CENTRO DE CIÊNCIA DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
EMILY RICELLY DA SILVA OLIVEIRA
Imunoexpressão da HSP27 em cistos radiculares e cistos residuais
NATAL/RN 2019
Imunoexpressão da HSP27 em cistos radiculares e cistos residuais
Trabalho de conclusão de curso apresentado ao Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como parte integrante dos requisitos para obtenção do título de Cirurgiã-Dentista. Orientadora: Márcia Cristina da Costa Miguel
NATAL/RN 2019
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Alberto Moreira Campos - -Departamento de Odontologia
Oliveira, Emily Ricelly da Silva.
Imunoexpresão da HSP27 em cistos radiculares e cistos residuais / Emily Ricelly da Silva Oliveira. - Natal, 2019. 37 f.: il.
Orientador: Profª. Drª. Márcia Cristina da Costa Miguel. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Odontologia) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Departamento de Odontologia, Natal, 2019.
1. Cisto radicular - Trabalho de Conclusão de Curso. 2. Cistos odontogênicos - Trabalho de Conclusão de Curso. 3. Imuno-histoquímica - Trabalho de Conclusão de Curso. 4. Proteínas de Choque Térmico HSP27 - Trabalho de Conclusão de Curso. I. Miguel, Márcia Cristina da Costa. II. Título.
RN/UF/BSO BLACK D6
Imunoexpressão de HSP27 em cistos radiculares e cistos residuais
Trabalho de conclusão de curso apresentado ao Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como parte integrante dos requisitos para obtenção do título de Cirurgião-Dentista.
Aprovada em: 20/11/2019
_______________________________________ Prof. Dra. Márcia Cristina da Costa Miguel Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Orientadora
_______________________________________ Prof. Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Banca Examinadora
_______________________________________ Prof. Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Objetivo: Avaliar a imunoexpressão de HSP27 em casos de cistos radiculares (CRs) e cisto radiculares residuais (CRRs), com o intuito de verificar se esta proteína influencia a patogênese dessas lesões periapicais (LPs). Metodologia: Vinte casos de CRs e vinte de CRRs foram submetidos à análise histopatológica sob microscópio de luz e categorizados quanto ao revestimento epitelial atrófico ou hiperplásico e intensidade do infiltrado inflamatório. A expressão de HSP27 foi avaliada através de imuno-histoquímica, verificando-se a positividade, distribuição e intensidade da marcação nas regiões do revestimento epitelial cístico. Os dados foram analisados através do programa estatístico SPSS na versão 22.0, onde os resultados foram submetidos às análises descritivas e testes estatísticos. Para todos os testes estatísticos foi estabelecido um nível de significância de 5% (p < 0,05). Resultados: A maioria dos CRs apresentou infiltrado inflamatório moderado/intenso e revestimento epitelial hiperplásico; os CRRs exibiram infiltrado predominantemente ausente/leve e epitélio atrófico; foi observada a correlação entre a intensidade do infiltrado inflamatório e o tipo de LP (p= <0,001), bem como entre a intensidade do infiltrado inflamatório e a imunomarcação (p=0,046). A HSP27 foi menos expressa na região superior dos CRs (p=0,019). Não houve associação entre o tipo de LP e o padrão da marcação para HSP27. Conclusões: A expressão da HSP27 identificada em CRs e CRRs sugere a sua participação na patogênese dessas lesões, especialmente na regulação do revestimento epitelial.
Palavras-chave: Cisto radicular. Cisto odontogênicos. Imuno-histoquímica. Proteínas de Choque Térmico HSP27.
Aim: To evaluate HSP27 expression in radicular cysts (RCs) and (RRCs), in order to verify if this protein influences the pathogenesis of these periapical lesions (PLs). Materials and methods: Twenty cases of RCs and twenty cases of RRCs were submitted to histologic analysis and categorized according to atrophic or hyperplastic epithelial lining and intensity of inflammatory infiltrate. HSP27 expression was evaluated by immunohistochemistry and performed by unifying the positivity, distribution and intensity of staining in the layers of the cystic epithelial lining. Data was analyzed using the statistical program SPSS 22.0, the results were submitted to descriptive analysis and statistical tests. For all statistical tests, a significance level of 5% (p <0.05) was established. Results: Most RCs showed moderate/intense inflammatory infiltrate and hyperplastic epithelial lining; RRCs were predominantly categorized as absent/mild infiltrate and atrophic epithelial lining; correlation between inflammatory infiltrate intensity and type of PL was observed (p = <0,001), as well as the inflammatory infiltrate and staining pattern (p=0,046). HSP27 was less expressed in the upper region of RCs (p = 0,019). There was no statistically significant association between PL types and HSP staining pattern. Conclusions: The expression of HSP27 identified in RCs and RRCs seems to influence the course of PLs, especially in the regulation of epithelial lining.
Keywords: Radicular cyst. Odontogenic Cysts. Immunohistochemistry. HSP27 Heat-Shock Proteins.
Tabela 1. Associação entre as características morfológicas e o tipo de lesão... 21 Tabela 2. Associação entre a espessura do epitélio e a intensidade do
infiltrado inflamatório em cada tipo de lesão... 21 Tabela 3. Imunoexpressão da HSP27 (regiões basal, suprabasal e superior)
por tipo de lesão... 22 Tabela 4. Associação da imunoexpressão da HSP27 (regiões basal, suprabasal
e superior) com o tipo de lesão... 22 Tabela 5. Associação entre a imunomarcação epitelial da HSP27 (regiões
basal, suprabasal e superior) e a intensidade do infiltrado
inflamatório em cistos radiculares e cistos radiculares residuais... 23 Tabela 6. Associação entre a distribuição da imunomarcação para HSP27 e o
INTRODUÇÃO... 6
MATERIAIS E MÉTODOS... 8
ANÁLISE MORFOLÓGICA... 8
ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO... 8
ANÁLISE DO PERFIL IMUNO-HISTOQUÍMICO... 9
ANÁLISE ESTATÍSTICA... 9 RESULTADOS... 10 ANÁLISE MORFOLÓGICA... 10 ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA... 10 DISCUSSÃO... 11 CONCLUSÃO... 15 AGRADECIMENTOS... 16 REFERÊNCIAS... 17 ANEXO... 25
INTRODUÇÃO
Infecções do canal radicular que levam à necrose pulpar, podem resultar no surgimento de lesões periapicais (LPs). Os dentes envolvidos não respondem aos testes de vitalidade pulpar, confirmando o diagnóstico clínico de necrose da polpa dentária. As LPs representam uma ação defensiva do organismo, secundária a um processo infeccioso, que dissemina-se em direção ao ápice radicular, causando destruição dos tecidos periradiculares e provocando o surgimento de entidades patológicas, como cistos radiculares (CR).1-5
O CR é definido como uma cavidade patológica, revestida por tecido epitelial, cuja patogênese está ligada a interação entre células epiteliais, tecido conjuntivo, matrizes ósseas e extracelulares. É responsável por 60% dos casos de lesões císticas de origem odontogênica, sendo diagnosticado, em sua maioria, em paciente com idade entre 20 e 40 anos.6, 1, 7, 8
Quando um CR não é removido durante a exodontia do elemento dentário associado, surgem os cistos radiculares residuais (CRR). Os CRRs são histopatologicamente semelhantes aos CR, porém, são encontrados em áreas edêntulas, após a remoção do elemento dentário necrosado, representando cerca de 3,3 a 18% de todos os cistos de natureza inflamatória, diagnosticados principalmente entre a 3ª e 6ª décadas de vida.9, 10, 5
A participação da resposta imune na patogênese destas lesões ainda não foi completamente esclarecida.11, 12 Através da investigação sobre a etiopatogenia das LPs, verificou-se que as proteínas de choque térmico (heat shock proteins - HSP) podem atuar na modulação do seu desenvolvimento.13, 14, 15
As HSPs são um conjunto de proteínas induzidas por hipertermia e injúrias celulares, transcritas a partir da regulação do fator de choque térmico HSF, durante o estresse celular.16, 17 Estas proteínas representam uma importante defesa frente aos desafios a que são expostas as células durante uma infecção, desencadeando ativação de macrófagos e citocinas pró-inflamatórias, atuando no transporte e degradação de proteínas e apoptose.15
A HSP27 é uma proteína de baixo peso molecular que atua na cicatrização de feridas, proliferação, diferenciação, proteção e apoptose celular durante o estresse inflamatório. A presença da HSP27 foi identificada em LPs de origem endodôntica, apontando seu possível papel na patogenicidade destas lesões, bem como na destruição tecidual periapical.15, 18, 19
Considerando que a elucidação do mecanismo desempenhado por estas proteínas na modulação destas reações periapicais é de extrema importância para a compreensão da evolução destas lesões que, além de muito comuns, frequentemente apresentam complicações clínicas, este estudo visou avaliar a imunoexpressão da HSP27 em casos de CRs e CRRs, buscando melhor esclarecer a atuação desta proteína em LPs de origem endodôntica.
MATERIAIS E MÉTODOS
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (número do parecer: 3.325.737).
As amostras de CRs e CRRs foram coletadas do serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral, do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN). Dentre os casos arquivados no laboratório de Anatomia Patológica da UFRN, foram selecionados 20 CRs e 20 CRRs para a realização do presente estudo.
ANÁLISE MORFOLÓGICA
Para análise morfológica, os espécimes foram cortados em secções de 5-µm de espessura, submetidos à coloração pela técnica da Hematoxilina/Eosina e observados sob microscópio de luz. A intensidade do infiltrado inflamatório foi avaliada em todos os espécimes. A partir da região subepitelial dos CRs e CRRs, em direção à profundidade da capsula, foi selecionado 1 campo microscópico sob aumento total de 200x, que foi dividido em três terços. As lesões foram então classificadas da seguinte forma: zero (ausência de infiltrado inflamatório), grau I (leve)/infiltrado inflamatório restrito ao primeiro terço, grau II (moderado)/infiltrado inflamatório até o segundo terço, ou grau III (intenso)/infiltrado inflamatório até o terceiro terço.20
Os revestimentos epiteliais dos CRs e CRRs foram avaliados adaptando-se o critério sugerido por Moreira et al., onde CRs e CRRs que apresentaram em sua maior extensão 2 a 10 camadas de células foram classificados como atróficos e os que revelaram mais de 10 camadas de células foram classificados como hiperplásicos.21
ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO
Os espécimes fixados em formol a 10% e emblocados em parafina foram submetidos a cortes de 3µm de espessura e estendidos em lâminas de vidro previamente limpas, preparadas com adesivo à base de Organosilano (3-aminopropyltrietoxi-silano, Sigma Chemical CO, St. Louis, MO, EUA). O material foi submetido ao anticorpo anti-HSP27 (Clone G31; Cell Signaling Technology®, diluição 1:4000; incubação 60’) e, posteriormente, as amostras foram incubadas com o sistema Hidef (Cell Marque, CA, USA). O controle positivo para o anticorpo anti-HSP27 foi realizado com cortes histológicos de carcinoma de mama. O controle negativo foi realizado a
partir da substituição dos anticorpos primários por albumina de soro bovino à 1% (BSA) em solução tampão.
ANÁLISE DO PERFIL IMUNO-HISTOQUÍMICO
A avaliação da imunoexpressão foi estabelecida baseando-se na positividade de marcação. Foram consideradas positivas todas as células que apresentaram pigmentação de coloração acastanhada. Para tanto, as amostras foram analisadas por dois examinadores previamente calibrados e os dados anotados em fichas elaboradas para o estudo, quando houve disparidade entre as análises, ou examinadores reavaliaram os casos em conjunto para alcançar um consenso. Cada espécime foi analisado sob microscópio de luz para quantificar a imunoexpressão da HSP27, foi utilizada uma adaptação da metodologia proposta por Luz et al.22 em que a expressão da proteína foi avaliada com base na intensidade de imunomarcação nas regiões basal, suprabasal e superior do revestimento epitelial dos cistos. Para a intensidade de marcação foi considerado escore 0 (negativa), 1 (fraca), 2 (moderada) e 3 (intensa).
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados obtidos foram organizados em um banco de dados informatizado com o auxílio do programa estatístico SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) na versão 22.0. O teste Exato de Fisher foi utilizado para investigar a associação entre o infiltrado inflamatório e o revestimento epitelial dos cistos, e entre o infiltrado inflamatório e a expressão de HSP27. Alguns grupos foram categorizados associadamente para a realização dos testes estatísticos, como o infiltrado inflamatório (zero + grau I + grau II versus grau III) e a intensidade da imunomarcação nas regiões epiteliais (ausente + leve versus moderada + intensa), para possibilitar a investigação entre a intensidade do infiltrado inflamatório e o revestimento epitelial das LPs, bem como da expressão de HSP27 por região, com o tipo de LP, através dos testes de qui-quadrado de Pearson e Exato de Fisher.
Para todos os testes estatísticos foi estabelecido um nível de significância de 5% (p < 0,05).
RESULTADOS
ANÁLISE MORFOLÓGICA
Foram analisados 20 casos de CRs e 20 casos de CRRs. O infiltrado inflamatório moderado/intenso foi encontrado em 90% dos CRs (n=18). Quanto ao revestimento epitelial, 60% (n=12) dos casos apresentaram epitélio hiperplásico. Nos CRRs, o infiltrado inflamatório ausente/leve predominou, representando 85% (n=17) das amostras. O revestimento epitelial atrófico foi identificado em 70% (n=14) dos casos (Tabela 1). Foi observada a correlação entre a intensidade do infiltrado inflamatório e o tipo de LP (p= <0,001) (Tabela 1). A avaliação da associação entre a espessura do revestimento epitelial e intensidade do infiltrado inflamatório, mostrou ausência de associação estatisticamente significativa entre as duas variáveis para esta amostra (p=1,000 e p=0,202) (Tabela 2).
ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA
Todas as amostras de CR e CRRs submetidas ao anticorpo anti-HSP27 mostraram marcação positiva para esta proteína.
As regiões basal e suprabasal dos CRs tiveram intensidade de marcação moderada/intensa em 60% dos casos (n=12), na região superior 85% dos casos tiveram marcação ausente/leve (Tabela 3). A região basal dos CRRs teve marcação moderada/intensa em 85% (n=17) das amostras. Na região suprabasal, a intensidade moderada/intensa foi identificada em 90% (n=18) dos casos. A região superior registrou marcação moderada/intensa para 55% (n=11) destes cistos (Fig. 1a-f).
A avaliação da associação entre o tipo de lesão e a intensidade da marcação para HSP27 nas diferentes regiões do epitélio cístico, revelou que há uma menor expressão desta proteína no terço superior de CRs (p=0,019) (Tabela 4). Os testes revelaram associação estatisticamente significativa entre a imunomarcação epitelial da HSP27 e a intensidade do infiltrado inflamatório cístico, 81% (n=17) das amostras com infiltrado moderado/intenso apresentaram marcação ausente/leve na região superior do epitélio (p= 0,046) (Tabela 5), não houve associação significativa entre os tipos de lesão e o padrão da marcação (focal ou difuso) (Tabela 6) pelo anti-HSP27.
DISCUSSÃO
A necrose pulpar de um elemento dentário e a consequente colonização microbiana do ápice radicular, provoca uma resposta do sistema imune do hospedeiro, levando ao surgimento de LPs que podem sofrer processos de agudização, quando há desestabilização do equilíbrio entre o fator etiológico e o sistema imunológico do paciente.1, 2, 4 O CR é o cisto inflamatório mais prevalente nos maxilares, por sua vez, os CRRs correspondem de 3,3 a 18% todos os cistos dessa natureza; ambos possuem etiologia comum, sendo distinguidos pela associação ou não a raiz de um dente.5, 8, 10
Em nosso estudo, a maioria dos CRs apresentou infiltrado inflamatório moderado/intenso, indicando que a presença do elemento dentário infectado, atuando continuamente como foco infeccioso, estimula o recrutamento de células inflamatórias. Como observado nos estudos de Mourão et al.,23 a presença de células inflamatórias em LPs está relacionada aos antígenos produzidos por este tipo de lesão, o infiltrado é composto de macrófagos, linfócitos, plasmócitos e monócitos. A remoção do foco de infecção leva a diminuição do estímulo ao sistema imune, reduzindo a intensidade do infiltrado inflamatório, como observado nos casos de CRRs, categorizados predominantemente como ausente/leve. Os achados de Lee et al.9 descrevem a redução da intensidade do infiltrado e da espessura do revestimento epitelial após a exodontia do elemento dentário afetado. Lin et al.24 também apontam que a redução dos mediadores inflamatórios, citocinas pró-inflamatórias e fatores de crescimento resultam na regressão do epitélio destes cistos, como visto em nosso estudo.
As HSPs têm sua síntese aumentada em resposta a situações que desencadeiam o estresse celular, tais como: presença de metais pesados, aumento da temperatura, toxinas, infecções virais e bacterianas, e alguns destes mecanismos então presentes nas LPs. A resposta ao estresse ocorre através da diminuição da produção de alguns polipeptídios e superexpressão das HSPs. Além de aumentar a termotolerância celular, a HSP27 atua na regulação da diferenciação celular epitelial e migração de ceratinócitos na cicatrização de feridas; pode bloquear a apoptose e protege as células contra citotoxicidade de mediadores inflamatórios.13, 25, 26 A superexpressão da HSP27 pode prover maior resistência ao choque térmico e estresse oxidativo.27
A HSP27 pode ser induzida por temperaturas que variam de 30 a 37°C, alcançando seu nível máximo a 35°C. Pode estar presente tanto no citoplasma, quanto no núcleo celular. Sua expressão nuclear está ligada a condições de choque térmico e estresse celular. A função
citoprotetora da HSP27 é associada com suas funções de chaperona, interferindo diretamente com a ativação de caspases e modulação do estresse oxidativo, regulando as dinâmicas do citoesqueleto através de sua interação com a actina, o que pode auxiliar na sobrevivência celular. A superexpressão e a subexpressão de HSP27 são associadas com diversas doenças em humanos, incluindo miopatia muscular, desordens neuronais e imunológicas. Presente em condições normais e de estresse, atuando para regular a sobrevivência celular e desempenhando papéis diversos em diferentes enfermidades, esta proteína pode ser considerada um importante alvo terapêutico.28
Neste estudo, investigamos o papel da HSP27 na modulação das lesões periapicais. Para testar nossa hipótese, nós avaliamos a intensidade da expressão desta proteína no revestimento epitelial de CRs e CRRs, dividindo-os em três regiões (basal, suprabasal e superior).
A observação das amostras submetidas ao anticorpo anti-HSP27 demonstrou a presença desta proteína em CR e CRRs, isto sugere que a expressão de HSP27 pode ocorrer após o surgimento das LPs, sendo desencadeado, provavelmente, pelo estresse celular local. As LPs apresentaram diferenças quanto a intensidade da imunomarcação para HSP27 nas regiões epiteliais avaliadas, sendo a distribuição moderada/intensa a mais prevalente nas regiões basal e suprabasal de ambas as lesões; na região superior, os CRRs dividiram-se entre marcações ausente/leve e moderada/intensa; predominou a marcação ausente/leve para CRs. Sua maior intensidade nas regiões basal e suprabasal do revestimento epitelial, abrangendo tanto células em proliferação, quanto células bem diferenciadas, sugere que esta proteína pode atuar na regulação do crescimento e migração celular, bem como na diferenciação de células epiteliais em LPs.
Estudos como o de Goodman et al.15 apontam que a HSP27 pode contribuir para migração de células epiteliais e aumento da resistência a morte por apoptose ou necrose. A migração epitelial sob atuação desta proteína vem sendo descrita desde 1998, quando os estudos de Laplante et al.29 associaram a HSP27 a migração de ceratinócitos durante o processo de cicatrização de feridas. Pesquisas posteriores também têm correlacionado a expressão dessa proteína a diferenciação celular, Mohtashan et al.30 sugerem sua participação na diferenciação de ceratinócitos e desenvolvimento da epiderme. Fortin et al.31 apontaram que em estágios avançados de carcinoma orofaríngeo, há baixa expressão dessa chaperona, fato corroborado por Romanucci et al.,32 que evidenciaram que essa HSP tem maior expressão em carcinomas de pele bem diferenciados, em comparação com espécimes de diferenciação moderada. Estes achados
foram compatíveis com a tendência de menor expressão de HSP27 em carcinomas de células escamosas pobremente diferenciados.33
A HSP27 é um componente da via de sinalização das proteínas cinases ativadas por mitogênio P38, que atua na integração dos estímulos fisiológicos e patológicos, bem como na resposta inflamatória. Leonardi et al.13 observaram a superexpressão desta proteína em restos epiteliais proliferativos e CRs na presença de infiltrado inflamatório intra ou subepitelial, em comparação com o epitélio não inflamado adjacente, indicando um possível efeito protetor desta molécula sobre as células epiteliais frente a processos inflamatórios.
Os resultados de Jiang et al.34 sugeriram que a expressão de HSP27 é maior com o aumento da inflamação em hiperplasia prostática benigna, podendo indicar que o estímulo inflamatório induz a expressão da proteína, que também se correlaciona com a maior prevalência de citocinas pró-inflamatórias. Entretanto, neste estudo, os cistos com maior quantidade de infiltrado inflamatório expressaram menos HSP27, este achado pode estar relacionado a produção local de IL-10, que afeta a ação anti-inflamatória destas proteínas, também influenciada pelo componente genético.35,36
Os experimentos de Nahomi et al.37 investigaram os efeitos das citocinas pró-inflamatórias na regulação da HSP27 em células endoteliais da retina, inicialmente, esperava-se o aumento da expressão de HSP27 frente a presença dos mediadores inflamatórios e estresse celular por eles provocado, no entanto, o achado foi que a combinação de citocinas pró-inflamatórias provoca a diminuição da expressão de HSP27. Este evento ocorreu em resposta a presença simultânea de TNF-α, IL-1β, IFN-γ, sugerindo que um mecanismo de cooperação entre estas citocinas pode levar a uma diminuição dos níveis de HSP27, através da formação de espécies reativas de oxigênio e óxido nítrico que permitem o surgimento de peroxinitrito. A suspeita parece ser corroborada pela adição de peroxinitrito ao meio de cultura utilizado, o que levou a maior diminuição dos níveis de HSP27. Estes achados podem ajudar a elucidar a menor expressão de HSP27 associada a alta intensidade do infiltrado inflamatório, encontrada nesta pesquisa.
Além da proteção contra mediadores citotóxicos, a HSP27 aumenta a resistência celular à apoptose, bloqueando as vias apoptóticas. Segundo Singh et al.28 a HSP27 protege as células da morte por necrose, apoptose e estresse fisiológico, podendo inibir as vias apoptóticas intrínseca e extrínseca. Kaigorodova et al.38 descreveram a participação da HSP27 na tolerância tumoral por
meio de diversos mecanismos, como proteção celular a citotoxicidade medicamentosa, bloqueando os eventos executores da via apoptótica. A HSP27 impede a formação dos apoptosomos por meio da ligação com o citocromo c no citoplasma celular, a fosfo-HSP27 liga-se a proteína Daxx e inibe a apoptoliga-se mediada pelo receptor Fas. Estes achados podem indicar que a expressão de HSP27 possivelmente ajuda na manutenção das LPs através da anti-apoptose. Nossos resultados indicam o possível papel dessa chaperona na modulação das LPs, entretanto, a avaliação do significado desta proteína para o prognóstico destas lesões é complexa, uma vez que a HSP27 desempenha diversos papéis, muitas vezes antagônicos e sítio-específicos. As limitações encontradas para a execução deste estudo devem-se a quantidade reduzida de amostras analisadas, dificultando a avaliação da relação desta proteína com o infiltrado inflamatório local e o tipo de lesão avaliada, bem como a ausência de um grupo controle, que permitiria quantificar os níveis de expressão desta HSP em condições não-patológicas.
Embora os mecanismos anti-apoptóticos da HSP27 possam ser descritos, suas atividades na migração e diferenciação celular ainda não estão completamente esclarecidas, tornando necessários estudos moleculares voltados para cada função da HSP27, que poderão ajudar a desvendar sua atuação nas lesões císticas de natureza inflamatórias que acometem a cavidade oral.
CONCLUSÃO
Nossos achados sugerem que a proteína HSP27 participa da patogenia de CRs e CRRs. Segundo a literatura, esta proteína influencia as células epiteliais, regulando a migração, diferenciação e auxiliando a sobrevida celular na hipóxia. Estes resultados ajudam a aprofundar o conhecimento sobre o papel do sistema imune nestas LPs. A elucidação dos mecanismos desempenhados por esta proteína pode, no futuro, melhorar os parâmetros diagnósticos e abordagem terapêutica a este tipo de lesão.
AGRADECIMENTOS
À Professora Doutora Márcia Cristina da Costa Miguel, minha orientadora, por sua paciência e dedicação durante cada passo da realização deste trabalho. Agradeço por ter me acolhido desde a iniciação científica, incentivando a curiosidade e pensamento crítico essenciais a um pesquisador desde o primeiro momento. Sua dedicação ao trabalho e busca incessante pelo conhecimento me inspiram e motivam a buscar a excelência.
À Natália Rodrigues Silva, por ter dedicado seu tempo e conhecimento a construção desta pesquisa, seu empenho e compromisso em entregar melhor a impulsionarão a um futuro brilhante.
À Rodrigo Porpino Mafra, que tão gentilmente se dispôs a me ajudar na realização dos testes estatísticos, este trabalho não estaria completo sem sua paciência e desprendimento.
Agradeço também a todos aqueles que contribuíram para minha formação. Aos professores com os quais aprendi além do conhecimento científico, aos pacientes que confiaram a mim sua saúde, aos dentistas e técnicos que facilitaram minhas atividades diárias.
REFERÊNCIAS
1. Berar AM, Bondor CI, Matros L, Câmpian RS. Radiological, histological and immunohistochemical evaluation of periapical inflammatory lesions. Rom J Morphol Embryol. 2016; 57(2): 419-425. PubMed PMID: 27516014.
2. Chananj A, Adhikari HD. Reliability of cone beam computed tomography as a biopsy independent tool in differential diagnosis of periapical cysts and granulomas: an in vivo study. J. Consery Dent. 2017; 20(5): 326-331. PubMed PMID: 29386780.
3. Huang Hy, Wang WC, Lin PY, Huang CP, Cheng CY, Chen YK. The roles of autophagy and hypoxia in human inflammatory periapical lesions. Int Endod Jornal. 2017; 51(S2): 127-145. PubMed PMID: 28439929.
4. Tavares DP, Rodrigues JT, Santos TCRB, Armada L, Pires FR. Clinical and radiological analysis of a series of periapical cysts and periapical granulomas diagnosed in a brazilian population. J Clin Exp Dent. 2017; 9(1): 129-135. PubMed PMID: 28149477.
5. Brito LNS, Almeida MMRL, Souza LB, Alves PM, Nonaka CFW, Godoy GP. Immunohistochemical analysis of galectins-1, -3, and -7 in periapical granulomas, radicular cysts, and residual radicular cysts. J Endod. 2018; 44: 728-733. PubMed PMID: 29510866.
6. Bernardi L, Visioli F, Nor C, Rados PV. Radicular cyst: an update of the biological factors related to lining epithelium. J. Endod. 2015; 41(12): 1951-1961. PubMed PMID: 26603778.
7. Álvares PR, Arruda JAA, Silva LP, Nascimento GJF, Silveira MMF, Sobral APV. Immunohistochemical expression of tgf-β1 and mmp-9 in periapical lesions. Braz. Oral resh. 2019 Nov 11; 31: 1-8. PubMed PMID: 28678970.
8. El-Naggar AK, Chan JKC, Takata T, Grandis JR, Slootweg PJ. World health organization classification of tumours: Pathology and genetics of head and neck tumours. 4th ed. Lyon: Iarc press; 2017.
9. Lee JS, Constandi J, Mandel L. The residual radicular cyst. Nys dent J. 2014; 80(4): 38-40. PubMed PMID: 25219063.
10. Tsvetanov TS. Residual cysts: a brief literature review. Int J Med Dent Sci. 2016; 5(2): 1341-1346.
11. Campos K, Franscisconi CF, Okehie V, et al. FOXP3 DNA methylation levels as a potential biomarker in the development of periapical lesions. J Endod. 2015; 41(2): 212-218. PubMed PMID: 25459573.
12. Dill A, Letra A, Souza LC, et al. Analysis of multiple cytokine polymorphisms in individuals with untreated deep carious lesions reveals il1b (rs1143643) as a susceptibility factor for periapical lesion development. J Endod. 2015; 41(2): 197-200. PubMed PMID: 25476976.
13. Leonardi R, Villari L, Caltabiano M, Travali S. Heat shock protein 27 expression in the epithelium of periapical lesions. J Endod. 2001; 27(2): 89-92. PubMed PMID: 11491645. 14. Suzuki T, Kumamoto H, Ooya Kiyoshi, Motegi K. Expression of inducible nitric oxide synthase and heat shock proteins in periapical inflammatory lesions. J Oral Pathol Med. 2002; 31(8): 488-493. PubMed PMID: 12220357.
15. Goodman SC, Letra A, Dorn S, et al. Expression of heat shock proteins in periapical granulomas. J. Endod. 2014; 40(6): 830-836. PubMed PMID: 24862711.
16. Nagaraja GM, Asea AAA. Heat Shock Proteins and Cancer. In: Asea AAA, Pedersen BK, editors. Heat Shock Proteins and Whole Body Physiology. 1st ed. New York, NY: Springer Science Business Media B.V.; 2010, p. 121-134.
17. Azad AA, Zoubeidi A, Gleave ME, Chi KN. Targeting heat shock proteins in metastatic castration-resistant prostate cancer. Nat Rev Urol. 2015; 12(1): 26-36. PubMed PMID: 25512207.
18. Cheng J, Zhen LV, Weng X, et al. Hsp27 acts as a master molecular chaperone and plays an essential role in hepatocellular carcinoma progression. Digestion. 2015; 92(4): 192-202. PubMed PMID: 26381739.
19. Karam J, Fadous-Khalifé MC, Tannous R, et al. Role of krüppel-like factor 4 and heat shock protein 27 in cancer of the larynx. Mol Clin Oncol. 2017; 7(5): 808-814. PubMed PMID: 29181170.
20. Tsai CH, Weng SF, Yang LC, Huang FM, Chen YJ, Chang YC. Immunohistochemical localization of tissue-type plasminogen activator and type I plasminogen activator inhibitor in radicular cysts. J Oral Pathol Med. 2004; 33(1): 156-161. PubMed PMID: 15128057.
21. Moreira PR, Santos DF, Martins RD, Gomes RS. CD57+ cells in radicular cyst. Int Endod J. 2000; 33(2): 99-102. PubMed PMID: 11307457.
22. Luz CCF, Noguti J, Araújo LB, Santos GMS, Gomes TS, Neto RA. Hsp27 and Hsp70 expression in esophageal squamous. Asian Pac J. Cancer Prev. 2017; 18(3): 789-794. PubMed PMID: 28441788.
23. Mourão RVC, Pinheiro Junior EC, Silva PGB, Turatti E, Mota MRL, Alves N. Study of the relationship between mononuclear inflammatory infiltrate and ki-67 and basement membrane and extracellular matrix protein expression in radicular cysts. Int Endod J. 2016; 49(5): 447-453. PubMed PMID: 26011468.
24. Lin LM, Ricucci D, Lin J, Rosenberg PA. Nonsurgical root canal therapy of large cyst-like inflammatory periapical lesions and inflammatory apical cysts. J Endod. 2009; 35(5): 607-615. PubMed PMID: 19410070.
25. Morimoto RI, Kline MP, Bimston DN, Cotto JJ. The heat-shock response: regulation and function of heat-shock proteins and molecular chaperones. Essays Biochem. 1997; 32: 17-29. PubMed PMID: 9493008.
26. Kline MP, Marimoto RI. Repression of the heat shock factor 1 transcriptional activation domain is modulated by constitutive phosphorylation. Mol Cell Biol. 1997; 17(4): 2107-2215. PubMed PMID: 9121459.
27. Hao X, Zhang S, Timakov B, Zhang P. The hsp27 gene is not required for drosophila development but its activity is associated with starvation resistance. Cell Stress Chaperon. 2007; 12(4): 364-372. PubMed PMID: 18229455.
28. Singh MK, Sharma B, Tiwari PK. A small heat shock protein: present understanding and future prospective. J Therm Biol. 2017; 69: 149-154. PubMed PMID: 29037376.
29. Laplante AF, Moulin V, Auger FA, et al. Expression of heat shock proteins in mouse skin during wound healing. J Histochem Cytochem. 1998; 46(11): 1291-2301. PubMed PMID: 9774628.
30. Mohtasham N, Babakoohi S, Montaser-Kouhsari L, et al. The expression of heat shock proteins 27 and 105 in squamous cell carcinoma of the tongue and relationship with clinicopathological index. Med Oral Patol Oral Cir Bucal. 2011; 16(6): 730-735. PubMed PMID: 21196872.
31. Fortin A, Raybaud-Diogène H, Têtu B, R Deschenes, Huot J, Landry J. Overexpression of the 27 KDa heat shock protein is associated with thermoresistance and chemoresistance but not with radioresistance. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2000; 46(5):1259-1266. Pubmed PMID: 10725639.
32. Romanucci M, Bongiovanni L, Marruchella G, et al. Heat shock proteins expression in canine intracutaneous cornifying epithelioma and squamous cell carcinoma. Vet Dermatol. 2005; 16(2): 108-116. PubMed PMID: 15842541.
33. Rocha KMS. Análise da proteína de choque térmico 27 (hsp27) em carcinomas de células escamosas de língua oral. 2018. [dissertação]. Programa de pós-graduação em Patologia Oral, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2018.
34. Jiang Y, Wang X, Guo Y, et al. Hsp27 expression in inflammatory Benign Prostatic Hyperplasia patients. Med sci monit. 2015; 21: 2976-2985. PubMed PMID: 26434601. 35. Miyata M, Sato H, Sato H, Sato Y, Kodama E, Kasukawa R. Significance of endogenous
heat shock protein in adjuvant arthritis. J Rheumatol. 1999; 26(10): 2210-2214. PubMed PMID: 10529142.
36. Xiao C, Chen S, Yuan M, et al. Expression of the 60 kDa and 71 kDa heat shock proteins and presence of antibodies against the 71 kDa heat shock protein in pediatric patients with immune thrombocytopenic purpura. BMC Blood Disord. 2004; 4(1): PubMed PMID: 15070425.
37. Nahomi RB, Palmer A, Green KM, Fort PE, Nagaraj RH. Pro-inflammatory cytokines downregulate Hsp27 and cause apoptosis of human retinal capillary endothelial cells. Biochim Biophys Acta. 2014; 1842(2): 164-174. PubMed PMID: 24252613.
38. Kaigorodova EV, Zavyalova MV, Bychkov VA, Perelmuter VM, Choynzonov EL. Functional state of the hsp27 chaperone as a molecular marker of an unfavorable course of larynx cancer. Cancer Biomarkers. 2016; 17(2): 145-153. PubMed PMID: 27540972.
Tabela 1. Associação entre as características morfológicas e o tipo de lesão. Natal-RN, 2019.
Fonte: Disciplina de patologia oral, Departamento de Odontologia/UFRN. Legenda: aTeste Qui-quadrado de Pearson (χ2); bTeste Exato de Fisher.
Tabela 2. Associação entre a espessura do epitélio e a intensidade do infiltrado inflamatório em cada tipo de lesão. Natal-RN, 2019.
Tipo de lesão/ Espessura do epitélio Infiltrado inflamatório p* Ausente – leve n (%) Moderado – intenso n (%) Cisto radicular Atrófico 1 (50,0) 7 (38,9) 1,000 Hiperplásico 1 (50,0) 11 (61,1)
Cisto radicular residual
Atrófico 13 (76,5) 1 (33,3) 0,202
Hiperplásico 4 (23,5) 2 (66,7)
Fonte: Disciplina de patologia oral, Departamento de Odontologia/UFRN. Legenda: *Teste Exato de Fisher.
Características morfológicas Tipo de lesão p Cisto radicular n (%)
Cisto radicular residual n (%) Espessura do epitélio Atrófico 8 (40,0) 14 (70,0) 0,057a Hiperplásico 12 (60,0) 6 (30,0) Infiltrado inflamatório Ausente – leve 2 (10,0) 17 (85,0) < 0,001b Moderado – intenso 18 (90,0) 3 (15,0)
Tabela 3. Imunoexpressão da HSP27 (regiões basal, suprabasal e superior) por tipo de lesão. Natal-RN, 2019. Tipo de lesão/Região epitelial Expressão da HSP27 Ausente – leve n (%) Moderada – intensa n (%) Cisto Radicular Basal 8 (40,0) 12 (60,0) Suprabasal 8 (40,0) 12 (60,0) Superior 17 (85,0) 3 (15,0)
Cisto radicular residual
Basal 3 (15,0) 17 (85,0)
Suprabasal 2 (10,0) 18 (90,0)
Superior 9 (45,0) 11 (55,0)
Fonte: Disciplina de patologia oral, Departamento de Odontologia/UFRN.
Tabela 4. Associação da imunoexpressão da HSP27 (regiões basal, suprabasal e superior) com o tipo de lesão. Natal-RN, 2019.
Região epitelial/ Tipo de lesão Expressão da HSP27 p* Ausente – leve n (%) Moderada – intensa n (%) Basal Cisto radicular 8 (72,7) 12 (41,4) 0,155
Cisto radicular residual 3 (27,3) 17 (58,6) Suprabasal
Cisto radicular 8 (80,0) 12 (40,0) 0,065
Cisto radicular residual 2 (20,0) 18 (60,0) Superior
Cisto radicular 17 (65,4) 3 (21,4) 0,019
Cisto radicular residual 9 (34,6) 11 (78,6)
Fonte: Fonte: Disciplina de patologia oral, Departamento de Odontologia/UFRN. Legenda: *Teste Exato de Fisher.
Tabela 5. Associação entre a imunomarcação epitelial da HSP27 (regiões basal, suprabasal e superior) e a intensidade do infiltrado inflamatório em cistos radiculares e cistos radiculares residuais. Natal-RN, 2019. Região epitelial/ Imunomarcação da HSP27 Infiltrado inflamatório p* Ausente – leve n (%) Moderado – intenso n (%) Basal Ausente – leve 4 (21,1) 7 (33,3) 0,488 Moderada – intensa 15 (78,9) 14 (66,7) Suprabasal Ausente – leve 2 (10,5) 8 (38,1) 0,069 Moderada – intensa 17 (89,5) 13 (61,9) Superior Ausente – leve 9 (47,4) 17 (81,0) 0,046 Moderada – intensa 10 (52,6) 4 (19,0)
Fonte: Disciplina de patologia oral, Departamento de Odontologia/UFRN. Legenda: * Teste Exato de Fisher.
Tabela 6. Associação entre a distribuição da imunomarcação para HSP27 e o tipo de lesão. Natal-RN, 2019. Distribuição da imunomarcação Tipo de lesão p* Cisto radicular n (%)
Cisto radicular residual n (%)
Focal 10 (50,0) 8 (40,0) 0,525
Difusa 10 (50,0) 12 (60,0)
Fonte: Disciplina de patologia oral, Departamento de Odontologia/UFRN. Legenda: *Teste Qui-quadrado de Pearson (χ2).
Figura 1: Imunoexpressão da HSP 27. A, B e C – Cisto radicular: A) Epitélio hiperplásico com intensa marcação nos três terços; B) Epitélio hiperplásico com moderada marcação nos terços basal/suprabasal e intenso no terço superior e C) Epitélio hiperplásico com moderada marcação nos terços basal/suprabasal e ausente no superior. D, E e F – Cisto residual: D) Epitélio atrófico com intensa marcação nos três terços; E) Epitélio atrófico com moderada marcação nos terços basal/suprabasal e leve na superior e F) Epitélio hiperplásico sem imunomarcação no terço basal e leve marcação nos terços suprabasal/superior. (A – 90 µm, B – 100 µm, C – 200 µm, D – 100 µm, E - 200 µm, F – 90 µm).
