A técnica atual para dosagem da tirosina, aminoácido utilizado como marcador dinâmico da proteólise muscular, foi inicialmente descrita por Waalkes e Udenfriend (1957) sendo realizada em volume final de 10 mL, com geração de um volume muito grande de rejeitos tóxicos. A dosagem da tirosina liberada por músculos utilizando esta técnica já é largamente empregada pela literatura, assegurando sua validade e confiabilidade (Navegantes et al.; 2000; Baviera et al., 2006; Baracos e Goldberg, 1986).
Por outro lado, a adaptação do método à microplaca, proposta por " # $%%&! resultava na redução da sensibilidade de detecção de tirosina. No presente trabalho, padronizamos um micrométodo de medida da tirosina, com sensibilidade 200 vezes maior que aquela do método descrito por Tina e Gregory
$%%&!. A técnica baseia*se na formação de um composto fluorescente estável, detectável sob excitação a 485 nm e emissão a 590 nm, após reação (derivatização) de L*tirosina das amostras com nitroso*naftol na presença de ácido nítrico a 55º C, já que a reação é claramente endergônica. Esta reação possui alta especificidade para compostos fenólicos, como a L*tirosina (Tina e Gregory, 2007). Contudo, no método atual de microplaca, a baixa sensibilidade (50 ]g/ml) devido à interferência de produtos de cor amarela que suprimem a medida adequada do fluoróforo, foi aumentada em 200 vezes pela inclusão de um passo (adição de 1,2 dicloroetano) responsável pela extração do nitroso naftol (figura 7). Logo, aliamos a alta sensibilidade do macrométodo proposto por ' ( ) * +&! com um baixo volume de reagentes (Tina e Gregory $%%&! o que permitiu a adaptação da dosagem do aminoácido tirosina à microplaca de 96 poços e a mensuração simultânea de várias amostras. Esta adaptação permite que o método seja utilizado para realização de triagem farmacológica, na qual a dosagem de um elevado número de amostras se faz necessária.
3. Introdução e validação da metodologia de medida da
proteólise muscular
Na terceira parte do presente estudo, validamos o modelo de músculo lumbricalis para a medida dinâmica da proteólise muscular esquelética, o que pode propiciar o estudo da regulação do catabolismo muscular em diferentes idades do desenvolvimento pós*natal (impúbere, adulto e senil), além de doenças crônicas degenerativas associadas, abordagem ainda não explorada pela literatura (Navegantes et al., 2001; Baviera et al., 2006; Furuno e Goldberg, 1986). Este novo modelo foi validado reproduzindo resultados clássicos de proteólise muscular relatados pela literatura, como lesão muscular aguda (Figura 11) e secção no neurônio motor (Reid, 2005; revisão; figura 12), situações nas quais a proteólise muscular está visivelmente aumentada. Em condições basais, a velocidade de proteólise do músculo lumbricalis manteve*se constante entre 1 a 3 horas de incubação (Figura 8). Logo, o tempo médio de 2 h foi escolhido como tempo de incubação para os experimentos subseqüentes. Além disso, não houve liberação detectável de tirosina pelos ossos metatarsos incubados na ausência dos músculos lumbricales (figura 9), demonstrando que a liberação do aminoácido neste sistema é exclusiva dos músculos lumbricales.
A proteólise muscular basal de cada um dos 4 músculos lumbricales de cada pata também foi avaliada, não sendo detectada diferença estatística entre os músculos de uma mesma pata (figura 9). Estes resultados permitem a análise de drogas na proteólise muscular em ensaios emparelhados, utilizando músculos de um mesmo animal como controle (n=8/animal). A possibilidade de redução do número de animais a serem utilizados nos protocolos experimentais, comparativamente à metodologia atual que utiliza músculos Sóleo ou EDL (n=2/animal) permite inferir que este sistema é eticamente mais vantajoso em relação àqueles descritos na literatura (Navegantes et al., 2000; Baracos e Goldberg, 1986). Esta constatação está em perfeita sintonia com os “Princípios Básicos do Código Internacional” de
1985, no qual se preconiza “ , - .
. ”.
Como estamos lidando com um sistema dinâmico e os processos de síntese e degradação protéicas acontecem simultânea e continuamente (Robert et al., 2004;
revisão), a interferência da síntese protéica na medida da proteólise não deve ser desconsiderada. A adição do inibidor de síntese protéica ciclohexamida no meio de incubação aumentou a quantidade de tirosina detectada (figura 10), o que pôde ser atribuído ao bloqueio da reutilização do aminoácido liberado pelo músculo na síntese protéica. Assim, a inclusão da ciclohexamida ao meio de incubação garantiu que os efeitos de drogas avaliados nos experimentos subseqüentes fossem exclusivamente relacionados ao processo de degradação protéica (Navegantes et al.; 2000; Baviera et al., 2006; Baracos e Goldberg, 1986).
O catabolismo muscular exacerbado devido à lesão aguda, pioneiramente descrito por Furuno e Goldberg (1986), foi satisfatoriamente mimetizado em nosso sistema (figura 11) assegurando a sua validação. A lesão obtida a partir de cortes concêntricos na musculatura esquelética leva ao aumento de influxo de cálcio e consequente ativação de proteases intracelulares, como as calpaínas, já que o uso de inibidores específicos de proteases abole a proteólise (Furuno e Goldberg, 1986).
A secção do nervo tibial também aumentou a proteólise do músculo lumbricalis, de forma tempo*dependente (figura 12A) e paralela à atrofia muscular (figura 12B). Nesta condição, o aumento da atividade do sistema ubiquitina*proteassoma é majoritariamente responsável pela atrofia muscular (Medina et al., 1995). Logo, desde a década de 90 este sistema vem sendo considerado como alvo terapêutico para o desenvolvimento de fármacos que atenuem o catabolismo muscular exacerbado (Tawa et al., 1997), razão pela qual esta área de estudo foi contemplada com um prêmio Nobel (Neefjes et al., 2004). A larga participação do sistema ubiquitina*proteassoma nos processos de degradação protéica também foi constatada em nosso sistema. A inibição do proteassoma pela incubação dos músculos lumbricales com MG*132 reduziu em 40% a proteólise basal, o dobro da redução da proteólise observada pela inibição das calpaínas com E64 e leupeptina (figura 13). Além disso, a associação dos inibidores de calpaínas e de proteassoma não causou uma somação de efeito inibitório, o que está de acordo com a teoria atual de que a proteólise dependente de calpaínas converge para a via do sistema ubiquitina proteassoma, sendo este último a etapa limitante no processo de degradação protéica (Robert et al., 2004; revisão; figura 1). Este dado pode ser importante para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas, já que a associação de inibidores dos vários sistemas proteolíticos pode ser desnecessária no tratamento
de doenças que resultam em atrofia muscular, sendo então mais indicado a monoterapia.
Outra vantagem do nosso sistema refere*se à facilidade de incubação do músculo em seu comprimento anatômico, através da fixação ao metatarso e à eliminação do uso de hastes e suportes de fixação (Navegantes et al.; 2001; Baviera et al., 2006; Furuno e Goldberg, 1986). De acordo Baracos e Goldberg, (1986), o comprimento anatômico é essencial para uma correta medição da proteólise muscular, já que a não observância desta condição pode levar à indução do catabolismo, por exemplo, via aumento do influxo de cálcio para o sarcoplasma e ativação de proteases.
A questão da estabilidade e resistência metabólica também é de fundamental importância quanto ao uso e à extrapolação de resultados obtidos em modelos animais para humanos (Demetrius, 2005; revisão). Foi demonstrado que há uma correlação linear (#=24.09/+2.68) entre a porcentagem de atrofia e a taxa metabólica (consumo de O2por kg/h) (Rennie et al., 2009; revisão). Isto implica que animais de pequeno porte como camundongos, por terem menor fração de massa muscular em relação à massa corporal total, sejam mais susceptíveis à perda de proteína muscular para a manutenção da gliconeogênese e do sistema imunológico (Demetrius, 2005), e não satisfazem os requisitos bioquímicos básicos para a obtenção de resultados experimentais válidos para a extrapolação em modelo humano. Além disso, de acordo com a teoria proposta por Demetrius (2005), modelos experimentais que utilizam ratos, que invariavelmente possuem maior peso corporal em relação aos camundongos, propiciam a obtenção de resultados experimentais mais facilmente extrapoláveis para o modelo humano.
Em nosso estudo também constatamos que a proteólise muscular do rato impúbere está visivelmente aumentada em relação ao animal adulto (figura 14). Este resultado foi validado através do uso de inibidores que classicamente reduzem a proteólise muscular, como o depletor de ATP dinitrofenol (Furuno e Goldberg, 1986, Navegantes et al., 2000; Figura 15). A depleção de ATP muscular reduz a atividade do sistema ubiquitina*proteassoma dependente de ATP, culminando na redução global da degradação protéica (Furuno e Goldberg, 1986, Navegantes et al., 2000, Navegantes et al., 2009; revisão), indicando que a maior taxa de proteólise observada em músculos lumbricales de animais impúberes, em relação a músculos de animais adultos, não é devido a artefato do sistema.
Resultados anteriores de nosso laboratório já demonstravam alterações tróficas no decorrer da maturação do músculo. Como exemplo, a atividade da AChE de músculos EDL aumenta proporcionalmente ao crescimento do músculo até a puberdade (Souccar et al., 1988). Contudo, após este período, observa*se um aumento mais lento de AChE, de forma não paralela ao crescimento muscular (Souccar et al., 1988), indicando que a maturação animal altera proteínas chave de manutenção do trofismo muscular. A redução da proteólise muscular durante a maturação foi descrita em uma única publicação, utilizando como modelo experimental músculos de camundongos da linhagem B6C3F1 (Reynolds et al., 2002). Embora esses resultados tenham sido obtidos em espécie animal cuja extrapolação para humanos é questionável, os mesmos corroboram a hipótese da existência de uma correlação inversa entre crescimento e proteólise musculares (figura 14), o que poderia inviabilizar a extrapolação de resultados obtidos em animais impúberes para adultos.