TÍTULO: ESTUDO DA REATIVIDADE VASCULAR EM RATOS COM DIFERENTES FENÓTIPOS DE ENZIMA CONVERSORA DE ANGIOTENSINA I (ECA – EC 3.4.15.1) PLASMÁTICA
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO
CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE
ÁREA:
SUBÁREA: BIOMEDICINA
SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): ALYNE STELLA DO ESPIRITO SANTO PISANO DIAS
AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): MARIA TERESA RIGGIO LIMA-LANDMAN
1. RESUMO
Segundo dados da Organização Mundial da Saúde (A Global Brief On Hypertension - WHO, 2013), 1 entre 3 pessoas da população mundial serão hipertensas, sendo as doenças cardiovasculares responsáveis por altas taxas de morbimortalidade emnosso país. A Hipertensão Arterial Sistêmica (HAS) é
caracterizada por níveis pressóricos elevados e sustentados, tendo seu
desenvolvimento e manutenção causados por diversos fatores, sendo o nosso foco neste trabalho, o Sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona (SRAA). Em estudos anteriores realizados em nosso laboratório, foi observado que ratos Wistar
apresentavam valores de atividade da Enzima Conversora de Angiotensina I (ECA) plasmática, bastante dispersos, porém mantidos durante toda a vida do animal. O cruzamento direcionado destes animais segundo o fenótipo da ECA plasmática possibilitou a criação de uma sublinhagem de animais com atividade da ECA alta (INFAR/ECAa) e atividade da ECA baixa (INFAR/ECAb). No presente estudo monitoramos a pressão arterial desses animais, assim como a atividade da ECA plasmática e verificamos a reatividade vascular de animais ECAa e ECAb frente a drogas vasoconstritoras e seus antagonistas. Até o presente momento, os animais mantiveram sua pressão arterial e a atividade da ECA mantidas durante todo o período experimental. A resposta a noradrenalina não apresentou diferença
significativa na reatividade vascular. Porém frente a angiotensina I, observou-se que os animais ECAb apresentam resposta pressórica maior a droga do que os ECAa. O efeito da angiotensina II e da acetilcolina e de seus respectivos antagonistas
também será avaliado, visando um melhor entendimento desta sensibilidade maior nos animais ECAb.
PALAVRAS CHAVE: Hipertensão Arterial Sistêmica, Sistema Renina Angiotensina Aldosterona, ECA, fenótipos, drogas vasoconstritoras, pressão arterial.
2. INTRODUÇÃO
A hipertensão arterial sistêmica (HAS) é uma das primeiras causas de
morbimortalidadepor doençascardiovasculares, principalmente nos países ocidentais (Hermansen,2000). A HAS uma patologia multifatorial e poligênica, caracterizada por níveis pressóricos elevados e sustentados, representando, um dos problemas de saúde pública mais graves no mundo (SBC/SBH/SBN/VI Diretrizes Brasileiras de Hipertensão, 2010). Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), em 2008 as doenças cardiovasculares levaram 17,3 milhões de pessoas no mundo a óbito,
sendo que 40% dos adultos acima de 25 anos de idade tiveram um aumento de sua pressão arterial neste período. Entre elas, a HAS, causou 9,4 milhões de óbitos no mundo, todos os anos, sendo assim responsável por pelo menos 45% das mortes por doenças cardíacas, principalmente por isquemia e por Acidente Vascular Cerebral (AVC). (A Global Brief On Hypertension/WHO, 2013). No Brasil, a prevalência da HAS varia de 43,8% a 22,3% em regiões diferentes do país (SBC/SBH/SBN/VI Diretrizes Brasileiras de Hipertensão, 2010).
Vários mecanismos estão envolvidos no desenvolvimento e na manutenção da HAS, como por exemplo: sistema nervoso simpático (SNS), a ação de alguns hormônios, como as vasopressinas e endotelinas e por fim, o sistema angiotensina-aldosterona (SRAA) (Lubanski&McCullough, 2009). O sistema renina-angiotensina desempenha uma função chave na regulação da pressão arterial. A ação biológica deste sistema é mediada pelo octapeptídio angiotensina II (AII), resultado da clivagem de angiotensina I pela ECA (enzima conversora de
angiotensina I), e sua ação é exercida através da ativação de receptores específicos de membrana denominados AT1 e AT2. Entre as drogas anti-hipertensivas atuais, a enzima conversora de angiotensina I (ECA) é um importante alvo terapêutico no tratamento da hipertensão arterial.
Estudos anteriores feitos em nosso laboratório mostraram que ratas fêmeas da colônia Wistar 2-BAW apresentam atividade da ECA bastante dispersa, podendo ser divididos em: animais com atividade da ECA alta (ECAa), ECA intermediária (ECAi) e ECA baixa (ECAb) que, apesar dos fenótipos enzimáticos diferentes, são normotensos (Ninahuaman e col., 2007). Em continuidade a esse estudo, a
hereditariedade de tal característica fenotípica foi demonstrada por Oliveira e col (2008) e, por cruzamento direcionado, foi estabelecida uma colônia de ratos normotensos com fenótipos de ECA plasmáticos distintos (Wistar INFAR/ECAa e ECAb). Além disso, foi também demonstrado que a atividade da ECA plasmática e a pressão arterial (PA), uma vez estabelecidas dos 60 dias de vida, não são alteradas durante até 360 dias de vida.
3. OBJETIVO
Este projeto teve por objetivos: monitorar a atividade da ECA plasmática e a pressão vascular de ratos machos e fêmeas, adultos e verificar a reatividade vascular destes animais frente a agentes hipertensores e anti-hipertensivos.
4. METODOLOGIA
Foram utilizados ratos normotensos (INFAR/ECAa e INFAR/ECAb)machos e fêmeas aos 60 e 90 dias de idade para a determinação da atividade da ECA
plasmática e aferição da pressão arterial sistólica (PA) pelo método não invasivo e aos 180 dias de idade para o estudo da reatividade vascular.
A atividade da ECA plasmática foi determinada pelo método FRET desenvolvido por Carmona e col. (2006) e expressa em nmol/min/mL. A PA foi medida pelo método não invasivo na cauda do rato, expressa em mm Hg, e a reatividade vascular foi avaliada pelo método invasivo em ratos anestesiados pela associação de pentobarbital (40 mg/kg, i.p.) e uretana (800 mg/kg, i.p.), e expressa em Δ mm Hg. Os dados foram expressos como média ± erro padrão da média e comparados pelo teste “t” para as variáveis sexo e fenótipo (p<0.05).
5. DESENVOLVIMENTO
A análise da reatividade vascular dos ratos com diferentes fenótipos de enzima conversora de angiotensina I (ECA – EC 3.4.15.1) plasmática através da resposta pressórica destes animais a agonistas e antagonistas dos sistemas: nervoso simpático (SNS) e renina-angiotensina (SRA) permitirá uma melhor
caracterização do modelo experimental de ratos com fenótipos enzimáticos de ECA plasmática viabilizando, futuramente, uma colônia de ratos com atividade enzimática alterada o que contribuirá para o entendimento do impacto de alterações no SRA e do SNS em diversos órgãos alvos e não alvos da hipertensão arterial.
6. RESULTADOS
6.1 Atividade da ECA Plasmática
A atividade da ECA foi quantificada no plasma de ratos machos e fêmeas, aos 60 e 90 dias de idade e representada em nmol/min/mL.
O fenótipo enzimático da ECA plasmática da geração parental foi mantido nos filhotes. Aos 60 dias de idade, em ratos machos, a atividade da enzima conversora de animais ECAa e ECAb foi 86.58 ± 2.7 nmol/min/mL e 46.13 ± 1.9 nmol/min/mL, respectivamente. Nas fêmeas de mesma idade, a atividade da ECA plasmática foi 81.00 ± 2.0 nmol/min/mL e 45.84 ± 1.0 nmol/min/mL, respectivamente. Este padrão foi mantido aos 90 dias de idade, em todos os grupos de animais avaliados (Figura 1).
0 20 40 60 80 100 ECA alta ECA baixa 60 dias 90 dias A ti v id a d e d a E C A p la s m á ti c a (n m o l/ m in /m L ) 0 20 40 60 80 100 ECA alta ECA baixa 60 dias 90 dias A ti v id a d e d a E C A p la s m á ti c a (n m o l/ m in /m L ) Figura 1: Atividades da ECA plasmática em comparativo dos gêneros nos 60 e 90
dias de vida. No gráfico (A) estão representados os valores de ECAa em vermelho e ECAb em azul de ratos machos, no gráfico (B) de ratos fêmeas de mesma idade.
6.2 - Pressão Arterial determinada pelo método indireto não invasivo em animais ECAa e ECAb
A pressão arterial sistólica (PA) foi medida em mm Hg, pelo método plestimográfico indireto não invasivo, em ratos machos e fêmeas aos 75 e 90 dias de idade. Como pode ser observado, há uma diferença significativa entre os fenótipos, as idades e os gêneros (Figura 2) .
A PA de ratos machos ECAa aos 75 dias de idade foi 7% menor quando comparado aos animais ECAa aos 90 dias e a dos animais machos ECAb na mesma idade foi 8% menor quando comparado aos animais ECAb aos 90 dias (ECAa 75 dias = 152.2 ± 3.4 mm Hg, n=9; ECAa 90 dias = 163.3 ± 2.5 mm Hg, n=10; ECAb 75 dias = 148.2 ± 4 mm Hg, n=10 e ECAb 90 dias = 160.1 ± 2.2 mm Hg, n=10) (Figura 2A). 0 50 100 150 200 ECA alta ECA baixa 75 dias 90 dias # * P re s s ã o A rt e ri a l S is tó li c a (m m H g ) 0 50 100 150 200 ECA alta ECA baixa 75 dias 90 dias P re s s ã o A rt e ri a l S is tó li c a (m m H g ) A B A B
Figura 2: A PA (mm Hg) medida pelo método indireto não invasivo na cauda de ratos normotensos em comparativo dos gêneros nos 75 e 90 dias de vida. No gráfico (A) estão representados os valores de ECAa em vermelho e ECAb em azul, de ratos machos, no gráfico (B) de ratos fêmeas de mesma idade.
6.3 Pressão Arterial em animais anestesiados obtida pelo método direto
A pressão arterial sistólica (PA) foi medida em mm Hg, pelo método direto via canulação da artéria carótida em ratos machos. Não foi detectada diferença significativa entre os valores de PA nos ratos com fenótipos enzimáticos distintos, sendo a PA dos animais ECAa 117,1 ± 3,6 mm Hg (n=8) e dos animais ECAb 117,8 ± 4,6 mm Hg, (n=8) (Figura 3).
Figura 3: Pressão arterial sistólica (PA, mm Hg) de ratos ECAa (vermelho) e ECAb (azul), medidas pelo método direto invasivo na artéria carótida de ratos.
6.4 Reatividade Vascular pelo método invasivo em animais anestesiados ECAa e ECAb
A reatividade vascular expressa em Δ mm Hg foi avaliada em ratos machos ECAa e ECAb aos 180 dias de idade.
A injeção e.v. de noradrenalina, angiotensinas I e II (AI - AII) e acetilcolina promoveram uma resposta dose-dependente na PA tanto dos ratos ECAa como dos ECAb. Como pode ser observado na figura 4, o efeito pressórico das angiotensinas (AI e AII) nos ratos ECAb foi maior do que nos ratos ECAa. Nas maiores doses utilizadas (30 e 100 ng/kg), as variações na PA dos animais ECAb foram 67% e 66% maiores do que nos ECAa, respectivamente. Após a administração de seus
0 50 100 150 ECA alta ECA baixa P re s s ã o A rt e ri a l S is tó li c a ( m m H g )
respectivos antagonistas, captopril (2,5 mgKg) e losartana (3 mg/Kg), não houve diferença significativa entre as respostas as AI e AII nos diferentes fenótipos. (Figura 4)
Frente aos agonistas simpáticos e parassimpáticos, noradrenalina (0,1 – 10
µg/Kg) e acetilcolina (0,3 a 30 ng/kg) não houveram diferenças significativas entre as respostas hiper e hipotensoras nos ratos com diferentes fenótipos enzimáticos em nenhuma das doses utilizadas, na ausência ou presença de bloqueio noradrenérgico e muscarínico obtidos pela injeção prévia de prasozin (0,5 mg/Kg) e atropina (10 mg/kg) (Figura 5). Angiotensina I 1 10 100 0 10 20 30 40 ECA alta ECA baixa
ECA alta AI + CAP (2,5 mg/Kg) ECA baixa AI + CAP (2,5 mg/Kg) * * * Dose (ng/Kg) P re s s ã o A rt e ri a l ( m m H g )
Figura 4: Efeito da injeção e.v de AI (1 – 100 ng/Kg, n=3) e AII (1 – 100 ng/kg, n= 4) na pressão arterial (Δ mm Hg) medida pelo método invasivo na artéria carótida de ratos normotensos com diferentes fenótipos enzimáticos, representados os animais ECAa em vermelho e os animais ECAb em azul, antes ou após a administração de seu inibidor, captopril (2,5 mg/Kg) e antagonista losartana (3 mg/Kg), * p<0,05.
Angiotensina II 1 10 100 0 10 20 30 40 ECA alta ECA baixa
ECA alta + LOSAR (3mg/Kg) ECA baixa + + LOSAR (3mg/Kg) * * Dose (ng/Kg) P re s s ã o A rt e ri a l ( m m H g )
Noradrenalina 0.1 1 10 0 20 40 60 80 100 ECA alta ECA baixa
ECA alta Nor + Praz (500g/Kg) ECA baixa Nor + Praz (500g/Kg)
* * Dose (g/Kg) P re s s ã o A rt e ri a l S is tó li c a ( m m H g )
Figura 5: Efeito da injeção e.v de noradrenalina (0,1 – 10 µg/Kg, n=4) e acetilcolina
(0,3 – 30 ng/Kg, n= 4) na pressão arterial sistólica (Δ mm Hg) medida pelo método invasivo na artéria carótida de ratos normotensos com diferentes fenótipos enzimáticos, representados os animais ECAa em vermelho e os animais ECAb em azul, antes ou após a administração de seus respectivos antagonistas prasozin (0,5 mg/Kg) e atropina (10 mg/Kg).
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS 7.1 Atividade da ECA Plasmática
O acasalamento direcionado da geração F-8 originou a geração F-9, que apresentou níveis plasmáticos de ECA semelhantes à geração parental e não houve modificação conforme a idade dos animais, ou seja: filhotes de ratos com atividades plasmáticas ECAa e ECAb, apresentam níveis de ECA compatíveis com a de seus pais e, com o envelhecimento do animal, essas atividades não se modificam, assim
Acetilcolina 0.1 1 10 100 -80 -60 -40 -20 0 ECA alta ECA baixa
ECA alta + ATR [10mg/Kg] ECA baixa + ATR [10mg/Kg]
Dose (ng/Kg) P re s s ã o A rt e ri a l S is tó li c a ( m m H g )
como também já havia sido observado por Ninahuaman (2002 ; 2007) e Oliveira, Sandrea Sales (2008).
7.2 Pressão Arterial pelo método não invasivo em ratos não anestesiados
A pressão arterial dos ratos Wistar da colônia 2-BAW é entre 120 e 150 mm Hg, podendo ser classificado como normotenso. Em nossos experimentos, este valor padrão da colônia foi mantido independente do fenótipo de ECA apresentado pelos animais. Este aparente comportamento paradoxal entre atividade plasmática de ECA e pressão arterial foi, também, observado por outros autores em ratos de linhagens com fenótipos de atividade da ECA alta e baixa (Ocaranza et al., 2006) indicando que o controle da PA é multifatorial, ou seja, um só fator (fenótipo da ECA) não é suficiente para controlar este parâmetro. No presente estudo observamos diferenças significativas, porém não significantes nos valores da pressão arterial entre os fenótipos e entre os gêneros, onde as diferenças encontradas foram: machos ECAa entre 75 e 90 dias; Machos ECAb entre 75 e 90 dias; Fêmeas ECAa e ECAb aos 90 dias e aos 90 dias de idade, entre machos e fêmeas ECAa. Estas diferenças observadas poderiam ser explicadas por alguns fatores técnicos, não relacionados diretamente com a característica enzimática do rato em estudo, como na forma de manuseio dos animais por exemplo.
7.3 Pressão Arterial pelo método direto em animais anestesiados
A análise da pressão arterial pelo método direto da artéria carótida nos animais com diferentes fenótipos de atividade plasmática de ECA alta e baixa (ECAa e ECAb) não detectou diferenças significativas entre os animais com os diferentes fenótipos enzimáticos, podendo ambos ser considerados normotensos. Este resultado confirmou resultados anteriores de valor de PA obtidos utilizando-se o método indireto de medida na cauda dos animais (Oliveira, 2008; Silva, 2012).
Como esperado, os animais anestesiados apresentaram PA menor (15%) do que a registrada nos animais pelo método indireto, possivelmente pelo efeito do anestésico na pressão arterial.
7.4 Reatividade Vascular pelo método direto em animais anestesiados
A reatividade vascular in vivo foi avaliada pelo registro da pressão arterial e análise da ação de agonistas e antagonistas dos sistemas nervoso simpático e renina-angiotensina-aldosterona.
A administração das angiotensinas I e II (AI e AII) aos ratos ECAa e ECAb possibilitou a verificação de diferenças significativas entre os fenótipos na presença das maiores doses do peptídeo. Os animais com fenótipo ECAb são mais sensíveis à administração das mesmas do que os animais ECAa. Após administração prévia do inibidor da ECA, captopril e da losartana, nas doses utilizadas, não foram observadas a manutenção desta diferença fenotípica.
Os resultados apresentados não suportam a hipótese de influencia do fenótipo da ECA plasmática no efeito da AI pois nos ratos ECAb foi também verificada uma maior sensibilidade a AII e, como no efeito da AII não há a participação da ECA, como no da AI. O efeito da AII é exercido diretamente nos receptores AT1, contrastando com o da AI que depende de sua hidrólise a AII pela ECA para exercer seu efeito hipertensor (Skeggs et al., 1984).
Experimentos complementares variando a dose de antagonista AT1 e avaliando a densidade e a reatividade deste receptor estão programados para melhor entendimento deste resultado.
8. FONTES CONSULTADAS
A Global Brief on Hypertension – World Health Organization (WHO) - WHO/DCO/WHD/2013.2, 2013.
CARMONA, A.K., SCHWAGER S.L., JULIANO, M.A., JULIANO, L., STTURROCK, E.D. A continuous fluorescence resonance energy transfer angiotensin I- converting enzyme assay. Nature Methods. 1 (4):1971-1976, 2006.
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OCARANZA, M. P, PALOMERA, C., ROMÁNA, M., BERGETTOA, J., LAVANDERB, S., JALIL, J. Effect of hypertension on angiotensina (1-7) levels in rats with different angiontensin-I converting enzyme polymorphism. Life Science. 78 (14): 1535-1542, 2006.
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