UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
TATIANI BRENELLI DE LIMA
APLICAÇÃO DE ESPECTROMETRIA DE MASSAS NA CARACTERIZAÇÃO DE INTERAÇÕES PROTEÍNA-PROTEÍNA
CAMPINAS 2018
TATIANI BRENELLI DE LIMA
APLICAÇÃO DE ESPECTROMETRIA DE MASSAS NA CARACTERIZAÇÃO DE INTERAÇÕES PROTEÍNA-PROTEÍNA
Orientador: Prof. Dr. Fabio Cesar Gozzo
Coorientadora: Dra. Juliana Helena Costa Smetana
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA POR TATIANI BRENELLI DE LIMA, ORIENTADA PELO PROF. DR. FABIO CESAR GOZZO
CAMPINAS 2018
Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Doutora em Ciências.
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Fabio Cesar Gozzo (Orientador)
Profa. Dr. Fábio César Sousa Nogueira (IQ-UFRJ/Rio de Janeiro)
Prof. Dr. Celso Eduardo Benedetti (LNBio-CNPEM/Campinas)
Profa. Dra. Denize Cristina Favaro (IQ-UNICAMP)
Profa. Dra. Taicia Pacheco Fill (IQ-UNICAMP)
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do(a) aluno(a).
Este exemplar corresponde à redação final da Tese de Doutorado defendida pelo(a) aluno(a) TATIANI BRENELLI DE LIMA, aprovada pela Comissão Julgadora em 19 de março de 2018.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Prof. Dr. Fábio Gozzo, por ter me aceitado no grupo, pelos incentivos e desafios, por acreditar em mim e meu trabalho, pelo ótimo convívio nesses últimos seis anos e pelos ensinamentos não somente sobre ciências que serão levados para a vida.
A minha coorientadora, Dra. Juliana Smetana, por ter aceitado a coorientação após uma colaboração, pela paciência e confiança, pelos incentivos, ensinamentos e discussões longas sobre ciências e o mundo das células e vias.
Aos meus pais, Sueli e Hélio, por todo esforço de vocês para minha formação pessoal e profissional, pelo incentivo em todos os momentos difíceis, pelo carinho, paciência, dedicação e amor sempre. Se hoje posso dizer que obtive alguma conquista na vida, é graças a vocês dois.
Ao meu irmão, Thiago, pela amizade, pelo companheirismo, compreensão, incentivo, paciência e tudo mais. A minha família, Mari, Edmilson, Rose, José Antônio, Rick, Fer, Julio, Sandy, May e todos os demais, pelo incentivo, carinho e compreensão.
Aos meus colegas e amigos do grupo Dalton, pela amizade, ótimo convívio e ensinamentos. Aos alunos mais antigos Alex, Mari e Hector pela amizade, apoio, paciência, por todas as dicas, ensinamentos e discussões científicas que possibilitaram construir uma base para desenvolver esse trabalho. Aos ex-alunos e atuais, Hugo, Luana, Allan, Adriana, Elidiane, Marcel, André, Mauro, Gilce, Bruno, Renan, Gisel por todos os momentos de aprendizagem, excelente convívio, pela amizade, paciência, apoio e ensinamentos. À Renata, pela amizade e discussões sobre ciência e vida que vou levar para vida.
A minhas amigas do grupo da Dra. Juliana, Ana, Mariana e Valéria, pela amizade que vou levar para a vida, excelente convívio, ensinamentos, discussões sobre ciências e vida, e também pela paciência todas as vezes que ouviram “isso não faz sentido”. À Nádia, pelos ensinamentos e discussões sobre ciência. Ao Vitor, Ricardo e Jordy, vocês de alguma forma fizeram parte dessa tese.
Ao Prof. Dr. Carlos Ramos, do IQ da UNICAMP, coorientador não oficial nesses últimos seis anos, pela colaboração, amizade, confiança e excelentes discussões sobre chaperonas. A Dra. Letícia Murakami pela amizade e colaboração.
Também, aos alunos e técnicos do grupo do Dr. Carlos, Dev, Viviane, Glaucia, Annelize, Vanessa e Regina pela amizade e discussões sobre ciência.
Aos colaboradores Prof. Dr. Ricardo Aparício, do IQ da UNICAMP, Dra. Adriana Soprano, do LNBio, Dr. Paulo Carvalho, da FIOCRUZ, e Dr. Diogo Borges pela amizade e colaboração.
Ao Prof. Dr. Tiago Santana Balbuena, pela sua amizade e disponibilidade, e por ceder seu tempo, laboratório e equipamento (espectrômetro de massas) para as análises.
Ao Prof. Dr. Martin R. Larsen, por disponilizar tempo de equipamento (espectrômetro de massas) para as análises das amostras.
Aos colegas e amigos do LNBio pela amizade, discussões sobre ciências e disponibilidade, Jhenifer, Carol, Dr. Daniel e Dra. Silvana Rocco. Em especial, a Jaqueline pelo ótimo convívio, diversas dicas, incentivos, discussões e ensinamentos.
A Profa. Dra. Andrea Sinz, pela amizade e orientação durante o período do doutorado sanduíche. Ao grupo da Dra. Andrea, pelo convívio e discussões sobre ciências. Em particular, aos alunos Christian, Friedirike, Alessandro e o técnico Dirk pela amizade, excelente convívio, ajuda, paciência e discussões sobre a vida e ciências.
Aos meus amigos, Samara, Joy, Je, Tate, Dani, Rick, Paulo, e todos os demais, pela amizade, incentivo, apoio e compreensão durante o trabalho.
A todos os professores que participaram da minha formação, por todos os ensinamentos que serão levados para vida.
Ao Instituto de Química da UNICAMP e o LNBio, pela infraestrutura e por seus vários funcionários que colaboraram direta ou indiretamente para a realização desse trabalho. Aos funcionários das oficinas mecânica e eletrônica, à Rita e Priscila pelo apoio, convívio e amizade. Aos funcionários da CPG por todo o suporte durante esse período.
Aos órgãos de formento CAPES e CNPq (processo n˚ 203800/2017-6), pelas bolsas concedidas.
RESUMO
A técnica de ligação cruzada associada à espectrometria de massas (XL-MS) baseia-se na união covalente de resíduos de aminoácidos estruturalmente próximos por meio de um agente de ligação cruzada (ALC). O ALC atua como uma régua molecular gerando informações a respeito da distância em que os resíduos reativos encontram-se na estrutura terciária e quaternária de proteínas. A técnica de troca de hidrogênio-deutério associada à MS (HDX-MS) consiste na troca de átomos de hidrogênio lábeis por átomos de deutério presentes na solução. Essa técnica fornece informações sobre mudanças conformacionais e dinâmica de proteínas e complexos proteicos. A Hsp90 é uma chaperona molecular essencial para células que exerce um papel fundamental na homeostase. A Hsp90 atua também no processo de translocação de proteínas do citosol para as mitocôndrias via complexo TOM, por meio da interação entre os domínios C-terminal da Hsp90 (CHsp90) e o citosólico da proteína Tom70 (Tom70C). As características estruturais do complexo CHsp90-Tom70C foram investigadas utilizando XL-MS e HDX-MS. Os resultados demonstraram uma nova região de interação entre essas proteínas que envolve a hélice A7 da Tom70C e o peptídeo TLRQKAEADKNDKSVKDLVILLY presente na Hsp90. Ensaios de importações mitocondriais confirmaram essa nova região de interação. Os resultados permitiram propor um modelo estrutural de baixa resolução para o complexo CHsp90-Tom70C e ampliar as informações descritas na literatura quanto ao mecanismo de importação de pré-proteínas para mitocôndria. A PP2A, segundo alvo desta tese, é uma serina/treonina fosfatase que atua em diversos processos celulares e é um importante supressor tumoral. A holoenzima funcional da PP2A é heterotrimérica e composta por uma subunidade ancoradora, regulatória e catalítica (PP2Ac). A sequência conservada do extremo C-terminal (306DYFL309) da PP2Ac sofre
modificações pós-traducionais que regulam a interação com outras subunidades e conferem seletividade ao substrato. A TIPRL é uma proteína conservada que interage e inibe a atividade da PP2Ac. Existe uma escassez nas informações sobre os mecanismo regulatórios e estruturais no processo de biogênese da PP2A e também do papel da TIPRL. Estudos utilizando co-imunoprecipitação combinada com western blot e MS foram propostos para analisar o processo de biogênese da PP2A comparando duas isoformas da PP2Ac: ativa e inativa. Informações estruturais da regulação da PP2A por TIPRL foram obtidos usando XL-MS e HDX-MS para estudar a estrutura e dinâmica da TIPRL em solução e complementar dados de cristalografia. Os resultados da biogênese da PP2A evidenciaram que esse processo ocorre em um tempo menor que 48 horas. O cristal da TIPRL humana é um novo fold, composto por folhas betas e uma fenda ligada a um peptídeo derivado do sítio de clivagem da enzima TEV. O peptídeo co-cristalizado (LYFQ) apresenta similaridade de sequência com o extremo C-terminal da PP2Ac. Análises de HDX-MS utilizando TIPRL e os tetrapeptídeos sintéticos (DYFL e DpYFL) demonstram que o extremo C-terminal da PP2Ac interage nessa fenda e existe maior afinidade com o peptídeo não fosforilado. Essas descobertas abrem novas vias de desenvolvimento de fármacos, já que a fenda na TIPRL pode ser alvo de fármacos para liberar a atividade da fosfatase em células cancerígenas.
Palavras-chave: espectrometria de massas, proteômica estrutural, reação de ligação cruzada, troca de hidrogênio-deutério, Hsp90, Tom70, TIPRL, PP2A.
ABSTRACT
Chemical cross-linking followed by mass spectrometry (XL-MS) involves the covalent linkage of amino acids that are close in space by using chemical agents (cross-linkers). The cross-linkers act as molecular rules that provide information on distances between the cross-linked amino acids residues in the tertiary and quaternary structure of proteins. The hydrogen-deuterium exchange is a chemical reaction in which label hydrogen of proteins is replaced by a deuterium in solution. This technique coupled to mass spectrometry (HDX-MS) is used to study the conformation and dynamics of proteins and complexes. Hsp90 is a molecular chaperone that is crucial to maintain cellular homeostasis. Hsp90 also facilitates the transport of preproteins from the cytosol to the mitochondria via TOM complex, through interaction between cytosolic domain of Tom70 (Tom70C) and C-terminal domain of Hsp90 (CHsp90). Structural insights of CHsp90-Tom70C complex were investigated using XL-MS and HDX-MS. This strategy has identified a novel region of contact between CHsp90-Tom70C (TLRQKAEADKNDKSVKDLVILLY and helix A7, respectively). The new interface was confirmed via mitochondrial import assays. The results allowed to generate a low resolution molecular model to the CHsp90-Tom70C complex and fulfill information of the mechanism which preproteins are translocated via Tom70 to the mitochondria. Protein phosphatase 2A (PP2A) is a serine/threonine phosphatase in cells, which acts in several cellular processes and is an important tumor suppressor. Functional PP2A holoenzymes are heterotrimers composed of scaffold, regulatory and catalytic (PP2Ac) subunits. The catalytic subunit has a conserved C-terminus (306DYFL309) that
undergoes post-translational modifications, which regulate the interactions with the other subunits and confer substrate selectivity. TIPRL is a conserved protein that binds and inhibits PP2Ac. There is a dearth of information regarding the regulatory and structural mechanisms in the assembly of PP2A heterotrimers and the possible role of TIPRL. Co-immunoprecipitation combined to western blot and MS were used to study the biogenesis process of PP2A using two PP2Ac isoforms: active and inative. The structural basis of regulation of PP2A by TIPRL was obtained using XL-MS and HDX-MS to understand the dynamics of TIPRL in solution and complement crystallographic data. The PP2A biogenesis analysis indicate that this process takes up to 48h. The crystal structure of human TIPRL is a new fold with beta-sheet core and a cleft bound to a peptide derived from TEV mediated cleavage of the affinity tag. The TEV-derived peptide (LYFQ) which co-crystallized had a striking similarity with the conserved C-terminus of PP2Ac. The HDX-MS analysis with TIPRL and synthetic tetrapeptides (DYFL and DpYFL) showed that this binding site in TIPRL structure actually harbors the C-terminus of PP2Ac and that TIPRL has a clear preference for the non-phosphorylated peptide. These findings open new drug development avenues as the presence of a druggable pocket in TIPRL could be targeted to release phosphatase activity in cancer cells.
Keywords: mass spectrometry, structural proteomics, chemical cross-linking, hydrogen-deuterium exchange, Hsp90, Tom70, TIPRL, PP2A
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Modelo estrutural dos complexos PRC2 e RVB ... 23 Figura 2. Representação esquemática da modificação do ALC na estrutura da proteína após a reação de ligação cruzada ... 24 Figura 3. Estrutura do ALC do tipo homobifuncional derivado de ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) utilizados em experimentos de ligação cruzada com análise por MS. ... 25 Figura 4. Esquema representativo do método de ligação cruzada associada à espectrometria de massas para caracterização de estrutura de proteínas e complexos proteicos ... 26 Figura 5. Representação das espécies geradas em experimentos de ligação cruzada associada à espectrometria de massas ... 27 Figura 6. Representação das estruturas químicas de alguns ALCs ... 29 Figura 7. Demonstração dos átomos presentes em peptídeos ... 31 Figura 8. Representação esquemática do experimento de HDX combinado com análise por MS ... 33 Figura 9. Representação da estrutura cristalográfica do homodímero da Hsp90 (PDB 2CG9) e do domínio TPR. ... 36 Figura 10. Representação dos sítios de modifições pós-traducionais na isoforma α da Hsp90 humana ... 37 Figura 11. Alterações da proteína Hsp90 em tumores humanos de acordo com os dados estatísticos disponíveis no banco cbioportal ... 38 Figura 12. Representação esquemática do complexo TOM e TIM responsáveis pelo transporte de proteínas precursoras para mitocôndria ... 40 Figura 13. Representação da estrutura cristalográfica do monômero do domínio citosólico da Tom71 de levedura na presença do peptídeo ligante MEEVD (peptídeo do extremo C-terminal da chaperona de levedura, Hsp90) (PDB 3FP2) ... 41 Figura 14. Estruturas cristalográficas do domínio citosólico da Tom71 de levedura na presença e ausência do ligante (peptídeo do extremo C-terminal da chaperona de levedura, Hsp90, MEEVD) ... 41 Figura 15. Modificações da proteína Tom70 em tumores humanos de acordo com o banco de dados cbioportal ... 42
Figura 16. Sítios de modifições pós-traducionais da Tom70 humana ... 43 Figura 17. Representação esquemática dos resíduos de aminoácidos compostos nas proteínas CHsp90 e Tom70C expressas nesta tese. ... 45 Figura 18. Sequência de resíduos de aminoácidos das proteínas CHsp90 e Tom70C destacando os resíduos de aminoácidos (lisina colorida em vermelho e serina em verde) reativos preferencialmente frente ao DSS ... 54 Figura 19. Esquema representando o mecanismo de formação de uma espécie de ligação cruzada utilizando o DSS como ALC sendo atacado por um grupo nucleofílico da cadeia lateral de um resíduo de lisina. ... 55 Figura 20. Mapa de espécies de ligação cruzada intra-proteína identificados para a proteína CHsp90 (A) e Tom70C (B) utilizando como ALC o DSS em temperatura ambiente... 56 Figura 21. Exemplos de espectros de íons produtos anotados para as espécies de ligação cruzada do tipo intermolecular intraproteína das proteínas (A) CHsp90 e (B) Tom70 ... 57 Figura 22. Exemplo de espectro de massas de íons produto anotados para a espécie de ligação cruzada do tipo intramolecular da proteína CHsp90. ... 57 Figura 23. Mapa de ligações cruzadas inter-proteínas observadas para o complexo Tom70C/CHsp90 em temperatura ambiente utilizando como ALC o DSS ... 59 Figura 24. Estrutura do complexo CHsp90/Tom70C. Os resíduos envolvidos nas ligações cruzadas inter-proteínas estão demonstrados conforme a cor dos resíduos de aminoácidos da Figura 23 ... 60 Figura 25. Representação do mapa de cobertura de sequência da proteína CHsp90 ... 61 Figura 26. Representação do mapa de cobertura de sequência da proteína Tom70C ... 62 Figura 27. Representação do cálculo do número de deutérios incorporados ... 63 Figura 28. Exemplos de gráficos da cinética de incorporação de deutério versus o tempo de incubação das amostras em solução deuterante para alguns peptídeos nos experimentos de HDX-MS ... 64 Figura 29. Resumo dos resultados de HDX-MS para proteína CHsp90 ... 66 Figura 30. Resumo dos resultados de HDX-MS para proteína Tom70C ... 67
Figura 31. Comparação dos dados de incorporação de deutério entre as proteínas Tom70C e CHsp90 e seus respectivos complexos para o tempo de cinética de 1h . 67 Figura 32. Dados de diferença relativa de incorporação de deutério plotados na estrutura do complexo Tom70C/MEEVD ... 68 Figura 33. Dados de diferença relativa significativa de incorporação de deutério para as proteínas Tom70C (A) e CHsp90 (B) ... 69 Figura 34. Dados de diferença relativa de incorporação de deutério no complexo Tom70C/CHsp90 ... 70 Figura 35. Representação do ensaio in vitro de importação de pré-proteína para a mitocôndria ... 72 Figura 36. Gráficos da porcentagem de importação de pré-proteínas para mitocôndria em ensaios in vitro ... 73 Figura 37. Representação esquemática e estrutural da holoenzima ou heterotrímero da PP2A (PDB 2IAE) ... 79 Figura 38. Representação esquemática do processo de biogênese da PP2A ... 81 Figura 39. Representação da análise das alterações no gene que codifica TIPRL em diversos tipos de tumores humanos ... 82 Figura 40. Represenção esquemática das isoformas da subunidade catalítica da fosfatase PP2A (PP2Ac) ... 87 Figura 41. Padronização dos experimentos de transfecção transiente, técnica de imunoprecipitação utilizando anticorpo anti-FLAG conjugado em beads de agarose e western blot usando plasmídeos contendo os vetores de PP2Acα ou WT (isoforma ativa) e PP2Acα2 ou 3.4 (isoforma inativa) e o controle vetor vazio (ø) ... 94 Figura 42. Análise por western blot das proteínas endógenas co-imunoprecipitadas com as proteínas FLAG-PP2Acα2 (A) e FLAG-PP2Acα (B) ... 95 Figura 43. Análise por western blot das proteínas endógenas dos extratos proteicos totais nos ensaios de transfecção das proteínas FLAG-PP2Acα2 (A) e FLAG-PP2Acα (B) ... 97 Figura 44. Análise por western blot das proteínas endógenas co-imunoprecipitadas com as proteínas FLAG-PP2Acα2 e FLAG-PP2Acα em ensaios de transfecção simultâneo das isoformas ... 98 Figura 45. Análise por SDS-PAGE seguido por coloração por azul de coomassie do perfil de proteínas endógenas co-imunoprecipitadas com as proteínas FLAG-PP2Acα
(A) e FLAG-PP2Acα2 (B) de células HEK293T transfectadas com pcDNA-Flag-PP2Acα, pcDNA-Flag- PP2Acα2 e o controle pcDNA-Flag 3.1 (vetor vazio). ... 99 Figura 46. Proteínas identificadas por MS após ensaios de co-imunoprecipitação com as proteínas PP2Ac 3.4 (A) e WT (B) ... 100 Figura 47. Sequências de resíduos de aminoácidos da Tiprl de Homo sapiens destacando em vermelho e azul os resíduos de lisina e serina, respectivamente. . 101 Figura 48. Representação do mapa de ligação cruzada para as duas construções da proteína TIPRL. (A) TIPRL-Full e (B) TIPRLΔN ... 101 Figura 49. Espectros de ESI-MS/MS para espécies de ligação cruzada do tipo intermolecular (A) e intramoleculares (B) da proteína TiprlΔN ... 102 Figura 50. Espectros de ESI-MS/MS para espécies de ligação cruzada do tipo intermolecular simétrica da proteína TIPRLΔN ... 104 Figura 51. Caracterização da TIPRLΔN ... 104 Figura 52. Estrutura cristalográfica da TIPRLΔN demonstrando a distância topológica para a restrição de distância inter-proteínas identificada nos ensaios de XL-MS (PDB 5D9G). ... 106 Figura 53. Estrutura do monômero da TIPRLΔN apontando a região de interação do peptídeo ligante (ENLYFQ) (A). Similaridade de sequência do peptídeo gerado com a clivagem do his-tag com a enzima TEV e os resíduos do extremo C-terminal das subunidades catalíticas das proteínas PP2A, PP4 e PP6 (B). ... 106 Figura 54. Representação dos resultados de mapa de cobertura da digestão péptica no experimento de HDX-MS para a proteína TIPRL-Full ... 107 Figura 55. Gráficos da cinética de incorporação de deutério versus o tempo de incubação das amostras em solução deuterante para alguns peptídeos nos experimentos de HDX-MS da proteína TIPRL... 108 Figura 56. Representação dos resultados da cinética de HDX – MS para os complexos TIPRL-Full – DYFL e TIPRL-Full – DpYFL ... 109 Figura 57. Representação da estrutura cristalográfica do complexo PP2A-TIPRL (PDB 5W0W) ... 110 Figura 58. Representação da estrutura cristalográfica da TIPRLΔN (PDB 5D9G) destacando em laranja a interface do dímero ... 111 Figura 59. Resumo dos dados de HDX – MS para proteína TIPRL-Full ... 112
Figura 60. Representação da estrutura cristalográfica da TIPRL de Mus musculus (PDB 5W0X) ... 113
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AGC Controle de ganho automático ALC Agente de ligação cruzada ATP Adenosina trifosfato
cDNA DNA complementar
CDK Quinase dependente de ciclina CID Dissociação induzida por colisão CHsp90 C-terminal da Hsp90
Cryo-EM Microscopia crio-eletrônica
Da Dalton (1 Da = 1,661.10-24 g)
DDA Aquisição dependente de dados DMF N,N-dimetilformamida
DNA Ácido desoxirribonucleico DRX Difração de Raio–X
DSG Glutarato de N,N-disuccinimidila DSS Suberato de N,N-disuccinimidila DTT 1,4-Ditiotreitol
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético ESI Ionização por eletrospray
ETD Dissociação por transferência de elétrons
FTICR Ressonância ciclotrônica de íons com transformada de Fourier HCD High energy collision dissociation
HDX Troca hidrogênio-deutério
HDX-MS Troca de hidrogênio-deutério associaida a espectrometria de massas HEAT Huntingtin Elongation A subunit TOR
HEPES Ácido 2-[4-(2-hidroxietil)1-pipezinil]-etanosulfónico Hsp Proteína de choque térmico
IAA Iodoacetamida
ITC Calorimetria de titulação isotérmica IM Mobilidade iônica
IPTG Isopropil-1-β-D-tiogalactopiranósido LB Luria Bertani
LC-MS Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas
LC-MS/MS Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial LCMT1 Leucine Carboxyl Methyl Transferase 1
LTQ Armadilha de íons
MALDI Ionização por dessorção a laser auxiliada por matrix MS Espectrometria de massas
MS/MS Espectrometria de massas sequencial
MSn Espectros de íons fragmentos do tipo multi-estágio m/z Razão massa carga
MWCO Corte de peso molecular NHS N-hidroxisuccinimida PDB Protein data bank
PME-1 PP2A methyl esterase 1 PP2A Fosfoproteína fosfatase 2A PP2Ac Subunidade catalítica da PP2A
PPM Metal dependent protein phosphatase PPP Fosfoproteína fosfatase
PTPA Phosphatase 2A phophatase activator
Q-TOF Analisador de massas do tipo quadrupolo - tempo de vôo RMN Ressonância Magnética Nuclear
RTK Receptor de tirosina quinase
SAXS Espalhamento de raios-X a baixos ângulos SPE Extração em fase sólida
SIM-XL Spectrum Identification Machine for Cross-Linked peptides TCEP Cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina
TIM Complexo translocase da membrana interna mitocondrial TIPRL Target of rapamycin signaling pathway regulator-like TOF - TOF Analisador de massas do tipo tempo de vôo - tempo vôo TOF Analisador de massas do tipo tempo de vôo
TOM Complexo translocase da membrana externa mitocondrial Tom70C Domínio citosólico da Tom70
Tris.HCl Cloridrato de tris(hidroximetil)aminometano UPLC Cromatografia líquida de ultra-alta eficiência
XL Ligação cruzada
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1 ... 20
1. INTRODUÇÃO GERAL ... 21
1.1 Espectrometria de massas em análise de proteínas ... 21
1.2 Espectrometria de massas no estudo estrutural de proteínas ... 22
1.2.1 Ligação cruzada associada à espectrometria de massas ... 22
1.2.2 Troca de hidrogênio deutério ... 30
CAPÍTULO 2 ... 34
2. CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DO COMPLEXO HSP90 – TOM70 .. 35
2.1. Introdução ... 35
2.1.1. Heat Shock Protein 90 ... 35
2.1.2. Complexo Mitocondrial TOM ... 39
2.2. Objetivos... 44
2.3. Materiais e Métodos ... 45
2.3.1. Materiais ... 45
2.3.2. Vetores de expressão e plasmídeos ... 45
2.3.3. Transformação, expressão e purificação das proteínas ... 45
2.3.4. Reação de ligação cruzada utilizando DSS ... 47
2.3.5. Análise por LC-MS das amostras e processamento dos dados ... 48
2.3.6. Modelagem da Tom70C, CHsp90 e complexo Tom70C/CHsp90 ... 49
2.3.7. Reação de troca hidrogênio-deutério (HDX) ... 50
2.3.7.1. CHsp90 e complexo CHsp90/Tom70C (excesso molar de Tom70C) ... 50
2.3.7.2. Complexos Tom70C/CHsp90 (excesso molar de CHsp90), peptídeos MEEVD/Tom70C e SCRAMBLE/Tom70C ... 51
2.3.7.3. Análise por LC-MSE das amostras ... 51
2.3.8. Ensaio de importação de pré-proteínas para a mitocôndria ... 52
2.4. Resultados e Discussão ... 53
2.4.1. Reação de ligação cruzada ... 53
2.4.2. Troca de hidrogênio-deutério ... 60
2.5. Conclusão ... 75
3. CARACTERIZAÇÃO DA ESTRUTURA EM SOLUÇÃO DA TIPRL E DE SUA INTERAÇÃO COM O C-TERMINAL DA FOSFOPROTEÍNA FOSFATASE 2A
... 77
3.1. Introdução ... 77
3.1.1. Fosfoproteína fosfatase 2A (PP2A) ... 77
3.1.2. Biogênese da PP2A ... 80
3.1.3. Proteína TIPRL ... 81
3.2. Objetivos... 85
3.3. Materiais e Métodos ... 86
3.3.1. Materiais ... 86
3.3.2. Vetores de expressão da PP2Ac ... 86
3.3.3. Cultura de célula e transfecção ... 87
3.3.4. Co-imunoprecipitação e western blot ... 88
3.3.5. Co-imunoprecipitação e análise por MS ... 89
3.3.6. Vetores de expressão da TIPRLΔN e TIPRL-Full ... 90
3.3.7. Transformação, expressão e purificação da TIPRLΔN e TIPRL-Full ... 90
3.3.8. Reação de ligação cruzada de TIPRL, digestão enzimática e análise de dados ... 92
3.3.9. Reação de troca hidrogênio-deutério (HDX) ... 92
3.3.9.1. Complexo TIPRL-Full com os peptídeos ligantes DYFL e DpYFL ... 92
3.3.10. Modelagem da TIPRL ... 93
3.4. Resultados e Discussão ... 94
3.4.1. Ensaios de transfecção, co-imunoprecipitação, western blot e MS ... 94
3.4.2. Caracterização estrutural da TIPRL-Full e TIPRLΔN ... 100
3.4.3. Análise dos dados de HDX para proteína TIPRL ... 107
3.5. Conclusão ... 114
CAPÍTULO 4 ... 115
4. Referências bibliográficas ... 116
CAPÍTULO 5 ... 132
5. ANEXO ... 133
20
CAPÍTULO 1 Introdução geral
21 1. INTRODUÇÃO GERAL
1.1. Espectrometria de massas em análise de proteínas
A espectrometria de massas (MS) consiste no estudo de íons na fase gasosa, caracterizando-os por sua razão massa carga (m/z) (HOFFMANN; STROOBANT, 2007). Essa técnica apresenta um amplo espectro de aplicações envolvendo identificação e/ou quantificação de compostos e elucidação de propriedades químicas e estruturais de moléculas em diversas áreas do conhecimento, destacando-se sua utilização nas áreas de química, biologia e física. O abundante uso de MS na área de biologia, mais especificamente em proteômica (AEBERSOLD; MANN, 2016; ALTELAAR; MUNOZ; HECK, 2012; CRAVATT; SIMON; YATES, 2007; LÖSSL; WATERBEEMD; HECK, 2016), foi impulsionado pelo advento das técnicas de ionização ‘suave’ denominadas de ESI (Ionização por electrospray) (FENN et al., 1989) e MALDI (dessorção a laser assistida por matriz) (KARAS; HILLENKAMP, 1988) no final da década de 80 possibilitando a ionização de macromoléculas, como peptídeos, proteínas e ácidos nucleicos, sem fragmentação durante esse processo ou necessidade de derivatização (AEBERSOLD; GOODLETT, 2001; GRIFFITHS, 2008; KINTER, 2005).
O interesse na ampla aplicação de MS para caracterização de proteínas e o desenvolvimento dessas técnicas de ionização incentivou uma grande evolução em analisadores de massas, sendo que a partir da década de 90 se tornaram disponíveis comercialmente instrumentos com capacidade de experimentos de MS sequencial (MSn), bem como instrumentos contendo plataformas com diversas geometrias
combinando diferentes analisadores, como tempo de voo - tempo de voo (TOF-TOF), quadrupolo - tempo de voo (Q-TOF) (MORRIS et al., 1996), ressonância ciclotrônica de íons com transformada de Fourier (FTICR) (KINTER, 2005), armadilha de íons - orbitrap (LTQ-Orbitrap) (HU et al., 2005) e quadrupolo - orbitrap (Q-Orbitrap) (MICHALSKI et al., 2011).
Paralelamente, o acoplamento de técnicas de separação permitiu a análise de misturas complexas, como os peptídeos resultantes da digestão enzimática de amostras biológicas (AEBERSOLD; GOODLETT, 2001; KINTER, 2005). Além disso, o desenvolvimento de ferramentas de bioinformática para buscas em bancos de dados possibilitou a análise de estudos proteômicos, chamados também de proteômica
22 shotgun (WASHBURN; WOLTERS; YATES, 2001; WOLTERS; WASHBURN; YATES, 2001), promovendo uma ampliação significativa da aplicabilidade da técnica. Dessa forma, o emprego de MS para a análise de proteínas tornou-se rotineiro, especialmente no caso de sequenciamento e identificação de proteínas (AEBERSOLD; GOODLETT, 2001;ALTELAAR; MUNOZ; HECK, 2012), determinação da massa molecular de proteínas e complexos proteicos intactos (SHARON; ROBINSON, 2007;,VAN DEN HEUVEL; HECK, 2004), identificação e localização de
modificações pós-traducionais (CRAVATT; SIMON; YATES, 2007) e quantificação absoluta e relativa de proteínas (CHAHROUR; COBICE; MALONE, 2015; MOHR et al., 2017).
Essa abrangente aplicação de MS para a caracterização de proteínas é consequência de vantagens intrínsecas da técnica, dentre elas a alta sensibilidade, rapidez, versatilidade, facilidade de operação e aplicabilidade universal, uma vez que não há limite conhecido de tamanho da proteína e complexidade do sistema a ser estudado, assim como não é necessiário um elevado grau de pureza das amostras (HOFFMANN; STROOBANT, 2007; KINTER, 2005). Essas características promoveram o surgimento de técnicas e metodologias baseadas em MS para determinar interações proteína-proteína (HUTTLIN et al., 2015; MORRIS et al., 2015), assim como estrutura, conformação e dinâmica de proteínas (AEBERSOLD; MANN, 2016; LÖSSL; WATERBEEMD; HECK, 2016), utilizando técnicas como troca de hidrogênio-deutério (HDX) (ENGEN; WALES; SHI, 2011; WALES; ENGEN, 2006), mapeamento radicalar (MALEKNIA; DOWNARD, 2014), mobilidade iônica (JURNECZKO; BARRAN, 2011; LANUCARA et al., 2014) e ligação cruzada (XL) (HOLDING, 2015; SINZ et al., 2015).
1.2. Espectrometria de massas no estudo estrutural de proteínas
1.2.1. Ligação cruzada associada à espectrometria de massas
A associação da técnica de ligação cruzada com espectrometria de massas (XL-MS) atualmente é empregada como uma estratégia complementar e/ou alternativa para caracterização estrutural de proteínas (ARLT; IHLING; SINZ, 2015; BELSOM et al., 2015; CHEN et al., 2016; YOUNG et al., 2000), complexos proteicos (KIOSZE-BECKER et al., 2016; RAPPSILBER, 2011) assim como na determinação
23 de parceiros de interação de uma proteína alvo (CHAVEZ et al., 2016; HÄUPL; IHLING; SINZ, 2016, 2017; HERZOG et al., 2012; MAKOWSKI et al., 2016). Essa abordagem pode ser combinada com métodos computacionais (KAHRAMAN et al., 2013) e outras técnicas experimentais e é especialmente útil quando técnicas de alta resolução (difração de raios-X, DRX, ressonância magnética nuclear, RMN, e microscopia crio-eletrônica, Cryo-EM) não podem ser aplicadas ou, quando aplicadas, resultam em dados de baixa resolução (ARLT et al., 2017; ARLT; IHLING; SINZ, 2015; RAPPSILBER, 2011; SINZ et al., 2015). A Figura 1 mostra dois modelos estruturais obtidos por meio de abordagens integrativas, como XL-MS combinada com Cryo-EM (CIFERRI et al., 2012; NGUYEN et al., 2013).
Figura 1. Modelo estrutural dos complexos PRC2 e RVB. (A) PRC2 (do inglês, Polycomb Repressive Complex 2) (CIFERRI et al., 2012) e (B) anel de RVB (do inglês, RuVB-like protein 2) (NGUYEN et al., 2013) determinados por meio da combinação das técnicas de XL-MS e Cryo-EM.
Conceitualmente, a técnica de ligação cruzada consiste na formação de ligações covalentes entre resíduos de aminoácidos que estão espacialmente próximos na estrutura nativa da proteína ou na interface do complexo, mediada por um reagente denominado agente de ligação cruzada (ALC) e pela orientação relativa dos átomos reativos que estão expostos ao solvente (GREEN; REISLER; HOUK, 2001). O ALC atua como uma régua molecular gerando informações a respeito da distância em que os resíduos reativos se encontram na estrutura tridimensional da proteína (Figura 2) (RAPPSILBER, 2011; SINZ, 2003, 2006).
24 Os ALCs são compostos orgânicos multifuncionais contendo em geral dois grupos reativos, podendo ser homobifuncionais ou heterobifuncionas, unidos por uma cadeia espaçadora de comprimento variável. Os grupos reativos conferem a cada ALC seletividade para alguns resíduos que constituem as proteínas (SINZ, 2003, 2006).
Atualmente, os ALCs mais usados são os reativos preferencialmente frente a grupos nucleofílicos, como aminas primárias (presente na cadeia lateral de resíduos de lisina e no N-terminal de proteínas). Esses ALCs podem reagir também em menor escala, com grupos álcool e tiol (presentes na cadeia lateral de resíduos de serina, treonina e cisteína). Nesse contexto, os ALCs mais comumente aplicados são grupos ésteres derivados de N-hidroxisuccinimida (NHS) (SANTOS; EBERLIN; GOZZO, 2011) (Figura 3) devido à significativa presença de grupos amino em proteínas, facilidade de sua obtenção (disponíveis comercialmente) e rendimentos razoáveis das reações em condições brandas (temperatura ambiente, pH 7,0 e solução aquosa).
Figura 2. Representação esquemática da modificação do ALC na estrutura da proteína após a reação de ligação cruzada.
Apesar do sucesso na aplicação desse ALC, existem algumas limitações na utilização dos ALCs derivados de NHS, como baixa solubilidade em meio aquoso no caso dos compostos não sulfonados (BOURQUE et al., 1999; PAN et al., 1993), elevada taxa de hidrólise (diminuindo o rendimento da reação) (SCIENTIFIC, [s.d.]) e restrição operacional à temperatura (o rendimento dessas reações diminuem significativamente com a diminuição de temperatura). Esse último fator é bastante importante, pois torna difícil a aplicabilidade de ALCs derivados de NHS em proteínas ou complexos proteicos que não são estáveis a temperatura ambiente, seja devido à formação de agregados proteicos ou até mesmo desenovelamento da proteína.
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Figura 3. Estrutura do ALC do tipo homobifuncional derivado de ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) utilizados em experimentos de ligação cruzada com análise por MS.
Após a reação de ligação cruzada, a proteína ou complexo proteico é analisado por MS para identificação dos peptídeos modificados por ALCs com objetivo de se obter informações estruturais (SINZ, 2014). Essa análise ocorre utilizando um protocolo de proteômica shotgun (RAPPSILBER, 2011), geralmente aplicado em estudos de proteômica convencional, seguido da identificação das espécies modificadas pelo ALC por meio de softwares específicos como o SIM-XL (LIMA et al., 2015) e StavroX (GÖTZE et al., 2012). Por meio dessas informações, é possível reconhecer os pares de resíduos de aminoácidos espacialmente próximos na proteína ou complexo alvo e, com isso, caracterizar a estrutura de proteínas e interfaces de interações de complexos proteicos (PEREIRA et al., 2014; SANTOS et al., 2012). A Figura 4 ilustra uma representação esquemática desse tipo de experimento.
Os produtos da proteólise enzimática modificados com o ALC são classificados em três tipos (HOLDING, 2015; SCHILLING et al., 2003; SINZ, 2003) (Figura 5):
Espécies intermoleculares: as duas extremidades do ALC reagem com dois resíduos de aminoácidos que, após a proteólise, estão contidos em diferentes peptídeos. Essa espécie indica que os resíduos reativos se encontram próximos nas estruturas terciárias devido ao enovelamento da proteína sendo que esses resíduos modificados podem estar distantes na estrutura primária. No caso de complexos proteicos, as espécies intermoleculares fornecem ainda informações sobre região de interação
26 entre as proteínas, caso cada extremidade do ALC tenha reagido com um dos monômeros.
Espécies intramoleculares: as duas extremidades do ALC reagem com dois resíduos de aminoácidos, mas que se encontram no mesmo peptídeo após a digestão enzimática. Essa espécie revela que os resíduos reativos contidos no mesmo peptídeo (portanto, próximos na estrutura primária) apresentam também proximidade na estrutura terciária. Essa espécie também fornece informações quanto a estrutura secundária desse peptídeo (FIORAMONTE et al., 2012);
Espécies parcialmente hidrolisadas ou dead-end: apenas uma das extremidades do ALC reage com a cadeia lateral de um resíduo da proteína, enquanto que a outra extremidade sofre hidrólise no meio reacional, seja por labilidade do grupo reativo ou simplesmente pela proteína não possuir outro resíduo reativo dentro do alcance do ALC. Essa espécie traz informações quanto à acessibilidade ao solvente do resíduo reativo.
Figura 4. Esquema representativo do método de ligação cruzada associada à espectrometria de massas para caracterização de estrutura de proteínas e complexos proteicos. (1) Reação da proteína com ALC. (2) Digestão enzimática formando peptídeos modificados e não modificados pelo ALC. (3) Análise da mistura de peptídeos por LC-MS/MS. (4) Processamento dos dados de LC-MS/MS seguido do agrupamento das restrições de distância obtidas experimentalmente e formação do mapa de ligação cruzada. (5) Utilização das restrições de distância para caracterização estrutural de proteínas.
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Figura 5. Representação das espécies geradas em experimentos de ligação cruzada associada à espectrometria de massas. (A) Tipos de espécies formadas após a reação de ligação cruzada e proteólise enzimática da proteína ou complexo proteico. (B) Representação dessas espécies modificadas por ALC na superfície do complexo proteico.
Apesar de bastante promissora, a detecção e identificação dos peptídeos modificados com o ALC após a digestão enzimática pode ser um desafio, uma vez que esses peptídeos modificados se apresentam em quantidade subestequiométrica em relação aos peptídeos não modificados (IGLESIAS; SANTOS; GOZZO, 2010; SOHN et al., 2012). Além disso, os peptídeos modificados aumentam muito a complexidade da amostra analisada. Como consequência, essas amostras precisam ser analisadas em equipamentos que adquiram o maior número de espectros de MS/MS por segundo, que apresente maior sensibilidade, com o propósito de aumentar a probabilidade de analisar uma espécie modificada pelo ALC. Também é necessário equipamentos com alta resolução/exatidão, para que a identificação da espécie de
28 ligação cruzada seja mais confiável. Essas limitações têm sido superadas com a disponibilidade de plataformas comerciais Q-TOF e Q-Orbitrap (MICHALSKI et al., 2011) que adquirem até 20 espectros de íons produtos por segundo com alta resolução.
Além disso, estratégias vêm sendo desenvolvidas com objetivo de facilitar a identificação dos peptídeos modificados, como desenvolvimento de ALCs com diferentes especificidades e características (Figura 6) (SINZ, 2006, 2014, 2017), dentre eles:
ALCs marcados isotopicamente, em que uma mistura 1:1 dos ALCs leves e pesados é usada na análise (MÜLLER et al., 2001; PETROTCHENKO; SERPA; BORCHERS, 2011; SEEBACHER et al., 2006). Essa estratégia facilita a confirmação da modificação pelo ALC por identificar sinais duplicados nos espectros. No entanto, torna a síntese do ALC mais cara, a análise mais complexa e a intensidade do sinal de cada espécie diminui pela metade;
ALCs modificados com grupos de afinidade, como biotina (CHU et al., 2006; PETROTCHENKO; SERPA; BORCHERS, 2011), visando a purificação por cromatografia de afinidade dos peptídeos modificados após a digestão enzimática (Figura 6A e Figura 6B). Essa abordagem facilita o enriquecimento dos peptídeos modificados pelo ALC. Entretanto, a presença de biotina, dificulta a interpretação do espectro de fragmentação das espécies modificadas, prejudicando sua identificação;
ALCs com sítios de fragmentação preferencial na cadeia espaçadora no processo de MS2 ou MS3, visando facilitar a detecção e confirmação dos
peptídeos modificados, uma vez que são gerados íons fragmentos com diferenças de massa características. Essa estratégia facilita a identificação de peptídeos modificados pelo ALC, no entanto os espectros de MS2
possuem maior complexidade (MÜLLER et al., 2010). Adicionalmente, alguns ALCs necessitam de análise MS3 para se obter os padrões
necessários (KAO et al., 2011)(Figura 6C e Figura 6D). Portanto, no último exemplo, é preciso usar instrumentos capazes de realizar experimentos de espectros de íons fragmentos do tipo multi-estágio (MSn) que implicam em
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ALCs heterobifuncionais fotoativáveis, no qual geralmente uma extremidade reage frente a resíduos nucleofílicos e a outra extremidade reage de maneira inespecífica aumentando o número de espécies formadas (GOMES; GOZZO, 2010; KRAUTH et al., 2010) (Figura 6E e Figura 6F). No entanto, há dificuldade na identificação dessas espécies uma vez que o número de combinações possíveis entre resíduos torna-se muito grande.
Figura 6. Representação das estruturas químicas de alguns ALCs. (A) e (B) ALCs com grupos de afinidade. (C) e (D) ALCs com sítios cliváveis. (E) e (F) ALCs com grupo fotoativável.
A técnica de ligação cruzada associada à espectrometria de massas apresentou um significativo desenvolvimento nos últimos anos. No entanto, existem limitações que ainda impedem o uso mais abrangente dessa técnica para resolução estrutural de proteínas e complexos proteicos, e determinação de parceiros de interação in vivo ou in vitro (TRNKA et al., 2014). As limitações mais significativas são:
As espécies modificadas com o ALC estão em quantidades inferiores que os peptídeos convencionais, dificultando sua identificação;
Pequenas quantidades de restrições de distância entre os resíduos ou distribuição não uniforme das restrições de distância na estrutura primária da proteína, dificultando a modelagem computacional;
30
Determinação de falsos positivos pelos softwares de análise de dados, prejudicando a modelagem da estrutura de uma proteína ou complexo proteico.
1.2.2. Troca de hidrogênio-deutério
A troca hidrogênio-deutério (HDX) é um fenômeno químico em que os átomos de hidrogênio lábeis são trocados por átomos de deutério presentes em solução (ENGEN, 2009). Essa técnica associada à MS ou RMN pode fornecer informações de regiões da proteína expostas ao solvente (KEPPEL; HOWARD; WEIS, 2011), mudanças conformacionais e dinâmica em proteínas após interações com ligantes (HARRISON et al., 2016), mecanismos de enovelamento e desenovelamento proteico, localização e propriedades de superfícies e sítios de interação (HUANG et al., 2012), e medidas de estabilidade estrutural de uma proteína em diversas condições (ENGLANDER et al., 1997; MARCSISIN; ENGEN, 2010).
Em MS, são monitoradas as trocas de átomos de hidrogênio lábeis da ligação amida da cadeia principal por deutério (Figura 7) por meio da comparação da massa média do peptídeo obtida a partir do padrão isotópico (WALES; EGGERTSON; ENGEN, 2013). Informações quanto à troca de hidrogênio lábeis por deutério dos outros átomos de hidrogênio presentes nos resíduos de aminoácidos não são passíveis de analisar por HDX-MS devido a elevadas velocidades de troca, promovendo assim o processo de troca reversa durante a análise por MS (MARCSISIN; ENGEN, 2010).
A velocidade de troca dos átomos de hidrogênio lábeis é dependente de fatores como pH, temperatura, pressão, acessibilidade ao solvente, efeito indutivo da cadeia lateral dos resíduos de aminoácidos vizinhos e perfil de ligação de hidrogênio (BROWN; WILSON, 2017). Os átomos de hidrogênio da ligação amida envolvidos em ligações de hidrogênio como em estruturas secundárias, geralmente apresentam menores velocidades de troca do que átomos que não participam de ligação de hidrogênio, como em loops (ENGEN; WALES; SHI, 2011; ENGLANDER et al., 1996). Em pH 7,0 e temperatura ambiente, a troca de átomos de hidrogênio da ligação amida por átomos de deutério ocorre na ordem de milissegundos a um segundo, enquanto que hidrogênios envolvidos em ligações de hidrogênio em regiões estruturadas podem
31 apresentar diminuição na taxa de troca de até 108 ordens de magnitude (ENGEN;
WALES; SHI, 2011; SMITH; DENG; ZHANG, 1997).
Figura 7. Demonstração dos átomos presentes em peptídeos. Os átomos de hidrogênio da ligação amida da cadeia principal (em amarelo) são colocados em evidência já que são os átomos passíveis de análise de HDX-MS.
O pH do meio é o fator mais crítico na velocidade de troca dos átomos de hidrogênio lábeis dos resíduos de aminoácidos e, consequentemente, esse fator deve ser bem controlado durante os experimentos de HDX (ENGEN; WALES; SHI, 2011). Os ensaios de troca hidrogênio-deutério são realizados em pH entre 7,0 - 8,0 e, após os diferentes tempos de exposição da proteína ao solvente deuterado, a troca é parada com tampão quench em pH entre 2,4 - 2,8 (faixa de pH com menor constante de troca para os átomos de hidrogênio lábeis da cadeia principal) para evitar a troca reversa dos átomos de deutério incorporados na cadeia principal (BROWN; WILSON, 2017). Essa redução do pH leva uma diminuição de aproximadamente 104 ordens de
magnitude na constante de troca (ENGEN, 2003). É importante ressaltar que os demais átomos de hidrogênio lábeis dos resíduos de aminoácidos (cadeias laterais) não podem ser verificados por MS devido a velocidade de troca reversa (BAI et al., 1993; ENGEN; WALES; SHI, 2011; ENGLANDER, 2006).
A temperatura, assim como o pH, é um fator experimental que influencia significativamente na constante de troca de hidrogênio por deutério e é um fator controlado experimentalmente (BROWN; WILSON, 2017; ENGEN; WALES; SHI, 2011). A constante de troca para os átomos de hidrogênio da ligação peptídica da cadeia principal em pH 7,0 apresenta uma diminuição de cerca de sete vezes com uma redução de temperatura de 25 °C para 0 °C. Dessa forma, nos experimentos de
32 HDX as reações são realizadas em temperatura ambiente, enquanto que as análises ocorrem em 0 °C, para reduzir a troca reversa (MARCSISIN; ENGEN, 2010).
O fluxograma experimental dos ensaios de HDX-MS pode ser observado na Figura 8 (MARCSISIN; ENGEN, 2010). Inicialmente, ocorre a etapa de troca dos átomos de hidrogênio lábeis por deutério adicionando-se um excesso de tampão deuterante (1); seguida da adição de um tampão que diminui a taxa de troca hidrogênio-deutério (tampão contendo agente caotrópico a pH 2,5 e temperatura de aproximadamente 4 °C) em diferentes tempos de incubação para obtenção de uma curva que descreva a cinética de troca (2); digestão enzimática com pepsina a 15ºC por aproximadamente 3 minutos (3); análise dos peptídeos por LC-MSE a 0ºC por
aproximadamente 10 minutos (4); processamento dos dados e interpretação dos dados na estrutura das proteínas (5).
A técnica de troca de hidrogênio-deutério associada à espectrometria de massas possui um amplo espectro de aplicações (PIRRONE; IACOB; ENGEN, 2015). Isso ocorre devido às vantagens de intrínsecas de MS, entretanto, existem limitações para essa técnica (BROWN; WILSON, 2017; ENGEN, 2009). As limitações mais importantes são:
Não distinguir entre interações por ligação ou mudanças conformacionais alostéricas;
Sobreposição de peptídeos em proteínas com grande número de resíduos devido a cromatografia rápida. Isso pode causar supressão iônica, prejudicando o processamento;
As taxas de troca da cadeia principal podem não ser observadas em interações que involvem principalmente as cadeias laterias;
Informações de mudanças conformacionais de microssegundos não podem ser obtidas;
A resolução espacial de 1 resíduo ocorre apenas em equipamentos que possuem dissociação por transferência de elétrons (ETD).
33
Figura 8. Representação esquemática do experimento de HDX combinado com análise por MS. (1) Diluição da proteína em tampão de água deuterada em temperatura ambiente e diferentes tempos de exposição; (2) Adição de tampão quench (contendo um agente caotrópico em pH 2,5, 0 °C) em diferentes tempos de incubação para construir a cinética de troca hidrogênio-deutério; (3) Digestão enzimática das amostras por pepsina (15°C, pH 2,5) por cerca de três minutos; (4) Análise dos peptídeos digeridos por cromatografia líquida a 0 °C, seguido de ionização por ESI e caracterização por MS; (5) Processamento dos dados das amostras, obtendo informações do número de átomos de deutério incorporados para cada peptídeo por meio da comparação do padrão isotópico da amostra controle versus a amostra exposta ao solvente deuterado, seguido de interpretação dos dados de incorporação de deutério na estrutura da proteína.
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CAPÍTULO 2 Caracterização estrutural do complexo Hsp90 – Tom70
35 2. CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DO COMPLEXO HSP90 – TOM70
2.1. Introdução
2.1.1. Heat Shock Protein 90
A Hsp90 (do inglês, heat shock protein 90kDa) é uma chaperona molecular altamente conservada e abundante tanto em bactérias quanto em eucariotos (cerca de 1-2% do total de proteínas em células) (CSERMELY et al., 1998; WEGELE; MÜLLER; BUCHNER, 2004). Nos seres humanos existem duas isoformas principais citoplasmáticas (isoformas α e β) de aproximadamente 85% de similaridade de sequência (JACKSON, 2013; PRODROMOU, 2016), uma isoforma mitocondrial (TRAP1) e uma do retículo endoplasmático (GRP94) (DA SILVA; RAMOS, 2012).
A Hsp90 atua como um homodímero composto de três domínios: o N-terminal (que contém um sítio de interação com nucleotídeo e tem aproximadamente 30 kDa), o domínio central ou M (de aproximadamente 35 kDa, importante para interação com proteínas substrato e também para a hidrólise do ATP) e o C-terminal (com aproximadamente 20 kDa, responsável pela dimerização, e que possui o motivo MEEVD, reconhecido pelo sítio de interação TPR, tetratricopeptídeo) (CSERMELY et al., 1998; PRODROMOU, 2016) (Figura 9). O domínio N e M são conectados por uma região flexível e carregada que modula a interação entre esses domínios e, portanto, afeta a função dessa chaperona (PRODROMOU, 2016). Na ausência de ATP, essa proteína adota majoritariamente uma conformação aberta, enquanto que, ao interagir com ATP e proteínas substrato ocorrem rearranjos adotando uma conformação fechada (CHAVEZ et al., 2016; LI; SOROKA; BUCHNER, 2012; RATZKE et al., 2010). A atividade da proteína Hsp90 é modulada por modificações pós-traducionais, incluindo fosforilação, sumoilação, acetilação, metilação, S-nitrosilação e ubiquitinação, e também por co-chaperonas (SCHOPF; BIEBL; BUCHNER, 2017). Os resíduos de aminoácidos nos quais foram observados modificações pós-traducionais em estudos de células normais e cancerígenas na isoforma α da Hsp90 humana estão representados na Figura 10 (DA SILVA; RAMOS, 2012; “HSP90A (human)”, [s.d.]; MOLLAPOUR; NECKERS, 2012).
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Figura 9. Representação da estrutura cristalográfica do homodímero da Hsp90 (PDB 2CG9) e do domínio TPR. (A) O domínio N-terminal (resíduos 1-223) está representado em azul, o domínio central (resíduos 285-560) em laranja e o domínio C-terminal em verde (resíduos 566-732). (B) O domínio TPR está colorido em verde, os resíduos de aminoácidos que interagem com o motivo MEEVD em roxo e o peptídeo do motivo MEEVD em branco (PDB 1ELR).
Dados estastísticos do banco de dados cbioportal (CERAMI et al., 2012; GAO et al., 2014) (Figura 11A) revelam que as possíveis alterações da proteína Hsp90 em tumores humanos são: amplificação do gene que codifica a proteína, mutação e deleção do gene. Investigando essas alterações, a proteína Hsp90 se encontra alterada em 18,7% dos casos de câncer de próstata neuroendrócino (NEPC) e 10,2% dos casos de carcinoma de bexiga. Outros tipos de câncer com frequência de alterações de Hsp90 inferior a 10% incluem carcinoma de células escamosas de pele (CSCC), câncer de pâncreas, pulmão, cervical, estômago, ovário, sarcoma, entre outros. Analisando as mutações da proteína Hsp90 em células cancerígenas, é possível observar mutações ao longo da estrutura primária dessa proteína. A mutação que acontece com maior frequência é a deleção do resíduo de lisina 241 presente na região flexível entre o domínio N-terminal e central dessa proteína (Figura 11B).
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Figura 10. Representação dos sítios de modifições pós-traducionais na isoforma α da Hsp90 humana. O domínio N-terminal (resíduos 1-223) está colorido em azul, o domínio central (resíduos 285-560) em laranja, o domínio C-terminal em verde (resíduos 566-732) e a região flexível (resíduos 224-284) está representada como uma linha preta. Os traços em cinza indicam cinco resíduos. (A) Resíduos de serina (traço azul), treonina (traço verde) e tirosina (traço vermelho) que podem sofrer fosforilação. (B) Resíduos de lisina (traço laranja) que sofrem acetilação. (C) Resíduos de lisina (traço roxo) que podem sofrer ubiquitinação. (D) Sítios de modifições pós-traducionais do tipo sumoilação (resíduo de lisina, traço azul), metilação (resíduos de arginina e lisina, traços rosa e verde, respectivamente) e S-nitrosilação (resíduos de cisteína, traço vermelho). Referências: DA SILVA; RAMOS, 2012b; “HSP90A (human)”, [s.d.]; MOLLAPOUR; NECKERS, 2012.
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Figura 11. Alterações da proteína Hsp90 em tumores humanos de acordo com os dados estatísticos disponíveis no banco cbioportal. (A) Análise das alterações no gene que codifica Hsp90 em diversos tipos de tumores humanos. Em vermelho: ampliação. Em verde: mutações. Em azul: deleção. Em cinza: alterações múltiplas. (B) Posição das mutações identificadas em tumores humanos na estrutura primária da proteína Hsp90. O domínio N-terminal (resíduos 1-223) está colorido em azul, o domínio central (resíduos 285-560) em laranja, o domínio C-terminal em verde (resíduos 566-732) e a região flexível (resíduos 224-284) está representada como uma linha preta entre os domínios N-terminal e central. Em verde escuro: mutações missense. Em preto: mutações truncadas. Em marrom: mutações inframe. Figura adaptada do banco de dados cbioportal (CERAMI et al., 2012; GAO et al., 2014).
A Hsp90 auxilia na estabilização, ativação e maturação de diversas proteínas substrato envolvidas em processos como controle de proliferação, desenvolvimento e diferenciação celular, apoptose, respostas adaptativas a situações de estresse (MAYER, 2010; MAYER; BUKAU, 1999) e apresenta um papel importante em doenças neurodegenerativas e câncer (KALIA; KALIA; MCLEAN, 2010; MIYATA et al., 2011; TIROLI-CEPEDA; RAMOS, 2011), sendo considerada um mediador chave da homeostase (DEZWAAN; FREEMAN, 2008). Além disso, essa proteína está envolvida na via de translocação de proteínas mitocondriais com auxílio do complexo
39 mitocondrial TOM (do inglês, Translocase of the mitochondrial Outer Membrane) (FAN; YOUNG, 2011).
2.1.2. Complexo Mitocondrial TOM
As mitocôndrias são organelas cruciais para inúmeros processos celulares, incluindo metabolismo energético, apoptose, sinalização e vias metabólicas envolvendo lipídeos e aminoácidos (CHACINSKA et al., 2009). Essas organelas possuem aproximadamente 1500 proteínas, das quais a grande maioria (cerca de 70%) (WAEGEMANN et al., 2015) são sintetizadas pelos ribossomos e precisam ser translocadas para o interior da mitocôndria. A principal via de translocação dessas proteínas ocorre por meio dos complexos mitocondriais TOM e TIM (do inglês, Translocase of the mitochondrial Inter Membrane) com auxílio de chaperonas (HOOGENRAAD; RYAN, 2001).
O complexo mitocondrial TOM está localizado na membrana externa da mitocôndria, possui aproximadamente 450 kDa (CHACINSKA et al., 2009) e é composto de proteínas receptoras Tom20, Tom22 e Tom70 (proteína que interage com a Hsp90 e Hsp70) e o poro de inserção, que contém as proteínas Tom5, Tom6, Tom7 e Tom40 (ENDO, 2003; REHLING; BRANDNER; PFANNER, 2004). Uma representação esquemática desse complexo pode ser visualizada na Figura 12.
A Tom70 é composta de um domínio transmembrana no N-terminal e um domínio citosólico que contém 11 motivos TPR, os quais estão agrupados em dois domínios principais (N- e C-terminal) (Figura 13). Por sua vez, os motivos TPR1-3 do domínio N-terminal do domínio citosólico interage com o peptídeo EEVD da Hsp90 e Hsp70 (FAN; YOUNG, 2011; LI et al., 2009), enquanto que o domínio C-terminal (TPR4-11) interage com as regiões hidrofóbicas das proteínas precursoras transportadas por essas chaperonas (LI et al., 2009).
Para o transporte de proteínas mitocondriais, as proteínas sintetizadas nos ribossomos são reconhecidas por chaperonas e transportadas até a membrana externa da mitocôndria, na qual as chaperonas são reconhecidas pelo domínio citosólico da Tom70 (por meio do domínio TPR) e, consequentemente, as proteínas mitocondriais são transportadas para dentro da mitocôndria (REHLING; BRANDNER; PFANNER, 2004).
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Figura 12. Representação esquemática do complexo TOM e TIM responsáveis pelo transporte de proteínas precursoras para mitocôndria. O complexo TOM está localizado na membrana mitocondrial externa e é composto pelas proteínas receptoras Tom20, Tom22 e Tom70, e pelo poro de inserção, que é composto pela Tom40 e as proteínas menores Tom5, Tom6 e Tom70. A membrana mitocondrial interna contém dois complexos translocase Tim22 e Tim23 e as small Tims, que auxiliam na translocação das preproteínas do complexo TOM para o complexo TIM no espaço intermembrana . Para translocação das proteínas para a mitocôndria as proteínas precursoras são entregues ao complexo TOM pelas chaperonas moleculares Hsp70 e Hsp90. Figura adaptada de ENDO, 2003.
Informações sobre a estrutura da Tom70 humana, do complexo Hsp90-Tom70 e consequentemente, o mecanismo de translocação de proteínas, eram escassas até o momento em que o estudo foi proposto. Sabia-se que: (1) a estequiometria do complexo consiste de um monômero de Tom70 para um dímero da Hsp90 (GAVA et al., 2011); e (2) após a interação entre o domínio citosólico da Tom71 de levedura com o peptídeo MEEVD da chaperona Hsp90, ocorre uma mudança conformacional na hélice A7, que está localizada após o motivo TPR3, promovendo uma rotação de 20 °C e, consequentemente, um rearranjo dos domínios N- e C-terminal da Tom71 (Figura 14) (LI et al., 2009).
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Figura 13. Representação da estrutura cristalográfica do monômero do domínio citosólico da Tom71 de levedura na presença do peptídeo ligante MEEVD (peptídeo do extremo C-terminal da chaperona de levedura, Hsp90) (PDB 3FP2). Em verde claro: motivos TPR1-3 (responsáveis por interagir com o MEEVD). Em verde escuro: alfa-hélice A7. Em azul: motivos TPR4-11 (responsáveis por interagir com as proteínas precursoras).
Figura 14. Estruturas cristalográficas do domínio citosólico da Tom71 de levedura na presença e ausência do ligante (peptídeo do extremo C-terminal da chaperona de levedura, Hsp90, MEEVD). Em verde: estrutura da Tom71 na ausência do peptídeo MEEVD (PDB 3FP3). Em azul, a estrutura da Tom71 na presença do peptídeo ligante (em branco) (PDB 3FP2). A alfa-hélice A7 apresenta uma mudança conformacional após interação com o peptídeo, sofrendo uma rotação de 20 °, o que causou significativo rearranjo entre os domínios do N- e C-terminal da Tom71. A7 N-terminal C-terminal A7 TPR1 TPR2 TPR3 TPR11 TPR10 TPR9 TPR8 TPR7 TPR6 TPR5 TPR4 N-term C-term
42 A proteína Tom70 demonstra-se alterada em alguns tipos de câncer humanos, conforme dados do banco de dados cbioportal (Figura 15) (CERAMI et al., 2012; GAO et al., 2014). O câncer que apresenta uma maior frequência de alteração dessa proteína é o de próstata. As alterações presentes em células cancerígenas dessa proteína são: ampliação do gene, seguido de mutação e deleção. Ao investigar as mutações na estrutura primária da proteína Tom70, verifica-se que as mutações mais comuns são do tipo missense (mutação na qual há uma alteração de uma das bases nitrogenas do DNA, que acarreta na codificação de um aminoácido diferente do normal) nos resíduos de arginina 366 (presente no motivo TPR6), 159 e 447 (TPR8), aspartato 311 (TPR4) e também mutação truncada no resíduo tirosina 446.
Figura 15. Modificações da proteína Tom70 em tumores humanos de acordo com o banco de dados cbioportal. (A) Análise das alterações no gene que codifica Tom70 em vários tipos de tumores humanos. Em vermelho: ampliação. Em verde: mutações. Em azul: deleção. Em cinza: alterações múltiplas. (B) Sítios de mutações determinados em tumores humanos na estrutura primária da proteína Tom70. O domínio N-terminal transmembrana (resíduos 1-111) está colorido em azul e o domínio citosólico em verde (resíduos 111-608). Marcações em verde escuro: mutações missense; em preto: mutações truncadas. Figura adaptada do banco de dados cbioportal (CERAMI et al., 2012; GAO et al., 2014).
43 Atualmente são descritas na literatuda algumas modificações pós-traducionais para a Tom70 em células normais e cancerígenas. As modificações descritas são fosforilação, acetilação, metilação e ubiquitinação (“TOMM70A (human)”, [s.d.]). Os sítios dessas modificações estão demonstrados na Figura 16. A função dessas modificações pós-traducionais para regular a atividade da Tom70 não foram totalmente elucidadas.
Figura 16. Sítios de modifições pós-traducionais da Tom70 humana. O domínio transmembrana no N-terminal (resíduos 1-111) está colorido em laranja, o domínio citosólico (resíduos 111-608) está marcado com uma caixa preta e os motivos TPR desse domínio estão coloridos em verde. Os traços em cinza indicam cinco resíduos. (A) Representação dos resíduos de serina (traço azul), treonina (traço vermelho) e tirosina (traço vermelho) que podem sofrer fosforilação. (B) Sítios de modificações pós-traducionais do tipo metilação em resíduos de arginina (traço laranja) e acetilação em resíduos de lisina (traço roxo). (C) Resíduos de lisina (traço azul) que sofrem ubiquitinação. Referência: “TOMM70A (human)”, [s.d.].
44 2.2. Objetivos
Tendo em vista a ausência de informações estruturais do mecanismo de translocação de proteínas do citosol para as mitocôndrias por meio do complexo Hsp90/Tom70, o objetivo geral dessa parte do trabalho foi empregar as técnicas de ligação cruzada e troca de hidrogênio-deutério associadas à espectrometria de massas para caracterizar estruturalmente esse complexo, tendo como objetivos específicos:
Identificar espécies de ligação cruzada do tipo dead-end e inter- e intramoleculares para cada proteína;
Identificar espécies de ligação cruzada do tipo inter-proteínas;
Realizar modelagem do domínio C-terminal da proteína Hsp90 humana e do domínio citosólico da proteína Tom70 humana;
Validar as estruturas modeladas por restrições de distâncias obtidas por meio de XL-MS;
Propor um modelo para o complexo baseado nos dados experimentais obtidos;
Analisar a dinâmica e flexibilidade das proteínas isoladas e no complexo por meio da técnica de troca de hidrogênio-deutério.
45 2.3. Materiais e Métodos
2.3.1. Materiais
As proteínas Tom70 (domínio citosólico, Tom70C) e Hsp90 (domínio C-terminal da Hsp90, CHsp90) de Homo sapiens foram expressas, purificadas e fornecidas em colaboração com a Dra. Letícia M. Z. Murakami (CTBE-CNPEM) e Prof. Dr. Carlos Ramos (IQ-UNICAMP). A água deionizada (ultrapura, resistividade de 18,2 MΩ cm-1 a 25°C) foi obtida de um purificador Milli-Q (Millipore). Suberato de N-hidroxisuccinimidila (DSS) foi obtido da Sigma Aldrich. Todos os outros reagentes foram obtidos da Sigma Aldrich, Merck, Tedia ou J.T. Baker, sendo usados sem purificação prévia.
2.3.2. Vetores de expressão e plasmídeos
O domínio C-terminal da proteína Hsp90 humana (CHsp90) (isoforma α, número de acesso NCBI AAI21063, resíduos 566-732) e o domínio citosólico da proteína Tom70 humana (Tom70C) (número de acesso NCBI O94826.1, resíduos 111-608) foram clonados em vetor pProExHTA (Invitrogen) (Figura 17). A cauda de seis resíduos de histidinas (His-tag) foi inserida no N-terminal. Esses plasmídeos foram gentilmente cedidos pelo Prof. Dr. Jason Young (McGill University-Canadá).
Figura 17. Representação esquemática dos resíduos de aminoácidos compostos nas proteínas CHsp90 e Tom70C expressas nesta tese.
2.3.3. Transformação, expressão e purificação das proteínas
A célula competente Escherichia coli BL21(DE3) foi transformada com 1 µL de solução contendo o plasmídeo. Para isso, foi utilizado o método de transformação por choque térmico. Placas de cultura foram inoculadas com as bactérias transformadas, usando meio LB sólido (meio de cultura Luria-Bertani composto de 1 g de triptona, 0,5 g de extrato de levedura, 1 g de cloreto de sódio e 2 g de ágar
