apresentam maior risco de desenvolver câncer (KARIN & GRETEN, 2005).
Acredita-se que o processo de eliminação do tumor compreende tanto a imunidade inata quanto adquirida, formando um sistema integrado de defesas do hospedeiro contra tumores, no qual diversas células e moléculas se relacionam mutuamente. Quanto à imunidade celular, processo eficaz na destruição dos tumores, é composta por células imunológicas que são capazes de liberar milhares de substâncias que tem como objetivo conter o processo inflamatório e/ou infeccioso (MILLS, et.al, 2004).
Dentre estas células os macrófagos desempenham papel chave na contenção do agente agressor, sendo uma das principais células que compõe o sistema imune inato. Possui papel de destaque na imunidade inata, e se comportam como células intermediadoras da imunidade inata e adaptativa. Em particular, os macrófagos são responsáveis pelo processamento e apresentação de antígeno às células T antígeno específicas (IONTCHEVA et al., 2004; JOKE & KRAAL et al., 2012).
Enzimas como a óxido nítrico sintase induzível (iNOS), responsável pela produção de óxido nítrico (NO), através da conversão de L-arginina em L-citrulina, desempenha um papel central nas reações inflamatórias (MACMICKING et al., 1997). Níveis elevados de iNOS promovem a carcinogênese, incuindo iniciação, promoção, progressão, metástase e angiogênese tumoral (GOCHMAN et al., 2012).
O microambiente tumoral está imerso por citocinas que afetam a proliferação e diferenciação de células do sistema imune. Citocinas são peptídeos endógenos de pequeno peso moleculares amplamente envolvidas na resposta imune. Estas moléculas solúveis liberadas por linfócitos e células do sistema fagocitário, são essenciais na comunicação intercelular e em muitos processos fisiológicos e fisiopatológicos. Elas também modulam a inflamação e a imunidade regulando o crescimento e a diferenciação de leucócitos e células não leucocitárias (DUBIN et al., 2012). Além disso, possuem um importante papel na patogênese de uma variedade de doenças inflamatórias e auto-imunes (SCHACHNA, 2004; DUBIN et al., 2012).
O TNF- é uma citocina que possui importantes efeitos biológicos em uma variedade de células, efeitos na maioria relacionados a processos imunomodulatórios e inflamatórios (CASALE et al., 1996) podendo induzir morte por necrose ou apoptose em algumas células tumorais humanas primárias e em linhagens celulares tumorais (PALLADINO et al., 2003).
fibroblastos. Na imunidade inata, esta molécula estimula a síntese de proteínas de fase aguda por hepatócitos contribuindo desta maneira com o efeito sistêmico da inflamação. Na imunidade adaptativa, esta estimula a diferenciação de linfócito B em células produtoras de anticorpos (plasmócitos) (ABBAS et al., 2003; NAUGLER et al., 2007).
A IL-12 é uma citocina produzida por macrófagos e outras células apresentadoras de antígeno em resposta a estimulação por uma série de microorganismos e seus produtos. Possui atividades biológicas múltiplas principalmente através de linfócitos T e células NK, induzindo a produção de inteferon-γ (IFN-γ). (TRINCHIERI & SCOTT, 1999; CHEN et al., 2012). Estimula a atividade antitumoral in vivo em diversos modelos de tumores murinos, utilizando mecanismos efetores da imunidade inata e adaptativa para mediar a resistência antitumoral (COLOMBO & TRINCHIERI, 2002).
Assim, o estudo in vitro de macrófagos nos permite analisar os prováveis mecanismos de defesa do hospedeiro para o controle e erradicação de doença neoplásica (GALDIERO et al., 2013; LAMEIJER et al., 2013).
Outro aspecto importante a ser analisado é o efeito de substâncias antitumorais sobre a angiogênese, uma vez que os tumores apresentam vascularização bastante proeminente em relação aos tecidos normais. A angiogênese e a metástase tumoral são processos funcionalmente relacionados, pois ambos envolvem uma tríade de eventos fisiopatológicos: mobilidade celular, proteólise tecidual e proliferação celular, e é controlada por diversos reguladores (PINHO, 2005).
elevação de CO2 ou óxido nítrico, proteínas como VEGF (Fator de crescimento
endotelial vascular) e a enzima COX-2 (ciclooxigenase-2) (PINHO, 2005).
O VEGF assim como outros fatores, é conhecido por possuir um papel central na promoção da angiogênese e é um dos mais potentes indutores de permeabilidade vascular sendo 50.000 vezes mais potente que a histamina. Sua síntese e liberação resultam em vasodilatação na rede vascular mais próxima e a permeabilidade vascular aumenta a partir da formação de fenestrações nesta rede capilar que possibilita a fuga de macromoléculas, proteínas e diversos fatores que retardam a absorção do edema intersticial e transformam um estroma normalmente antiangiogênico em um ambiente pró-angiogênico (HICKLIN, 2005).
Recentemente testes envolvendo drogas antitumorais com a propriedade de inibir o VEGF, ou seu receptor, apresentaram resultados promissores destinados à terapia oncológica como antiangiogênicos. Bates (2002) demonstrou que o incremento da condução de fluidos é mediado por aumento do influxo de cálcio através da membrana plasmática possivelmente decorrente da ativação da oxido nítrico sintetase (iNOS) e pelo próprio VEGF, já que inibidores da iNOS bloqueiam a permeabilidade vascular em processos crônicos e agudos mediados por VEGF.
Atualmente os tratamentos possuem baixa eficácia em virtude do mecanismo de ação que as drogas supressoras possuem, inibindo o crescimento ou matando as células malignas. A maior parte desses quimioterápicos são genotóxicos, produzindo dano ao DNA e mutações, que podem induzir a formação de novas células neoplásicas. Os princípios ativos mais procurados são aqueles que induzem a apoptose, levando apenas células malignas à morte (SUBHASHIN et al., 2005; SUK et al., 2013; WOZNIAK et al., 2013).
1.4 Qualea grandiflora Mart.
As plantas medicinais correspondem às mais antigas fontes empregadas pelo homem no tratamento de enfermidades de todos os tipos, ou seja, a utilização de plantas na prevenção e/ou na cura de doenças é um hábito que sempre existiu na história da humanidade. Segundo Duarte (2005), os primeiros registros sobre a utilização de plantas medicinais é datado de 500 a. C., no texto chinês que relata nomes, doses e indicações de uso de plantas para tratamento de doenças. Outros registros foram encontrados no manuscrito egípicio “Ebers Papirus”, de 1.500 a. C., em que continham informações sobre 811 prescrições e 700 drogas. E algumas dessas plantas ainda são utilizadas, como Ginseng (Panax spp.), Ephedra spp., Cassia spp. e Rheum palmatum L., inclusive como matérias primas para indústrias farmacêuticas.
suprir necessidades de assistência médica privada (YUNES et al., 2001; DONG et al., 2013; PEĆANAC et al., 2013).
Os estudos envolvendo plantas, principalmente a partir dos anos 80, tiveram uma reorientação, inclusive no Brasil, devido ao surgimento de novos métodos analíticos de alta tecnologia, os quais permitem isolar componentes presentes nas plantas mesmo que em baixas quantidades (LIRA, 2007). O desenvolvimento de bioensaios simplificados, novos métodos de screening, introdução de testes in vitro que mimetizam situações análogas in vivo, entre tantos outros, também determinaram o ressurgimento do interesse na investigação de produtos naturais, perdido durante a década de 60, como possível fonte de novos protótipos para indústria farmacêutica (YUNES et al., 2001; SCHENKEL et al., 2003).
O gênero Qualea é constituído por árvores típicas da zona tropical e distribuído em, aproximadamente, 200 espécies, ocorre em toda a América tropical, desde o México, passando pelo Peru e Guianas, e o Brasil onde três espécies são predominantes no Cerrado: Qualea grandiflora, Qualea parviflora e Qualea multiflora, e são conhecidas popularmente como mandioqueira ou quaruba (CÔRREA, 1974).
Q. grandiflora, é uma árvore do cerrado brasileiro de aproximadamente 12 metros de altura, com caule de até 40 cm de diâmetro. Foi estudada em projetos temáticos BIOTA-FAPESP, apresenta folhas simples, opostas e rígidas com 10-14 cm de comprimento. Sua ocorrência abrange desde o Amazonas até São Paulo, sendo encontrada geralmente em terrenos altos, bem drenados e secos. Seu florescimento ocorre nos meses de novembro-janeiro e a maturação dos frutos ocorre geralmente nos meses de agosto-setembro, quando a planta está quase totalmente despida de sua folhagem (Figura 1) (LORENZI et al., 2002).
Figura 1: Árvore de Qualea grandiflora
Fonte: http://plantecerrado.webnode.com.br/products/pau-terra-grande-qualea-grandiflora
atividade inibitória do crescimento tumoral frente à linhagem de câncer murino LM3 ativados com LPS (CARLI, et al., 2013).
2. OBJETIVOS
2.1 Gerais
Avaliar o efeito do extrato bruto hexânico (EH) e de sua fração terpênica (FT) e como a substância isolada β-sitosterol (BS) e Taxol® (Paclitaxel- TX), como droga padrão em modelo de câncer mamário murino, concomitante com a avaliação da produção de mediadores pró-inflamatórios no animal após esses tratamentos.
2.2 Específicos
Obtenção do extrato hexânico (EH) e fração terpênica (FT) de Q. grandiflora Testes in vitro
Determinar a viabilidade de células do exsudato peritoneal de camundongos e células tumorais de Ehrlich, após incubação com os diferentes tratamentos
Verificar a angiogênese pela presença de VEGF na célula tumoral de Ehrlich pelo teste imunoenzimático ELISA
Determinar a ocorrência de apoptose em células tumorais frente às substâncias testadas pelas técnicas de Tunel e Anexina V
Determinar a inibição de NO em sobrenadantes de culturas de células do exsudato peritoneal de camundongos
Determinar a inibição das citocinas TNF-α, IL-1, IL-12 e IL-6 em sobrenadantes de culturas de células do exsudato peritoneal de camundongos
Testes in vivo
Verificar o volume tumoral
Avaliar a taxa de inibição do crescimento dos tumores após os diferentes tratamentos
Avaliar número células em mitose
3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Delineamento experimental
- Testes in vitro
3.2 Obtenção do extrato bruto e fração terpênica de Qualea grandiflora.
As cascas de Q. grandiflora, foram coletadas em Pedro Afonso (Estado do Tocantins, TO, Brasil), por Cristiano Borges Pereira em 25 de Outubro de 2003. O voucher da espécie foi identificado por Dr. S. F. Lolis, no herbário pertencente à UNITINS (Fundação Universidade do Tocantins) sob o no 3379.
O preparo de EH e FT obtida de Qualea grandiflora foi realizado, no Instituto de Química (IQ) da UNESP, sob a orientação do Prof. Dr. Wagner Vilegas. As cascas do tronco foram secas em estufa a 40 ºC, triturada em moinho de facas, e extraída
exaustivamente com hexano (48h-3L) (três vezes) à temperatura ambiente. A destilação foi feita em evaporador rotatório. Após essa etapa, o extrato hexânico foi fracionado em coluna sílica gel utilizando um gradiente crescente de polaridade (hexanoacetatometanol), fornecendo a fração terpênica estudada neste projeto.
3.3 Obtenção das Soluções a serem utilizadas nos Ensaios Biológicos
EH, FT e BS foram primeiramente diluídas em dimetilsulfóxido (DMSO- Merk, Alemanha) para a realização dos testes. Foram preparadas soluções-mãe para todos os compostos testados. A partir da solução-mãe foram feitas diluições seriadas em meio de cultura (RPMI-1640- Sigma, Chemical Co., EUA). No máximo, 4% de DMSO foi utilizado (concentração anteriormente testada em ensaio de citotoxicidade).
A substância isolada β-sitosterol (BS) (lot# 0001448346) e a droga padrão utilizada Taxol (TX) (lo# BCBB4101) foram compradas da Sigma-Aldrich.
3.4 Animais
Araraquara, São Paulo, foram mantidos em gaiolas em grupos de 5, com condições estáveis de ambiente (23 ± 2°C, 56 ± 2% de umidade relativa do ar) e ciclos de 12 horas com e sem luz. Os animais receberam água e ração (Purina) esterilizadas, ad libitum. Os animais foram sacrificados em câmara de CO2. Os procedimentos experimentais foram
realizados segundo parece emitido pela Comissão Local de Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Farmacêuticas (CEUA/FCF/Car nº 01/2010).
Testes in vitro
3.5Obtenção de macrófagos do exsudato peritoneal
Os animais dos diferentes grupos, após o desenvolvimento da massa tumoral, foram previamente estimulados através da inoculação intraperitoneal de 3,0 mL de solução de tioglicolato de sódio a 3% (Difco Lab. Ltda, EUA), três a quatro dias antes da coleta das células. Após esse período, os animais foram eutanasiados em câmara de CO2. A coleta do exsudato peritoneal foi realizada em fluxo laminar classe 100 (Veco,
RPMI-1640-C, suplementado com L-glutamina, sem NHCO3 (Sigma Chemical Co., EUA),
acrescido de soro fetal bovino, estreptomicina e penicilina. O meio assim composto denominou-se NCTC-135-Completo (NCTC-135-C).
3.6 Linhagem celular tumoral utilizada e manutenção do tumor de Ehrlich in vivo
As células tumorais de Ehrlich foram gentilmente cedidas pela Dra. Denise Fecchio do Departamento de Patologia da UNESP, Botucatu, Brasil. A manutenção das células tumorais no laboratório se deu na forma ascítica in vivo através de repiques semanais. Para manutenção do tumor in vivo, 1x107 células tumorais em um volume de 0,2 mL foram inoculadas intraperitonealmente em camundongos receptores, a cada 7 dias, segundo metodologia descrita na literatura (FECCHIO et al., 1990).
3.7 Inoculação das células tumorais para formação do tumor sólido
Os camundongos, após assepsia local com álcool iodado, foram inoculados subcutaneamente no coxim plantar com 0,1 mL da suspensão tumoral ajustada na concentração de 1x107 células tumorais/mL em meio de cultura NCTC-135 (Sigma
Chemical Co., EUA ) suplementado com L-glutamina, sem NHCO3 (Sigma Chemical
3.8 Obtenção das células tumorais de Ehrlich para os ensaios in vitro
Após 5 dias de evolução do tumor, período no qual ainda não há influxo significativo de células inflamatórias (FECCHIO et al., 1990), houve o sacrifício dos camundongos portadores do tumor de Ehrlich na forma ascítica em câmara de CO2 e
estes tiveram o fluido ascítico retirado assepticamente em fluxo laminar Classe 100 (Veco, Ind. Bras.).
Para o preparo da suspensão celular, esta foi centrifugada duas vezes com 5 volumes de cloreto de amônio (NH4Cl, Labsynth Ind. Bras. Ltda) , caso o fluido ascítico
estivesse hemorrágico, e depois duas vezes com solução salina tamponada de fosfatos de pH 7,2, estéril (PBS) a 200xg durante 5 min.
As células tumorais sedimentadas foram ressuspendidas em 1,0 mL de meio NCTC-135-C para os ensaios de citotoxicidade e/ou viabilidade celular in vitro, sendo ajustadas à concentração de 1x106 células/mL.O número de células foi determinado por
contagem em câmara hemocitométrica tipo Neubauer utilizando-se o corante azul de Tripan.
3.9 Avaliação da citotoxicidade em cultura de macrófagos
Para o ensaio de viabilidade celular foi utilizado o método baseado na capacidade que as células viáveis têm de clivar o anel tetrazólico presente no MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio) (Across Organics) pela ação de enzimas desidrogenases presentes na mitocôndria ativa, formando cristais de formazana (MOSMAN, 1983).
A uma placa de microtitulação de 96 cavidades de fundo plano (Corning, Inc.) foram distribuídos 100µL por cavidade das suspensões de célula do exsudato peritoneal de camundongos, ajustadas à concentração de 5.106células/mL em meio de
concentrações, além de 100L de LPS a 0,5 g/mL (Lipopolissacarídio de Escherichia coli sorotipo 0111:B4, Sigma Chemical. Co, EUA) (controle positivo) ou somente 100L meio de cultura RPMI-1640-C, em triplicata. As placas foram incubadas por 24h a 37°C em estufa contendo tensão constante de 5% de CO2 (Forma Scientific, EUA).
Após essa incubação, o sobrenadante foi descartado e as células aderentes lavadas com PBS e depois tratadas com 100µL de uma solução de MTT a 0,5 mg/mL em RPMI-1640. A placa foi então incubada por mais 3h nas mesmas condições anteriores. Após esta incubação os sobrenadantes foram descartados e as células aderentes tratadas com 100µL de isopropanol (Mallinckrodt) para solubilizar os cristais de formazana formados. A leitura da densidade ótica foi determinada em espectrofotômetro (Multiskan Ascent, Labsystems Research Tech. Div., Helsinki, Finland) em UV/visível a 540 nm com filtro de referência de 620nm.
3.10Avaliação da citotoxicidade em linhagem tumoral de Erhlich
O crescimento celular foi quantificado através do ensaio de MTT, previamente descrito. As células foram obtidas de acordo com o item 4.8 100 µL da suspensão celular tumoral foram adicionadas aos poços juntamente com 100 µL de EH, FT, BS e TX em diversas concentrações posteriormente incubadas a 37 °C com pressão constante de 5% CO2. Apenas meio de cultura NCTC-135- C foi usado como controle
3.11 Análise da angiogênese pela dosagem de VEGF por Teste Imunoenzimático
(ELISA)
A produção de VEGF foi quantificada nos sobrenadantes obtidos das culturas de célula tumoral de Ehrlich, conforme descrito no item 4.8 através do teste imunoenzimático ELISA de captura de acordo com as instruções do fabricante (eBioscience – BMS277/2TEN). As microplacas foram lavadas duas vezes com 300 µL de tampão de lavagem (PBS com 1% Tween 20) (Sigma Chemical Co., EUA). Após a lavagem, foi adicionado as placas 100 µL das amostras e padrão em cada cavidade e incubadas à temperatura ambiente por 120 minutos sob agitação a 100 rpm. Em seguida, foram lavadas seis vezes com tampão de lavagem e adicionados 100 L/cavidade do conjugado peroxidase-streptavidina diluído em PBS/BSA e incubadas novamente à temperatura ambiente por 60 minutos. Após esse processo, as placas foram lavadas seis vezes com tampão de lavagem e 100 L do substrato (Tetrametilbenzidina) foram adicionados a cada cavidade e incubados por 30 minutos à temperatura ambiente ao abrigo da luz. A reação foi interrompida adicionando-se 100 L de H3PO4 1M (Stop
Solution). A absorvância foi lida a 450nm em espectrofotômetro UV/Visível de microplacas (Multiskan Ascent, Labsystems Research Tech. Div., Helsinki) e as concentrações foram quantificadas utilizando uma curva padrão previamente estabelecida com quantidades conhecidas de VEGF padrão. Os testes foram realizados em triplicata e os resultados expressos em picogramas/mL.
3.12 Determinação da ocorrência de apoptose em células tumorais por TUNEL
na incorporação de nucleotídeos (d-UTP = 2’-desoxiuridina 5’ trifosfato) marcados com o corante fluorescente FITC (Isotiocianato de fluoresceína) na região livre 3’OH das quebras do DNA fita simples ou fita dupla (KOCKX et al., 1998; GORCZYCA et al., 1993).
A técnica foi realizada utilizando-se o kit In Situ Cell Death Detection Kit (Roche), conforme instruções do fabricante. Foi adicionado às placas de 96 wells (Falcon cód. 353046) 2 mL de células tumorais ajustadas à 5.105células/mL em NCTC-C, juntamente com 2 ml das substâncias testadas nas concentrações pré-estabelecidas em mg/ml (EH: 1, FT: 1, BS: 0,125 e TX: 0,125) e como controle foi utilizado somente NCTC-C. Após 24 hr de incubação em estufa a 37ºC contendo tensão constante de 5% de CO2 (Forma Scientific, EUA), a linhagem celular foi então recolhida e colocada em
um tubo falcon. Foram expostas à 100 μL de tampão de fixação, e incubadas por 60 minutos. As células foram lavadas com tampão de lavagem e ressuspensas em 100 μL de tampão de permeabilização. A seguir, às amostras foram acrescentados 50 μL do reagente de TUNEL; e no controle negativo, 50 μL da solução de ligação, somente. As amostras foram incubadas por 60 minutos a 37°C em câmara úmida, ao abrigo da luz. A seguir, foram adicionados 5 L de iodeto de propídio a 2 g/mL e foi realizada uma incubação de 10 minutos nas mesmas condições anteriores. A leitura foi feita em citômetro de fluxo BD FACSCanto (BD Biosciences).
3.13Determinação da ocorrência de apoptose em células tumorais por Anexina V
exterior da bicamada. Anexina V é uma proteína que se liga a fosfolipídeos e possui alta afinidade por PS na presença de íons de cálcio. Mudanças nesta assimetria da membrana, que é analisada através da medição da aderência de Anexina V à membrana celular, podem ser detectadas antes das alterações morfológicas associadas ao início da apoptose e antes da perda da integridade da membrana (BOERSMA et al., 2005; BRUMATTI, 2008; VAN GENDEREN, et al., 2008).
A dosagem de Anexina foi realizada pelo FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Pharmngen), de acordo com as instruções do fabricante. Foi adicionado às placas de 96 poços (Falcon cód. 353046) 2 mL de células tumorais ajustadas à 5.105células/mL em NCTC-135-C, juntamente com 2 mL das substâncias testadas nas
concentrações pré-estabelecidas em mg/mL (EH: 1, FT: 1, BS: 0,125 e TX: 0,125) e como controle foi utilizado somente NCTC-135-C. Após 24 hr de incubação em estufa a 37ºC contendo tensão constante de 5% de CO2 (Forma Scientific, EUA), as células
foram recolhidas em tubo falcon e adicionadas de 400 L de tampão de ligação, 5 L de anexina V-FITC e 5 L de iodeto de propídio (2 g/mL). Após incubação de 10 minutos, foram adicionados 100 L de paraformaldeído a 1% na mistura e esta foi mantida a 4C. No momento da leitura, foram adicionados 400 L de tampão de ligação a cada tubo e as células analisadas por citometria de fluxo em Citômetro BD FACSCanto (BD Biosciences).
3.14 Determinação de Óxido Nítrico (NO)
sacrificados como descrito anteriormente. A suspensão celular foi ajustada à 5.106
células/mL em meio de RPMI-1640-C, e foram distribuídos 100L dessa suspensão celular em placas de 96 cavidades estéreis (Corning Inc.). Na placa foram adicionados 100L de EH (1mg/mL), FT (1mg/mL), BS (0,125 mg/mL) e TX (0,125 mg/mL) + 100L de uma solução de LPS a 0,5 g/mL como agente estimulante, 100L de LPS a 0,5g/mL + 100L de células (controle positivo). Em outras cavidades, foram adicionados 200L de meio RPMI-1640-C à suspensão celular, como controle de células (controle negativo). A placa assim constituída foi incubada por 24 hr em estufa a 37ºC com tensão constante de CO
2 a 5% . Após a incubação, foram retiradas alíquotas
de 50L de cada amostra, transferidas para outra placa e adicionados 50L/cavidade de reagente de Griess. Após 10 minutos à temperatura ambiente, as placas foram lidas em espectrofotômetro UV/visível de microplacas com filtro de 540nm. As concentrações de NO liberadas foram calculadas a partir de uma curva padrão previamente estabelecida com concentrações molares conhecidas de nitrito de sódio em meio RPMI-1640. Os testes foram feitos em triplicata e os valores expressos em mol de NO/5.105 células.
3.15 Obtenção dos sobrenadantes das culturas de macrófagos peritoneais
Os sobrenadantes das culturas de macrófagos foram utilizados na determinação da inibição da produção das citocinas TNF-α, IL-1, IL-12 e IL-6. As células peritoneais foram ajustadas à concentração de 5.106células/mL em meio RPMI-1640-C e
distribuídas em placas de cultura de tecidos de 24 cavidades (Corning, Inc.). A cada cavidade foi adicionado 1mL da suspensão celular e as placas foram incubadas a 37°C por 60 minutos em estufa contendo tensão constante de 7,5% de CO2. Após esta
Na avaliação da inibição da produção das citocinas TNF-α, 1, 12 e IL-6 foi adicionado às células aderentes 1mL de RPMI-1IL-640-C, 1mL de EB, FT, BS e TX e 1mL de LPS a 0,5g/mL aos macrófagos que ficaram aderidos à placa. Da mesma forma, 1mL de LPS a 0,5g/mL + 2mL de RPMI-1640-C foi utilizado como controle positivo e 3mL de RPMI-1640-C como controle de negativo.
Estas placas foram novamente incubadas a 37°C em estufa com tensão constante de 7,5% de CO2 por 24hr. Após esta incubação, o conteúdo das placas foi
transferido para tubos do tipo eppendorfs que foram, em seguida, centrifugados a 7800 xg durante 10 minutos em centrífuga refrigerada (Hettich, Inc.) a 4°C. Após a centrifugação, os sobrenadantes das culturas foram coletados, aliquotados em tubos do tipo eppendorfs e armazenados em freezer a -80o C até o momento da determinação das citocinas através do teste imunoenzimatico, ELISA.
3.16 Determinação das citocinas TNF-α, IL-1, IL-12 e IL-6
100 L da citocina padrão ou sobrenadantes das culturas de células peritoneais de camundongos. As placas foram incubadas à temperatura ambiente por 120 minutos, e lavadas quatro vezes com PBS/T. Em seguida, foram adicionados 100 L/cavidade de anticorpo monoclonal de cabra anti- TNF-α, IL-1, IL-12 e IL-6 de camundongo marcado com biotina na concentração de 400 ng/mL em diluente de reagente (1%BSA, 0,05% de Tween 20 em tampão Tris-NaCl) (Sigma Chemical Co., EUA). As placas foram incubadas à temperatura ambiente por 120 minutos e lavadas 3 vezes com PBS-T, sendo então adicionados 100 L do conjugado peroxidase-streptavidina diluído em PBS/BSA e incubadas novamente à temperatura ambiente por 20 minutos. Após esse processo, as placas foram lavadas três vezes com PBS-T e 100 L do substrato (10mM de tampão citrtato-fosfato, contendo 0,4 mM de tetrametilbenzidina [SIGMA] e 1,2 mM de H2O2) foram adicionados a cada cavidade. A reação foi interrompida adicionando-se
50 L de H2SO4 2N. A absorvância foi lida a 450nm em espectrofotômetro UV/Visível
de microplacas (Multiskan Ascent, Labsystems Research Tech. Div., Helsinki, Finland) e as concentrações das citocinas foram quantificadas utilizando uma curva padrão previamente estabelecida com quantidades conhecidas de TNF-α, IL-1, IL-12 e IL-6 padrão. Os testes foram realizados em triplicata e os resultados expressos em picogramas/mL.
Testes in vivo
3.17 Protocolo Terapêutico
As células tumorais foram ajustadas na concentração de 1.107cel/mL e
auxílio de seringa e agulha (0,70 x 25mm- BD PrecisionGlide TM) após assepsia local.
Foram realizadas 2 aplicações no interior da massa tumoral, com intervalos de 5 dias entre cada uma. Cada animal recebeu o tratamento, de acordo com as especificações dos grupos de estudo (4.18).
3.18 Grupos de Estudo
Os camundongos foram distribuídos em grupos de 5 animais/grupo:
Grupo I: inoculados com células tumorais de Ehrlich e tratados com PBS.
Grupo II: inoculados com células tumorais de Ehrlich e tratados com EH.
Grupo III: inoculados com células tumorais de Ehrlich e tratados com FT.
Grupo IV: inoculados com células tumorais de Ehrlich e tratados com BS.
Grupo V: inoculados com células tumorais de Ehrlich e tratados com de TX.
3.19 Avaliação do volume e inibição tumoral
Após o sacrifício, os tumores foram retirados com auxílio de material cirúrgico, e medidos em seus diâmetros maior e menor utilizando paquímetro digital (Mitutoyo Sul Americana Ltda, Ind. Bras.). O tumor também foi pesado com auxílio de uma balança não analítica (Boeco, Alemanha). O volume do tumor foi calculado pela fórmula (ZHOU et al.,1998):
Volume = 0,5 x diâmetro maior x (diâmetro menor)2
Inibição tumoral = (1 – V1/V2) x100
V1 = Média dos volumes dos tumores tratados com as substâncias estudadas
3.20 Análise Histopatológica dos Tumores
Os tumores removidos dos animais de estudos foram fixados em parafina e corados com eosina e hematoxilina. As lâminas foram então analisadas histopatologicamente e fotografadas com auxílio de microscópio com captura de imagem (Nikon Eclipse E200).
3.21Determinação da presença de mitoses
A ocorrência de mitoses foi observada estereometricamente em microscópio óptico em cortes de 5 μm do tecido tumoral mamário fixado em formaldeído, desidratados usando etanol e xileno e embebidos em parafina e posteriormente corados com hematoxilina e eosina, utilizando um aumento de 400 vezes. Os resultados foram expressos em média ± desvio-padrão do número de células em mitose em 5 campos aleatórios de cada animal, em 3 animais de cada grupo de estudo.
3.22 Análise da angiogênese pelo Sistema de Gradação para Angiogênese por
Microscopia (MAGS)
vezes. A pontuação foi calculada como: MAGS = KnN + KeE + KxX, onde as constantes são: Kn = 1, Ke = 3 e Kx = 6.
A vasoproliferação (KnN) possui um valor máximo de 40, com N sendo o número de capilares vistos sob o aumento de 400 vezes em cada campo. A hiperplasia de células endoteliais (KeE) possui valor máximo de 30, sendo E o número de células alinhadas na seção transversal do capilar, com valor máximo de 10. A citologia endotelial (KxX) possui um valor máximo de 30; X possui um valor entre 0 e 5 indicando a aparência histológica das células endoteliais na zona de hiperplasia, sendo 0 = célula endotelial normal; 1 = célula aumentada, mas com núcleo normal e claro; 2 = célula aumentada, mas com núcleo claro e proeminente; 3 = célula com núcleo grande e hipercromático; 4 = células endoteliais “bizarras”; 5 = células que se apresentem como figura mitótica. A gradação MAGS calculada por esta fórmula varia entre 0 e 100, em valores arbitrários. Os resultados foram expressos em média ± desvio-padrão em valores arbitrários, obtidos de pelo menos 5 campos aleatórios em cada uma das lâminas de 3 animais de cada grupo de estudo.
3.23 Análise dos Resultados
4. RESULTADOS
4.1 Avaliação da citotoxicidade de macrófagos peritoneais e células tumorais de
Ehrlich pela técnica de MTT (MOSSMAN, 1983)
Por meio do teste de MTT, foram estabelecidas as concentrações utilizadas para o tratamento do animal portador de tumor (in vivo), concentrações estas que deve ser seletivas, ou seja, apresentarem baixa citotoxicidade frente às células imunológicas e alto efeito tóxico às células tumorais.
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 0 20 40 60 80 100
Concentrações EH (mg/mL)
Vi a b ili d a d e (% ) Macrófagos
Célula tumoral Ehrlich
Figura 2: Viabilidade de macrófagos e células tumorais de Ehrlich frente ao extrato hexânico (EH).
As células foram incubadas com asdiferentes concentrações 2, 1, 0,5, 0,125, 0,5 e 0,0625 mg/mL de EH
pelo período de 24h em estufa de CO2 a 37ºC. A viabilidade docontrole negativo (apenas meio de cultura
NCTC-135- C) foi considerada 100%.Valores representam a média ± desvio padrão de seis animais realizados em triplicata.
Tabela 1. Viabilidade celular após o tratamento com diferentes concentrações de EH
EH (mg/mL) Macrófagos1, 3 Ehrlich2,3
2 41,46 ± 6,89*** 1,59 ± 0,99***
1 93,58 ± 5,98 1,71 ± 1,38***
0,5 96,32 ± 8,61 9,73 ± 1,67***
0,25 100 ± 7,99 15,85 ± 4,66***
0,125 100 ± 4,32 35,47 ± 8,56**
0,0625 100 ± 5,23 57,50 ± 5,78**
Controle Negativo 100 100
1- 5x106 células / cavidade.
2- 1x106 células / cavidade.
3- Valoresdeterminados por uma curva dose-resposta, expressos em mg/mL.
Avaliação após 24 horas de incubação. Cada valor referente aos macrófagos representa a média ± desvio-padrão de seis animais realizados em triplicata. Os valores referentes às células tumorais de Ehrlich representam a média ± desvio-padrão de três ensaios realizados em triplicata. EH: extrato hexânico. *** p<0,001 quando comparada ao controle negativo (somente células) que equivale a 100% de viabilidade.
Foi demonstrado pela figura 3 e tabela 2, que a FT apresenta na concentração de 1 mg/mL alguma citotoxicidade aos macrófagos (75,27± 2,78%) e maior citotoxicidade frente às células tumorais de Ehrlich (35,56 ± 3,78%).
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
0 20 40 60 80 100 Vi a b ili d a d e (% )
Concentração de FT (mg/mL) Macrófago
Célula Tumoral de Ehrlich
Figura 3: Viabilidade de macrófagos e células tumorais de Ehrlich frente à fração terpênica (FT). As células foram incubadas com as diferentes concentrações 2, 1, 0,5, 0,125 e 0,0625 mg/mL de FT pelo período de 24h em estufa de CO2 a 37ºC. A viabilidade do controle negativo (apenas meio de cultuta NCTC-135- C) foi considerada 100%. Valores representam a média ± desvio padrão de seis animais realizados em triplicata.
Tabela 2. Viabilidade celular após o tratamento com diferentes concentrações de FT
1- 5x106 células / cavidade.
2- 1x106 células / cavidade.
3- Valoresdeterminados por uma curva dose-resposta, expressos em mg/mL.
Avaliação após 24 horas de incubação. Cada valor referente aos macrófagos representa a média ± desvio-padrão de seis animais realizados em triplicata. Os valores referentes às célula tumoral de Ehrlich representam a média ± desvio-padrão de três ensaios realizados em triplicata. FT : fração terpênica. *** p<0,001 quando comparada ao controle negativo (somente células) que equivale a 100% de viabilidade.
** p<0,01 quando comparada ao controle negativo (somente células) que equivale a 100% de viabilidade.
* p<0,05 quando comparada ao controle negativo (somente células) que equivale a 100% de viabilidade.
FT (mg/mL) Macrófagos1, 3 Ehrlich2,3
2 76,73 ± 4,90* 36,30 ± 1,20***
1 75,27 ± 2,78* 35,56 ± 3,78***
0,5 63,68 ± 2,88** 43,17 ± 2,56**
0,25 75,27 ± 3,77* 54,21 ± 4,78**
0,125 88,84 ± 5,99 75,92 ± 4,65*
0,0625 100 ± 4,89 78,44 ± 5,89*
-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 0 20 40 60 80 100 Macrófagos
Célula tumoral Ehrlich
Concentrações -sito (mg/mL)
Vi a b ili d a d e (% )
Figura 4: Viabilidade de macrófagos e células tumorais de Ehrlich frente ao β- sitosterol (BS).
As células foram incubadas com as diferentes concentrações 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 e 0,0625 mg/mL de BS pelo período de 24h em estufa de CO2 a 37ºC. A viabilidade do controle negativo (apenas meio de cultura
NCTC-135- C) foi considerada 100%. Valores representam a média ± desvio padrão de seis
animais realizados em triplicata. Valores representam a média ± desvio padrão de seis animais realizados em triplicata.
Tabela 3. Viabilidade celular após o tratamento com diferentes concentrações de BS
1- 5x106 células / cavidade.
2- 1x106 células / cavidade.
3- Valoresdeterminados por uma curva dose-resposta, expressos em mg/mL.
Avaliação após 24 horas de incubação. Cada valor referente aos macrófagos representa a média ± desvio-padrão de seis animais realizados em triplicata. Os valores referentes as célula tumoral de Ehrlich representam a média ± desvio-padrão de três ensaios realizados em triplicata. BS: β- sitosterol.
*** p<0,001 quando comparada ao controle negativo (somente células) que equivale a 100% de viabilidade.
** p<0,01 quando comparada ao controle negativo (somente células) que equivale a 100% de viabilidade. * p<0,05 quando comparada ao controle negativo (somente células) que equivale a 100% de viabilidade.
β- sito (mg/mL) Macrófagos1, 3 Ehrlich2,3
2 44,81 ± 3,90*** 16,25 ± 3,89***
1 49,13 ± 4,44*** 21,65 ± 5,77***
0,5 52,67 ± 5,89*** 29,74 ± 3,99***
0,25 58,24 ± 4,33*** 35,81 ± 5,12***
0,125 63,38 ± 8,90** 54,12 ± 6,78***
0,0625 62,32 ± 6,76** 70,57 ± 4,88**
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 0 20 40 60 80 100 Vi a b ili d a d e (% )
Concentrações TX (mg/mL)
Macrófagos
Célula tumoral Ehrlich
Figura 5: Viabilidade de macrófagos e células tumorais de Ehrlich frente ao taxol (TX).As
células foram incubadas com as diferentes concentrações 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 e 0,0625 mg/mL de TX pelo período de 24h em estufa de CO2 a 37ºC. A viabilidade do controle negativo (apenas meio de cultuta
NCTC-135- C) foi considerada 100%. Valores representam a média ± desvio padrão de seis animais
realizados em triplicata.
Tabela 4. Viabilidade celular após o tratamento com diferentes concentrações de TX
TX (mg/mL) Macrófagos1, 3 Ehrlich2,3
2 22,87 ± 3,94*** 28,42 ± 3,2***
1 30,41 ± 2,67*** 36,56 ± 2,22***
0,5 0,25 0,125 0,0625
45,65 ± 5,70*** 48,91 ± 5,65*** 78,76 ± 7,91*
100
44,36 ± 6,88*** 48,23 ± 2,56*** 46,32 ± 2,36*** 68,23 ± 1,25*
Controle Negativo 100 100
1- 5x106 células / cavidade.
2- 1x106 células / cavidade.
3- Valores determinados por uma curva dose-resposta, expressos em mg/mL.
Avaliação após 24 horas de incubação. Cada valor referente aos macrófagos representa a média ± desvio-padrão de seis animais realizados em triplicata. Os valores referentes às célula tumoral de Ehrlich representam a média ± desvio-padrão de três ensaios realizados em triplicata. TX: taxol.
*** p<0,001 quando comparada ao controle negativo (somente células) que equivale a 100% de viabilidade.
Desta maneira, foram escolhidas concentrações seletivas que apresentaram uma alta viabilidade para os macrófagos e alta citotoxicidade frente à célula tumoral. Para o extrato bruto – 1 mg/mL (93,58 ± 5,98%; 1,71± 1,38%), fração terpênica – 1 mg/mL (75,27 ± 2,78%; 35,56 ± 3,78%), β-sitosterol – 0,125 mg/mL (63,38 ± 8,90%; 54,12 ± 6,78%) e taxol – 0,125 mg/mL (78,76 ± 7,91%; 46,32 ± 2,36%) viabilidade de macrófagos e células tumorais respectivamente.
4.2 Determinação da produção do fator de crescimento vascular endotelial (VEGF)
EH FT BS TX PMA C-0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000
**
# # # V E G F ( p g /m L )Figura 6: Produção de fator de crescimento vascular endotelial nas células tumorais de
Ehrlich expostos as substâncias. As células tumorais foram incubadas com as diferentes
concentrações dos compostos, somente PMA (controle positivo) ou somente célula (controle negativo),
durante o período de 24 horas, em estufa de CO2 a 37ºC. As concentrações de VEGF foram calculadas
através de uma reta padrão previamente estabelecida com concentrações molares conhecidas de VEGF. Cada barra representa a média e desvio padrão de três experimentos realizados e triplicata. EH: extrato
hexânico; FT: fração terpênica; BS: β- sitosterol; TX: taxol; PMA: acetato de forbol miristato; C-:
controle negativo.
** p<0,01 quando comparada ao tratamento com controle negativo.
# p<0,05 quando comparado ao Taxol.
Tabela 5. Produção de VEGF nas células tumoral de Ehrlich
Tratamentos VEGF (pg/mL)
EH 5000,3 ± 8,39
FT 5000,9 ± 6,34
BS 5000,6 ± 2,42
TX PMA
C-
17000,5 ± 3,25 84000,6 ± 2,84 2000, 8 ± 5,23
Avaliação após 24 horas de incubação. Cada valor representa a média ± desvio-padrão de três ensaios
consecutivos realizados em triplicata. Valoresdeterminados por uma curva dose-resposta, expressos em
pg/mL. EH: extrato hexânico; FT: fração terpênica; BS: β- sitosterol; TX: taxol; PMA: acetato de forbol
4.3 Quantidade de células apoptóticas nos tumores
A quantidade de células apoptóticas em cada tumor foi contada por citometria de fluxo utilizando duas metodologias, através da marcação de células com reagente de anexina V (Figuras 7 e 8) e através da marcação das células com reagente de TUNEL (Figuras 9 e 10), ambas associadas ao fluorocromo FITC.
Foi observada maior quantidade de células em estágio apoptótico nos animais que receberam o tratamento com EH, quando comparados com o controle PBS e a droga padrão utilizada TX (73,9 ± 0,98 %, 20,0 ± 1,78 %, 40,7 ± 1,98 %) para anexina V e (56,2 ± 1,98 %, 7,4 ± 0,74 %, 28,3 ± 0,74 %) para técnica do TUNEL respectivamente (p< 0,001 para todas as comparações).
Figura 7: Porcentagem de células em apoptose no tumor de Ehrlich pelo teste de
ANEXINA V.As células tumorais de Ehrlich em apoptose foram incubadas por 24 hr na presença das
EH FT BS TX PBS 0 25 50 75
***
***
### ## ## P o rc e n ta g e m d e c é lu la s m a rc a d a s c o m A N E X IN AFigura 8: Porcentagem de células em apoptose no tumor de Ehrlich pelo teste de
ANEXINA V.As células em apoptose foram incubadas por 24 hr na presença das substâncias testadas
pela técnica de citometria coradas com reagente de anexina V e iodeto de propídio. Os resultados foram expressos com a média ± desvio-padrão de três ensaios realizados em triplicata. Como controle C- foi utilizado PBS. EH: extrato hexânico; FT: fração terpênica; BS: β- sitosterol; TX: taxol; PBS: solução salina tamponada de fosfatos.
EH FT BS TX PBS 0 10 20 30 40 50 60 70
***
**
### # # P o rc e n ta g e m d e c é lu la s m a rc a d a s c o m T U N E LFigura 10: Porcentagem de células em apoptose no tumor de Ehrlich pelo teste de TUNEL.
As células em apoptose foram incubadas por 24 hr na presença das substâncias testadas pela técnica de citometria coradas com reagente de TUNEL e iodeto de propídio. Os resultados foram expressos com a média ± desvio-padrão de três ensaios realizados em triplicata. Como controle C- foi utilizado PBS. EH: extrato hexânico; FT: fração terpênica; BS: β- sitosterol; TX: taxol; PBS: solução salina tamponada de fosfatos.
*** p<0,001 quando comparada ao tratamento com controle. ** p<0,01 quando comparada ao tratamento com controle. ### p < 0,001 quando comparado ao Taxol.
4.4 Determinação da inibição de óxido nítrico (NO)
EH FT BS TX LPS C-0 25 50 75 100
***
***
*
1 1 0,125 0,125
LPS + + + +
### ## # N O ( m o ls/ m L )
Figura 11: Produção de óxido nítrico em macrófagos peritoneais estimulados com LPS e
expostos as substâncias. Os macrófagos peritoneais foram incubados com concentração específica de
cada composto + LPS (0,5 g/mL), LPS (0,5 g/mL- controle positivo) ou somente células (controle
negativo), durante o período de 24 horas, em estufa de CO2 a 37ºC. Cada barra representa a média e
desvio padrão de seis animais, sendo que cada determinação foi realizada em triplicata. EH: extrato hexânico; FT: fração terpênica; BS: β- sitosterol; TX: taxol; LPS: lipopolissacarídeo bacteriano C-: controle negativo.
***p<0,001 quando comparado ao LPS. * p<0,05 quando comparado ao LPS. ### p < 0,001 quando comparado ao Taxol. ## p<0,01 quando comparado ao Taxol.
# p<0,05 quando comparado ao Taxol.
Tabela 6. Produção de NO em macrófagos peritoneais ativados com LPS
Tratamentos NO (µmols/5x105células) Inibição (%)
EH 1,43 ± 1,11 98,15%
FT 28,69 ± 7,4 62,98%
BS 47,43 ± 16,18 38,80%
TX 69,61 ± 9,17 10%
LPS 66,99 ± 7,6 ...
C - 0,62 ± 0,55 ...
Avaliação após 24 horas de incubação. Cada valor representa a média ± desvio-padrão de experimento
realizado com 06 animais em triplicata. Valoresdeterminados por uma curva dose-resposta, expressos em
µmols/5x105células. EH: extrato hexânico; FT: fração terpênica; BS: β- sitosterol; TX: taxol; LPS:
4.5 Determinação da inibição de TNF-α
Na determinação da atividade inibitória da produção de TNF-α em macrófagos peritoneais de camundongos portadores de tumor, é possível observar que EB (82,20%) apresentou uma intensa inibição deste mediador imunológico (Figura 12 e Tabela 7), seguido pela FT e BS, apesar de não apresentarem uma resposta tão proeminente, também apresentou importante atividade inibitória da produção de TNF-α com valores de 66,15% e 54,90%, respectivamente, quando comparados com o controle positivo (LPS) e a droga padrão (TX) (p<0,001 para EH, FT e BS) Por outro lado, de maneira oposta aos derivados de Q. grandiflora, a droga padrão TX não apresentou nenhum efeito (0%) sobre a inibição da produção de TNF-α pelos macrófagos peritoneais.
EH FT BS TX LPS
C-0 100 200 300 400 500
1 1 0,125
LPS + + + +
0,125
***
***
***
# ## # ## # ## T NF - ( p g /m L )Figura 12: Inibição da produção de TNF-α em macrófagos peritoneais estimulados com
LPS e expostos as substâncias. Os macrófagos peritoneais foram incubados com as diferentes
concentrações dos compostos + LPS (0,5 g/mL), somente LPS (0,5 g/mL- controle positivo) ou
somente células (controle negativo), durante o período de 24 horas, em estufa de CO2 a 37ºC. Cada barra
representa a média e desvio padrão de 06 animais portadores de tumor, sendo que cada determinação foi realizada em triplicata. EH: extrato hexânico; FT: fração terpênica; BS: β- sitosterol; TX: taxol; LPS: lipopolissacarídeo bacteriano C-: controle negativo.
