1 Autor, Bolsista CNPq (PIBIC): Graduação em Farmácia, UNIFAJ, Jaguariúna 2 Pesquisador da Embrapa Meio Ambiente, Jaguariúna
3 Orientador: Pesquisador da Embrapa Meio Ambiente, Jaguariúna
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE COMPONENTES DE ÓLEOS ESSENCIAIS FRENTE AOS PATÓGENOS Aeromonas
Maria Carolina Bertolo Bonin¹; Ana Lucia
RESUMO – O consumo e cultivo Streptococcus agalactiae podem animais. Para sanar este problema
causar resistência microbiana, deixar resíduos no alimento
têm sido realizadas buscas por novos antimicrobianos eficazes e q meio ambiente, aos animais e consumidores finais.
antimicrobiano de carvacrol, carvona, citral, eucaliptol, eugenol, linalol, L-limoneno,
difusão em ágar e pela concentração inibitória mínima (CIM) contra Os compostos carvacrol, citral, t
maiores que 32mm e 25,5mm,
resultados indicam que esses compostos produtos com ação inibitória contra os
Palavras-chaves: Carvacrol; Citral
1 Autor, Bolsista CNPq (PIBIC): Graduação em Farmácia, UNIFAJ, Jaguariúna-SP; mariacarolinabertolo@gmail.com 2 Pesquisador da Embrapa Meio Ambiente, Jaguariúna-SP;
Meio Ambiente, Jaguariúna-SP; sonia.queiroz@embrapa.br
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE COMPONENTES DE ÓLEOS ESSENCIAIS FRENTE AOS eromonas hydrophila E Streptococcus agalactiae
Ana Lucia Penteado2; Sonia Claudia do Nascimento de
Nº 20406
e cultivo de peixes contaminados com Aeromonas hydrophila ocasionar doenças infecciosas tanto em seres humanos
Para sanar este problema utilizam-se antibióticos, porém seu uso indiscriminado pode deixar resíduos no alimento e contaminar o meio ambiente.
por novos antimicrobianos eficazes e que causem menor impacto ao animais e consumidores finais. Neste trabalho foi avaliado o potencial carvacrol, carvona, citral, D-limoneno, nerolidol, terpineol, terpinoleno, timol,
limoneno, α-pineno, β-cariofileno, β-pineno e γ concentração inibitória mínima (CIM) contra A. hydrop
terpinoleno e timol foram os que apresentaram frente à A. hydrophila e à S. agalactiae,
compostos podem contribuir para o desenvolvimento de novos contra os patógenos estudados.
Citral; Bacterioses; Piscicultura; Terpinoleno; Timol
SP; mariacarolinabertolo@gmail.com sonia.queiroz@embrapa.br
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE COMPONENTES DE ÓLEOS ESSENCIAIS FRENTE AOS agalactiae
Sonia Claudia do Nascimento de Queiroz³;
Aeromonas hydrophila e seres humanos como em uso indiscriminado pode o meio ambiente. Então, ue causem menor impacto ao Neste trabalho foi avaliado o potencial limoneno, nerolidol, terpineol, terpinoleno, timol, γ-terpineno, através de hydrophila e S. agalactiae. que apresentaram halos de inibições , respectivamente. Os podem contribuir para o desenvolvimento de novos
ABSTRACT – The consumption and cultivation of fish contaminated with
and Streptococcus agalactiae can cause infectious diseases in both humans and animals. Antibiotics are used to solve the
resistance, leave residues in the food have been carried out to find new
environment, animals and consumers. In this work, the
citral, D-limonene, nerolidol, terpineol, terpinolene, thymol, eucalyptol, eugenol, linalool, L α-pinene, β-caryophyllene, β-pinene and
by the minimum inhibitory concentration (MIC) against compounds carvacrol, citral, terpinolene and thymol 32mm and 25.5mm to A. hydrophila
compounds can contribute to the development of new products with an inhibitory action against the studied pathogens.
Keywords: Carvacrol; Citral; Bacteriosis;
1 INTRODUÇÃO
A prevalência de doenças transmitidas por a
apresentam como causa principal microrganismos patogênicos, em especial as bactérias 2010), as quais ocasionam toxidade
de alterações organolépticas aparentes com maior risco de contaminação Diversos fatores corroboram para
armazenamento, até o preparo do alimento pelo consumidor geralmente crus ou malcozidos (SANTIAGO
Em 2018 foram produzidos
mais de 85% destinaram-se ao consumo humano pelo notável valor nutritivo dos
importantes para saúde humana
com o papel de produzir em larga escala esses organismos aquáticos Contudo, há fatores que alteram
a qualidade da água, o acúmulo de materiais orgânicos,
The consumption and cultivation of fish contaminated with Aeromonas hydrophila can cause infectious diseases in both humans and animals. solve these problems, but their indiscriminate use can cause micro resistance, leave residues in the food, and contaminate the environment. In this context
to find new antimicrobials that are effective and also have l
environment, animals and consumers. In this work, the antimicrobial potential of carvacrol, carvone, limonene, nerolidol, terpineol, terpinolene, thymol, eucalyptol, eugenol, linalool, L
pinene and γ-terpinene, was evaluated through diffusion minimum inhibitory concentration (MIC) against A. hydrophila and
compounds carvacrol, citral, terpinolene and thymol presented inhibition A. hydrophila and S. agalactiae, respectively. The resul
compounds can contribute to the development of new products with an inhibitory action against the
Bacteriosis; Fish-farming; Terpinolene; Thymol.
doenças transmitidas por alimentos (DTA) em nível internacional omo causa principal microrganismos patogênicos, em especial as bactérias
toxidade alimentar em humanos, majoritariamente alterações organolépticas aparentes (OLIVEIRA et al., 2010; SANTIAGO et al
com maior risco de contaminação no conceito microbiológico são os peixes e frutos do mar iversos fatores corroboram para essa transmissão, desde o cultivo desses animais,
preparo do alimento pelo consumidor final, os quais são ingeridos (SANTIAGO et al., 2013).
oram produzidos mundialmente 179 milhões de toneladas de pescado ao consumo humano (COLPANI, 2020). A alta
pescados, posto que possui alto teor de vitaminas e proteínas a (CAMPOS, 2019; MENEZES, 2006). Assim, a aq
com o papel de produzir em larga escala esses organismos aquáticos
a sanidade nos viveiros, como as altas concentrações acúmulo de materiais orgânicos, temperatura e salinidade
2
Aeromonas hydrophila can cause infectious diseases in both humans and animals. , but their indiscriminate use can cause microbial In this context, studies have low impact on the antimicrobial potential of carvacrol, carvone, limonene, nerolidol, terpineol, terpinolene, thymol, eucalyptol, eugenol, linalool, L-limonene, through diffusion in agar and and S. agalactiae. The diameter greater than , respectively. The results indicate that these compounds can contribute to the development of new products with an inhibitory action against the
em nível internacional omo causa principal microrganismos patogênicos, em especial as bactérias (SILVA, , majoritariamente por não ter presença
et al., 2013). Alimentos
são os peixes e frutos do mar. s animais, o processo de os quais são ingeridos
179 milhões de toneladas de pescado e, destes, demanda foi motivada , posto que possui alto teor de vitaminas e proteínas Assim, a aquicultura vem com o papel de produzir em larga escala esses organismos aquáticos (CARVALHO, 2012). concentrações de animais, temperatura e salinidade do ambiente
(KUBITZA, 2005). O conjunto dessas condições torna o sistema de pescados suscetível à contaminação por patógenos
Aeromonas hydrophila e o Streptococcus
maiores causadores de mortalidade A Aeromonas hydrophila animais (CANGUSSU, 2019; SILVA
água (doce, salgada, potável e de reuso), no esgoto e em alimentos presentes nos peixes causam nestes,
todo o corpo, incluindo ulcerações, hemorragias e septicemia
2005). Nos viveiros é causadora de elevada mortalidade, antes mesmo do desenvolvimento de sinais clínicos, ou entre 2 a 10 dias após a pres
bactéria pode produzir exotoxinas e multiplica adequadas para refrigeração (CANGUSSU, 2019
Streptococcus agalactiae
hospedeiros, sendo considerado
FIGUEIREDO, 2006), podendo causar (TRABULSI et al., 1989). Nos peixes
do sistema nervoso e sinais como os ocasionados por comumente mortalidade nesses animais (KUBITZA, 2005;
O uso indiscriminado de antibióticos acarret
resistentes, colocando em risco a saúde humana e animal necessário o fomento de novos compostos
al., 2008), com menor toxidade aos o al., 2012; TRAESEL, 2011), bem
biossegurança no manejo aquícola, para redução de perdas e de contaminações (KUBITZA, 2005). Óleos essenciais podem ser utilizados como uma alternativa ao uso de antibiótico
eles uma mistura de compostos voláteis, lipofílic São oriundos de metabólitos secundários e concentração de acordo com fatores, como (MORAIS, 2009). Estes compostos antibacteriana (RODRIGUES, 2017)
componentes dos óleos essenciais, que desempenham funções antibacterianas comprovadas e utilizadas na indústria. Em temperatura ambiente
. O conjunto dessas condições torna o sistema de produção à contaminação por patógenos (CARVALHO, 2012; KUBITZA, 2005
Streptococcus agalactiae os patógenos mais comuns encontrados e
causadores de mortalidade em peixes de água doce e salgada (MARTINS
é um bacilo Gram-negativo, patogênico para seres humanos e ILVA, 2010), possui mobilidade, podendo ser encontrad
de reuso), no esgoto e em alimentos (LEIRA nestes, diminuição do consumo de alimentos todo o corpo, incluindo ulcerações, hemorragias e septicemia dos seus órgãos
Nos viveiros é causadora de elevada mortalidade, antes mesmo do desenvolvimento de sinais clínicos, ou entre 2 a 10 dias após a presença desta bactéria (LEIRA
exotoxinas e multiplicar-se mesmo em temperaturas CANGUSSU, 2019; PEIXOTO et al., 2012).
Streptococcus agalactiae é um coco Gram-positivo, capaz de contaminar diversos
considerado um patógeno emergente de peixes (TRABULSI
, podendo causar meningites e septicemias em humanos e animais . Nos peixes acarreta modificação da motilidade, lesões na pele,
sinais como os ocasionados por A. hydrophila, tais manifestações ocasionam comumente mortalidade nesses animais (KUBITZA, 2005; MARCUSSO et al.,
de antibióticos acarreta na seletividade de risco a saúde humana e animal (PONTES, 2017).
compostos com ação antimicrobiana (SILVA aos organismos aquáticos e de baixo impacto
, bem como a adoção de medidas preventivas e boas práticas de biossegurança no manejo aquícola, para redução de perdas e de contaminações (KUBITZA, 2005).
podem ser utilizados como uma alternativa ao uso de antibiótico voláteis, lipofílicos e de odores característico
de metabólitos secundários de todas as partes das plantas, com variações de função fatores, como espécie vegetal, sazonalidade e métodos de extração MORAIS, 2009). Estes compostos desempenham múltiplas funções, dentre elas
(RODRIGUES, 2017). Os compostos carvacrol, citral, timol e
componentes dos óleos essenciais, que desempenham funções antibacterianas comprovadas e utilizadas na indústria. Em temperatura ambiente, os três primeiros se apresentam na forma liquida 3 produção intensivo de KUBITZA, 2005;), sendo a mais comuns encontrados e os
(MARTINS et al., 2011). para seres humanos e , podendo ser encontrado no solo, na LEIRA et al., 2016). Quando diminuição do consumo de alimentos e manifestações por órgãos internos (KUBITZA, Nos viveiros é causadora de elevada mortalidade, antes mesmo do desenvolvimento de (LEIRA et al., 2016). Esta em temperaturas consideradas
z de contaminar diversos (TRABULSI et al., 1989; meningites e septicemias em humanos e animais lesões na pele, necrose , tais manifestações ocasionam
., 2017).
seletividade de cepas bacterianas PONTES, 2017). Por isso se faz et al., 2012; SMITH et impacto ambiental (SILVA et como a adoção de medidas preventivas e boas práticas de biossegurança no manejo aquícola, para redução de perdas e de contaminações (KUBITZA, 2005). podem ser utilizados como uma alternativa ao uso de antibióticos, sendo
característicos (FERREIRA, 2014). partes das plantas, com variações de função sazonalidade e métodos de extração desempenham múltiplas funções, dentre elas a ação imol e terpinoleno são componentes dos óleos essenciais, que desempenham funções antibacterianas comprovadas e os três primeiros se apresentam na forma liquida
enquanto o último como cristais (ALMEIDA, 2015;
OLIVEIRA, 2008). Possuem mecanismo de ação semelhante aos dos antibióticos, permeabilidade da membrana plasmática ou
(ERNANDES; GARCIA-CRUZ, 2007;
O objetivo deste trabalho foi avaliar concentração bactericida mínima
patógenos de importância para a
2 MATERIAL E MÉTODOS
A pesquisa foi realizada no Laboratório Embrapa Meio Ambiente, Jaguariúna
2.1 Patógenos bacterianos
Os patógenos de origem animal utilizados neste estudo foram o (ATCC 13813) e a Aeromonas hydrophila
Pesquisas e Tecnologia Andre Tosello
2.2 Preparo das culturas bacterianas As culturas de S. agalactiae
mL de TSA inclinado, com auxílio de uma alça bacteriológica a 35 ± 2°C. Após
esterilizada, as colônias foram repica solução salina estéril, para os testes de para os testes de concentração inibitóri foram ajustadas para aproximadamente 1x equipamento densimat (Biomerieux)
Para controle da concentração de bactéria inoculada nos testes foram realizadas
destes microrganismos para cada experimento por meio de diluições do inóculo inicial em água peptonada. Sendo elas a diluição inicial a solução salina para o “screening” e TSB para CIM, sendo transferidas para soluções seriadas de 1 a 6. E então
formadoras de colônias (UFC/mL) das diluições representadas pelos números 5 e 6, sendo 1mL cada diluição repicadas para toda
cristais (ALMEIDA, 2015; AZAMBUJA, 2016;
mecanismo de ação semelhante aos dos antibióticos, permeabilidade da membrana plasmática ou inibindo os sistemas enzimáticos
CRUZ, 2007; FERREIRA, 2014).
O objetivo deste trabalho foi avaliar, in vitro, a concentração inibitória mínima concentração bactericida mínima de compostos presentes em alguns óleos essenciais, frente aos
piscicultura: A. hydrophila e S. agalactiae.
A pesquisa foi realizada no Laboratório de Microbiologia Ambiental Embrapa Meio Ambiente, Jaguariúna-SP, no período de agosto de 2019 a março
rigem animal utilizados neste estudo foram o Streptococcus agalactiae
Aeromonas hydrophila (ATCC 7966), doados pela F
Andre Tosello.
Preparo das culturas bacterianas
S. agalactiae e A. hydrophila foram ativadas em tubos
com auxílio de uma alça estéril, e incubadas por 24 horas em estufa Após o crescimento destes microrganismos, com
repicadas, separadamente, para tubos de ensaio contendo 5ml de , para os testes de “screening” e em 5ml de Trypticase Soy Broth (T
de concentração inibitória (CIM). As concentrações das suspensões foram ajustadas para aproximadamente 1x108 UFC/mL, na escala MacFarland equipamento densimat (Biomerieux).
Para controle da concentração de bactéria inoculada nos testes foram realizadas
destes microrganismos para cada experimento por meio de diluições do inóculo inicial em água peptonada. Sendo elas a diluição inicial a solução salina para o “screening” e TSB para CIM, sendo transferidas para soluções seriadas de 1 a 6. E então, realizada a contagem de unidades formadoras de colônias (UFC/mL) das diluições representadas pelos números 5 e 6, sendo 1mL
repicadas para toda a superfície das placas de Petri contendo
4 AZAMBUJA, 2016; AZAMBUJA, 2017; mecanismo de ação semelhante aos dos antibióticos, alterando a inibindo os sistemas enzimáticos das bactérias
a concentração inibitória mínima e óleos essenciais, frente aos
de Microbiologia Ambiental – Raquel Ghini da março de 2020.
Streptococcus agalactiae
, doados pela Fundação Tropical de
foram ativadas em tubos de ensaio contendo 5 estéril, e incubadas por 24 horas em estufa com auxílio de uma alça de ensaio contendo 5ml de Trypticase Soy Broth (TSB) estéril ). As concentrações das suspensões bacterianas na escala MacFarland, com auxílio do
Para controle da concentração de bactéria inoculada nos testes foram realizadas contagens destes microrganismos para cada experimento por meio de diluições do inóculo inicial em água peptonada. Sendo elas a diluição inicial a solução salina para o “screening” e TSB para CIM, sendo , realizada a contagem de unidades formadoras de colônias (UFC/mL) das diluições representadas pelos números 5 e 6, sendo 1mL de placas de Petri contendo meio TSA fundido à
450C. Em seguida, foi realizada a homogeneização
dentro da câmara e incubação em estufa bacteriológica à 35 ± 2°C por 24 horas.
2.3 “Screening" dos compostos isolados Utilizou-se para a avaliação da atividade
disco, realizado conforme descrito na Farmacopeia VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2019), p
presentes em alguns óleos essenciais
Para avaliação do potencial antibacteriano desses compostos foram utilizadas Petri descartáveis estéreis de 9 cm
item anterior contendo o patógeno
Agar (TSA), previamente vertido na placa de Petri. placas, com o auxílio de uma pinça
cada composto descritos na Tabela 1.
por estar na forma de cristais, foi necessário
sem diluição (puros) e com diluição utilizando o solvente 250mg/ml. As placas de Petri foram incubadas
Após esse período, foi feita a medição de acordo com a reatividade de 0 a 4
Farmacopeia Brasileira (AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2019). seleção dos compostos para os testes de CIM e CBM
delimitados e igual ou maior que o controle Florfenicol® triplicata, sendo cada repetição uma placa de Petri estudados para controle do inóculo inicial des controle positivo foi utilizado disco de Florfenicol®,
para tratamento de peixes, e o controle negativo foi utilizado utilizado para diluir o timol.
a homogeneização do meio com o inóculo, seguido de em estufa bacteriológica à 35 ± 2°C por 24 horas.
dos compostos isolados de óleos essenciais
para a avaliação da atividade antimicrobiana o método de difusão em ágar por descrito na Farmacopeia Brasileira (AGÊNCIA NACIONAL DE
, para avaliar o potencial antibacteriano de essenciais, e sua concentração conforme mostra a
Para avaliação do potencial antibacteriano desses compostos foram utilizadas Petri descartáveis estéreis de 9 cm, uma para cada composto testado. A solução
o patógeno foi transferida com auxílio do SWAB, para o meio T Agar (TSA), previamente vertido na placa de Petri. Em seguida, foi depositado
com o auxílio de uma pinça esterilizada, um disco de papel de filtro estéril abela 1. Os compostos estavam na forma liquida
foi necessário realizar sua diluição. Os compostos com diluição utilizando o solvente hexano (timol)
foram incubadas em estufa bacteriológica a 35 ± 2°C por 24 horas i feita a medição do halo de inibição com régua milimétrica
de 0 a 4 para teste de difusão em ágar, conforme (AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2019).
seleção dos compostos para os testes de CIM e CBM foi a apresentação de halo de inibição bem delimitados e igual ou maior que o controle Florfenicol®. Cada experimento foi executado
sendo cada repetição uma placa de Petri. Foram realizadas contagens dos patógenos estudados para controle do inóculo inicial destes microrganismos, conforme o item anterior controle positivo foi utilizado disco de Florfenicol®, que é um dos poucos
para tratamento de peixes, e o controle negativo foi utilizado o solvente
5 seguido de resfriamento em estufa bacteriológica à 35 ± 2°C por 24 horas.
de difusão em ágar por (AGÊNCIA NACIONAL DE de 16 compostos puros, onforme mostra a Tabela 1.
Para avaliação do potencial antibacteriano desses compostos foram utilizadas 16 placas de solução salina descrita no do SWAB, para o meio Tryptic Soy depositado no centro destas ro estéril, contendo 5μL de na forma liquida, exceto o timol, que Os compostos foram utilizados em concentração de 35 ± 2°C por 24 horas. halo de inibição com régua milimétrica e a classificação , conforme descrito na (AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2019). O critério para de halo de inibição bem Cada experimento foi executado em Foram realizadas contagens dos patógenos , conforme o item anterior. Para antibióticos aprovados o solvente hexano, por ter sido
Tabela 1. Compostos encontrados em alguns óleos essenciais e as concentrações testadas contra os
patógenos Aeromonas hydrophila e Streptococcus agalactiae
Substâncias testadas em diferentes concentrações: com diluição em hexano (timol) e sem diluição (forma pura, conforme adquirida comercialmente).
2.4 Determinação das Concentrações
Foi realizada a pesagem individual de 0,1g volumétrico de 1ml, estéril e, em seguida foi
previamente preparado e estéril acrescido de Tween 80 a solução mãe. Em seguida, foi realizada agitação manual para meio. Posteriormente foi feita a diluição seriada d
previamente esterilizados, nomeados detalhadas na Tabela 2.
Tabela 2. Concentração (mg/ml) dos compostos da diluição seriada em seus respectivos tubos.
Tubo A B
Concentração
(mg/ml) 100 50
Para avaliação da concentração inibitória mínima descartáveis e estéreis. Em cada poço foi
cada composto, em triplicata, separadamente em cada poço 100
S. agalactiae) em caldo TSB, resultando em 200
inoculação das bactérias (0 horas)
agitada por 20s, para não ocorrer precipitação d foi incubada em estufa bacteriológica
crescimento e uma nova leitura em espectrofotômet
Nome do composto Carvacrol Carvona Citral D-Limoneno Eucaliptol Eugenol Linalol L-Limoneno
s em alguns óleos essenciais e as concentrações testadas contra os
Streptococcus agalactiae.
Substâncias testadas em diferentes concentrações: com diluição em hexano (timol) e sem diluição (forma pura,
Concentrações Inibitória e Bactericida Mínima
realizada a pesagem individual de 0,1g de cada um dos compostos
m seguida foi adicionado a esse balão o meio de cultura TSB, previamente preparado e estéril acrescido de Tween 80 a uma concentração de 1%
realizada agitação manual para homogeneização a diluição seriada desta solução mãe (A) nomeados pelas letras do alfabeto de B a L
Concentração (mg/ml) dos compostos da diluição seriada em seus respectivos tubos.
C D E F G H I
25 12,5 6,25 3,13 1,56 0,78 0,39 0,20
a concentração inibitória mínima foram utilizadas micro
cada poço foi adicionado 100µl de cada diluição seriada de A conforme descrito anteriormente. Em seguida foi adicionado separadamente em cada poço 100μl de suspensão bacteriana (1x108 UFC/mL
em caldo TSB, resultando em 200μl de volume final. Foi realizada inoculação das bactérias (0 horas) de cada placa em espectrofotômetro a
, para não ocorrer precipitação dos compostos e do patógeno
foi incubada em estufa bacteriológica a 35 ± 2°C por 24 horas e realizada a observação de e uma nova leitura em espectrofotômetro em 620mn e agitação de 20s
Concentração
(mg/ml) composto Nome do Concentração(mg/ml)
Puro Nerolidol Puro
Puro Terpeneol Puro
Puro Terpinoleno Puro
Puro Timol 250mg/ml
Puro α-Pineno Puro
Puro β-Cariofileno Puro
Puro β-Pineno Puro
Puro γ-terpineno Puro
6
s em alguns óleos essenciais e as concentrações testadas contra os
Substâncias testadas em diferentes concentrações: com diluição em hexano (timol) e sem diluição (forma pura,
compostos em um balão o meio de cultura TSB, concentração de 1%, formando a homogeneização do composto com o (A) para 11 eppendorfs, a L, nas concentrações
Concentração (mg/ml) dos compostos da diluição seriada em seus respectivos tubos.
J K L
0,20 0,10 0,05
microplacas de 96 poços 100µl de cada diluição seriada de A L de Em seguida foi adicionado UFC/mL de A. hydrophila ou realizada leitura após a a 620nm, previamente s e do patógeno. Em seguida a placa e realizada a observação de 620mn e agitação de 20s.
Concentração (mg/ml)
Após 24 horas da incubação das
puras e o inóculo de cada microrganismo foi realizado o teste de Concentração Bactericida Mínima (CBM). Para isso, foram retirados
transferido para placas de Petri previamente vertidas contendo o meio de cultura placas foram incubadas em estufa bacteriológica
realizada a leitura quanto à presença ou ausência em UFC. adicionado a cada um dos poços das
de 2,3,5-trifeniltetrazólio a 0,5% para confirmação visual célula apresenta coloração vermelha.
Cada experimento foi realizado
Cloranfenicol® com patógeno e o meio de cultura sem inóculo. Como controle positivo foi inoculado o patógeno ao seu meio de crescimento TSB.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Teste de “screening" dos
As atividades antibacteriana
agalactiae é apresentada na Tabela 3.
de inibição detectável para A. hydrophila
apresentaram os maiores halos de inibição, reatividade 4 classificada como forte, apresentando
al. (2017) descreveram Carvacrol e
positivas e negativas, pela alteração da membrana celular desses microrganismos. óleos essenciais vem sendo estudada para substituição de antibióticos
demonstrado atividade antimicrobian
(2020), em que seu uso evitou o surgimento de usuais.
Carvacrol, citral, timol e terpinoleno apresentaram atividade inibitória para inibição ≥ 26,5mm. Os compostos
ilustra a Figura 1. Para esse patógeno
não apresentou nenhum efeito antibacteriano limoneno, β-Pineno e γ-terpineno
diferenciação na composição da membrana plasmática negativas, conforme descrito por
a incubação das microplacas de 96 poços com as diluições d
o inóculo de cada microrganismo foi realizado o teste de Concentração Bactericida Mínima s 10μl de cada poço da microplaca utilizada para o teste de CIM previamente vertidas contendo o meio de cultura
foram incubadas em estufa bacteriológica a 35 ± 2°C por 24 horas e após esse período presença ou ausência em UFC. Logo após a realização d
os poços das microplacas de 96 poços, uma solução reveladora de cloreto trifeniltetrazólio a 0,5% para confirmação visual da inibição. O composto em presença de apresenta coloração vermelha.
foi realizado em triplicata, utilizados como controles negativos o Cloranfenicol® com patógeno e o meio de cultura sem inóculo. Como controle positivo foi inoculado
tógeno ao seu meio de crescimento TSB.
ÃO
s compostos puros
antibacterianas dos 16 compostos testados contra é apresentada na Tabela 3. Os compostos nerolidol e β-cariofileno
A. hydrophila. Carvacrol, citral, timol e terpinoleno
apresentaram os maiores halos de inibição, reatividade 4 (conforme descrito no ítem 2.3), apresentando zonas de inibição ≥ a 32mm contra A. hydrophila
Carvacrol e timol como inibidores do crescimento de bactérias Gram positivas e negativas, pela alteração da membrana celular desses microrganismos.
sendo estudada para substituição de antibióticos na indústria antimicrobiana efetiva em diversos estudos, como o realizado
evitou o surgimento de cepas resistentes de A. hydrophila
erpinoleno apresentaram atividade inibitória para
s compostos timol e terpinoleno apresentaram halos bem definidos, como atógeno foi possível verificar que um número de
não apresentou nenhum efeito antibacteriano (Tabela 3), sendo eles D-limoneno, eucaliptol, L terpineno. Esse número de compostos sem atividade
composição da membrana plasmática das bactérias Gram positivas e descrito por Oliveira (2008) que observou que os óleos essenciais
7 com as diluições dos compostos o inóculo de cada microrganismo foi realizado o teste de Concentração Bactericida Mínima placa utilizada para o teste de CIM e previamente vertidas contendo o meio de cultura Mueller Hinton. As e após esse período foi Logo após a realização da CBM foi uma solução reveladora de cloreto . O composto em presença de
tilizados como controles negativos o Cloranfenicol® com patógeno e o meio de cultura sem inóculo. Como controle positivo foi inoculado
testados contra A. hydrophila e S. ariofileno não mostraram zona erpinoleno foram os que (conforme descrito no ítem 2.3),
A. hydrophila. Memar et
imol como inibidores do crescimento de bactérias Gram positivas e negativas, pela alteração da membrana celular desses microrganismos. A utilização de na indústria e carvacrol tem como o realizado por Liu et al.
hydrophila aos antibióticos
erpinoleno apresentaram atividade inibitória para S. agalactiae com apresentaram halos bem definidos, como ro de compostos (cinco) limoneno, eucaliptol, L-sem atividade talvez ocorra devido à das bactérias Gram positivas e Gram óleos essenciais inibem com
maior frequência as bactérias Gram negativas
hydrophila.
Figura 1: Halos de inibição A- Terpinoleno e B
Maria Carolina Bertolo Bonin).
Tabela 3.Média do halo de inibição (mm) formado
e Streptococcus agalactiae.
*n=3 ± Com base nesses resultados, escolhidos para o teste CIM, por
O número de pesquisas relacionadas isolados são crescentes, tais co
importantes bactérias patogênicas de origem
Composto Carvacrol Carvona Citral D-Limoneno Eucaliptol Eugenol Linalol L-Limoneno Nerolidol Terpeneol Terpinoleno Timol α-Pineno β-Cariofileno β-Pineno γ terpineno Controle (Florfenicol®) Controle (Hexano)
bactérias Gram negativas, conforme observado no presente trabalho com a
Terpinoleno e B- Timol (250 mg/ml), frente Streptococcus agalactiae
Média do halo de inibição (mm) formado pelos compostos avaliados frente
3 ± desvio padrão.
Com base nesses resultados, os compostos carvacrol, citral, timol e apresentarem atividade antibacteriana para
número de pesquisas relacionadas às funções dos óleos essenciais e seus compostos tais compostos são descritos como antimicrobianos promissores frente importantes bactérias patogênicas de origem alimentar, tais como Staphylococcus aureos
A. hydrophila (mm)* S. agalactiae (mm) 53,7 ± 7,0 50,0 ± 10,0 33,3 ± 7,3 12,0 ± 1,0 48 ± 24,5 44,3 ± 18,8 Limoneno 15,5 ± 0,7 0,0 12,3 ± 0,5 0,0 27 ± 2,65 18,0 ± 2,6 20,0 ± 5,7 11,7 ± 1,5 Limoneno 16,0 ± 5,7 0,0 0,0 5,3 ± 4,7 35,3 ± 9,9 18,3 ± 5,9 Terpinoleno 32,0 ± 3,5 32,7 ± 4,0 52,3 ± 14,8 26,5 ± 2,1 21,5 ± 9,2 13 ± 14,7 Cariofileno 0,0 3,3 ± 5,8 11,5 ± 0,7 0,0 terpineno 9,7 ± 0,6 0,0 Controle (Florfenicol®) 39,7 ± 3,5 33 ± 4,0 Controle (Hexano) 0,0 0,0 8 observado no presente trabalho com a A.
Streptococcus agalactiae (Fonte:
à Aeromonas hydrophila
imol e terpinoleno foram ambos os patógenos. funções dos óleos essenciais e seus compostos
antimicrobianos promissores frente
Staphylococcus aureos, S. agalactiae (mm)* 50,0 ± 10,0 12,0 ± 1,0 44,3 ± 18,8 0,0 0,0 18,0 ± 2,6 11,7 ± 1,5 0,0 5,3 ± 4,7 18,3 ± 5,9 32,7 ± 4,0 26,5 ± 2,1 13 ± 14,7 3,3 ± 5,8 0,0 0,0 33 ± 4,0 ,0
Escherichia coli, dentre outros (
suficientes para comparação dos resultados obtidos bactérias avaliadas, A. hydrophila
3.2 Avaliação da Concentração Inibitória Mínima Os resultados dos testes CIM
organismo foi eliminado, dos quatro estão descritos na Tabela 4. O baixas concentrações (≤12,5µg/ml
para ambos os patógenos, em concentrações
hydrophila e em concentrações de 0,39
S. agalactiae. Tais resultados podem ser visualizados
células bacterianas pela solução reveladora de uma coloração vermelha na presença
Tabela 4. Concentração Inibitória Mínima (CIM)
carvacrol, citral, terpinoleno e timol para
O potencial antimicrobiano dos compostos
al.(2015) frente a importantes bactérias patogênicas como
de alta patogenicidade, em concentrações 750µg/ml para testes CBM. Tais
cultivo in vivo de frangos para corte
doses bem inferiores de carvacrol e timol mostraram efeito bactericida para
agalactiae do que a observada
compostos. Marinelli et al. (2019) bactérias Gram positivas e negativas crescimento de S. agalactiae, com c
encontrada é provavelmente devido ao uso de cepas
Composto Concentração Inibitória Mínima (CIM)
A.hydrophila
Carvacrol 0,78125
Citral 3,125
Terpinoleno 3,125
Timol 6,25
(MEMAR et al., 2017). Contudo não foram encontrados estudos ra comparação dos resultados obtidos no presente estudo,
A. hydrophila e S. agalactiae.
Concentração Inibitória Mínima e Concentração Bactericida Mínima Os resultados dos testes CIM, que avalia se o micro-organismo foi inibido
quatro compostos selecionados frente aos patógenos estudados Os compostos avaliados apresentaram inibição das bactérias em 12,5µg/ml), sendo que o carvacrol foi o que apresentou
oncentrações em torno de 0,8μg/ml nos testes CIM e CBM para de 0,39 μg/ml e 1,5 μg/ml, respectivamente para CIM e CBM contra Tais resultados podem ser visualizados na Figura 2, com a presença ou ausência de células bacterianas pela solução reveladora de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio a 0,5%
na presença de cepas bacterianas vivas.
Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (C carvacrol, citral, terpinoleno e timol para Aeromonas hydrophila e Streptococcus agalactiae
O potencial antimicrobiano dos compostos carvacrol e timol foi demonstrado
frente a importantes bactérias patogênicas como Escherichia coli, bactéria Gram negativa em concentrações entre 187 e 375µg/ml para testes CIM e de 375 a 750µg/ml para testes CBM. Tais compostos foram utilizados conjuntamente
de frangos para corte. Comparativamente, observou-se no carvacrol e timol mostraram efeito bactericida para
do que a observada para E. coli, que apresentou menor sensibilidade para . (2019) realizaram estudo da ação antibacteriana do
negativas e observaram um aumento de 50 a 90% com concentrações entre 256 e 512 µg/ml. mente devido ao uso de cepas isoladas de origens diferentes.
Concentração Inibitória Mínima (CIM) Concentração Bactericida Mínima (
A.hydrophila S.agalactiae A.hydrophila
0,390625 0,78125
1,5625 3,125
6,25 6,25
1,5625 12,5
9 ão foram encontrados estudos no presente estudo, frente às mesmas
tração Bactericida Mínima organismo foi inibido e CBM se o
os patógenos estudados s apresentaram inibição das bactérias em que apresentou melhor atividade g/ml nos testes CIM e CBM para A. g/ml, respectivamente para CIM e CBM contra presença ou ausência de trifeniltetrazólio a 0,5%, que revela
Concentração Bactericida Mínima (CBM) em µg/ml de
Streptococcus agalactiae.
imol foi demonstrado por DU et bactéria Gram negativa entre 187 e 375µg/ml para testes CIM e de 375 a conjuntamente com antibióticos no se no presente estudo que carvacrol e timol mostraram efeito bactericida para A. hydrophila e S. menor sensibilidade para os estudo da ação antibacteriana do carvacrol para 50 a 90% na inibição do oncentrações entre 256 e 512 µg/ml. A grande diferença
diferentes.
Concentração Bactericida Mínima (CBM)
S.agalactiae
1,5625 1,5625 12,5 6,25
Citral apresentou atividade teste CIM e no teste de CBM. C CIM e CBM. Saddiq e Khayyat (2010)
do crescimento de cepas de Staphylococcus aureus
Figura 2: Placa de 96 poços, contendo os compostos: Citral (inibição de A
A-G), Terpinoleno (inibição de A-D) e Carvacrol (inibição de A patógeno S. agalactiae. Sendo a linha 4 os controles,
(Fonte: Maria Carolina Bertolo Bonin)
4 CONCLUSÃO
Concluiu-se que carvacrol, para A. hydrophila e S. agalactiae
carvacrol, apresentou atividade antimicrobiana em menor concentraç patógenos. Esses compostos têm potencial para serem utilizadas atuais, contra os patógenos estudados
quanto para a segurança da alimentação humana.
5 AGRADECIMENTOS
Agradeço ao CNPq pela bolsa PIBIC concedida. Ao p parceria celebrada entre o BNDES, FEA e Embrapa, com e contrapartida da Embrapa.
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atividade para S. agalactiae em concentrações menores que 1,6µg/ml no . Contra A. hydrophila os valores foram menores que 3,2
Saddiq e Khayyat (2010) descreveram o Citral como agente promissor
Staphylococcus aureus.
Placa de 96 poços, contendo os compostos: Citral (inibição de A-G), Timol 250mg/ml (inibição de D) e Carvacrol (inibição de A-H) respectivamente, todos com a presença do . Sendo a linha 4 os controles, de A a C controle negativo, e de J a L controle positivo
(Fonte: Maria Carolina Bertolo Bonin).
arvacrol, citral, terpinoleno e timol apresentaram atividade antibacteriana
agalactiae, em baixas concentrações nos testes CIM e CBM.
atividade antimicrobiana em menor concentração (0,78µg/ml) frente aos dois m potencial para serem utilizadas como substitutos aos antibióticos contra os patógenos estudados, podendo contribuir assim tanto para a saúde dos animais
segurança da alimentação humana.
a bolsa PIBIC concedida. Ao projeto BRS Aqua ( BNDES, FEA e Embrapa, com apoio financeiro do
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10 em concentrações menores que 1,6µg/ml no valores foram menores que 3,2μg/ml para promissor para redução
G), Timol 250mg/ml (inibição de H) respectivamente, todos com a presença do de A a C controle negativo, e de J a L controle positivo
atividade antibacteriana em baixas concentrações nos testes CIM e CBM. O composto (0,78µg/ml) frente aos dois como substitutos aos antibióticos , podendo contribuir assim tanto para a saúde dos animais
rojeto BRS Aqua (01.17.02.001.03.08), do BNDES, SAP/MAPA,
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