Novo sistema in situ para análise da proteólise muscular esquelética: papel da via do AMP cíclico

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SQUELÉTICA

: P

APEL DA

V

IA DO

A

MP

C

ÍCLICO

Orientadora:

Profa. Dra. Rosely Oliveira Godinho

São Paulo 2010

iii

De acordo com:

Como elaborar sua tese: Estrutura e referências Edna Terezinha Rother e Maria Elisa Rangel Batista

São Paulo, 2005

Bergantin, Leandro Bueno

NOVO SISTEMA PARA ANÁLISE DA PROTEÓLISE MUSCULAR ESQUELÉTICA: PAPEL DAVIA DOAMPC

Leandro Bueno Bergantin. São Paulo, 2010. XVI, 56f.

Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Programa de Pós Graduação em Farmacologia.

Título em inglês: A new system to analyze skeletal muscle

proteolysis: role of cAMP pathway

iv

DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGIA

Pró*Reitor de Pós*Graduação: Prof. Dr. Arnaldo Lopes Colombo

Chefe do Departamento:

Profa. Dra. Rosana de Alencar Ribeiro

v

incondicional apoio nesta etapa da

vida.

"na sua teimosia entrevejo a futura constância e

firmeza de caráter; nas suas garotices o bom humor

que lhes fará vencer facilmente os perigos deste

mundo. E tudo isso de modo tão puro, tão

incontaminado!"

vi

Fátima e ao meu padrinho Élcio, e ao

meu avô (José

) pelo

vii

orientação; e à Fapesp pela bolsa

viii

Aos professores do Setor de Produtos Naturais, Prof. Dr. Antônio José Lapa, Profa. Dra. Caden Souccar, Profa. Dra. Maria Teresa Riggio de Lima*Landman e Profa. Dra. Miriam Hayashi, pelos ensinamentos e convívio no laboratório.

Aos meus amigos de grupo: Sandro (“mais que um amigo!”), Thiago Duarte (uma amizade recente que espero que dure muito!), Marcelo (um amigo totalmente diferente de todos os amigos que tive, e que agora está fazendo doutorado em Michigan), Ana (uma pessoa tão boa que nem parece fazer parte deste mundo), Leonardo Bruno (por ter me ajudado a fazer toda a morfologia dos músculos lumbricales!), Luciana, Edilaine e Gracielle.

A todas as pessoas maravilhosas que trabalham no Setor de Produtos Naturais: Maria do Carmo, Bia, Betty, Joca, Alex, Chico, Celso, Dona Laura, Wilma e Emília.

Aos amigos do Setor de Mecanismo de Ação de Drogas, Kleber e Regiane, por toda ajuda e compreensão.

ix

aplicando, durante anos, todos os seus pensamentos e esforços a

manter*se rigidamente à mesa! E não fazem isso porque nada mais

tenham em que ocupar*se; ao contrário, o trabalho acumula*se

precisamente porque um mundo de dificuldadezinhas impede a marcha

dos negócios sérios.(...)

Esses insensatos não veem que o cargo não tem a mínima importância,

porquanto aquele mesmo que ocupa o primeiro lugar tão raramente

desempenha o principal papel! Quantos reis são governados pelo seu

ministro e quantos ministros são governados pelo seu secretário! Quem

é então o primeiro? Ao que me parece, aquele que, vendo mais longe do

que todos nós, é bastante poderoso ou bastante fino para dirigir as

nossas faculdades e as nossas paixões no sentido da realização dos

seus desígnios."

x Dedicatórias

Agradecimentos Lista de figuras Lista de abreviaturas Resumo v viii xii xiii xiv Abstract Justificativa xv xvi I. Introdução

1. Fisiofarmacologia do músculo esquelético e a influência trófica neural motora

2

2. Manutenção da massa muscular e a participação dos sistemas intrínsecos de proteólise muscular

2.1.Sistema proteolítico ubiquitina*proteasoma 2.2.Sistema proteolítico dependente de Ca2+ 2.3.Sistema proteolítico lisossomal

3

4 6 6

3. Métodos de avaliação da proteólise muscular

4. Papel da adenilil ciclase e do AMPc na sinalização intracelular do músculo esquelético

7 8

5. Papel dos adrenoceptores β2e de inibidores de fosfodiesterases na

inibição da proteólise muscular

10

II. Objetivos 14

III. Material e Métodos

1. Drogas e Reagentes 16

2. Soluções 16

3. Animais e procedimento cirúrgico 17

4. Mensuração da proteólise muscular

4.1. Incubação dos músculos e mensuração da proteólise muscular 17

5. Dosagem do aminoácido tirosina 18

6. Análise morfológica dos músculos 19

7. Análise Estatística 19

IV. Resultados

1. Caracterização morfológica dos músculos lumbricales

1.1. Massa dos músculos lumbricales 21 1.2. Análise morfométrica dos músculos 22

2. Padronização da dosagem do aminoácido tirosina

2.1. Curva Padrão de dosagem de tirosina 24

3. Introdução e validação da metodologia de medida da proteólise muscular

3.1. Efeito do tempo de incubação na proteólise de músculos lumbricales controles

25

3.2. Relação entre a posição anatômica dos lumbricales e a proteólise muscular

25

3.3. Interferência da síntese protéica na medida da proteólise muscular

xi

3.5. Contribuição dos sistemas ubiquitina*proteasoma e das calpaínas na proteólise do músculo lumbricalis 28 3.6. Efeitos da maturação do rato na proteólise do músculo lumbricalis

4. Efeito de moduladores da via do AMPc na proteólise muscular esquelética

29

4.1. Efeito da ativação de adrenoceptores β na proteólise muscular 31 4.2. Efeitos da inibição de fosfodiesterases e da ativação da adenilil

ciclase na proteólise muscular

33

4.3. Efeito de moduladores da via de sinalização do AMPc na proteólise muscular de animais impúberes

34

4.4. Efeito de moduladores da via de sinalização do AMPc na proteólise de músculos EDL de animais impúberes

35

V. Discussão

1. Caracterização do novo modelo de estudo da proteólise muscular 38

2. Padronização da técnica de dosagem do aminoácido tirosina 39

3. Introdução e validação da metodologia de medida da proteólise muscular

40

4. Efeito do uso de moduladores da sinalização mediada pelo AMPc na proteólise muscular esquelética em situações basais e

catabólicas

44

VI. Sinopse e Conclusões 48

xii

Sistemas de proteólise muscular responsáveis pelo processo da atrofia

muscular resultante de desuso ou doença Fig. 1

Sinalização intracelular mediada pelo AMPc Fig. 2

Músculos lumbricales da pata posterior do animal Fig. 3

Massa muscular relativa dos músculos EDL e dos músculos lumbricales de

ratos adultos Fig. 4

Secções transversais dos músculos lumbricales e EDL Fig. 5

Freqüência de distribuição do diâmetro das fibras dos músculos lumbricales Fig. 6

Pad Curvas*Padrão de dosagem de tirosina

Representação molecular da L*tirosina

Efeito do tempo de incubação na proteólise muscular

Fig. 7 A

Fig. 7 B

Fig. 8

Relação entre a posição anatômica e a proteólise muscular Fig. 9 Interferência da síntese protéica na proteólise muscular Fig. 10 Efeito da lesão mecânica na proteólise muscular

Efeito da desnervação na proteólise muscular

Efeito da desnervação na massa muscular

Fig. 11

Fig. 12 A

Fig. 12 B

Efeito de inibidor de proteasoma e de calpaínas na proteólise muscular Fig. 13

Efeito da maturação na proteólise muscular Fig. 14 Efeito da depleção de ATP na proteólise de músculos lumbricales de ratos

impúberes Fig. 15

Efeito do isoproterenol na proteólise muscular Fig. 16

Efeito do isoproterenol na proteólise de músculos controles e desnervados Fig. 17

Efeito do formoterol na proteólise muscular Fig. 18

Efeito do formoterol na proteólise de músculos controles e desnervados Fig. 19

Efeito do IBMX na proteólise muscular Fig. 20

Efeito da forscolina na proteólise muscular Fig. 21 Efeito de moduladores da via de sinalização do AMPc na proteólise

muscular de animais adultos e impúberes Fig. 22

Efeito de moduladores da via de sinalização do AMPc na proteólise de

xiii

AC adenilil ciclase

ACh acetilcolina

AChE acetilcolinesterase

AMPc adenosina monofosfato cíclico

ATP adenosina trifosfato

DMSO dimetilsulfóxido

E*64 (L*transepoxysuccinyl*leucylamido*[4*guanidino] butano)

EDL extensor longo dos dedos

Epac exchange protein directly activated by cAMP

FSK forscolina

GDP guanosina difosfato

GPCR G*protein coupled receptor

GTP guanosina trifosfato

HE hematoxilina*eosina

IBMX 3*isobutil *1*metilxantina

JNM junção neuromuscular

MG 132 Z*Leu*Leu*Leu*al

ML/MT músculo lumbricalis associado ao seu osso metatarso

Murf*1 muscle ring*finger protein 1

nAChR colinoceptores nicotínicos

PDE fosfodiesterases

PKA proteína quinase dependente de AMPc

RNAm ácido ribonucléico mensageiro

xiv

O

músculo esquelético de mamífero é responsável tanto pelo desencadeamento da contração e geração de força e movimento. Por outro lado, o músculo participa do controle da homeostase energética corporal ao disponibilizar aminoácidos gerados a partir da proteólise muscular. A regulação fina dessa proteólise é crucial para a manutenção da massa muscular. Até o momento, os mecanismos de regulação desse processo assim como a triagem farmacológica de drogas que interferem com a proteólise muscular tem sido realizadas pela medida da liberação de tirosina de músculos de ratos impúberes, devido ao tamanho e à má perfusão tecidual de músculos de ratos adultos. Logo, o efeito da idade ou de doenças neurodegenerativas tem sido analisado apenas com marcadores estáticos, como atrogin*1/MAFbx ou Murf*1. Além disso, músculos de ratos impúberes diferem daqueles do rato adulto quanto a resistência à insulina e alta taxa de crescimento, o que pode comprometer a extrapolação direta dos resultados obtidos em animais impúberes para adultos. No presente estudo, propusemos o estabelecimento de um novo modelo experimental – o músculo lumbricalis do rato adulto para a medida dinâmica da proteólise muscular, através da quantificação da liberação de tirosina pelo músculo. Além disso, adaptamos o método fluorimétrico da medida do aminoácido para microplaca de 96 fossos, o que implicou na redução de 90% da formação de rejeitos químicos. Esse estudo foi complementado pela análise do efeito de moduladores da via da proteína Gs/ Adenilil ciclase/ AMP cíclico, cuja participação na regulação da proteólise muscular já havia sido demonstrada em músculos de ratos impúberes. Utilizando o músculo lumbricalis de rato adulto, comprovamos que moduladores da via de sinalização do AMPc inibem a proteólise muscular em situações basais ou catabólicas induzidas pela desnervação. Os agonistas de adrenoceptores β isoproterenol (30*100 ]M; não seletivo) e formoterol (1*10 nM; seletivoβ2),

o ativador de adenilil ciclase forscolina (30*100 nM) e o inibidor não seletivo de fosfodiesterases IBMX (100*1000 ]M) reduziram a proteólise muscular em 12 a 20%. Além disso, evidenciamos que a proteólise muscular de ratos impúberes (30 dias de idade) é 94% maior que a de animais adultos, resultado que torna questionável a extrapolação de resultados obtidos em músculos de animais impúberes para a idade adulta.

xv

xvi

O

processo de atrofia muscular esquelética pode ocorrer como conseqüência direta de

estados catabólicos deficientes, como por exemplo, no diabetes e em doenças neuromusculares degenerativas (Reid et al, 2005; revisão). As abordagens farmacológicas atuais para o tratamento da atrofia muscular ainda são bastante limitadas, especialmente porque as vias de sinalização intracelulares envolvidas são pouco conhecidas. O uso agudo e crônico de agonistas de adrenoceptores β2, drogas amplamente utilizadas na clínica para

o tratamento de doenças respiratórias, têm se mostrado promissor na atenuação da atrofia muscular. Apesar de alguns estudos atribuirem os efeitos desses agonistas na atenuação da atrofia muscular ao aumento da concentração intracelular de AMPc, o papel dessa via de sinalização nesse processo ainda foi pouco explorado, principalmente no animal adulto. A possível utilização terapêutica dos agonistas seletivos de adrenoceptores β2, assim como o

1. Fisiofarmacologia do músculo esquelético e a influência trófica neural motora

O

músculo esquelético de mamíferos é formado por células alongadas e

multinucleadas, as fibras musculares, responsáveis diretas pela dinâmica da

contração muscular. Nos mamíferos, cada fibra muscular é inervada por um único

axônio de neurônio motor, constituindo uma unidade motora (Mantilla e Sieck, 2008;

revisão).

A contração muscular é desencadeada pela deflagração do potencial de ação

nervoso, que induz a mudança da conformação de canais de Ca2+ dependentes de

voltagem presentes na membrana neuronal, ocasionando um aumento intracelular

de Ca2+necessário para a liberação de acetilcolina (ACh) na fenda sináptica (Prado

et al., 2002; revisão). Assim, vesículas contendo o neurotransmissor ACh fundem*se

à membrana do terminal do neurônio motor, liberando o neurotransmissor na fenda

sináptica. A interação subseqüente da ACh com os receptores colinoceptivos

nicotínicos (nAChR) pós*sinápticos desencadeia a resposta contrátil da fibra

muscular. Na fenda sináptica, a ação da ACh é finalizada pela enzima

acetilcolinesterase (AChE), a qual hidrolisa o neurotransmissor, evitando assim o

estímulo exacerbado dos nAChR (Sanes e Lichtman, 1999).

A região de contato entre o neurônio motor e a fibra muscular, também

denominada de junção neuromuscular (JNM), é altamente especializada e

caracterizada pela alta concentração de nAChR e AChE (Duclert e Changeux, 1995;

revisão). Essa especialização é condicionada por fatores tróficos neurais que

modificam o estado transcricional dos núcleos dessa região, diferenciado*os

daqueles extrajuncionais (Jasmin et al., 1998). A influência trófica neuronal também

é em parte responsável pela modulação da massa muscular e da expressão de

proteínas sinápticas, podendo ser evidenciada através da desnervação motora que

promove atrofia muscular gradativa (Guth e Albuquerque, 1978), com redução da

AChE do músculo (Guth e Albuquerque, 1978).

Além dos nAChR, a musculatura esquelética de mamífero também apresenta

receptores acoplados à proteína G heterotrimérica, tais como os adrenoceptores β2.

A ativação desses receptores por catecolaminas possibilita, por exemplo, a redução

da degradação protéica muscular, contribuindo para a manutenção da massa do

Por fim, o músculo esquelético pode ser classificado de acordo com as fibras

musculares que o constituem: tipo I ou II (A e B). A existência de diferentes tipos de

fibras musculares é devido, principalmente, à propriedade funcional inerente a cada

músculo (Zierath et al., 2004; revisão). Como exemplo, as fibras musculares do tipo I

possuem lenta velocidade de contração e baixa capacidade anaeróbia (ex.: músculo

sóleo). Já as fibras musculares do tipo II, por sua vez, possuem rápida velocidade de

contração e alta capacidade anaeróbia (ex.: músculo extensor longo dos dedos

(EDL)) (Zierath et al., 2004; revisão).

2. Manutenção da massa muscular e a participação dos sistemas

intrínsecos de proteólise muscular

A manutenção da massa muscular é dependente do balanço entre dois processos fisiológicos antagônicos: a síntese e a degradação de proteínas

musculares (Kettelhut et al., 1988; revisão). Esses dois processos são finamente

regulados por fatores nutricionais, hormonais e neuronais (Robert et al., 2004;

revisão). A quebra da homeostase entre esses dois processos pode resultar em

condições patológicas debilitantes acompanhadas de atrofia muscular, que são

claramente evidenciadas em modelos experimentais de desnervação, ou em várias

doenças de cunho degenerativo: esclerose lateral amiotrófica, distrofia de

Duchenne, dentre outras (Robert et al., 2004; revisão).

A regulação fina da proteólise muscular é uma importante etapa no controle da

homeostase energética corporal, assim como na manutenção da massa muscular e

do crescimento corporal (Kettelhut et al., 1988; revisão). Como o músculo

esquelético é considerado o maior reservatório protéico do organismo, a hidrólise de

proteínas musculares para a geração de aminoácidos é uma etapa importante na

gliconeogênese. Como conseqüência, em situações como jejum, diabetes e sepse,

nas quais observamos um balanço protéico negativo com perda de massa muscular,

observa*se um aumento da gliconeogênese (Kettelhut et al., 1988; revisão).

Corroborando com esta teoria, recentemente foi demonstrado que aminoácidos

como a leucina promovem um efeito anti*catabólico na musculatura esquelética

(Combaret et al., 2005). Esses autores evidenciaram que a suplementação crônica

da dieta de ratos com leucina causa uma inibição da proteólise de cerca de 30%,

aminoácidos essenciais (Zanchi et al., 2008; revisão). Na realidade, a

suplementação da dieta com leucina em modelos animais incrementa a síntese

protéica e diminui a proteólise muscular, propiciando um expressivo efeito

antiatrófico (Zanchi et al., 2008; revisão).

A elucidação dos mecanismos de regulação da proteólise muscular avançou

mais vigorosamente somente a partir da década de 90, com enfoque em estratégias

terapêuticas para a atenuação do catabolismo muscular exacerbado associado a

doenças crônicas e degenerativas (Tawa et al., 1997). Embora saibamos que o

músculo esquelético contém múltiplos sistemas intrínsecos de degradação protéica,

é cada vez mais necessária a elucidação de como os hormônios ou as moléculas

sinalizadoras endógenas modulam esses sistemas.

O controle da degradação protéica muscular envolve classicamente três

sistemas distintos: o sistema ubiquitina*proteassoma dependente de ATP, o sistema

dependente de Ca2+constituído pelas proteases denominadas calpaínas e o sistema

lisossomal constituído pelas proteases denominadas catepsinas (Nader et al., 2002;

revisão; figura 1). Vários autores descreveram que a proteólise das miofibrilas

musculares ocorre com a participação majoritária do sistema ubiquitina*proteassoma

(Medina et al. 1991; Price et al., 1996; Tiao et al., 1996). No entanto, como esse

sistema não possui a capacidade de degradar proteínas intactas de miofibrilas

(Soloman et al., 1998; revisão), torna*se dependente da ação prévia de proteases do

sistema de calpaínas. Proteínas envolvidas na manutenção do arcabouço da fibra

muscular, como titina, também são substratos endógenos das calpaínas (Sorimachi

et al., 2000; figura 1). Logo, essas enzimas propiciam um desarranjo da estrutura

protéica da miofibrila, possibilitando a ação proteolítica do sistema ubiquitina*

proteassoma.

2.1. Sistema proteolítico ubiquitinaHproteassoma

Osistema ubiquitina*proteassoma envolve a ubiquitinação de substratos, com a cooperação de pelo menos três classes de proteínas denominadas ubiquitinas (E1),

(E2) e (E3), sendo então endereçados ao proteassoma para que a degradação

protéica ocorra. Este sistema pode ser considerado a etapa chave no processo de

degradação protéica (Robert et al., 2004; revisão; figura 1), cuja elucidação dos

Ciechanover, Avram Herskho e Irwin Rose (Neefjes et al., 2004). Este sistema

possui o seguinte funcionamento bioquímico (Robert et al., 2004; revisão):

1. Ativação: A enzima E1 ativa a molécula de ubiquitina. O resíduo C*terminal da

ubiquitina é ligado covalentemente a um resíduo de sulfidril*cisteína da enzima

E1, que ocorre na presença de Mg² e com o consumo de uma molécula de ATP,

liberando AMP e pirofosfato (PPi) (figura 1).

2. Transferência: A ubiquitina é transferida para a enzima E2, liberando a enzima

E1.

3. Reconhecimento: A enzima E3 reconhece e se liga à proteína*alvo formando um

complexo não covalente.

4. Ubiquitinação: O complexo E2*ubiquitina é ligado à E3 de modo que a ubiquitina

seja transferida de E2 para o grupo amina de um resíduo de lisina da proteína*

alvo. Posteriormente, a enzima E3 solta*se, liberando a enzima E2 e a proteína

ubiquitinada.

5. Poli*ubiquitinação: As etapas 3, 4 e 5 se repetem várias vezes, formando uma ou

mais cadeias de ubiquitina.

6. A cadeia de ubiquitina é reconhecida pelo proteassoma. A proteína é

desubiquitinada por enzimas denominadas desubiquitinases, a proteína é

desdobrada com consumo de ATP e hidrolisada formando pequenos peptídeos

(de 7 a 9 aminoácidos).

Como se pode notar, as ubiquitinas ligases E3 possuem papel fundamental no

reconhecimento do substrato protéico a ser devidamente degradado pelo

proteassoma. Partindo*se deste fato, duas ubiquitinas ligases E3 foram identificadas

no músculo esquelético: Murf*1/Trim63 (Bodine et al., 2001) e atrogin*

1/MAFbx/FBXO32 (Gomes et al., 2001). Por terem suas expressões aumentadas em

processos de atrofia, essas proteínas e seus transcritos são utilizadas como

marcadores estáticos da proteólise muscular. Além disso, drogas que inibem o

sistema proteassomal reduzem a proteólise de músculos esqueléticos submetido ao

desuso, atenuando, portanto, o processo de atrofia muscular (Taillandier et al.,

2.2. Sistema proteolítico dependente de Ca2+

A participação do sistema dependente de Ca2+ na atrofia e na proteólise musculares foi demonstrada em músculos de rato, cuja atrofia induzida pela

imobilização foi atenuada por inibidores de calpaínas (Tischler et al., 1990). De

acordo com Tidball et al. (2002), a superexpressão de calpastatinas, inibidores

endógenos das calpaínas, atenua em 30% a atrofia de músculos sóleos submetidos

ao desuso, confirmando a relevância do sistema dependente de Ca2+ nesse

processo. A ausência de efeitos de inibidores do sistema proteolítico lisossomal (ex.:

aminoácidos de cadeia curta como leucina, isoleucina e valina), sugere que esse

sistema possui papel secundário no processo da atrofia muscular (Deval et al.,

2001).

2.3. Sistema proteolítico lisossomal

A organela responsável pela ação proteolítica neste sistema é o lisossomo, que possui um conteúdo extremamente ácido (pH 4*5) (Bechet et al., 2005; revisão).

Estão contidas nesta organela diversas enzimas hidrolíticas, dentre as quais se

encontram as proteases denominadas catepsinas (B, D, H e L) e as hidrolases

ácidas: responsáveis por degradar proteínas extracelulares de membrana e

citoplasmáticas (Tanida et al., 2004). O acesso do substrato às enzimas lisossomais

depende de diferentes processos intracelulares, como a autofagia (Bechet et al.,

2005; revisão). A princípio, por ser o primeiro sistema proteolítico identificado, a

autofagia foi considerada o principal mecanismo proteolítico da musculatura

esquelética, tanto em situações fisiológicas quanto patológicas. Contudo, ao

contrário do que se esperava, a inibição da autofagia em animais transgênicos, os

quais possuem a deleção de um gene crucial no processo autofágico (Atg7), não

previne a atrofia, sugerindo então um papel secundário deste sistema no processo

Figura 1: Sistemas de proteólise muscular responsáveis pelo processo da atrofia muscular resultante de desuso ou doença:A.Sistema dependente de Ca2+constituído pelas calpaínas;B.

Sistema lisossomal constituído pelas catepsinas;C.Sistema ubiquitina*proteassoma dependente de ATP (Traduzido de Robert et al., 2004; revisão).

3. Métodos de avaliação da proteólise muscular

Atualmente, as limitações das metodologias utilizadas no estudo do metabolismo de proteínas, mais especificamente quanto aos processos de

degradação protéica, vêm sendo revisados (Rennie et al., 2009; revisão). Devido à

limitação metodológica atual, o estudo dinâmico da modulação da proteólise

muscular em modelos animais fica restrito a animais impúberes, que diferentemente

dos animais adultos, apresentam alta taxa de crescimento. Logo, a extrapolação dos

resultados obtidos em animais impúberes para adultos pode ser equivocada. Devido

a este fato, os resultados da literatura referentes aos processos de degradação

protéica em animais adultos ou senis são restringidos apenas a marcadores

(Bodine et al., 2001), cuja expressão está aumentada em diversos modelos de

atrofia, incluindo: diabetes, câncer e insuficiência renal (Gomes et al., 2001), além da

privação androgênica de músculos esqueléticos alvos, recentemente demonstrada

pelo nosso grupo (Pires*Oliveira et al., 2010). Contudo, a análise exclusiva desses

marcadores de proteólise deve ser evitada, já que muitas vezes os resultados

obtidos com tais marcadores são conflitantes (Attaix et al., 2010).

Acerca do que foi exposto até aqui, conclui*se que o estudo dos mecanismos

de controle da proteólise muscular é cada vez mais necessário para o

desenvolvimento de estratégias terapêuticas visando à inibição do catabolismo

muscular exacerbado, associado ou não a doenças crônicas degenerativas. Assim,

uma nova metodologia que permita a análise direta e dinâmica da proteólise

muscular em animais adultos se faz claramente necessária.

4. Papel da adenilil ciclase e do AMPc na sinalização intracelular do músculo esquelético

O monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) é um segundo mensageiro que está envolvido diretamente na regulação de enzimas chaves da cascata de

sinalização intracelular. No músculo esquelético, o AMPc participa da manutenção

da massa muscular, principalmente através da inibição do sistema proteolítico

dependente de Ca2+ (Navegantes et al., 2000), através da ativação da proteína

quinase dependente de AMPc (PKA) e consequente fosforilação de resíduos de

serina/treonina de calpaínas. As variações fisiológicas das concentrações

intracelulares de AMPc dependem da atividade e regulação de duas famílias de

enzimas: as adenilil ciclases (AC) e as fosfodiesterases (PDE). Enquanto as AC

catalisam a conversão de ATP em AMPc, as fosfodiesterases degradam o AMPc em

AMP (Post et al 1995).

Em geral, a via AC/AMPc é ativada por receptores da membrana celular, como

os adrenoceptores β2, que estão acoplados a uma classe de proteínas ligadoras de

nucleotídeos da guanina, conhecidas como proteínas G heterotriméricas, por serem

formadas pelas subunidades α, β e γ. As subunidades Gα identificam a proteína G e

podem ser agrupadas em 4 subfamílias de acordo com a homologia estrutural: a)

primariamente ativada pelos adrenoceptores β2; b) família das proteínas G inibitórias

(Gi); c) família das proteínas Gq/11e d) família G12/13, que regula as proteínas G de

baixo peso molecular (Milligan e Kostenis, 2006; revisão). Enquanto as proteínas G

estimulatórias levam à ativação da AC, aumentando assim a síntese basal de AMPc

intracelular, as proteínas G inibitórias levam à inibição da AC, diminuindo a síntese

basal do segundo mensageiro.

Quando receptores acoplados à proteína G são estimulados por seus

agonistas, ocorre uma mudança conformacional da subunidade Gα, que por sua vez

tem a afinidade pelo GDP diminuída (Tang e Hurley, 1998; revisão). A dissociação

do GDP é seguida pela formação do complexo Gα*GTP e a dissociação da

subunidade Gα do complexo βγ, permitindo a interação da subunidade α e do complexo βγ com sistemas efetores, como a enzima AC (Tang e Hurley, 1998;

revisão; figura 2). A duração da resposta é regulada pela própria subunidade α, que

possui atividade enzimática capaz de hidrolisar GTP em GDP, restabelecendo o

complexo inativo GDP*Gαβγ(Shmidt, 1997; revisão).

Atualmente, nove isoformas de AC associadas à membrana, numeradas de 1 a

9 estão caracterizadas, além de uma AC solúvel (Linder 2006; revisão). Todas

compartilham a mesma estrutura primária (Linder, 2006; revisão) e, com exceção da

AC solúvel, podem ser ativadas pela proteína G estimulatória. Além disso, as AC1 a

AC8 podem ser ativadas diretamente pela forscolina, diterpeno encontrado em

plantas do gênero (Tang e Hurley 1998; revisão)

O músculo esquelético de mamífero expressa majoritáriamente as isoformas

AC2, AC6, AC7 e AC9; sendo esta última a de maior abundância (Suzuki et al.,

1998). Estes autores demonstraram que após a desnervação do músculo

gastrocnêmico de camundongo, a quantidade de RNAm de AC2 e AC9 diminui,

enquanto os transcritos das AC6 e AC7 aumentam, demonstrando que a expressão

das AC é modulada pela inervação motora. Resultados obtidos em nosso laboratório

mostram ainda que o AMPc está envolvido em processos de manutenção de

trofismo muscular (Chiavegatti et al., 2007, Bergantin et al., 2010).

O AMPc é capaz de modular diversos processos celulares via ativação da PKA,

como a abertura de canais iônicos; a ativação e/ou dessensibilização de receptores

acoplados à proteína G, e a ativação de fatores de transcrição, como a proteína

ligadora do elemento de resposta ao AMPc (

Além disso, a sinalização intracelular mediada pelo AMPc está envolvida na

inibição da degradação protéica, e conseqüente modulação da massa muscular,

evento também atribuído à ativação de PKA (Navegantes et al., 2006). Por outro

lado, a descoberta de Epac (Exchange protein directly activated by cAMP), uma

molécula sinalizadora também ativada pelo AMPc independentemente da ativação

de PKA, abriu uma nova via de sinalização a ser explorada. Estudo recente,

realizado por Baviera et al. (2009), demonstrou que a incubação de músculos EDL

de ratos impúberes com catecolaminas ou análogos do AMPc também ativa esta via

de sinalização, aumentando ainda mais a complexidade de regulação da proteólise

muscular pelo AMPc.

Figura 2Sinalização intracelular mediada pelo AMPc.1) Ativação de receptores de membrana2)

Ativação da proteína Gs estimulatória 3) Ativação da adenilil ciclase 4) Ativação da proteína quinase dependente de AMPc5)Respostas celulares.

5. Papel dos adrenoceptores β2 e de inibidores de fosfodiesterases na

inibição da proteólise muscular

Dentre os fatores endógenos que regulam o metabolismo de proteínas musculares, as catecolaminas possuem papel de destaque (Navegantes et al., 2000)

e podem ter seus efeitos mimetizados pelos inibidores de fosfodiesterases (Baviera

processos catabólicos, promovendo tanto a degradação de glicogênio e como de

gordura (Navegantes et al., 2009; revisão), estudos demonstrando que as

catecolaminas reduzem também a proteólise muscular podem ser

encontrados (Navegantes et al., 2000) Agonistas de adrenoceptores β2 promovem

hipertrofia muscular acentuada (Mersmann 1998; revisão; Navegantes et al., 2004) e

também retardam a atrofia induzida pela desnervação de músculos impúberes

(Zeman et al., 1987). Por outro lado, a redução da atividade adrenérgica induzida

pelo tratamento de ratos impúberes com o depletor de catecolaminas, guanetidina,

causa um aumento da taxa de degradação protéica do músculo sóleo (Navegantes

et al., 1999), sugerindo que o sistema nervoso simpático exerça um papel inibitório

na proteólise da musculatura esquelética.

A redução da proteólise muscular por catecolaminas ou por drogas que ativam

o adrenoceptor β2, como clenbuterol (agonista seletivo de adrenoceptores β2) ou

passos intermediários da sinalização intracelular, como o dibutiril*AMPc (análogo

não hidrolisável do AMPc), indica que as catecolaminas inibem o catabolismo

muscular através de mecanismos dependentes de AMPc (Navegantes et al., 2001,

2006).

O efeito inibitório das catecolaminas na proteólise muscular pode ser

mimetizado pelos inibidores de fosfodiesterases (Baviera et al., 2006). Essas drogas

são utilizadas amplamente no tratamento de várias doenças respiratórias e

cardiovasculares, por induzirem o aumento intracelular do AMPc (Albrecht et al.;

Lipworth BJ, 2005). A pentoxifilina, xantina inibidora não*seletiva de fosfodiesterases

reduz a proteólise muscular em modelo de sepse em ratos impúberes (Breuille et al.,

1993). Baviera et al. (2006) constataram também que o tratamento de ratos

impúberes diabéticos com pentoxifilina por 4 dias diminui significativamente a

degradação protéica em músculos EDL, através da redução da atividade do sistema

proteolítico dependente de Ca2+e do sistema proteolítico dependente de ATP. Hinkle

et al. (2005) recentemente demonstraram que a inibição de fosfodiesterases previne

a perda de massa muscular em dois modelos de atrofia, desnervação e desuso por

imobilização. Esses dados confirmam a hipótese do aumento do AMPc intracelular

ser um dos principais mecanismos responsáveis pela prevenção da degradação

protéica muscular excessiva. É importante ressaltar que todos os resultados

publicados por esses autores foram obtidos utilizando músculos de animais

oxigenação e de perfusão tecidual adequada de músculos de animais adultos

(Baracos e Goldberg, 1986). Logo, uma metodologia que permita a análise dinâmica

Este trabalho teve como objetivo a validação de um novo modelo para a avaliação dinâmica da proteólise muscular esquelética em ratos adultos, utilizando o

músculo lumbricalis de rato.

Considerando que a via da proteína Gs/AC/AMPc tem participação crucial na

manutenção da massa muscular, e que apenas músculos de animais impúberes vêm

sendo utilizados para os ensaios atuais de proteólise muscular, este trabalho teve

como objetivos específicos:

Padronizar e aprimorar em nosso laboratório a técnica de dosagem da

tirosina, aminoácido utilizado como marcador dinâmico da proteólise muscular;

Desenvolver e validar uma nova metodologia de medida da proteólise

muscular esquelética em animais adultos, abrindo a perspectiva para o uso de

animais senis ou portadores de doenças crônicas tardias e neurodegenerativas no

estudo da proteólise muscular esquelética;

Avaliar o efeito do uso de moduladores/ativadores da sinalização mediada

1. Drogas e Reagentes

Soluble Startch (Amido solúvel; Reagen, Quimibrás Indústrias Químicas, Brasil);

Tissue tek, optimal critical temperature compound (Miles laboratories, USA);

Harri’s Hematoxilin (Merck, USA);

Eosin Y (Sigma*aldrich, USA);

1* Nitroso 2 – Naftol (Sima*aldrich, USA);

Nitrito de sódio (Sigma*aldrich, USA);

Ácido nítrico absoluto (Merck, USA);

Etanol absoluto (Merck, USA);

1,2 – Dicloroetano (Merck, USA);

Dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma*aldrich,USA);

D* Glicose anidra (Synth, Brazil);

Dinitrofenol (Sigma*aldrich, USA);

NaCl (Synth, Brazil);

KCl (Synth, Brazil);

MgCl2.6 H2O (Synth, Brazil);

NaHCO3(Synth, Brazil);

NaH2PO4.H2O (Synth, Brazil);

CaCl2.2 H2O (Synth, Brazil);

Ciclohexamida (Sigma*aldrich,USA);

Cloridrato de Isoproterenol (Sigma*aldrich,USA);

3*Isobutil*1*metilxantina (IBMX) (Sigma*aldrich,USA);

Forscolina (Sigma*aldrich,USA);

Fumarato de Formoterol (Sigma*aldrich,USA);

MG 132 (Tocris, USA);

E*64 (Sigma*aldrich, USA);

Leupeptina (Sigma*aldrich, USA)

2. Soluções

Tyrode (135 mM NaCl; 5 mM KCl; 1 mM MgCl2.6 H2O; 15 mM NaHCO3; 2 mM

NaH2PO4.H2O; 2 mM CaCl2.2 H2O; 11 mM glicose, pH 7, 4);

Nitrito de sódio 72.5 mM diluído em 20% de ácido nítrico.

3. Animais e procedimento cirúrgico

Foram utilizados ratos Wistar machos adultos (com 3*4 meses de idade) e impúberes (30 dias de idade) da colônia 2 BAW, fornecidos pelo biotério do Instituto

de Farmacologia e Biologia Molecular (INFAR) da Universidade Federal de São

Paulo. Os animais foram mantidos em condições controladas de temperatura e

iluminação (ciclo de 12 h claro/escuro) com livre acesso à água e ração.

Para a desnervação dos músculos da pata posterior, os ratos foram

anestesiados com cetamina (48 mg/kg ip) e xilazina (6 mg/kg ip). Após antissepsia

local com álcool 70% e incisão na fossa poplítea do animal, o nervo tibial foi pinçado

e seccionado, retirando*se 2 mm para dificultar a reinervação. Em seguida, o corte

foi suturado com linha cirúrgica de algodão, sob condições assépticas. A secção do

nervo tibial resulta na desnervação dos músculos plantaris, sóleo, gastrocnêmio

(cabeças lateral e medial), flexor hallucis longus, tibial posterior, flexor longo dos

dedos, os digitais da pata traseira, dentre eles os 4 lumbricales (figura 3), músculos

situados na região posterior da pata do animal, e acessórios ao tendão do EDL.

Para avaliar o efeito da lesão muscular na proteólise, em outros experimentos,

imediatamente após a retirada dos músculos, os mesmos foram submetidos a cortes

concêntricos na região central, utilizando pinça dente de rato. Todos os

procedimentos foram realizados de acordo com protocolos experimentais aprovados

pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Unifesp (processo no1431/08).

4. Mensuração da proteólise muscular

4.1. Incubação dos músculos e mensuração da proteólise muscular

A mensuração da proteólise muscular foi realizada pela quantificação do aminoácido tirosina liberado pelos músculos esqueléticos. Como o músculo é

incapaz de degradar ou sintetizar tirosina, a liberação deste aminoácido

reflete a velocidade de proteólise muscular !. A

dosagem de tirosina foi realizada por método fluorimétrico, inicialmente descrito por

se na formação de um composto fluorescente estável detectável sob excitação a 485

nm e emissão a 590 nm, após reação de L*tirosina das amostras com nitroso*naftol

na presença de ácido nítrico a 55º C. Esta reação possui alta especificidade para

compostos fenólicos, como a L*tirosina (Tina e Gregory, 2007). A dosagem da

tirosina liberada por músculos utilizando esta técnica já é largamente empregada

pela literatura, assegurando sua validade e confiabilidade (Navegantes et al., 2000;

Baviera et al., 2006; Baracos e Goldberg, 1986).

Após o sacrifício do rato por decapitação, cada músculo lumbricalis, associado

ao seu próprio osso metatarso (sistema ML/MT), foi retirado do animal e transferido

para microtubo contendo 1,0 ou 1,5 ml de meio nutritivo Tyrode, pH 7,4 equilibrado

com 95% de O2 e 5% de CO2. A temperatura foi rigorosamente mantida a 37º C, já

que altas temperaturas induzem a proteólise muscular (Hall*Angeras et al., 1990).

Após 30 min com a pré*incubação das drogas a serem testadas, o sistema ML/MT

foi incubado por 1h a 5h em meio idêntico ao anterior. Posteriormente, o sistema

ML/MT foi retirado do tubo, o músculo foi dissecado e pesado e o meio nutritivo

contendo a tirosina liberada pelo músculo foi utilizado para a determinação da

proteólise muscular.

5. Dosagem do aminoácido tirosina

O método original de dosagem do aminoácido tirosina descrito por Waalkes e Udenfriend (1957) foi adaptado em nosso laboratório para quantificação em

microplaca. A técnica baseia*se na formação de um composto fluorescente estável,

detectável sob excitação a 485 nm e emissão a 590 nm, após reação (derivatização)

da L*tirosina das amostras com nitroso*naftol, na presença de ácido nítrico a 55º C.

Esta reação, nesta alta temperatura, possui alta especificidade para compostos

fenólicos como a L*tirosina (figura 7B) (Tina e Gregory, 2007).

Resumidamente, amostras (500 ]l) foram transferidas para microtubos de 2 ml

e incubadas com 200 ]l de mistura reacional, que consistiu em nitroso*naftol 1%

(w/v) diluído em etanol absoluto e nitrito de sódio 72.5 mM diluído em ácido nítrico

20% na proporção 1:1 v/v por 30 min a 55o C. Depois de arrefecimento por 10 min,

uma extração adicional do nitroso*naftol foi realizada pela adição de 1 ml de 1,2*

dicloroetano. Esta etapa é necessária, já que a presença do nitrosonaftol, de

e Udenfriend, 1957). Logo, esta etapa de extração garante a alta sensibilidade de

leitura (≥ 0,25 ]g/ml de tirosina). A seguir, as amostras foram vigorosamente

misturadas e centrifugadas por 10 min a 800 x , a 4ºC. Com este procedimento, há a formação de 2 fases líquidas: uma orgânica e outra aquosa, que contém o

aminoácido tirosina. A tirosina foi quantificada por fluorimetria (excitação a 485 nm e

emissão a 590 nm) e expressa como nmol/ mg de tecido/ hora.

6. Análise morfológica dos músculos

Os animais foram pesados e decapitados em guilhotina. Posteriormente, os músculos lumbricales e EDL de ambas as patas foram retirados, pesados,

desidratados em amido solúvel e envolvidos em Tissue tek (Miles laboratories,

Naperville, IL, USA). Após fixação em cortiças, os músculos foram congelados

rapidamente em nitrogênio líquido e armazenados a –80ºC.

Para a determinação do diâmetro (im) das fibras musculares, secções

transversais (5 ]m) dos músculos lumbricales e EDL foram obtidas em criostato

(Carl Zeiss, USA), coradas com hematoxilina e eosina (HE) e 7 campos por secção

foram fotografados sob microscópio de luz (Nikon Eclipse E800, Melville, New York,

USA; objetiva de 40x) conectado a um sistema de captura de imagens. As imagens

foram analisadas utilizando o software HL Image 97 (Western Vision Software,

Layton, Utah, USA) e processadas utilizando o software Adobe Photoshop CS 4.0

(Adobe Systems Inc., Mountain View, CA, USA) (Eriksson, 2006 a e b).

7. Análise Estatística

Os resultados obtidos foram expressos como média ±erro padrão da média. As diferenças estatísticas entre duas médias foram determinadas através do teste “t” de

Student e aquelas entre três ou mais médias por ANOVA de uma via com pós*teste

de Tukey, utilizando o programa computacional Graphpad Prism versão 5.01. A

probabilidade de se rejeitar falsamente a hipótese de nulidade foi fixada em 5% (p<

1. Caracterização morfológica dos músculos lumbricales

Na primeira parte deste trabalho, foi realizada a caracterização morfológica dos músculos lumbricales, comparando*os com um músculo de propriedade contrátil

semelhante: o EDL. De acordo com a descrição histoquímica de Gates et al. (1991),

os músculos lumbricales possuem um padrão misto de fibras, predominantemente

de contração rápida (tipo II), com 84 % de fibras do tipo II B, 6 % de fibras do tipo II

A e 10 % de fibras do tipo I.

1.1. Massa dos músculos lumbricales do rato adulto

Afigura 3 mostra os 4 músculos lumbricales, numerados de 1 a 4 conforme a posição anatômica. Conforme indicado na figura 4, não houve diferença estatística

entre a massa dos 4 músculos (38,6 ± 0,6 a 39,5 ± 0,7 mg).Entretanto, a massa dos músculos lumbricales representou cerca de 1/3 daquela do músculo EDL (124,3 ±

0,3 mg).

Figura 3. Fotografia da pata esquerda de rato Wistar

adulto. Os 4 músculos lumbricales foram numerados de 1 a 4, a partir da região medial da pata.

Figura 4. Massa dos músculos EDL e

lumbricales, numerados a partir da região medial da pata de ratos adultos (3 meses de idade). Cada barra representa a média ± erro*padrão da média de 8 músculos de 4 animais. (*) significantemente diferente do músculo EDL; P<0,05.

0 50 100 150

Lumbricales

EDL

1

2

3

4

*

*

*

*

M

a

s

s

a

M

u

s

c

u

la

r

(m

g

1.2. Análise morfométrica dos músculos

O diâmetro das fibras dos músculos lumbricales (26,97 ± 0,12 im, figuras 5B*E e 6B*F) foi cerca de 22% menor que aqueles do EDL (34,52 ± 0,42 im; figuras 5F e

6B). De acordo com o teste de normalidade de Pearson (1931) e D'Agostino et al.,

(1990), a variação do diâmetro das fibras musculares de todos os músculos

analisados seguiu um padrão de distribuição normal (figura 6B*F).

Figura 5. (A) Fotografia da pata direita do rato adulto mostrando os 4 músculos lumbricales,

EDL 1 2 3 4 0 10 20 30 40 Lumbricales (posição anatômica) * * * * D iâ m e tr o d a s fi b ra s ( m ) EDL

11 14 17 20 23 26 29 32 35 38 41 44 47 50 53 56 59 62

0 5 10 15 20

Diâmetro das Fibras ( m)

F re q u ê n c ia R e la ti v a (% ) Lumbricalis 1

12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46

0 5 10 15 20

Diâmetro das Fibras ( m)

F re q u ê n c ia R e la ti v a (%

) Lumbricalis 2

12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46

0 5 10 15 20

Diâmetro das Fibras ( m)

F re q u ê n c ia R e la ti v a (% ) Lumbricalis 3

12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46

0 5 10 15

Diâmetro das Fibras ( m)

F re q u ê n c ia R e la ti v a (% )

A

C

E

Lumbricalis 4

12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46

0 5 10 15 20

Diâmetro das Fibras ( m)

F re q u ê n c ia R e la ti v a (% )

F

B

D

Figura 6.(A) Diâmetro das fibras dos músculos EDL e lumbricales (numerados de 1 a 4 segundo a

2. Padronização da dosagem do aminoácido tirosina

2.1. Curva Padrão de dosagem de tirosina

A liberação de tirosina pelos músculos lumbricales em função do tempo reflete a velocidade da proteólise muscular (Baracos e Goldberg, 1986). Neste

estudo, a dosagem da tirosina foi padronizada com base no método descrito por

Waalkes e Udenfriend (1957). A figura 7A mostra curvas*padrão de tirosina obtidas,

na ausência ou presença da etapa de extração com dicloroetano. Conforme descrito

no item 5 de Materiais e Métodos, a reação é altamente específica para composto

fenólicos, como a L*tirosina (Figura 7B). Embora as duas curvas tenham se ajustado

à regressão linear (r2 = 0,99), a extração com 1,2*dicloroetano aumentou em 200

vezes a sensibilidade do método. O aumento da sensibilidade promovido por esta

etapa de extração, inicialmente descrito no macrométodo proposto por Waalkes e

Udenfriend (1957), permitiu a adaptação da dosagem para micrométodo, utilizando

microplaca de 96 fossos.

A B

Figuras 7.(A) Curvas*Padrão de tirosina obtidas na ausência ou presença da etapa de extração com

1,2*dicloroetano. Cada ponto representa a média de ensaios realizados em duplicata. (B) Estrutura química da molecula da L*tirosina mostrando o grupo fenólico.

0 2 4 6 8 10

0 10 20 30

40 _{com dicloroetano}

sem dicloroetano

Concentração de tirosina ( g/ml)

U

n

id

a

d

e

d

e

F

lu

o

re

s

c

ê

n

c

3. Introdução e validação da metodologia de medida da proteólise

muscular

3.1. Efeito do tempo de incubação na proteólise de músculos lumbricales controles

A figura 8 ilustra a liberação basal de tirosina de músculos lumbricales mantidos a 37ºC em Tyrode por 1 a 5 h. A proteólise basal foi aumentada

proporcionalmente ao tempo até a 3ª hora de incubação, estabilizando*se em 0,42 ±

0,03 nmol/ mg (figura 8). A partir desses dados, os experimentos subseqüentes

foram realizados incubando*se os músculos por 2h em Tyrode.

Figura 8. Efeito do tempo de

incubação na proteólise (liberação de tirosina) de músculos lumbricales incubados por 2h com ciclohexamida. Cada barra representa a média ± erro* padrão da média de 3 a 9 músculos de 3*5 animais.

(*) significantemente diferente de 1h; (**) significantemente diferente de 2h. P < 0,05.

3.2. Relação entre a posição anatômica dos lumbricales e a proteólise muscular

A figura 9 representa a proteólise basal dos 4 músculos lumbricales,

numerados de acordo com a posição anatômica, a partir da região medial da pata

dos animais. Não foi detectada diferença estatística entre a proteólise basal dos

músculos, sugerindo que estes sejam metabolicamente equivalentes (figura 9).

Experimentos realizados apenas com o metatarso mostram que não há liberação

detectável de tirosina pelo osso (figura 9).

0 1 2 3 4 5

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

**

**

**

Tempo de incubação (h)

Figura 9. Proteólise (liberação de tirosina) de músculos lumbricales, numerados de 1 a 4 de a partir da região medial e dos metatarsos (Osso) Cada barra representa a média ± erro*padrão da média de 6 músculos de 3 animais. ND = não detectável.

3.3. Interferência da síntese protéica na medida da proteólise do músculo lumbricalis

Para avaliar a interferência da síntese protéica na medida da proteólise muscular, a medida da liberação de tirosina foi realizada na presença do inibidor da

síntese protéica ciclohexamida 0,5 mM, que aumentou em 30% a proteólise basal

(0,12 ± 0,01 nmol/ mg/ h) (figura 10). Com base nestes dados, em todos os

experimentos subseqüentes, adicionamos ao meio de incubação ciclohexamida 0,5

mM.

Figura 10. Interferência da síntese

protéica na medida da proteólise (liberação de tirosina) de músculos lumbricales incubados por 2h com ciclohexamida. Cada barra representa a média ± erro*padrão da média de 8 músculos de 4 animais. (*) significantemente diferente do grupo controle; P<0,05.

0.00 0.04 0.08 0.12 0.16

Controle

Ciclohexamida

0,5 mM

*

P

ro

te

ó

lis

e

(n m o l ti ro si n a / m g / h ) 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20

1 2 3 4 Osso

3.4. Efeito da lesão mecânica e da desnervação cirúrgica na proteólise do músculo lumbricalis

Para averiguarmos se o método era capaz de detectar modificações na liberação de tirosina, avaliamos o efeito da lesão mecânica dos músculos através

de cortes concêntricos na região medial do músculo. Conforme mostrado na

figura 11, a lesão aumentou a proteólise basal (0,14 ± 0,01 nmol/ mg/ h) em 57%.

Neste modelo, a indução de catabolismo é resultante do intenso influxo de Ca2+

na fibra muscular, que culmina no aumento da proteólise (Furuno e Goldberg,

1986).

Figura 11. Efeito da lesão

mecânica na proteólise (liberação de tirosina) de músculos lumbricales incubados por 2h com ciclohexamida. Cada barra representa a média ± erro*padrão da média de 6 músculos de 3 animais.

(*) significantemente diferente do grupo controle; P<0,05.

Da mesma forma, a desnervação por 3 e 7 dias, induzida pela secção do nervo tibial, aumentou em 28% e 64% respectivamente a proteólise muscular basal (0,14 ±

0,01 nmol/ mg/ h; figura 12A). Esse efeito foi acompanhado pela redução de 10% e

25% da massa muscular (38,5 ± 1,2 mg; figura 12B), o que valida o uso de músculos

lumbricales de rato adulto como modelo experimental para o estudo do catabolismo

Figura 12.Efeito da desnervação por 1, 3 e 7 dias na proteólise (liberação de tirosina) (A) e na massa (B) dos músculos lumbricales. Cada barra representa a média ± erro*padrão da média de 8*12 músculos de 4*6 animais. (*) significantemente diferente do grupo controle (sham); P<0,05.

3.5. Contribuição dos sistemas ubiquitinaHproteassoma e das calpaínas na proteólise do músculo lumbricalis

Em geral, os principais sistemas envolvidos na degradação protéica muscular esquelética são aqueles dependentes de ATP (sistema ubiquitina*proteassoma) ou

de Ca2+(sistema das calpaínas) (Nader et al., 2002; revisão; figura 1).

A contribuição desses sistemas em nosso modelo experimental foi avaliada

pela pré*incubação dos músculos lumbricales de ratos adultos com o inibidor do

sistema ubiquitina*proteassoma MG132 (20 ]M) (Kadlcíková et al., 2005) ou com os

inibidores do sistema das calpaínas E64 (25 ]M) e leupeptina (50 ]M) (Navegantes

et al., 2001). O veículo utilizado para a diluição das drogas (DMSO 0,2%) não

modificou a liberação basal de tirosina (basal = 0,13 ± 0,01 nmol/ mg/ h; DMSO =

0,12 ± 0,01 nmol/ mg/ h). A incubação dos músculos lumbricales com MG132 ou

com E64 e leupeptina reduziu em 40% e 20%, respectivamente, a proteólise obtida

0.06 0.12 0.18 0.24 0.30

*

*

sham 1 3 7

P ro te ó lis e (n m o l ti ro s in a / m g / h ) 10 20 30 40 50 * *

sham 1 3 7

Período de Desnervação (dias)

na presença de DMSO (Figura 13). É interessante notar que a incubação conjunta

dos inibidores de calpaínas e de proteassoma não ocasionou uma somação dos

efeitos inibitórios, o que confirma elegantemente a teoria atual de que o sistema

ubiquitina*proteassoma é a etapa limitante do processo de proteólise muscular

(Robert et al., 2004; revisão; figura 1).

0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14

*

***

**

E64 + Leup

DMSO MG132 MG132 +

E64 + Leup Basal

P

ro

te

ó

li

s

e

(n m o lt ir o s in a / m g / h )

Figura 13. Efeito de inibidor de proteassoma (MG132 20 ]M) e de inibidores de calpaínas (E64 25

]M e leupeptina 50 ]M) na proteólise (liberação de tirosina) de músculos lumbricales incubados por 2h com ciclohexamida. Cada barra representa a média ± erro*padrão da média de 8 músculos de 4 animais. Significantemente diferente do grupo controle + veículo (DMSO): *P<0,05, **P<0,005, ***P<0,0001.

3.6. Efeitos da maturação do rato na proteólise do músculo lumbricalis

Para avaliar se o modelo experimental permite a análise direta da proteólise em músculos de ratos em diferentes estágios do desenvolvimento pós*natal,

comparamos a proteólise basal de músculos lumbricales de animais impúberes e

adultos. Como mostrado na figura 14, a proteólise de músculos de ratos de 30 dias

(0,33 ± 0,01 nmol/ mg/h) foi 94% superior àquela de animais com 3 meses de

idade. Este dado, por si só, pode impedir a extrapolação dos resultados obtidos em

Figura 14. Efeito da maturação animal na proteólise (liberação de tirosina) de músculos lumbricales incubados por 2h com ciclohexamida. Cada barra representa a média ± erro*padrão da média de músculos de 4 animais.

(*) significantemente diferente do grupo impúbere (zero); P<0,05.

Para averiguarmos se a proteólise aumentada no músculo lumbricalis do animal impúbere não era devido a algum artefato do sistema, determinamos a

proteólise na presença de dinitrofenol 0,5 mM, depletor de estoques intracelulares

de ATP, via desacoplamento do transporte de elétrons e da ATP sintase mitocondrial

(Stuart et al., 1999; revisão). Conforme mostrado na figura 15, o dinitrofenol reduziu

em 38% a proteólise do músculo lumbricalis (0,29 ± 0,01 nmol/ mg/ h), efeito

semelhante aquele obtido com MG132, em músculo de ratos adultos (figura 13).

Figura 15.Efeito da depleção de

ATP com dinitrofenol 0,5 mM na proteólise (liberação de tirosina) de músculos lumbricales de animais impúberes incubados por 2h com ciclohexamida. Cada barra representa a média ± erro* padrão da média de músculos de 4 animais. (*) significante* mente diferente do grupo controle (zero); P<0,05.

4. Efeito de moduladores da via do AMPc na proteólise muscular

esquelética

Considerando o papel crucial da via da proteína Gs/ AC/ AMPc na manutenção do trofismo muscular, e que apenas músculos de animais impúberes vêm sendo

utilizados para os ensaios de medida da proteólise muscular, analisamos a

viabilidade do uso de moduladores da via de sinalização do AMPc na inibição da

proteólise de músculo lumbricalis de rato adulto em situações basais e de

hipercatabolismo.

4.1. Efeito da ativação de adrenoceptores β na proteólise muscular

A ação trófica anticatabólica dos agonistas de adrenoceptores β já foi descrita em músculos esqueléticos de ratos impúberes (Navegantes et al., 2001). Em nosso

modelo, avaliamos o efeito anticatabólico do agonista clássico não*seletivo de

adrenoceptores β, isoproterenol (10 a 100 CM). A incubação por 2 h com a droga (30 e 100 iM) reduziu em 13 e 20 % a proteólise basal (0,15 ± 0,01 nmol/ mg/ h;

figura 16) de músculos lumbricales.

Figura 16. Efeito do isoproterenol

na proteólise (liberação de tirosina) de músculos lumbricales incubados por 2h com ciclohexamida. Cada barra representa a média ± erro* padrão da média de 12 músculos de 6 animais. (*) significantemente diferente do controle (zero); P<0,05.

O efeito do isoproterenol também foi avaliado em músculos lumbricales submetidos à desnervação por 3 dias. Conforme mostrado na figura 17, o

isoproterenol atenuou o efeito hipercatabólico do músculo desnervado (0,18 ± 0,01

0.00 0.04 0.08 0.12 0.16

*

_*

Isoproterenol ( M)

0 10 30 100

nmol/ mg/ h), restabelecendo os valores da proteólise àqueles de músculo controle

inervado (0,14 ± 0,01 nmol/ mg/ h).

Figura 17. Efeito do isoproterenol

(ISO, 100 CM) na proteólise (liberação de tirosina) de músculos

lumbricales controles e

desnervados incubados por 2h com ciclohexamida. Cada barra representa a média ± erro*padrão da média de músculos de 4*6 animais. (*) significantemente diferente do grupo controle não tratado; (**) significantemente diferente do grupo desnervado não tratado; P<0,05.

O efeito do isoproterenol foi mimetizado pelo agonista seletivo de adrenoceptores β2, formoterol. A incubação dos músculos lumbricales por 2 h com

formoterol 1 a 10 nM reduziu em 12 a 20% a proteólise basal (0,16 ± 0,01 nmol/

mg/ h; figura 18). Cabe ressaltar que os efeitos antiproteolíticos do formoterol foram

observados em concentrações equivalentes àquelas plasmáticas eficazes na

profilaxia da crise asmática, o que pode evidenciar uma nova utilidade terapêutica

para este fármaco.

Figura 18.Efeito do formoterol na

proteólise (liberação de tirosina) de músculos lumbricales

incubados por 2h com

ciclohexamida. Cada barra representa a média ± erro*padrão da média de 9*13 músculos de 6* 7 animais. (*) significantemente diferente do grupo controle (zero); P<0,05. 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25

*

*

**

Controle

Desnervado

Basal ISO 100 M

P

ro

te

ó

lis

e

(n m o l ti ro s in a / m g / h ) 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20

*

*

*

0 1 3 10

Conforme mostrado na figura 19, o formoterol também atenuou em 20% o efeito hipercatabólico de músculos desnervados por 3 dias (0,23 ± 0,01 nmol/ mg/

h).

Figura 19. Efeito do formoterol (3 nM)

na proteólise (liberação de tirosina) de músculos lumbricales controles ou desnervados por 3 dias. Cada barra representa a média ± erro*padrão da média de músculos de 4*6 animais. (*) significantemente diferente do grupo controle não tratado; (**) significan* temente diferente do grupo desnervado não tratado; P<0,05.

4.2. Efeito da inibição de fosfodiesterases e da ativação da adenilil ciclase na proteólise muscular

A incubação dos músculos lumbricales com 3*Isobutil*1*metilxantina (IBMX), inibidor não*seletivo de fosfodiesterases, promoveu a redução de 15% da

proteólise basal (0,14 ± 0,01 nmol/ mg/ h) (figura 20), mimetizando o efeito do

Isoproterenol (figura 16).

Figura 20. Efeito da 3*isobutil*1*

metilxantina (IBMX) na proteólise (liberação de tirosina) de músculos lumbricales incubados por 2h com ciclohexamida. Cada barra representa a média ± erro*padrão da média de 8*16 músculos de 4*8 animais. (*) significantemente diferente do grupo controle (zero); P<0,05. 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 _Basal

*

*

**

Formoterol 3 nM

Controle

Desnervado

P

ro

te

ó

li

s

e

(n m o l ti ro s in a / m g / h ) 0.00 0.04 0.08 0.12 0.16

0

30

100

300 1000

*

*

IBMX ( M)

A Ativação direta da adenilil ciclase com forscolina 30 e 100 nM, diterpeno isolado de plantas do gênero , reduziu em 12*17% a proteólise basal dos

músculos lumbricales (0,14 ± 0,01 nmol/ mg/ h; figura 21). O efeito observado

coloca a adenilil ciclase como um importante alvo farmacológico de modulação do

catabolismo muscular.

Figura 21. Efeito da forscolina na

proteólise (liberação de tirosina) de músculos lumbricales incubados por 2h com ciclohexamida. Cada barra representa a média ± erro*padrão da média de 4*16 músculos de 4*8 animais. (*) significantemente diferente do grupo controle (zero); P<0,05.

4.3. Efeito de moduladores da via de sinalização do AMPc na proteólise

muscular de animais impúberes

Além disso, o efeito dos moduladores da via de sinalização do AMPc forscolina 100 nM, IBMX 300 ]M e formoterol 3 nM na proteólise muscular de animais

impúberes também foi avaliado (figura 22). Todas as drogas inibiram em 20% a

proteólise de maneira similar a de animais adultos, sugerindo que, para esta via de

sinalização, seu efeito anticatabólico permanece preservado na idade adulta.

Figura 22. Efeito dos

moduladores da via de sinalização do AMPc (forscolina, Fsk; IBMX e formoterol, Form) na proteólise de músculos lumbricales de animais adultos (3 meses) e impúberes (1 mês), incubados por 2h com ciclohexamida. Cada barra representa a média ± erro*padrão da média de músculos de 4*6 animais. (*) significantemente diferente do respectivo controle (C); (#) significantemente diferente do grupo impúbere ; P<0,05. 0.00 0.04 0.08 0.12 0.16

*

*

0

10

30

100

4.4. Efeito de moduladores da via de sinalização do AMPc na proteólise de músculos EDL de animais impúberes

Por fim, comparamos o efeito de moduladores da via de sinalização do AMPc na proteólise de músculos lumbricales adultos e impúberes com aqueles de

músculos EDL de animais impúberes (30 dias de idade), largamente utilizado para

medida de proteólise muscular na literatura atual. Tanto o formoterol (3 nM) como a

forscolina (100 nM) inibiram em 20% a proteólise basal de músculos lumbricales de

ratos adultos (0,14 ± 0,01 nmol/ mg/ h), impúberes (0,32± 0,01 nmol/ mg/ h) e EDL

de animais impúberes (0,10± 0,01 nmol/ mg/ h). A proteólise de músculos

lumbricales impúberes representou cerca de 3 vezes aquela de músculos EDL de

animais impúberes (figura 23). A proteólise de músculos EDL de animais adultos não

pôde ser medida devida à limitação metodológica já descrita anteriormente.

Bas al Form oter ol Fors colin a Bas al Form oter ol Fors colin a Bas al Form oter ol Fors colin a 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4

*

*

*

*

*

*

?

#

EDL

Lumbricales

P

ro

te

ó

li

s

e

(n m o l ti ro s in a / m g / h )

Figura 23.Efeito da forscolina (100 nM) e formoterol (3 nM) na proteólise (liberação de tirosina) de

Aregulação fina da proteólise muscular é um processo fundamental no controle da homeostase energética corporal, permitindo a manutenção adequada da massa

muscular e do crescimento corporal (Kettelhut et al., 1988; revisão). Como o músculo

esquelético é considerado o maior reservatório protéico do organismo, a hidrólise de

proteínas musculares para a geração de aminoácidos é uma etapa importante, por

exemplo, na gliconeogênese. Além disso, a manutenção da massa muscular é

freqüentemente associada ao balanço entre a proteólise e a síntese protéica

(Kettelhut at., 1988; revisão). Esses dois processos são majoritariamente regulados

por fatores nutricionais, hormonais e neuronais (Robert et al., 2004; revisão). A

quebra da homeostase entre esses dois processos pode resultar em condições

patológicas debilitantes acompanhadas de atrofia muscular, e que são claramente

evidenciadas em modelos experimentais de desnervação, ou em várias doenças de

cunho degenerativo: esclerose lateral amiotrófica, distrofia de Duchenne, dentre

outras (Robert et al., 2004; revisão).

Considerando que a via da proteína Gs/AC/AMPc tem participação crucial na

manutenção do trofismo muscular (Navegantes et al., 2000), e que apenas músculos

de animais impúberes vêm sendo utilizados para os ensaios de proteólise muscular

devido à limitação metodológica, caracterizamos neste trabalho um novo modelo de

estudo da proteólise muscular no animal adulto, que foi validado pela análise

do efeito de ativadores/moduladores da via de sinalização do AMPc na proteólise

1. Caracterização

do

novo

modelo

de

estudo

da

proteólise muscular

Nessa primeira parte do estudo, realizamos a caracterização morfológica do modelo de estudo proposto, o músculo lumbricalis, comparando*o com o EDL do

rato adulto, músculo geralmente utilizado em ensaios de proteólise (Baracos e

Goldberg, 1986; Navegantes et al., 2000). Nossos dados mostram que os músculos

lumbricales possuem massa 3 vezes menor que a do EDL (figura 4). Além disso, as

fibras dos músculos lumbricales apresentaram diâmetro 20% menor que aquelas do

músculo EDL (figura 5). Estes aspectos são de extrema relevância para a medida da

proteólise muscular, visto que o protocolo de medida da liberação de tirosina exige

músculos delgados com fibras de diâmetro suficientemente pequenos para uma

perfeita perfusão tecidual (Baracos e Goldberg, 1986; Baviera et al., 2006). Como se

pode destacar, a utilização do músculo EDL de animal adulto é inviável para a

realização desses protocolos, já que ao longo do experimento, as fibras musculares

mais internas inevitavelmente sofrem necrose tecidual (Navegantes et al., 2000),

além de indução de catabolismo não condizente à condição . Por fim, como se

pode notar na figura 6, o diâmetro médio das fibras foi semelhante nos 4 músculos

lumbricales de cada pata, seguindo um padrão de distribuição normal Gaussiano,

independentemente da posição anatômica de cada músculo, indicando uma

homogeneidade no tamanho das fibras.

De acordo com a descrição histoquímica de Gates et al. (1991); os músculos

lumbricales possuem um padrão de fibras de contração rápida semelhante ao EDL

(tipo II), com cerca de 90% de fibras rápidas (tipo II). Esse perfil assemelha*se muito

mais aquele de músculos de humanos, nos quais predominam as fibras rápidas

(Gates et al., 1991). Além disso, músculos constituídos majoritariamente por fibras

lentas, como o sóleo, possuem um padrão de atrofia diferente daquelas de fibras

rápidas (Rennie et al., 2009; revisão). Como exemplos, em modelo de desuso por

imobilização, o músculo sóleo perde massa muscular a uma taxa maior (3% ao dia)

que aquela do EDL, cuja perda de massa ocorre a uma taxa de 0,8% ao dia (Rennie

et al., 2009; revisão). Em humanos, a imobilização causa uma perda de massa

muscular em músculos quadríceps a uma taxa de 0,5% ao dia, isto é, mais próxima