Hemoglobinas em silurídeos
da Amazonia Central: I. Análise eletroforética dos hemoiisados.
M a r i a I s a b e l G . P o r t u s ( ' ) E l b a Lucy D o n a l d (?)
A l d o F o c e s i J r . ( ' )
Resumo
Os hemolisados das espécies de Silurídeos (bagres e cascudos) pertencentes às famílias: Doradidae, Au-chenipteridae, Pimelodidae, Ageneiosidae, Callicthyidae e Loricariidae, (oram analisados por eletroforese e m gel de poliacrilamida. Os resultados permitiram suge-rir que peixes Siluriformes muito ativos que vivem e m habitat variável possuem múltiplas hemoglobinas d e mobilidade exclusivamente anódica. Por outro ledo pei-xes adaptados a condições mais drásticas de hipoxia inclusive com respiração aérea adicional apresentam maior heterogeneidade eletroforética d e suas hemoglo-binas com componentes tanto anódicos como catódicos. A multiplicidade de componentes de hemoglobinas b e m como suas características de migração no campo elé-trico permitiram propor mecanismo para explicar a ca-pacidade dos peixes de v i v e r e m e m habitat tão variá-vel como o é o do rio A m a z o n a s .
INTHODUÇÃO
Os Silurídeos do r i o Amazonas que abran-gem os bagres e cascudos f o r n e c e m material de alto interesse para estudos sobre hemoglo-binas. Esta é talvez a região do globo onde tais espécies são as mais abundantes vivendo num habitat dos mais variados possibilitando por conseguinte detalhados estudos da relação estrucura-função entre hemoglobinas de peixes. A função da hemoglobina deve estar associada as necessidades respiratórias do animal, e es-tas necessidades ou melhor os níveis de oxi-genação no rio Amazonas são os mais diversos e os peixes devem possuir uma ou mais des-tas proteínas respiratórias adaptadas a tal di-versidade na tensão do g á s .
Neste trabalho, pretendemos determinar a multiplicidade de componentes de hemoglobi-nas das diferentes famílias mais comuns e mais facilmente capturados de bagres e
cascu-( 1 ) — Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, ( 2 ) — Universidade Estadual de Campinas, S P .
A C T A A M A Z Ô N I C A 1 2 ( 4 ) : 707-711. 1982
dos no rio Amazonas. Realizamos eletroforesis individuais dos peixes e relatamos nossos re-sultados procurando relacionar c o m o meio amb'ente predominante das espécies estuda-das.
MATERIAIS E MÉTODOS
A s espécies mais comuns dos peixes Silu-r i f o Silu-r m e s Tabela I f o Silu-r a m coletadas no lago Ja-nauacá, rio Sclimões. Exemplares adultos foram sangrados individualmente logo após coleta por punção cardíaca c o m seringa heparinizada, as hemácias separadas por centrifugação e la-vadas repetidas vezes c o m solução de NaCI 1,7% e tris 1 m M pH 8,0 a 4 ° C . Após lise c o m solução de t r i s 1 m M pH 8,0 a 4°C, o material f o i centrifugado várias vezes até obter-se so-lução límpida de hemolisado e era mantido a
Os componentes de hemoglobinas dos he-molisados foram analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida 7,5% pH 8,9 utilizan-do-se técnicas descrita originalmente por Orns t e i n 1964 e Davis 1964, c o m algumas modifica-ções feitas por Fyhn ef al, 1979, controlando-se cuidadosamente as condições de padronização e concentrações do gel de resolução e de con-traste .
A s amostras de hemoglobina para eletro-forese foram preparadas misturando-se 0.1 m l de solução de hemoglobina 1 m g / m l . 0,4 ml de g l i c e r o l , 0,2 ml de B-mercaptoetanol 0,01 M em tampão tris-glicina 0,05 M pH 8,9 equilibrada até saturação c e m monóxido de carbono. C sis-tema de tampões tris-glicina 0,05 M pH 8,9 foi usado no anôdo e tris-C1 0,1 M pH 8,1 no cá-todo, e a eletroforese foi realizada, mantendo-anaus.
se uma intensidade de corrente contínua de 2 mA oor gel e o tempo de migração eletroforé-tica de duas horas. Como indicador de migra-ção foram utilizadas algumas gotas de solumigra-ção de azul de bromofenol 0,05% contendo azida de sódio 0,02 % em tampão f o s f a t o 0,1 M pH 7,0, adicionadas à cuba s u p e r i o r .
RESULTADOS
Os peixes S i l u l i f o r m e s capturados foram identificados e subdivididos em seis famílias quatro de bagres (Doradidae, Auchenipteridae. Pimelodidae e Ageneiosidae) e duas de cas-cudos (Cailicthyidae e Loricariidae). A tabela I mostra as espécies, c o m p r i m e n t o dos animais, peso número de exemplares, número dos com-ponentes encontrados nos hemolisados e os esquemas dos perfis e l e t r o f o r é t i c o s típicos a cada espécie. Procuramos descrever sucinta-mente as características de cada família e os resultados da análise eletroforética das nemo-globinas das espécies estudadas :
i) Os Doradídeos f a c i l m e n t e reconhecidos pelas placas ósseas que c o b i e m a linha late-ral, são geralmente peixes de natação lenta de fundo e que se alimentam principalmente de insetos aquáticos, ( M a r l i e i , 1966) . A aná-lise eletroforética de suas hemoglobinas mos-tra além de migração anódica, ponto isoeletri-co muito próximo entre os isoeletri-componentes, em Oxydoras niger, cuiú-cuiú, observou-se uma único banda em repetidas análises, indicando um único fenótipo de hemoglobinas; em Ptero-ocres granulosus, bacu, a hemoglobina foi identificada com um padrão de t r ê s faixas nãc bem definidas, tendo dois componentes princi-pais; em Anadoras cf regani rabeca, visualizou-se três faixas claramente definidas com um componente levemente predominante;
ii) Os representantes da família Auchenip-teridae, o Auchenipterus s p . , mandi peruano, e o 7 rachycorystes sp., cangati, são peixes pe-quenos, ativos e de águas rápidas próximas a depósitos arenosos. A s análises das hemoglo-binas em gel de poliacrilamida revelam em ambos componentes com migração anódica ten-do o primeiro ama faixa de hemoglobina difusa e o segundo uma faixa mais concentrada e duas menores;
iii) Os peixes da família Pimelodiciae, ge-ralmente peixes ativos piscívoros, capazes de utilizar qualquer tipo de a l i m e n t o , plantas e invertebrados, (Fink & Fink, 1979), apresentam em eletroforese em gel de poliacrilamida m ú l t i -plos componentes de hemoglobina variando de
1 a 4 todos de migração anódica m u i t o próxi-m a . Pipróxi-melodus blockii, próxi-mandi c o próxi-m u próxi-m , caracte-rizou-se sempre com um único f e n ó t i p o , exem-plares de tamanho u n i f o r m e , vendo este padrão dois componentes maiores e um menor d i f u s o . O Brachyplatystoma s p . , dourada, apresentou quatro componentes, dois maiores e dois me-nores difusos e outro representante do mesmo gênero Brachyplatystoma sp2, piraíba, apresen-tou três componentes d i f u s o s . Os espécimes do gênero Pseudoplatystoma, surubim e ca-paran, apresentam três e um componentes respectivamente, apesar de serem espécies f i
-logeneticamente m u i t o p r ó x i m a s . No Piniran-nopterus, piracatinga, apresentou três compo-nentes sendo duas as bandas principais bem definidas. A hemoglobina de Callophysus ma-cropterus, piracatinga, apresentou t r ê s compo-nentes de hemoglobina, com duas bandas prin-cipais e uma pequena d i f u s a , este padrão ele-t r o f o r é ele-t i c o foi semelhanele-te ao Pinarampus s p . difei enciando-se contudo na mobilidade eletro-f o r é t i c a ;
iv) A s espécies da família Ageneiosidae são hábeis nadadores adaptados a uma vida pelágica, o único representante analisado f o i o Ageneiosus brevifilis, mandubé, a sua hemo-globina apresentou-se como um único compo-nente de migração anódica;
v) Os peixes da família Callichthyidae, são extremamente r e s i s t e n t e s , possuem placas ós-seas, seus habitats são de fundo pantanoso são capazes de locomoção em terra e são resis-tentes às grandes flutuações de t e m p e r a t u r a . Suas hemoglobinas em eletroforese em gel de poliacrilamida apresentaram componentes com migração catódica e anódica. O mais notável desta família foi ter encontrado fenotipos dife-rentes de hemoglobina em machos e fêmeas de Hoplosternum throcatum, acompanhado de d i m o r f i s m o sexual observado em sua estrutu-ra externa, em que os machos apresentam pla-cas ósseas espinhosas diferenciando se das fêmeas com placas lisas;
VABhLA 1 — Número de componentes e diagrama de eletroforese de Siiurideos de diferentes e s p é c i e s . Os nomes, peso e comprimento dos animais bem como o número de análises realizadas estão indicados e m colunas.
Família, espécie, nome comum
Família DORADIDAE peso (gramas) comprimento (cm) n.° analises eletrof. n.° compo-nentes de H t esquema eletroforético de Hb
Oxydoras niger (cuiu-cuiu) 300 — 1400 30 — 50 33 1
Pterodoras granulosus (bacu) 360 — 1000 29 — 40 9 3
Anadoras cf regani (rabeca) 100 — 180 17 — 22 7 3
Familia AUCHENIPTERIDAE
Auchenipterus sp. (mandi peruano) 40 — 50 18 — 20 2 1
Trachycorystes sp. (cangati) 80 — 120 18 — 20 6 3
Familia PIMELODIDAE
Pimelodus blockii (mandi comum) 90 — 190 20 — 25 17 3
Brachyplatystoma flavicans (dourada)
—
—
5 4Brachyplatystoma filamentosum (piraiba) 3525 71 2 3
(filhote)
Pseudoplatystoma tigrinum ( s u r u b i m )
—
—
2 3Pseudoplatystoma fasciatum (caparari) 1100 - 1400 55 — 60 2 1
Pinirampus pinirampus (piranambu)
—
3 3Callophysus macropterus (piracatinga)
—
3 3Familia AGENEIOSIDAE
Ageneiosus brevifilis (mandubé) —
-
ó 1Familia CALLICHTHYIDAE
Hoplosternum littorale (tamoatá 1) 80 18 1 2
Hoplosternum thorocatum (tamoatá 2) 2 140 — 150 19 — 20 5 2 Hoplosternum thorocatum (tamoatá 2) ¿ 60 — 150 15 — 20 11 2
Familia LORICARIIDAE
PterygopÜchthys pardalis (cascudo comum) 350 — 900 30 — 55 7G 4 Pterygoplichthys sp. (cascudo j a c a r é ) 550 — 700 35 - 4 3 37 4 Plecostomus plecostomus (cascudo pedra) 250 — 560 30 — 40 76 1
Hemiancistrus scaphyrynchus (cascudinho) 180 23 2 2
Ancistrus sp. (cascudinho 2) 70 — 190 15 — 20 4 3
Canthoporus genibarbis (cascudo preto) 150 — 300 24 — 28 5 2 Loricariichthys acutus (cachimbo 1) 60 — 100 23 — 27 1 6 Loricariichthys typus (cachimbo 2) 150 — 190 30 — 34 6 3 Sturisoma saphyrhynchus (cachimbo 3 ) 50 — 60 27 — 33 2 2
H
in
ií
vi) Os Loricariídeos, peixes adaptados à vida de fundos lodosos e de habitat variados, apresentaram hemoglobina com componentes de migração catódica e anódica. A s espécies estudadas foram duas do gênero Pterygoplich-thys que apresentaram o mesmo número de componentes em gel de poliacrilamida, mas que diferiram entre si em sua migração, prin-cipalmente no componente catódico o qual tor-na-se mais anódico. No Pterygoplichthys s p 2 . , cascudo pedra, observamos um único compo-nente de hemoglobina, em sucessivas análises eletroforéticas, o que nos indica um único fe-nótipo de h e m o g l o b i n a . As hemoglobinas dos peixes dos gêneros Hemiancistrus e A n c i s t r u s apre.-entaram-sc na eletroforese em gel de po-liacrilamida uma e duas faixas principais res-pectivamente e quanto a hemoglobina de Can thoporus genibarbis, cascudo preto, dois com ponentes principais de migração muito próxima puderam ser e v i d e n c i a d o s . A s espécies do gê-nero Loricariichthys apresentaram-se com per-fis eletroforéticos bastante diferentes tanto quanto ao número de componentes como t i p o de migração, apesar de serem espécies
morfo-logicamente s e m e l h a n t e s . A hemoglobina de Sturisoma sp. cachimbo, mosirou-se com ban-das eleiroforéticas nítiban-das distribuíban-das equita-t i v a m e n equita-t e .
DISCUSSÃO
A p-esença de vários componentes de he-mogiobinas em peixes de modo g e r a l , está perfeitamente estabelecida. Recentemente por análise eletroforética de hemoglobinas de um grande número de espécies da Amazônia Cen-tral, constatou-se alto grau de heterogeneidade entre estas proteínas encontrando-se peixes com até sete componentes (Davis ef a/., 1979). As interpretações desta multiplicidade de he-moglobinas em peixes são as mais diversas e seu possível significado biológico é muito discutido havendo contudo uma tendência dos autores em relacioná-la com uma adaptação da proteína ao meio ambiente variável, (Johnan-sen, 1979; Sullivan, 1977; Riggs, 1979) .
Analisando espécies adultas de peixes si-luriformes fílogeneticamente próximas obser-vamos que tal tendência se c o n f i r m o u uma vez
que a multiplicidade de hemoglobinas parecc-guardar uma relação estreita com o comporta-mento do animal, assim peixeò muito ativos e de hábitos alimentares variados vivendo pois em habitat variável, tais como os pertencentes a famílias Doradidae, Pimelodidae, Auchenip-terídae e Ageneiosidae, mostraram componen-tes de hemoglobinas exclusivamente de mobi-lidade anódica. É interessante observar que a carpa Cyprinus carpió peixe com as mesmas características descritas, possue também múl-tiplas hemoglobinas de migração anódica rela-tivamente próxima e f u n c i o n a l m e n t e semelhan-tes (Weber et ai., 1975) . Por outro lado peixes adaptados a sobreviverem em condições mais drásticas de hipoxia como àqueles Loricarií-deos e CallicthyiLoricarií-deos em que se observa respi-raçãc adicional aérea, através do t r a t o diges-t i v o , parece apresendiges-tar maior hediges-terogeneidade eletroforética de suas hemoglobinas, tendo ain-da componentes catódicos e anódicos, de pon-tos isoelétricos distantes, provavelmente rela-cionados com estrutura proteica e proprieda des funcionais diversas, comportando-se de modo semelhante a truta Salmo gairdneri (Bru nori ef a/., 1973.
Os peixes S i l u r i f o r m e s parecem possuir hemoglobinas com propriedades respiratórias que seguem tipos de estrategias adaptativas, condicionadas ao ambiente ou ao t i p o respira-t ó r i o , uma delas é de narespira-tureza qualirespira-tarespira-tiva que mantém a plasticidade da hemoglobina no transporte de bases. Deste ponto de vista as hemoglobinas de um mesmo hemolisado pos-suem propriedades diferentes como por exem-plo ausência de efeito Bohr em um ou mais
c o m o o n e n t e s . A outra estrategia adaptativa sería somente de natureza quantitativa mais relacionadas com níveis de efetores heterotró picos no sangue no animal. A s s i m peixes com concentração de efetores mais elevados pos suiriam hemoglobinas c o m efeito Bohr mais elevado em c e r t o s componentes por exemplo. Neste contexto a razão da multiplicidade dos componentes das hemoglobinas seria no pri-meiro caso, a incapacidade de uma única he-moglobina responder as várias condições am bientaís e metabólicas do animal e duas ou mais proteínas fundamentalmente diferentes conseguiriam níveis de oxigenação tecidua! adequados nas várias condições em que são
submetidos OÒ a n i m a i s . De estratégias adap-tativas quantiadap-tativas, seriam aquelas hemoglo-binas que poderiam se adaptar as diferenies condições respiratória dos peixes, graças a sua " m a l e a b i l i d a d e " , por exemplo, cuja função esta-ria condicionada a diferentes concentrações de efetores polifosfatos no sangue. Nestas con-dições uma única hemoglobina no hemolisado seria s u f i c i e n t e para responder efetivamente as mais variadas condições que é exposto o a n i m a l .
Um fato que nos pareceu de relevância mostrado pela análise e l e t r o f o r é t i c a das hemo-globinas f o i aqueles dos 11 exemplares ma-chos e 5 fêmeas de Hoplostemum throcatum. que até há pouco eram classificados como es-pécies d i s t i n t a s , possuírem perfis eletroforé-ticos completamente diferentes mostrando ní-tido d i m o r f i s m o sexual e m nível de hemoglobi-nas. A l é m disto animais jovens machos e fêmeas apresentavam perfis eletroforéticos se-melhantes as das fêmeas adultas.
Se confirmar-se a classificação como ani-mais da mesma espécie tal d i m o r f i s m o torna-se evidência insofismável de adaptação estru-tura-função das hemoglobinas e a proteína se-ria exclusivamente " c o n s t r u í d a " tendo em vista o meio ambiente a que o animal é sub-m e t i d o .
S U M M A R Y
Silurídeos species f r o m t h e families: Doradidae, Aucheniptaridae, Pimelodidae, Ageneiosidae, Callicthyi-dae and LoricariiCallicthyi-dae, w e r e analysed by polyacrylamide
gel electrophoresis. The results allow us to suggest that very active fishes which live in different habitat, present hemoglobin with exclusively anodic mobility. On the other hand, fishes adapted to more severe con-dition such as those of high hypoxy including fishes w i t h aerobic respiration show hemoglobins with elec-trophoretic patern highly heterogeneous presenting anodic and cathodic components. A mechanism is pro-posed to explain the heterogenity as well as t h e elec-trical mobility of t h e hemoglobin components related to t h e habitat extremely variable of the Amazon River.
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(Aceito para publicação e m 2 9 / 0 7 / 8 2 )
