UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCAIS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA REDE NORDESTE DE BIOTECNOLOGIA - RENORBIO
FRANCISCO JOSÉ CARVALHO MOREIRA
Prospecção de extratos de Tephrosia toxicaria Pers. para controle de
nematoides das galhas e desenvolvimento de bionanoformulações
derivadas dos extratos para aplicação como nematicida na agricultura
NATAL-RN 2018
FRANCISCO JOSÉ CARVALHO MOREIRA
Prospecção de extratos de Tephrosia toxicaria Pers. para controle de
nematoides das galhas e desenvolvimento de bionanoformulações
derivadas dos extratos para aplicação como nematicida na agricultura
Tese submetida à Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia da Rede Nordeste de Biotecnologia - RENORBIO, do ponto focal da Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Biotecnologia.
Área de Concentração: Recursos Naturais Orientadora: Profª. Drª. Adriana Ferreira Uchoa Co-orientadora: Profª. Drª. Maria Aparecida de
Medeiros Maciel
NATAL-RN 2018
Moreira, Francisco José Carvalho.
Prospecção de extratos de Tephrosia toxicaria Pers. para controle de nematoides das galhas e desenvolvimento de
bionanoformulações derivadas dos extratos para aplicação como nematicida na agricultura / Francisco José Carvalho Moreira. -2018.
174 f.: il.
Tese (doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Biociências, Rede Nordeste de Biotecnologia, Natal, RN, 2019.
Orientadora: Profa. Dra. Adriana Ferreira Uchoa.
1. Meloidogyne Tese. 2. Nanoencapsulação Tese. 3. Timbó -Tese. 4. Nematicidas - -Tese. I. Uchoa, Adriana Ferreira. II. Título.
RN/UF/BCZM CDU 632.955
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede
Aos meus Avós, pais adotivos, pela a criação, educação, amor incondicional! Maria Geralda Carvalho (in memorium) Francisco Sales Carvalho (in memorium)
AGRADECIMENTOS
A Deus por me dar força ao longo desta caminhada, nas dificuldades, na superação de perdas, e que em cada momento, me ofereceu novos motivos para sorrir, sonhar e seguir!
Ao programa de Pós Graduação da Rede Nordeste de Biotecnologia, RENORBIO/UFRN por oportunizar a realização de mais uma etapa da minha vida acadêmica.
Aos professores do Programa RENORBIO, nos diversos estados, Universidades e Laboratórios, onde cursei disciplinas, pelo empenho, dedicação, entusiasmo, conselhos, incentivos e nos mostrar que somos capazes, a minha eterna gratidão!
Ao Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Ceará (IFCE), pela concessão do meu afastamento, de forma integral, nos dois últimos anos do Doutorado, sem o qual seria impossível a realização de todas as etapas desta pesquisa.
A minha orientadora, Profa. Drª. Adriana Ferreira Uchoa pelo rigor da orientação, conselhos, dedicação, por abrir as portas de várias oportunidades que vivenciei na construção desta Tese, que serão agregadas as minhas atividades profissionais.
A minha Co-orientadora Profa. Drª. Maria Aparecida de Medeiros Maciel pela inestimável contribuição para o incremento desta tese, com os tensoativos para a produção das nanoformulações e suas caracterizações, além do enriquecimento teórico adquirido tanto na disciplina quanto no convívio do laboratório.
Aos membros da Banca Examinadora da Qualificação Profa. Drª. Riva Oliveira, Profa. Drª. Maria Aparecida e ao Prof. Dr. Eduardo Voigt por aceitarem esta tarefa e pelas valiosas contribuições sugeridas para a melhoria da qualidade deste trabalho.
Aos membros da Banca de Avaliação da Defesa Prof. Dr. Leonardo Lima Pepino de Macedo, Prof. Dr. Ludovico Migliolo, Prof. Dr. Daniel Carlos Ferreira Lanza, Profª. Drª. Gorete Ribeiro de Macedo por aceitarem o convite e pelas valiosas contribuições aludidas para o enriquecimento científico da qualidade que este trabalho se propôs.
Ao Laboratório de Biologia Experimental, da Universidade Estadual Vale do Acaraú, em Sobral - CE, em nome da Profa. Drª. Lúcia Betânia da Silva Andrade, onde foram iniciadas as primeiras atividades com os extratos desta espécie, que culminou com os estudos desta Tese. Ao Laboratório de Genética Bioquímica, em nome da Profa. Drª. Riva de Paula Oliveira, pela atenção e contribuição, onde fui muito bem recebido, e, aos estudantes Giovana Martins, Aelton, Iolanda Raquel, José Felipe, Wamberto, Marina Machado, Luciana, Ana Raquel, Ana Lúcia, onde aprendi bastante sobre Caenorhabditis elegans, em vários de seus aspectos, que serviram para enriquecer este trabalho.
Ao Laboratório de Ecotoxicologia Aquática, DOL/NUPRAR/UFRN, em nome do Prof. Dr. Guilherme Fulgêncio, pela atenção e contribuição, e dos estudantes, Thiago Farias, Samuel Araújo e Hernani Pinto, que me receberam tão bem, e pelo auxílio na realização dos testes, que também muito agregaram para enriquecer este trabalho.
Ao Laboratório de Biopolímeros Naturais, em nome do Prof. Dr. Hugo Alexandre, pela atenção e contribuição, e a Rony Lucas realizou os testes de citotoxicologia e auxiliou na interpretação dos resultados.
Ao Laboratório de Tecnologia de Tensoativos - LTT, IQ/UFRN, em nome da Profa. Drª. Maria Aparecida Maciel pela atenção e contribuição, e a Joherbson Deived, que me auxiliou na realização nas atividades lá desenvolvidas.
A Coordenação do RENORBIO, e a secretária do ponto focal da UFRN, Paula Peroba, pela disponibilidade de sempre atender às solicitações e dúvidas.
A secretaria do Departamento de Biologia Celular e Genética, todos sempre atenciosos para resolver qualquer solicitação.
Aos Técnicos laboratoristas Maiara, Diogo, Verônica (LAMA), Virgínia (Laboratório de Entomologia - LABENT) pela atenção e pronto atendimento em todas as solicitações feitas. A Leidiane Barbosa, estudante IC, pelas contribuições nas realizações dos ensaios com os microcrustáceos, e pelos ensaios subsequentes realizados com Aedes aegypti.
Aos amigos de Doutorado Cesar Muñoz e Ricardo Basílio - extensivo a sua família, com quem convivi a maior parte deste tempo aqui em Natal, pelos momentos de trabalho em laboratório, de diversão, pelas resenhas, que nos motivou a permanecer entusiasmados nesta árdua, mas gratificante caminhada.
Ao Sr. Julião Ferreira Soares, das Estufas Timbaúbas, em Guaraciaba no Norte-CE, que nos cedeu às mudas de tomate ‘Pati’ para a realização do ensaio in vivo e a Rosemberg Trajano, Tecnólogo em Irrigação, que proporcionou esta cortesia.
A minha esposa Adriana Sousa, pela dedicação, companheirismo, força, seu amor incondicional; por entender as ausências, a chatice, e apoiar em cada uma das etapas desta longa e sinuosa caminhada, apesar das dificuldades, dos momentos tristes, de perdas, foi sempre meu porto seguro, obrigado por tudo!!!
A minha família, aos meus pais Maria do Socorro e José Guido; sogros Antônia de Jesus e Firmino Vieira; irmãos Adriana Pinheiro, Márcio Cleiton, Júlio César e Mário Wagner; cunhados Cleiton, Irene, Ana Maria, Eulália, Anderson, Adrilene e Adelaide; aos concunhados Ana Paula e Marcelo; sobrinhos, Larissa, Vitória, Gabriel, Miguel, Caio, Diana, Cauã, Danilo e Cecília! Apesar da distância, dos desencontros, das ausências nas ocasiões festivas, nas datas especiais, souberam entender este momento!
A tia Liduína e tio Fil, que sempre nos recebem tão bem, quando vamos ao interior matar um pouco a saudade da infância, dos meus avós!
Aos estudantes do IFCE - Campus Sobral, vinculados ao Laboratório de Fitossanidade e Sementes, que ao longo de dois anos contribuíram na realização de algumas etapas desta pesquisa, além da manutenção dos nematoides em casa de vegetação, Gleiciane Lopes, Beatriz Araújo, Antonio de Assis, Luciana Mesquita, Elisângela Silva, Doricleson Almeida, Tiago Filomeno, Maria de Fátima, Cristiane Cunha, Mikael Nascimento, Erlane Sales, Andreza Moreira, Adriano Azevedo, Kelma Moreira, Benedita Idelbrando.
Aos professores e Técnicos do IFCE - Campus Sobral, Eixo de Recursos Naturais, pela compreensão, auxílio em algumas etapas desta caminhada, obrigado!
Enfim, a todos que de alguma forma, direta ou indiretamente, contribuíram para a concretização deste sonho, meu muito obrigado!
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS RESUMO
ABSTRACT
1. INTRODUÇÃO... 17
2. REVISÃO DE LITERATURA... 21
2.1 Nematoides das galhas... 21
2.2 Os nematoides das galhas (Meloidogyne spp. - Goeldi, 1879) 24 2.2.1 Meloidogyne enterolobii (Yang & Eisenback, 1983) (sin. = M. mayaguensis)... 25
2.2.2 Meloidogyne javanica (Treub, 1885) Chitwood (1949)... 27
2.3 Controle dos nematoides das galhas... 28
2.3.1 Controle alternativo de nematoide das galhas... 28
2.3.2 Extratos botânicos no controle de nematoides... 30
2.4 A espécie Tephrosia toxicaria Pers... 38
2.4.1 Aspectos botânicos sobre a família Fabaceae... 38
2.4.2 Aspectos botânicos sobre espécies do gênero Tephrosia... 39
2.4.3 Aspectos farmacológicos do gênero Tephrosia... 40
2.4.4 Aspectos fitoquímicos de compostos bioativos de Tephrosia toxicaria Pers... 42
2.5 Estabilização dos extratos botânicos de T. toxicaria pelo processo de Liofilização... 46
2.6 Encapsulamento de compostos bioativos de plantas... 47
2.6.1 Sistema de liberação de bioativo do tipo autonanoemulsificante (SNEDDS)... 52
2.7 Avaliação da segurança ambiental de pesticidas botânicos... 55
3. OBJETIVOS... 60
3.1 Objetivo geral... 60
3.2 Objetivos específicos... 60
4. CAPÍTULO I: Controle de Meloidogyne enterolobii e M. javanica com extratos aquosos de Tephrosia toxicaria Pers... 61
4.1 Introdução... 63
4.2 Material e métodos... 64
4.2.1 Local de realização do trabalho e coleta do material vegetal... 64
4.2.2 Obtenção e multiplicação dos inóculos de Meloidogyne enterolobii e M. javanica... 64
4.2.3 Preparação dos extratos aquosos de caule, folhas e raízes de Tephrosia toxicaria... 65
4.2.4 Obtenção das mudas de tomate ‘Pati’... 65
4.2.5 Parâmetros e variáveis analisadas... 66
4.2.6 Delineamento experimental e análises estatísticas... 66 4.2.7 Avaliação da segurança ambiental dos extratos de T. toxicaria...
4.2.7.1 Efeitos dos extratos no desenvolvimento e reprodução de Caenorhabditis
elegans... 67
5.2.7.2 Ensaio de toxicidade em células 3T3... 69
4.3 Resultados e Discussão... 70
4.3.1 Resultados sobre a densidade populacional dos nematoides no solo... 70
4.3.2 Resultados sobre o desenvolvimento das plantas de tomate ‘Pati’... 77
4.3.3 Resultados de segurança ambiental dos extratos de T. toxicaria... 82
4.4 Conclusões... 89
5 CAPÍTULO II: Avaliação in vitro de extratos polares livres e veiculados das raízes de Tephrosia toxicaria sobre a eclosão e mortalidade de juvenis J2 de nematoide das galhas... 90
5.1 Introdução... 92
5.2 Material e métodos... 95
5.2.1 Local de realização do trabalho e coleta do material vegetal... 95
5.2.2 Obtenção dos extratos polares (aquoso e hidroalcoólico) liofilizados de raízes de Tephrosia toxicaria... 95
5.2.3 Veiculação em sistema SNEDDS... 96
5.2.4 Obtenção e multiplicação dos inóculos de Meloidogyne enterolobii e M. javanica... 97
5.2.5 Parâmetros mensurados nos dois bioensaios... 97
5.2.6 Testes de segurança ambiental... 97
5.2.6.1 Ensaio de ecotoxicologia aguda em microcrustáceo (Ceriodaphnia dubia)... 98
5.2.6.2 Avaliação de fitotoxidez sobre a germinação de alface ‘Babá de Verão’ 98 5.3 Resultados e Discussão... 99
5.7.1 Caracterização das SNEDDS dos extratos polares livres e veiculados das raízes de T. toxicaria... 99
5.7.2 Efeitos dos extratos polares livres e veiculados das raízes de T. toxicaria sobre a eclosão e mortalidade de juvenis J2 de M. enterolobii e M. javanica... 102
5.7.3 Segurança ambiental dos extratos polares livres e veiculados das raízes de T. toxicaria - ecotoxicologia aquática em microcurstáceo (C. dubia)... 114
5.7.4 Avaliação da fitotoxicidade dos extratos polares livres e veiculados das raízes de T. toxicaria sobre L. sativa, ‘Babá de Verão’... 117
5.4 Conclusões... 120
6.1 CONSIDERAÇÕES FINAIS... 121
6.2 Referências... 126 ANEXOS
LISTA DE FIGURAS Revisão de literatura
Figura 1. Ilustração esquemática de fitonematoides atacando a raiz de planta, onde: 1. Cephalenchus; 2. Tylenchorhynchus; 3. Belonolaimus; 4. Rotylenchus; 5. Hoplolaimus; 6. Helicotylenchus; 7. Verutus; 8. Rotylenchulus; 9.
Acontylus; 10. Meloidodera; 11. Meloidogyne; 12. Heterodera; 13. Hemicycliophora; 14. Criconemoides; 15. Paratylenchus; 16.
Trophotylenchulus; 17. Tylenchulus; 18. Sphaeronema; 19. Pratylenchus;
20. Hirschmanniella; 21. Nacobbus ... 22
Figura 2. Sintomas característicos de nematoides das galhas (Meloidogyne ssp.); em (A) galhas pronunciadas sobre o solo em plantas de tomate (B) sistema radicular completamente infectado de galhas e (C) reboleira em área de
soja. 23
Figura 3. Fases do ciclo de vida dos nematoides das galhas (Meloidogyne spp.) ... 26
Figura 4. Aspectos de uma planta de Tephrosia toxicaria em produção (A) e em (B) aspecto da floração característica de espécie e sementes, em detalhe... 40
Figura 5. Estruturas básicas dos flavonoides e de suas principais classificações... 44
Capítulo I
Figura 1. Efeito dos extratos aquosos de caule, folhas e raízes de T. toxicaria sobre a sobrevivência (a) e longevidade (b) de C. elegans. Os ensaios foram realizados em triplicatas... 83
Figura 2. Resultados do efeito dos extratos aquosos de caule, folhas e raízes de T.
toxicaria sobre a batimento faríngeo (a) e comportamento (b) de C. elegans. Os ensaios foram realizados em triplicatas... 84
Figura 3. Efeito dos extratos aquosos de caule, folhas e raízes de T. toxicaria sobre a reprodução (progênie) de C. elegans. Os ensaios foram realizados em triplicatas. ** Significância estatística... 84
Figura 4. Efeito dos extratos aquosos de caule, folhas e raízes de T. toxicaria sobre o crescimento de C. elegans. Os ensaios foram realizados em triplicatas.... 85
Figura 5. Viabilidade celular de fibroblasto de camundongos linhagem celular 3T3 após incubação por 24 h com extratos de caule, folhas e raízes de T.
toxicaria nas concentrações de 0,05; 0,10; 0,20; 0,40; 0,60; 0,80; 1,60;
3,20; 4,00 e 4,80%. O controle foi apenas o meio. O efeito sobre a proliferação celular foi determinado usando MTT... 86
Capítulo II
Figura 1. Diagrama de fases ternário do sistema carreador SNEDDS... 100
Figura 2. Estudo da viscosidade do sistema carreador SNEDDS... 101
Figura 3. Diluição máxima dos agregados micelares do sistema SNEDDS... 101
Figura 4. Eclosão (A, C) e mortalidade (B, D) de juvenis J2 de Meloidogyne
enterolobii e M. javanica no extrato aquoso (A, B) e hidroetanólico (C, D)
livres obtido das raízes de Tephrosia toxicaria... 103
Figura 5. Eclosão (A) e mortalidade (B) de juvenis J2 de Meloidogyne enterolobii e
M. javanica no extrato aquoso veiculado em sistema coloidal SNEDDS,
obtido das raízes de Tephrosia toxicaria... 108
Figura 6. Eclosão (A) mortalidade (B) de juvenis J2 de Meloidogyne enterolobii e
M. javanica no extrato hidroalcoólico veiculados em sistema coloidal
SNEDDS, obtido das raízes de Tephrosia toxicaria... 112
Figura 7. Ecotoxidade em microcrustáceo Ceriodaphnia dubia para sobrevivência (%) nos extratos aquoso e hidroalcoólico livres (A) e veiculados em sistema coloidal SNEDDS, obtido das raízes de Tephrosia toxicaria... 116
Figura 8. Fitotoxidade em sementes de alface (Lactuca sativa) ‘Babá de Verão’ expostas a extrato aquoso (EA) e hidroalcoólico (EHA) das raízes de
Tephrosia toxicaria. Primeira contagem da germinação (A), percentagem
total de germinação (B), comprimento da raiz (C) e biomassa seca total (D). Controle (água)... 118
Figura 9. Fitotoxidade em sementes de alface (Lactuca sativa) ‘Babá de Verão’ expostas a extrato aquoso (EA) e hidroalcoólico (EHA) das raízes de Tephrosia toxicaria veiculados em sistema coloidal SNEDDS. Primeira contagem da germinação (A), percentagem total de germinação (B), comprimento da raiz (C) e biomassa seca total (D). Controle (água)... 119
LISTA DE TABELAS Revisão de Literatura
Tabela 1. Atividades biológicas relacionadas ao controle de pragas e doenças agrícolas, como também vetores de doenças, relacionadas a uma, duas, três, quatro e cinco espécies do gênero Tephrosia...
34
Tabela 2. Atividades biológicas e farmacológicas relacionadas à espécie Tephrosia
toxicaria...
35
Capítulo I
Tabela 1. Reação dos nematoides das galhas (Meloidogyne enterolobii e M.
javanica), em plantas de tomate, quando analisados os parâmetros,
número de galhas (NG), número de ovos (NO), número de ovos por grama de raiz (NO/gR), índice de massa de ovos (IMO), fator de reprodução (FR) e redução do fator de reprodução (RFR), em função do tipo de extrato (folhas, caule e raízes), das concentrações dos extratos aquosos (t(+), t(-), 0,1; 0,2, 0,4, 0,8, 1,6 e 3,2%)...
75
Tabela 2. Desenvolvimento das plantas de tomate na avaliação dos parâmetros altura da planta (AP), peso da matéria fresca da parte aérea (PMFPA), peso da matéria seca da parte aérea (PMSPA) e peso da matéria fresca das raízes (PMFR), em função do tipo de extrato (folhas, caule e raízes), das concentrações dos extratos aquosos (t(+) - não infectada, t(-) - infectada, 0,1; 0,2, 0,4, 0,8, 1,6 e 3,2%) em dois nematoides das galhas (Meloidogyne enterolobii e M. javanica)... 102
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
% percentagem
ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas
cm centímetro (s)
cm3 centímetro (s) cúbico (s) et al. et alli (e outros)
g grama (s)
g.pl-1 grama (s) por planta
IFCE Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Ceará
Kg quilograma (s)
L litro (s)
L1, L2, L3, L4 Larva de primeiro, segundo, terceiro e quatro estágio LTT Laboratório de Tecnologia de Tensoativos
m metro (s)
m2 metro (s) quadrado (s)
mg miligrama (s)
mL mililitro (s)
mL.L-1 mililitro (s) por litro
mL.m-3 mililitro (s) por metro cúbico mm milímetro (s)
MTT brometo 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólico
NGM Nematode Growth Medium
º C grau (s) Celsius O/N Overninght
OP-50 cepa de bactéria Escherichia coli
p/v peso por volume
pH potencial hidrogeniônico ppm parte por milhão
RENORBIO Rede Nordeste de Biotecnologia RKN Root-Knot Nematode
SNEDDS Self nanoemulsifying drug delivery systems
UFRN Universidade Federal do Rio Grade do Norte
v/v volume por volume
MOREIRA, F. J. C. Prospecção de extratos de Tephrosia toxicaria Pers. para controle de nematoides das galhas e desenvolvimento de bionanoformulações derivadas dos extratos para aplicação como nematicida na agricultura. Tese (Doutorado em Biotecnologia) –
Rede Nordeste de Biotecnologia - RENORBIO, Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Orientadora: Profa. Drª. Adriana Ferreira Uchoa, Co-orientadora: Profª. Drª. Maria Aparecida de Medeiros Maciel. Natal - RN: UFRN, 2018.
RESUMO
Dentre os fitonematoides, o gênero Meloidogyne se sobressai, devido a sua plasticidade genética, versatilidade e adaptabilidade, o que os coloca como o principal grupo causador de danos à agricultura. Vários compostos de origem vegetal apresentam atividade nematicida, são rentáveis e ambientalmente seguros, podendo ser utilizados em sistemas de agricultura biológica, contudo, muitos destes produtos se degradam com facilidade, reduzindo a persistência, dificultando a eficiência do controle. Nesse sentido, a nanoencapsulação de pesticidas botânicos apresenta-se como uma tecnologia formidável, podendo transformar o estado físico das substâncias para melhor manipulação, possibilitando a otimização de formulações com liberação controlada, evitando assim a sua degradação, decorrente de condições adversas. Assim, objetivou-se neste trabalho a avaliar a atividade nematicida in
vivo dos extratos aquosos e hidroalcoólicos de caules, folhas e raízes de Tephrosia toxicaria
no controle de alternativo de nematoide das galhas (Meloidogyne enterolobii e M. javanica) em tomate ‘Pati’ e sua avaliação ambiental por meio da citotoxicidade em células 3T3 e ecotoxicidade no solo em Caenorhabditis elegans. Em seguida, outro conjunto de ensaios para avaliar o efeito in vitro dos extratos aquosos e hidroalcoólicos livres e veiculados em sistema coloidal SNEDDS das raízes de T. toxicaria sobre nematoide das galhas (M.
enterolobii e M. javanica) e sua avaliação ambiental, com ecotoxicidade aquática em
microcrustáceo (Ceriodaphinia dubia) e de fitotoxicidade em alface (Lactuca sativa). Os resultados demonstram que extratos aquosos de folhas, caules e raízes de T. toxicaria foram eficientes no controle de M. enterolobii e M. javanica, sendo que os de folhas e raízes mostraram-se mais promissores, a partir da concentração de 0,8%, revelando o potencial destes para o desenvolvimento de alternativas para o controle de nematoides das galhas com baixo custo e baixo risco ambiental. Quanto ao segundo ensaio, observou-se que o extrato aquoso livre, inibiu a eclosão e causou a mortalidade (100%) dos J2 a partir de 0,2%; enquanto extrato hidroalcoólico livre inibiu a eclosão a partir de 0,1% e provocou mortalidade total a partir de 0,2%, com comportamento semelhante para ambos os nematoides. Sendo o extrato hidroalcoólico, o que proporcionou maior inibição da eclosão e mortalidade dos juvenis. Com a veiculação dos extratos em sistema coloidal SNEDDS (Self-nanoemulsifying
drug delivery systems), contendo os extratos aquosos e hidroalcoólicos de raízes de T. toxicaria mostraram-se efetivos, in vitro, inibição completa da eclosão a partir de 0,10 e
0,025%, respectivamente; e mortalidade total a partir de 0,050% nos dois tipos de extratos veiculados; quanto à ecotoxicidade, verificou-se ainda que os extratos livres provocaram mortalidade apenas nas duas concentrações mais elevadas (1,6 e 3,2%), enquanto os extratos veiculados não apresentaram toxidez aquática ao microcrustáceo (C. dubia); quanto a fitotoxicidez sobre a germinação de sementes de alface (L. sativa) ‘Babá de Verão’ não houve
efeito danoso. Considerando esses resultados, podemos concluir que os extratos polares de T.
toxicaria apresentam potencial para aplicação como nematicida botânico. O sistema SNEDDS
apresentou eficiência como sistema carreador das biomoléculas dos extratos aquoso e hidroalcoólico de T. toxicaria, melhorando o efeito nematicida dos princípios ativos. O conjunto de dados apresentados indicam os extratos de T. toxicaria como uma alternativa ao controle de nematoide das galhas, com significativo efeito a baixas concentrações e com razoável segurança ambiental. O sistema SNEDDS, carreador dos extratos polares demonstrou potencial como um novo insumo para o manejo de nematoides das galhas, podendo, portanto, resultar numa formulação que poderá ser empregada comercialmente na agricultura, a qual resultou em um depósito de patente junto ao Instituto Nacional da Propriedade Industrial (INPI).
Palavras-chave: Timbó, Meloidogyne, moléculas bioativas, nanoencapsulação, ecotoxicidade, citotoxicidade.
MOREIRA, F. J. C. Prospecting extracts of Tephrosia toxicaria Pers. for control of root-knot nematodes and development of bionanformulations derived from extracts for application as nematicides in agriculture. Tesis (Doutorado em Biotecnologia) – Rede
Nordeste de Biotecnologia - RENORBIO, Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Orientadora: Profa. Drª. Adriana Ferreira Uchoa, Co-orientadora: Profª. Drª. Maria Aparecida de Medeiros Maciel. Natal - RN: UFRN, 2018.
ABSTRACT
Among the phytonematoids, the genus Meloidogyne stands out, due to its genetic plasticity, versatility and adaptability, which places them as the main group causing damage to agriculture. Several compounds of plant origin have nematicidal activity, are profitable and environmentally safe, and can be used in organic farming systems, however, many of these products degrade easily, reducing persistence, making control difficult. In this sense, the nanoencapsulation of botanical pesticides presents as a formidable technology, being able to transform the physical state of the substances for better manipulation, allowing the optimization of formulations with controlled release, thus avoiding their degradation, due to adverse conditions. The objective of this work was to evaluate the in vivo nematicidal activity of the aqueous and hydroalcoholic extracts of stems, leaves and roots of Tephrosia toxicaria in the control of root-knot nematodes (Meloidogyne enterolobii and M. javanica) in 'Pati' tomato their environmental evaluation through cytotoxicity in 3T3 cells and soil ecotoxicity in
Caenorhabditis elegans. Then another set of assays to evaluate the in vitro effect of the
aqueous and hydroalcoholic extracts free and conveyed in SNEDDS colloidal system of the roots of T. toxicaria on root-knot nematodes (M. enterolobii and M. javanica) and their environmental evaluation, with aquatic ecotoxicity in microcrustaceans (Ceriodaphinia dubia) and phytotoxicity in lettuce (Lactuca sativa). The results demonstrate that aqueous extracts of leaves, stems and roots of T. toxicaria were efficient in the control of M. enterolobii and M.
javanica, and the leaves and roots were more promising, from the concentration of 0.8 %,
revealing the potential of these for the development of alternatives for the control of gnats nematodes with low cost and low environmental risk. As for the second assay, it was observed for the free aqueous extract, inhibited hatching and caused mortality (100%) of the J2 from 0.2%; while free hydroalcoholic extract inhibited hatching from 0.1% and total mortality from 0.2%, with similar behavior for both nematodes. As the hydroalcoholic extract, which gave greater inhibition of hatching and mortality of juveniles. With the introduction of the extracts in colloidal SNEDDS (Self-nanoemulsifying drug delivery systems) containing aqueous and hydroalcoholic extracts of roots of T. toxicaria were effective, in vitro, inhibition complete of hatching from 0.10 and 0.025%, respectively; and total mortality from 0.050% in the two types of extracts conveyed; to the ecotoxicity, it was also verified that the free extracts caused mortality in only the two highest concentrations (1.6 and 3.2%), whereas the extracts showed no aquatic toxicity to the microcrustacean (C. dubia); as for phytotoxicide on germination of lettuce (L. sativa) seeds 'Summer Nanny' there was no harmful effect. Considering these results, we can conclude that the polar extracts of T. toxicaria present potential for application as a botanical nematicide. The SNEDDS system presented efficiency
as a carrier system of the biomolecules of aqueous and hydroalcoholic extracts of T. toxicaria, maintaining the nematicidal effect of the active principles. The data set indicate the extracts of
T. toxicaria as an alternative to the control of gall nematodes, with significant effect at low
concentrations and with reasonable environmental safety. The SNEDDS, system carrier of the polar extracts demonstrated potential as a new input for the management of root knots nematodes,and may therefore result in a formulation that could be commercially employed in agriculture, which resulted in a patent deposit with the National Institute of Industrial Property (INPI).
Key words: Timbó, Meloidogyne, bioactive molecules, nanoencapsulation, ecotoxicity,
17 1. INTRODUÇÃO
Atualmente, a agricultura representa cerca de 20% da balança comercial brasileira, ou seja, participa com aproximadamente um trilhão de reais do Produto Interno Bruto (PIB). Ainda, contribui com 41% das exportações do Brasil e emprega, direta e indiretamente, entre 25 e 30 milhões de pessoas, cerca de 30% da população economicamente ativa (MENTEN, 2014). O Brasil é o terceiro maior produtor mundial de frutas, com cerca de 40 milhões de toneladas anuais e participa com aproximadamente 6,0% da produção, mas contribui com apenas 2,0% das exportações mundiais (FACHINELLO et al., 2011). Nas últimas duas décadas, o setor frutícola brasileiro vem mudando seu foco, investindo em tecnologias de produção para aumentar o rendimento e melhorar a qualidade das frutas, como nos Perímetros Irrigados na região Nordeste, destacando-se o Vale do Rio São Francisco, em que manga, uva e goiaba são as principais frutas da balança comercial local (BUSTAMANTE, 2009).
A expansão das áreas cultivadas e o emprego de algumas técnicas de manejo podem possibilitar a disseminação de novas pragas e doenças, como os nematoides das galhas (Meloidogyne spp.) que apresentam ampla distribuição geográfica e elevada gama de hospedeiros, incluindo muitas espécies de interesse agronômico. Apresentam interação com outros organismos patogênicos, o que os classificam como um dos principais patógenos responsáveis por perdas de até 90% da produtividade, dependendo do grau de infestação nos ecossistemas tropicais e subtropicais (ECHEVERRIGARAY et al., 2010; FERRAZ; BROW, 2016). Dentro deste contexto, duas espécies se destacam, quais sejam: Meloidogyne
enterolobii e M. javanica. São espécies que apresentam ampla gama de hospedeiros, tanto
cultivadas quanto plantas invasoras (SILVA; OLIVEIRA, 2010), sendo capazes de se reproduzir em mono e dicotiledôneas (PERRY; MOENS, 2013).
A espécie M. enterolobii foi relatada pela primeira vez nos estados da Bahia e de Pernambuco em pomares de goiabeira situados no Vale do São Francisco (CARNEIRO et al., 2001), já se encontrando amplamente disseminada pelas diversas regiões do país, tendo sido relatada em outros estados como Rio Grande do Norte (TORRES et al., 2004), Ceará (TORRES et al., 2005), Piauí (SILVA et al., 2006), Paraná (CARNEIRO et al., 2006), São Paulo (ALMEIDA et al., 2006), Espírito Santo (LIMA et al., 2007), Minas Gerais (SILVA; OLIVEIRA, 2010; MARTINS et al., 2013), entre outros.
Enquanto a espécie M. javanica tem seu conhecimento consolidado como um patógeno extremamente comprometedor, apresentando-se com quatro raças fisiológicas baseadas em
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reação de plantas hospedeiro-diferenciadoras desafiadas com o nematoide (CARNEIRO et al., 2003), tais como: raça 1 parasitando fumo, melancia e tomate; raça 2 que parasita além dessas espécies, o pimentão; raça 3 que parasita as mesmas espécies da raça 1 além do amendoim (RAMMAH; HIRSCHMANN, 1990); e, raça 4 que infecta fumo, melancia, tomate, pimentão e amendoim, sendo que o algodão se apresenta imune a este patógeno (CARNEIRO et al., 2003).
Os sintomas diretos causados pelos nematoides das galhas nos sistemas radiculares concorrem, com frequência, para a manifestação subsequente de sintomas reflexos de murcha nos horários mais quentes do dia, principalmente por limitação na absorção e no transporte de água e nutrientes disponíveis no solo para a parte aérea da planta. Em vista disso, as plantas parasitadas por nematoides apresentam-se além de murchas, cloróticas e subdesenvolvidas, ainda predispondo a planta a outros estresses ambientais (LORDELLO, 1992; TIHOHOD, 1993).
Vários são os métodos de controle que podem ser empregados no manejo destes fitopatógenos, os quais estão classificados em químicos, físicos, genéticos e culturais (VIEIRA JÚNIOR et al., 2014). Cabe, portanto, ao produtor fazer a escolha daquele que melhor lhe convier, sempre analisando fatores como: custo/benefício, agressividade do ataque, persistência e prejuízos ao ambiente e às pessoas envolvidas na aplicação dos defensivos agrícolas (LORDELLO, 1992; TIHOHOD, 1993; AGRIOS, 1997; SILVA, 2006).
Na agricultura, os agrotóxicos vêm sendo utilizados de forma frequente e indiscriminada no controle de pragas e doenças, o que pode resultar no acúmulo de resíduos tóxicos nos alimentos, em intoxicações de seres vivos, na contaminação do solo, de corpos d’água e da água subterrânea, na eliminação de inimigos naturais, no desequilíbrio biológico e na resistência destes aos produtos químicos sintéticos. Com intuito de reduzir a utilização de produtos químicos na agricultura, e devido ao apelo da sociedade por alimentos mais saudáveis com menor nível de danos ao ambiente, uma alternativa de controle de pragas e doenças é a utilização de plantas e compostos vegetais que apresentem atividades inseticidas e antimicrobianas (CHITWOOD, 2002; SILVA, 2006).
Este tipo de ação direcionou, sobremaneira, as pesquisas envolvendo o controle de pragas e doenças no sentido de conseguir encontrar produtos naturais com ação antimicrobiana para fungos, bactérias, insetos e nematoides (SILVA, 2006). Na busca por tais produtos, tem-se dado atenção especial aos metabólitos produzidos pelas plantas,
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principalmente aos decorrentes do metabolismo secundário. Estes produtos, geralmente, resultam de compostos presentes em extratos brutos e/ou óleos essenciais, constituindo numa potencial forma de utilização no controle alternativo de pragas e doenças de plantas e que, com os avanços das pesquisas, possibilita comprovar a existência de novas moléculas bioativas e biodegradáveis mais eficientes que poderão ser aplicadas com menor ou nenhuma toxicidade ao homem e ao meio ambiente.
Em função destas fontes naturais já terem sido pesquisadas para outros agentes patogênicos de plantas, com resultados satisfatórios, há um vasto campo alternativo para o controle de nematoides (ALVES et al., 2004; BRITO; OLIVEIRA; BORTOLI, 2006; MOREIRA, 2007; MOREIRA; SANTOS; INNECCO, 2009; MARINO et al., 2012). Contudo, observa-se que a utilização de produtos naturais para o manejo de pragas agrícolas tem como desvantagem sua perda rápida no ambiente em função da fácil degradação das moléculas, seja por agentes químicos, físicos ou biológicos. Logo, a utilização de um veículo, em que os compostos bioativos sejam incorporados/carreados numa matriz ou num sistema de revestimento, em estado líquido ou sólido (TRINDADE; PINHO; ROCHA, 2008), é essencial para o efeito prolongado deste no ambiente de manejo, os quais estão sujeitos às intempéries ambientais.
Para tanto, os sistemas carreadores nanoemulsionados contendo substâncias naturais com atividades pesticidas têm chamado atenção nos últimos anos. Além de serem biodegradáveis e menos tóxicos ao ambiente (IGLESIAS, 2010), eles permitem uma maior molhabilidade, espalhamento e penetração, que são vantagens adicionais para o uso de nanoemulsões como pesticidas agrícolas (WANG et al., 2007). Sendo assim, tendo-se em vista que muitos pesticidas de origem natural são pouco solúveis em água, o desenvolvimento de nanoemulsões é uma alternativa viável para o lançamento de novos produtos. Agregado a isso, está o fato de uma mudança no perfil dos consumidores, o que tem levado a uma busca por “produtos verdes”, indicando o potencial das nanoemulsões contendo produtos naturais para agroindústria (LIM et al., 2012).
Levando-se em consideração a presente pesquisa, a possibilidade de uso deste sistema em aplicação de agroquímicos que não requer uma alta estabilidade, como a diluição de pesticidas e fertilizantes, dá a este estudo uma aplicação prática, considerando o contexto de demanda de pesticidas naturais para uso na agricultura orgânica.
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Segundo Irache et al. (2011), essas nanoemulsões apresentam uma série de vantagens, como maior estabilidade, penetração por membranas, biodisponibilidade, incremento da solubilidade em água de substâncias pouco solúveis e liberação controlada de substâncias. Ainda, outra vantagem é que as nanoemulsões podem potencializar, em alguns casos, uma determinada atividade biológica (SANTOS et al., 2014). As formulações de nanoemulsões vêm ganhando mais destaque , por ser um tipo de formulação de fácil obtenção por diferentes métodos e por sua versatilidade (FERNANDES, 2014).
Neste contexto, voltado para a busca de novos produtos com potencial aplicação na agricultura e biotecnologia, encontra-se o gênero Tephrosia, que pertence à família Leguminoseae Papilionoideae (Fabaceae), possuindo aproximadamente 300 espécies distribuídas em regiões tropicais e subtropicais. Espécies deste gênero apresentam capacidade biogenética para produzir substâncias com grande diversidade estrutural, tais como esteroides, aminoácidos e flavonoides, incluindo os isoflavonoides rotenoides – estes últimos são conhecidos por apresentarem as atividades ictiotóxica e larvicida. Outras atividades biológicas importantes, como antitumoral e antiviral, aparecem também descritas na literatura (SINHA; NATU; NANAVAT, 1982; CABIZZA et al., 2004; YENESEW et al., 2006; VASCONCELOS, 2010).
Vasconcelos (2010) e Lima (2010) reforçam que, em estudo fitoquímico de espécies do gênero Tephrosia, foram relatadas a composição química e as atividades larvicida e antioxidante de T. toxicaria. Os flavonoides iso-obovatina, obovatina, 6a,12a-desidro-β-toxicarol, 6a,12a-desidro-α-toxicarol e α-toxicarol foram isolados e testados frente às larvas de Aedes aegypti.
Considerando o cenário e justificativas apresentados acima, o objetivo principal desta tese consiste em utilizar extratos polares (aquoso e hidroalcoólico) de Tephrosia toxicaria Pers. para o controle alternativo de duas espécies nematoides das galhas (Meloidogyne
enterolobii e M. javanica), tendo sido avaliados em experimentos biológicos in vitro e in vivo
na sua forma livre e encapsulada em sistema de liberação lenta e controlada do tipo SNEDDS (self-nanoemulsifying drug delivery system). O uso do nano carreador biotecnológico viabiliza a aplicação comercial de T. toxicaria e agrega valor científico às pesquisas ecossustentáveis em função de serem produtos biodegradáveis, de fácil aquisição, atóxicos ao homem e resistentes no meio ambiente, o que garante sua ação prolongada.
21 2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Os Nematoides Fitoparasitas
Os nematoides são vermes cilíndricos, sendo a forma do corpo, embora variável, referida comumente como filiforme, ou seja, em forma de fio (aliás, o nome deriva do grego νῆμα – nêma, que significa fio-filamento). Ecologicamente, encontram-se em todos os habitats, terrestres, marinhos e de água doce, e são mais numerosos que outros animais, tanto em espécies como em número de indivíduos. Algumas espécies são microscópicas e outras podem atingir metros de comprimento, como exemplo Placeutonema gigantinima (13 m) (LORDELLO, 1992; TIHOHOD, 1993; FERRAZ; BROW, 2016).
Certas espécies desenvolveram uma habilidade particular de subsistir sob umidade muito baixa por períodos relativamente longos, num estado de repouso, quase sem dispêndio de energia, retomando as atividades normais quando expostas novamente em ambientes favoráveis. Isso pode ocorrer, também, com os nematoides parasitas de plantas, havendo espécies que sobrevivem em sementes (de arroz, como a Aphelenchoides besseyi), em outros órgãos vegetais armazenados a seco por diversas semanas ou até durante meses (na “palha” de bulbilhos de alho, a exemplo de Ditylenchus dipsaci) ou no solo em pousio (de soja, como a
Heterodera glycines) (LORDELLO, 1992; TIHOHOD, 1993; AGRIOS, 1997; FERRAZ;
BROW, 2016).
Segundo os hábitos alimentares, os nematoides podem ser divididos em três grupos: os de vida livre, os zooparasitas ou parasitas de animais e os fitoparasitas ou parasitas de plantas (fitonematoides). Os parasitas de plantas podem ser encontrados no interior de estruturas vegetais, tanto dos órgãos subterrâneos (raízes, rizomas, tubérculos e bulbos) e em raros casos na parte aérea (caules, folhas e flores). Contudo, os maiores problemas relacionados com estes fitoparasitos ocorrem no sistema radicular (Figura 1), onde podem ser encontrados no solo ou no interior da raiz, caracterizando-os como ectoparasitas e endoparasitas, migradores e sedentários, respectivamente (LORDELLO, 1992; TIHOHOD, 1993; AGRIOS, 1997; FERRAZ; BROW, 2016).
22 Figura 1 – Ilustração esquemática de fitonematoides atacando a raiz de planta, onde: 1.
Cephalenchus; 2. Tylenchorhynchus; 3. Belonolaimus; 4. Rotylenchus; 5. Hoplolaimus; 6. Helicotylenchus; 7. Verutus; 8. Rotylenchulus; 9. Acontylus; 10. Meloidodera; 11. Meloidogyne; 12. Heterodera; 13. Hemicycliophora; 14. Criconemoides; 15. Paratylenchus;
16. Trophotylenchulus; 17. Tylenchulus; 18. Sphaeronema; 19. Pratylenchus; 20.
Hirschmanniella; 21. Nacobbus (Ilustração: M. R. Siddiqi).
Fonte: Ferraz e Brown (2016).
Os sintomas diretos da infecção desses fitoparasitos são expressos como galhas ou tumores, os quais resultam da hiperplasia e hipertrofia dos tecidos radiculares, ocasionando o bloqueio dos mesmos e interferindo na absorção de água e de nutrientes do solo (Figuras 2A e 2B). Um exemplo disso, são as deformidades das raízes provocadas por Meloidogyne spp. que constituem-se em fortes drenos metabólicos, espoliando fotoassimilados e utilizando-os para
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o seu desenvolvimento e reprodução, o que contribui para reduzir, sobremaneira, o aproveitamento dos produtos sintetizados para o desenvolvimento normal das plantas, causando a murcha de plantas nos horários mais quentes do dia (CHARCHAR, 1999; MOREIRA 2007). Além de murchas, as plantas tornam-se raquíticas e amareladas, sintomas que se confundem com os de severa deficiência mineral da planta (CHARCHAR, 1999; CHARCHAR, 2001; PEÑA, 2000).
Figura 2 – Sintomas característicos de nematoides das galhas (Meloidogyne ssp.); em (A)
galhas pronunciadas sobre o solo em plantas de tomate, em (B) sistema radicular completamente infectado de galhas e em (C) reboleira em área de soja.
Fonte: (A) próprio autor. (B) Disponível em:
http://www.gvaa.com.br/revista/index.php/RVADS/article/view/4907/4821. (C) Disponível em: biogene.com.br.
As plantas afetadas por nematoides tornam-se mais vulneráveis ao ataque de outros fitopatógenos (danos indiretos), ficam menos resistentes aos estresses hídricos e não respondem satisfatoriamente ao manejo da irrigação e de adubação. A manifestação da presença de nematoides costuma ocorrer em áreas limitadas dentro da cultura, chamadas de manchas ou reboleiras (Figura 2C), nas quais se observam plantas com desenvolvimento atrasado, de tamanho irregular, muitas vezes amarelecidas (cloróticas) e que pouco produzem, contrastando com o restante da área cultivada (LORDELLO, 1992; TIHOHOD, 1993; MOURA, 1996; FREITAS; OLIVEIRA; FERRAZ, 2004).
As perdas agrícolas devidas aos nematoides podem variar muito, dependendo da espécie do nematoide e da cultura hospedeira envolvida na associação, das condições de solo, principalmente umidade e aeração, além do clima da região onde se localiza a área infestada, do tipo de manejo adotado pelo produtor, do valor comercial do produto agrícola e da época.
24 2.2 Os Nematoides das Galhas (Meloidogyne spp. Goeldi)
A palavra Meloidogyne vem do grego melon, que significa maçã ou o fruto de cabaceira, cabaça, mais o sufixo oeides, oid (semelhante) mais gyne (mulher ou fêmea) (MITKOWSKI; ABAWI, 2003). O primeiro relato de plantas infectadas por nematoides data de 1855, quando Berkeley, trabalhando na Inglaterra descobriu que havia uma associação entre um pequeno verme do solo com a formação de nódulos em raízes de pepino (MOURA, 1996).
Em relato sobre a primeira referência de nematoides formadores de galhas, realizada por Jobert, em 1878, na antiga Província do Rio de Janeiro, foi observada, na doença que causava engrossamento das raízes de cafeeiro, a presença de pequenas e numerosas estruturas denominadas galhas, formadas por estruturas císticas que continham ovos elípticos e pequenos animais vermiformes denominados por Goeldi (1887) de Meloidogyne exigua, que descreveu a importância da espécie para a cultura do cafeeiro, sendo esta a espécie tipo (MOURA, 1998; MITKOWSKI; ABAWI, 2003).
Com o decorrer dos anos, novas espécies foram descritas e o gênero Meloidogyne tornou-se o mais representativo em importância agrícola e econômica e de maior interesse no mundo, por comprometer diversas culturas (frutícolas, ornamentais, forrageiras, hotaliças, dentre outras (MITKOWSKI; ABAWI, 2003). Atualmente, cerca de 100 espécies destes nematoides já foram descritas (FERRAZ; BROWN, 2016), sendo Meloidogyne incognita, M.
javanica, M. arenaria e M. hapla as que ocasionam as maiores perdas para a agricultura
mundial (CARNEIRO; ALMEIDA, 2001). Esses nematoides apresentam um alto grau de importância devido à sua ampla distribuição geográfica, sendo esta cosmopolita, e, ainda, por possuírem uma vasta gama de hospedeiros (TAYLOR; SASSER, 1983; AGRIOS, 2005).
Os sintomas diretos desses fitoparasitos são expressos como galhas ou tumores, os quais resultam da hiperplasia e hipertrofia dos tecidos radiculares que bloqueiam a absorção de água e de nutrientes do solo (PEÑA, 2000). Essas deformidades das raízes provocadas por
Meloidogyne spp. constituem-se em fortes drenos metabólicos, espoliando fotoassimilados e
utilizando-os para o seu desenvolvimento e reprodução, o que contribui para reduzir, sobremaneira, o aproveitamento dos produtos sintetizados para o desenvolvimento e a produção do potencial fisiológico das plantas, causando a murcha de plantas nos horários mais quentes do dia (LORDELLO, 1992; TIHOHOD, 1993; MITKOWSKI; ABAWI, 2003).
25 2.2.1 Meloidogyne enterolobii Yang & Eisenback (sin. M. mayaguensis)
A partir do final da década de 1980, severos danos à goiabeira, causados pelo nematoide das galhas, foram reportados, mas o primeiro relato de Meloidogyne enterolobii (YANG; EISENBACK, 1983), sinonímia Meloidogyne mayaguensis (RAMMAH; HIRSCHMANN, 1988), em raízes de goiabeira, no Brasil, foi realizado em pomares localizados nos municípios de Petrolina (Pernambuco), Curaçá e Maniçoba (Bahia) (CARNEIRO et al., 2001). Como consequências desse patossistema, em áreas irrigadas da região do Médio São Francisco, houve redução de 72,2% da área cultivada entre 2000 e 2006, passando de cerca de 6.000 ha para menos de 1.700 ha em decorrência da erradicação dos pomares infestados (CARNEIRO
et al., 2007). Este nematoide é uma espécie com ampla gama de hospedeiros, tanto cultivadas
quanto plantas invasoras (SILVA; OLIVEIRA, 2010). Atualmente, encontra-se amplamente disseminado pelas diversas regiões do país, tais como Rio Grande do Norte (TORRES et al., 2004), Ceará (TORRES et al., 2005), Piauí (SILVA et al., 2006), Paraná (CARNEIRO et al., 2006), São Paulo (ALMEIDA et al., 2006), Espírito Santo (LIMA et al., 2007), Minas Gerais (SILVA; OLIVEIRA, 2010; MARTINS et al., 2013).
Esta espécie é altamente virulenta a diferentes espécies vegetais, representando uma ameaça a diversas culturas, principalmente no semiárido brasileiro, principalmente em áreas de cultivo de frutíferas tropicais, em especial a cultura da goiabeira (MARANHÃO; MOURA; PEDROZA, 2003); é considerada uma espécie polífaga, com alto grau de disseminação e multiplicação. M. enterolobii tem o potencial de atacar plantas resistentes a outras espécies do gênero Meloidogyne (CARNEIRO et al., 2006), o que torna esta espécie uma ameaça a diversas culturas de interesse econômico.
M. enterolobii, é um endoparasita sedentário, que tem seus ovos (cerca de 400 e 600
ovos) depositados pelas fêmeas em uma massa gelatinosa próxima a superfície da raiz. Então, quando larvas juvenis de segundo estádio (J2) eclodem dos ovos, migram para o ápice radicular e, por meio de seu estilete, penetram e movem-se intercelularmente para o tecido cortical, onde serão estabelecidos os sítios de alimentação (MITKOWSKI; ABAWI, 2003), conforme pode ser observado na Figura 3. Os padrões de esterase e malato desidrogenase já foram descritos para essa espécie, sendo que a maior parte das populações apresenta fenótipos M2 e N1a (ALFENAS, 2006), o que veio auxiliar na identificação correta e precisa das espécies por meio da técnica de eletroforese de isoenzimas.
26 Figura 3 – Fases do ciclo de vida dos nematoides das galhas (Meloidogyne spp.).
Fonte: Cortesia de V. Brewster. Adaptado de Mitkowski e Abawi (2003).
Com a infecção nas raízes ocasionada por M. enterolobii, é desencadeado o quadro sintomatológico da doença, que se caracteriza pelo declínio das plantas, iniciando com o amarelecimento generalizado e bordos foliares avermelhados, passando à murcha, necrose e abscisão prematura. Com a evolução da doença, há menor densidade do dossel foliar das goiabeiras e os troncos perdem o ritidoma (conjunto de camadas de tecido morto na superfície dos caules), característica peculiar de alguns gêneros da família Myrtaceae (Campomanesia,
Eucalyptus, Eugenia, Myrciaria, Psidium), tornando-se acinzentados devido à maior
exposição à radiação solar, culminado com a morte das plantas (CARNEIRO et al., 2001; FREITAS et al., 2014).
27 2.2.2 Meloidogyne javanica (Treub) Chitwood
Trata-se de uma espécie polífaga predominante de regiões com estações secas bem definidas (EISENBACK; TRIANTAPHYLLOU, 1991). As fêmeas de M. javanica apresentam forma de pêra e os machos apresentam disco labial não elevado e ausência de lábios laterais. Essa espécie pode ser facilmente identificada pela configuração da região perineal, com dois campos laterais distintos claramente demarcados por estrias mais ou menos paralelas (CARNEIRO et al., 2016).
Esses nematoides são capazes de se reproduzir em mono e dicotiledôneas (PERRY; MOENS, 2013), apresentando quatro raças fisiológicas baseadas em reação de plantas hospedeiro-diferenciadoras ao nematoide (CARNEIRO et al., 2003), tais como: raça 1 parasitando fumo, melancia e tomate; raça 2 que parasita além dessas espécies, o pimentão; raça 3 que parasita as mesmas espécies da raça 1, além do amendoim (RAMMAH; HIRSCHMANN, 1990); e, raça 4 que infecta fumo, melancia, tomate, pimentão, amendoim, sendo que o algodão se apresenta imune (CARNEIRO et al., 2003).
Os padrões de esterase e malato desidrogenase já foram descritos para essa espécie, sendo que a maior parte das populações apresenta fenótipos EST-J3 e MDH-N1. No entanto, algumas populações apresentaram perfis J2 e J2a, diferenciando de J3 pela ausência de uma das bandas. A diagnose tradicional a partir da configuração perineal tem sido substituída pela diagnose molecular com marcadores SCAR e eletroforese de isoenzimas (COFCEWICZ et
al., 2004; ALFENAS, 2006; CARNEIRO et al., 2016).
O estudo ora apresentado se debruça sobre estas duas espécies de nematoides das galhas, pois eles foram as mais observadas em levantamentos realizados em áreas comerciais de produção de frutas e de hortaliças na mesorregião Noroeste do Estado do Ceará (SILVA, 2014). Nessa região estão sendo desenvolvidos trabalhos de pesquisa voltados para tecnologia agrícola no instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Ceará visando contribuir a alavancar estes setores do agronegócio na região, corroborando para justificar a importância de se estudar o controle destas duas espécies de nematoides.
28 2.3 Controle de Nematoides das Galhas
Vários métodos de controle podem ser empregados no manejo destes fitopatógenos, e estes são classificados em controles: químicos, físicos, genéticos e culturais (VIEIRA JÚNIOR et al., 2014). Cabe, portanto, ao produtor fazer a escolha daquele que melhor lhe convier, sempre analisando fatores como: custo/benefício, nível de agressão da doença, persistência e prejuízos ao ambiente e às pessoas envolvidas na aplicação dos defensivos agrícolas (LORDELLO, 1992; TIHOHOD, 1993; AGRIOS, 2005).
Em virtude da toxicidade dos nematicidas de origem sintética, dos danos provocados ao homem e ao meio ambiente e, também, devido ao apelo da sociedade por alimentos mais saudáveis, muitos produtos de origem natural têm sido testados no controle desses fitopatógenos no intuito de substituí-los. Atualmente, em decorrência da pressão exercida por parte da sociedade, tem-se direcionado, sobremaneira, as pesquisas envolvendo o controle de pragas e doenças no sentido de se descobrir produtos naturais com ação antimicrobiana para fungos, bactérias, insetos e nematoides (CASTRO, 1989; SILVA et al., 2006).
Na busca por tais produtos, tem-se dado uma expressiva atenção aos metabólitos produzidos pelas plantas, principalmente aos derivados do metabolismo secundário. Estes produtos resultam, geralmente, de compostos presentes em extratos brutos das distintas partes do vegetal e/ou óleos essenciais, constituindo uma potencial forma de controle alternativo de pragas e doenças de plantas, e que, com os avanços das pesquisas, poderão fornecer novas moléculas bioativas e biodegradáveis que sejam mais eficientes contra as pragas e doenças e com menor ou nenhuma toxicidade ao homem e ao meio ambiente (OKA et al., 2000; CHITWOOD, 2002).
O estudo in vitro de produtos naturais para o controle de fitopatógenos é sempre o primeiro passo para avaliar se esses produtos têm potencial para utilização subsequente em estudos mais elaborados em casa de vegetação e em campo.
2.3.1 Controle alternativo dos nematoides das galhas
A busca por compostos nematicidas de origem vegetal deve-se, primeiramente, à escassez de compostos nematicidas comerciais que eliminem com segurança estes fitoparasitas. Na natureza, em especial em plantas de Biomas como a Caatinga que ainda têm sua biodiversidade pouco explorada, ocorrem uma gama de compostos fitoquímicos com
29
potencial atividade nematicida. Além disso, uma outra razão pelo interesse em se pesquisar bioativos naturais para o controle de fitoparasitas do solo é a preocupação em se utilizar compostos que reduzam o problema da contaminação da fauna e flora e que não deixem resíduos tóxicos nos alimentos, como, por exemplo, em frutas, hortaliças folhosas, tubérculos e rizomas destinados ao consumo humano (CHAGAS, 2004).
De acordo com Quarles (1992), os pesticidas botânicos apresentam algumas vantagens sobre os pesticidas sintéticos, tais como: fornecer novos compostos que as pragas ainda não são capazes de inativar; são menos concentrados e, portanto, potencialmente menos tóxicos que os compostos sintéticos puros; são biodegradáveis, podendo possuir múltiplos modos de ação, possibilitando um amplo espectro de uso enquanto retêm uma ação seletiva dentro de cada classe de praga; e, são derivados de recursos renováveis. Outras vantagens incluem baixo custo, disponibilidade fácil e imediata em relação aos nematicidas convencionais.
Sabe-se que muitas plantas possuem fitoquímicos com atividade nematicida contra uma vasta gama de nematoides parasitas de plantas (CHITWOOD, 2002), incluindo nematoide das galhas (Meloidogyne spp.) (JOURAND et al., 2004; HUSSAIN et al., 2011). Em estudo com os extratos aquosos de C. sativa e Z. alatum observou-se atividade contra M. incognita, sendo
C. sativa o mais tóxico (MUKHTAR; KAYANI; HUSSAIN, 2013). Extratos aquosos de C. sativa promoveram a morte de juvenis J2 de nematoide Heterodera cajani (MOJUMDER et
al., 1989) e outros nematoides fitopatogênicos (Tylenchorhynchus brassicae, Hoplolaimus indicus, Rotylenchulus reniformis) como relataram Haseeb et al. (1978).
O mecanismo de ação da atividade nematicida de extratos de plantas ou seus componentes ainda não foi elucidado; vários extratos de plantas têm mostrado inibir a atividade da acetilcolinesterase em insetos (RYAN; BYRNE, 1988). Como a acetilcolina também serve como um neurotransmissor em nematoides, os componentes dos óleos essenciais podem afetar adversamente o sistema nervoso. Outra possibilidade é que extratos de plantas e óleos essenciais causem ruptura da membrana celular dos nematoides e afetem negativamente sua permeabilidade. Este mecanismo também tem sido sugerido para explicar a atividade fungicida e antimicrobiana de óleos essenciais e extratos de plantas antagônicas.
Diversos compostos vegetais, isoladamente ou em conjunto, contribuem para o comprometimento de muitos processos biológicos, apresentando atividades como atração e repulsão de nematoides, estímulo ou inibição da eclosão de J2 e mostrando também possuir propriedades nematicidas (CHITWOOD, 2002). Os compostos nematicidas que ocorrem
30
naturalmente em relação ao M. incognita incluem os alcaloides pirrolizidínicos (KINGHORN; SMOLENSKI, 1981), trans-anetole (OKA et al., 2000), p-anisaldeído, transcinmaldeído, 2-furaldeído e benzaldeído (OKA, 2001). Nestes estudos, as propriedades nematicidas de C.
sativa são creditadas aos canabinoides presentes nos extratos foliares, os quais são
especialmente sintetizados pela Cannabis, que são compostos terpenofenólicos contendo 21 carbonos (TURNER; ELSOHLY; BOEREN, 1980). Mais de 60 canabinoides, como o canabidiol, o canabinol, o delta 9-tetrahidrocanabinol, a tetrahidrocanbivarina, o ácido tetrahidrocanbólico, dentre outros, foram identificados (McPARTLAND, 1997).
Importantes funções na autodefesa e adaptação das plantas no ambiente, contribuindo para uma melhor interação com os diferentes ecossistemas, estão associadas ao metabolismo secundário. No entanto, estes metabólitos não apresentam uma distribuição que possa ser encontrada em todas as plantas, devendo-se considerar, então, que certos componentes estarão presentes somente em determinadas espécies, o que demonstra sua importância também na taxonomia (BOURGAUD et al., 2001; CSEKE et al., 2006; FUMAGALI et al., 2008).
Extratos bioativos de plantas podem conter um grande número de metabólitos secundários, substâncias biologicamente ativas que podem agir isoladas ou em combinação para produzir efeito direto ou indireto, levando à redução populacional e, consequentemente, diminuindo a potencialidade de infestação e de perdas de produção agrícola. Os compostos presentes nas diversas partes das plantas também podem promover melhoria na disponibilidade proteica para o hospedeiro e/ou ter efeito direto ou indireto sobre minerais ou elementos traços. É sabido que há muitos compostos bioquimicamente ativos que podem agir contra parasitas de plantas, incluindo os presentes em extratos, em óleos essenciais como por exemplo, os inibidores de enzimas , as lectinas e polifenóis como os taninos (NEVES et al., 2005; JACKSON; GORDON, 2008).
Plantas medicinais e aromáticas são bastante estudadas no controle de fitonematoides em razão de possuírem uma série de componentes com comprovada eficiência, como alcaloides, isotiocianatos e compostos fenólicos que possuem propriedades nematicidas (CHITWOOD, 2002).
2.3.2 Extratos botânicos no controle de nematoides
As plantas, de uma maneira geral, produzem metabólitos secundários que são produtos finais das reações ocorridas em seu metabolismo. Estes compostos possuem diversas funções
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no desenvolvimento fisiológico das plantas e, também, como mediadores de interações entre elas e outros organismos (GARDIANO et al., 2008). As propriedades pesticidas das plantas são conhecidas há milhares de anos e, nos tempos recentes, o interesse pela identificação de pesticidas naturais tem crescido bastante, especialmente para utilização no controle de pragas agrícolas (KOUL; WALIA, 2009).
Os extratos de plantas têm mostrado uma série de atividades biológicas relevantes para a comunidade científica, sendo associadas principalmente à ampla diversidade, tanto de estruturas quanto de constituintes presentes nos extratos e suas interações que, muitas vezes, potencializam a atividade biológica (ação sinergística). Salientando-se este fato, o estudo fitoquímico torna-se de vital importância para a busca de moléculas potencialmente ativas, bem como a caracterização e identificação de novas moléculas (LIMA, 2010).
A utilização de extratos pode ser vantajosa uma vez que eles, em geral, possuem elevado grau de biodegradação, resultando em baixo impacto ambiental, e são constituídos por diferentes moléculas que, atuando em mecanismos de ação diversos, podem retardar o surgimento de resistências, bem como possuem modo de preparo fácil com baixo custo de produção (GOVINDARAJAN, 2009; PONTUAL et al., 2012). Portanto, as plantas podem ser utilizadas para a preparação de extratos, obtenção de óleos essenciais ou terem certos componentes químicos ativos identificados e purificados para serem utilizados isoladamente (KOUL; WALIA, 2009).
A toxicidade de um extrato não difere apenas entre os alvos (fungos, bactérias, nematoides, insetos), mas pode variar significativamente dependendo do órgão ou da idade da planta, assim como do solvente de extração utilizado (LUNA et al., 2005; PATIL et al., 2010).
Mervat, Shawky e Shaker (2012) observaram que extratos de Origanum majorana e
Tagetes erecta (folhas + galhos) durante o crescimento e a produção de videiras, em que
ambos apresentaram influência na redução populacional de M. incognita em comparação com o nematicida sintético comercial, mostrando-se equivalentes, contudo, esses extratos apresentam maior segurança do ponto de vista ecológico. Tal melhoria ainda pode ser expressa em termos de produção de videira, características da baga e aumento do tamanho e da capacidade de absorção do sistema radicular. Os autores atribuem tal feito à presença de compostos ativos de O. majarana como timol, inalol e alcavacrol e em T. erecta contém
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limoneno, linalol, tagetona, ocimeno, α-felandreno, cineol e α-tertenil, conforme resultado semelhante observado por Moreira e Ferreira (2015).
Já Asif et al. (2017) observaram mortalidade de J2 de 95,6 e 90,4% e inibição da eclosão de 98,8 e 95,9% sobre M. incognita em extratos aquosos de A. conyzoides e de C. grandis, respectivamente, após 72 horas de avaliação. Nestes extratos foram observados um grande número de compostos bioativos, como flavonoides, saponinas, taninos, gomas, glicosídeos, carboidratos, esteroides e alcaloides nas diferentes partes das plantas, caule, folhas e frutas, sugerindo-se que estes compostos foram os responsáveis por estes efeitos, visto que eles já têm comprovadas atividades nematicidas e namatostásticas. Azhagumurugan e Rajan (2014), analisando o controle de M. incognita sobre as características de crescimento de Vigna mungo tratado com extrato das folhas de Mimusops elengi, observaram que a altura da planta, área foliar, conteúdo de clorofila ‘a’, comprimento da raiz, massa fresca e seca da parte aérea, aumentaram proporcionalmente às concentrações de extratos das folhas, com diminuição no índice de galhas e de massas de ovos nas raízes.
Azhagumurugan, Rajan e Pavaraj (2014) constataram a eficácia no controle de M.
incognita por meio do crescimento de Macrotyloma uniflorum tratada com extrato de Aegle marmelos, bem como verificaram que este extrato apresentou redução populacional do
nematoide. Os autores atribuem tal feito à presença de compostos com atividade antihelmíntica e nematicida de A. marmelos, em que os extratos das folhas mostraram-se altamente tóxicos para juvenis J2. Enquanto os extratos aquosos de alho, mamona e calêndula foram efetivos no biocontrole de nematoide das galhas em tomate, verificou-se que Ricinus
communis foi melhor inibidor de número de ovos e índice de massa de ovos, reduzindo a taxa
de reprodução de M. incognita, recomendando-se, portanto, para o manejo destes fitonematoides (TIBUGARI et al., 2012).
Lanza et al. (2010), avaliando o efeito de Capraria biflora sobre a eclosão e a mortalidade de juvenis J2 de M. javanica, em bioensaio in vitro, observaram que os extratos de caule e raiz, a partir do material triturado de C. biflora, proporcionaram maior mortalidade de juvenis J2 de M. javanica. Enquanto para o método de extração, o extrato obtido de folhas de C. biflora foi o que proporcionou maior mortalidade de J2 de M. javanica. Portanto, a utilização de folhas, combinada com o método de extração, apresenta-se como uma boa alternativa para o controle de M. javanica por sua praticidade, efetividade de controle e seu baixo custo de preparo e obtenção da matéria-prima.
