DISSERTAÇÃO
QUITOSANA/CURCUMINA: MEMBRANAS DE LIBERAÇÃO
CONTROLADA PARA TRATAMENTO DE MELANOMA
GLÓRIA TAMIRIS FARIAS DA SILVA FURTADO
ORIENTADOR: PROF. DR. MARCUS VINICIUS LIA FOOK
CAMPINA GRANDE AGOSTO/2014 1
UNIVERSIDADE FEDERAL DE CAMPINA GRANDE CENTRO DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E ENGENHARIA DE MATERIAIS
GLÓRIA TAMIRIS FARIAS DA SILVA FURTADO
QUITOSANA/CURCUMINA: MEMBRANAS DE LIBERAÇÃO
CONTROLADA PARA TRATAMENTO DE MELANOMA
Dissertação de Mestrado
apresentado ao Departamento de Ciência e Engenharia de Materiais da Universidade Federal de Campina Grande como exigência final para obtenção do título de mestre.
Orientador: PROF. DR. MARCUS VINICIUS LIA FOOK
CAMPINA GRANDE - PB AGOSTO/2014
DEDICATÓRIA
. Dedico este trabalho aos meus pais Minervino e Marinalva, a minha irmã Jéssica e minha avó Maria da Glória pelo amor, apoio, educação e fontes de motivação. E ao meu noivo Thiago pelo amor e apoio.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me dar força, coragem e capacidade para superar todos os desafios que encontrei e serão encontrados por toda a minha vida.
A meus pais Minervino e Marinalva, pelo amor, paciência e apoio incondicional em todas as etapas da minha vida.
A toda a minha família, em especial a minha irmã Jéssica, que contribuíram para o meu crescimento pessoal e profissional sempre me apoiando em todos os momentos.
Ao meu AMIGO e noivo, Thiago, por participar intensamente de cada desafio superado, me ajudando, incentivando, sempre com muito amor, e principalmente paciência.
Ao Professor Dr. Marcus Vinicius Lia Fook, pela orientação e oportunidade, dada desde da graduação, confiança a mim dirigida e por ter sempre acreditado na minha capacidade para as realizações dos desafios proposto por ele. Agradeço por sua sinceridade e confiança depositada em mim.
Aos queridos, amados e grandes amigos Paulinha, Dona Val, Rafaela
Meneses, Rafaela Quinto, Natália Guedes, Milena, Suelem, Italo Macedo, Rayane Santa Cruz, Hugo Lisboa, Ana Carolina, Greyce Sampaio, Ivna Daniele, Anna Silvia, Isabel Rabello, Hugo Yves, Luciane, Josilene, Sr. Sergio, Willams e Thiago pelo o apoio, incentivo, companheirismo, ajuda,
contribuição, de cada um, na realização deste trabalho.
A todos os colegas do Grupo de Biomateriais em especial, Sr.Sergio, Joselene, Dona Val, Dailma, Tania, Paulinha, Bruno, Thais, Luciane, Italo, Paulo, Rayane, Silvia, Daniel e Kladson por todo o auxilio prestado durante o desenvolvimento deste trabalho e por todos esses anos de convivência.
À coordenação do curso de Pós-Graduação, na pessoa do Professor Dr. Romualdo Menezes.
"Devemos ser a mudança que queremos ver no mundo"
RESUMO
O câncer vem crescendo nas estatísticas da saúde pública, e o melanona é um dos tipos mais letais. Tem-se pesquisado substâncias que sejam menos tóxicas e que possam ser liberadas de forma controlada através de sistemas farmacêuticos. Para desenvolver os sistemas farmacêuticos utilizam-se materiais polímeros, os quais serão responsáveis pelo o controle de liberação da droga in situ desejado. A quitosana tem sido estudada por apresentar propriedades como atividade antimicrobiana, analgésico, pode ser modificada químicamente, fácil acesso e de baixo custo. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e avaliar membranas de quitosana para o uso em sistemas de liberação controlada da curcumina para o tratamento de melanoma. As amostras foram preparadas pelo método de evaporação de solvente, utilizando uma solução de ácido acético (1% v/v), para obter uma solução de quitosana a 2% (m/v). As membranas de quitosana/curcumina foram obtidas a partir da dissolução da curcumina em etanol (1,2 mg/ml), vertendo-a na solução de quitosana, As membranas de quitosana com e sem curcumina, foram caracterizadas por FTIR, DRX, MEV, TG, DSC, GI, biodegradação enzimática, citotoxicidade (MCF-7), e como também realizado o desenvolvimento e validação do método analítico, e determinação do teor de curcumina na membrana desenvolvida. A partir das caracterizações ficou evidenciado que o método de processamento usado na obtenção da membrana quitosana/curcumina é adequado, tendo em vista que não houve degradação da curcumina. As membranas de quitosana/curcumina apresentaram menor intumescimento e degradação, e maior estabilidade quando comparadas às membranas de quitosana. Para o ensaio de citotoxicidade as membranas de quitosana/curcumina apresentaram potencial para o tratamento de câncer. O método analítico desenvolvido está conforme a RE Nº 899/2003 da ANVISA. Logo, o método utilizado foi adequado para identificação e quantificação da curcumina na membrana de quitosana/curcumina. Diante dos resultados obtidos, o sistema desenvolvido apresenta potencial para aplicações em liberação controlada de drogas.
PALAVRAS CHAVES: Melanoma, sistemas de liberação controlada,
ABSTRACT
The cancer is growing in public health statistics, and the melanoma is one of the most lethal types. Research has focused on substances that are less toxic and can be released in a controlled way through the developoment of pharmaceutical systems. To develop pharmaceutical systems are used polymer materials, which will be responsible for the drug release control in situ. Chitosan has been studied for having properties such as antimicrobial, analgesic, may be chemically modified, easy and inexpensive. The aim of this study was to develop and evaluate chitosan membranes for curcumin controlled release systems for treating melanoma. Samples were prepared by solvent casting, using a solution of acetic acid (1% v/v) to obtain a chitosan solution at 2% (w/v). The membranes of chitosan/curcumin was obtained from the dissolution of curcumin in ethanol (1.2 mg / ml) pouring the solution of chitosan, chitosan membranes with and without curcumin were characterized by FTIR, XRD, SEM, TG, DSC, SD, enzymatic degradation, cytotoxicity (MCF-7), and also performed as the development and validation of the analytical method, and determination of curcumin in membrane developed. From the characterizations became evident that the processing method used in obtaining the chitosan membrane/curcumin is appropriate, considering there was no degradation of curcumin. The membranes of chitosan/curcumin showed lower swelling ratio and degradation, and increased stability as compared to the chitosan membranes. For the cytotoxicity assay the membranes of chitosan/curcumin showed potential for the treatment of cancer. The developed analytical method is accordint to the ANVISA resolution No. RE 899/2003. Therefore, the method was suitable for identification and quantification of curcumin in chitosan/curcumin membranes. Based on these results, the system developed has potential for applications in controlled release of drugs.
KEYWORDS: Melanoma, controlled release systems, membranes, chitosan
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Os cinco tipos mais frequentes de câncer no Brasil . ... 11
Figura 2: Formação e tipos de câncer. ... 12
Figura 3: Estatística sobre as principais causas de câncer. ... 14
Figura 4: Camadas da pele. ... 15
Figura 5: Crescimento do Melanoma. ... 16
Figura 6: Comparação ilustrativa das variações de concentração de fármacos: (a) administrados por métodos convencionais de multidosagem;(b) sistema de liberação controlada. ... 18
Figura 7: Mecanismos de liberação do fármaco em SLC. ... 22
Figura 8: Estrutura química da quitosana. ... 26
Figura 9: Estrutura química da curcuminalonga. ... 29
Figura 10: Constituintes do corante cúrcuma. ... 29
Figura 11: Principais produtos gerados a partir da degradação da Curcumina.30 Figura 12: Etapas deobtenção da membrana de quitosana. ... 35
Figura 13: Etapa de obtenção da membrana de quitosana/curcumina . ... 35
Figura 14: Membrana de quitosana (a); membrana de quitosana/curcumina (b) ... 45
Figura 15: Espectros de FTIR:(a) Membrana de quitosana;(b)curcumina e (c) quitosana/curcumina. ... 46
Figura 16: Difratogramas: (a) membrana de quitosana; (b) pó da curcumina e (c) membrana quitosana/curcumina. ... 48
Figura 17: Micrografias: (a) membrana de quitosana, pó da curcumina, membrana quitosana/ curcumina, respectivamente: (a) 500X; (b) 1000 X; (c) 5000 X. ... 50
Figura 18: Micrografias do corte transversal das membranas de quitosana e quitosana/ curcumina. ( a) 500 X; (b) 1000 X; (c) 5000 X, respectivamente. ... 51
Figura 19. Curvas TG/DTG para membrana de quitosana, pó da curcumina e membrana de quitosana/curcumina ... 52
Figura 20. Curvas de DSC: (a) membrana de quitosana, (b) pó da curcumina, (c) membrana quitosana/curcumina. ... 55
Figura 21: Grau de intumescimento (%) das membranas de quitosana e quitosana/curcumina: (a) pH 7,4; (b) pH 5,8; (c) pH 4,6. ... 57
Figura 22: Biodegradação da membrana de quitosana. ... 59
Figura 23: Biodegradação para as membranas de quitosana/curcumina ... 60
Figura 24: Viabilidade celular do sistema quitosana/curcumina. ... 61
Figura 26: Cromatogramas das soluções-padrão da curcumina (A) e quitosana (B) obtido por CLAE-UV a 425nm. ... 63 Figura 27 – Curva de Calibração para curcumina. ... 64 Figura 28: Teor real de curcumina na membrana de quitosana/curcumina. .... 68
LISTA DE TABELA
Tabela 1: Modelos Matemáticos. 23
Tabela 2: Expoente difusional e mecanismo de liberação para sistemas de
liberação controlada. 24
Tabela 3: Eventos térmicos para membrana de quitosana, pó da curcumina e
membrana de quitosana/curcumina. 53
Tabela 4: Resultados do ensaio para verificação da exatidão do método. 64 Tabela 5: Resultados do ensaio para verificação da precisão (precisão
intermediária). 65
Tabela 6: Resultados do ensaio para verificação da precisão (repetibilidade). 66 Tabela 7: Resultados do ensaio para verificação da robustez do método. 67
Fluxograma
Fluxograma 1: Etapas de desenvolvimento e caracterização das membranas
ABREVIAÇÕES
ANVISA- Agência Nacional de Vigilância Sanitária ASTM-American Society for Testing and Materials CLUE- cromatógrafo líquido de ultra eficiência CTAB-cetiltrimetilamóniobrometo
DRX- Difração de Raios X
DSC- Análise de Calorimetria Exploratória Diferencial
FTIR- Espectroscopia na Região do Infravermelho por Transformada de Fourier GI-Grau de IntumescimentoINCA-Instituto Nacional de Câncer José Alencar ISO-International Organization for Standardization
MBCSPs-fibroblastos dérmicos humanos MCF7- Câncer de mama humano
MEV- Microscopia Eletrônica de Varredura
MTT-brometo de 3-(4,5-dimetiliazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio PBS-Phosphate Buffered Saline
PLGA- poli (ácido láctico-co - glicólico RE- Resolução da ANVISA
SLC- Sistemas de Liberação Controlada de Fármacos TG-Termogravimetria
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 7 2. OBJETIVOS 9 2.1 Objetivo geral 9 2.2 Objetivos específicos 9 4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 10 4.1 Câncer 10 4.1.1Pele 14
4.1.2 Câncer de pele: Melanoma 15
4.2 Sistemas de Liberação Controlada de Fármacos( SLC) 17 4.2.1 Classificação dos Sistemas de Liberação Controlada 20
4.3 Biopolímeros: Quitosana 25 4.4Curcumina 28 4.5 Quitosana/Curcumina 31 5. MATERIAIS E MÉTODOS 34 5.1 Local da Pesquisa 34 5.2Reagentes e Materiais 34 5.3 Procedimentos experimentais 34
5.3.1 Preparação das membranas de quitosana 34 5.3.2 Preparação das membranas de quitosana/curcumina 35
5.4 Caracterizações das membranas 36
5.4.1 Caracterização Parcial 36
5.4.1.1Espectroscopia na Região do Infravermelho por Transformada de
Fourier - (FTIR) 36
5.4.1.1.2 Difração de Raios X - (DRX) 36
5.4.1.1.3 Microscopia Eletrônica de Varredura – MEV 37
5.4.1.1.4 Termogravimetria ( TG) 37
5.4.1.1.5 Análise de Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) 37
5.4.1.1.6. Grau de Intumescimento (GI) 38
5.3.2.4 Biodegradação enzimática 38
5.3.2.5 Citotoxicidade 39
5.3.2.6 Desenvolvimento e Validação do método analítico para
quantificação da curcumina 40
5.3.2.6.1 Determinação do comprimento de onda de detecção 41
5.3.2.6.2 Validação do método analítico 41
5.3.2.6.3 Determinação do teor de curcumina nas membranas 43
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO 45
6.1 Espectroscopia na Região do Infravermelho por Transformada de
Fourier - (FTIR) 46
6.2 Difração de Raios X- DRX 48
6.3 Microscopia Eletrônica de Varredura- MEV 49
6.4 Termogravimetria (TG) 52
6.5 Calorimetria Exploratória Diferencial- DSC 54
6.6 Grau de Intumescimento ( GI%) 57
6.7 Biodegradação enzimática 59
6.8 Citotoxicidade 61
6.9 Desenvolvimento e Validação do método analítico para quantificação
da curcumina 62
6.9.1 Determinação do comprimento de onda de detecção para
6.9.2 Validação do método analítico para quantificação da curcumina 62 6.9.3 Determinação do teor de curcumina nas membranas 67
7. CONCLUSÕES 69
8. PERSPECTIVAS FUTURAS 70
1. INTRODUÇÃO
Uma ampla gama de doenças e lesões tem afetado tecidos e órgãos de uma maneira que resultam em perda parcial ou total de função. Essencialmente, essas condições são classificadas em lesões agudas ou crônicas e mudanças degenerativas. Dentre estas doenças, o câncer vem ganhando destaque nas estatísticas da saúde pública. Em países desenvolvidos e em desenvolvimento, é responsável por mais de seis milhões de óbitos a cada ano, representando cerca de 12% de todas as causas de morte no mundo. Embora as maiores taxas de incidência de câncer sejam encontradas em países desenvolvidos, dos dez milhões de casos novos anuais de câncer, cinco milhões e meio são diagnosticados nos países em desenvolvimento (GUERRA, 2005).De acordo com o Instituto Nacional de Câncer José Alencar (INCA) a situação do câncer no Brasil, para o ano 2012/2013, é estimado 518.510 novos casos(INCA 2010)
Dentre os vários tipos de casos de câncer no Brasil, o câncer de pele é o segundo mais frequente. Dentre estes, o melanona figura entre os mais letais, com cerca de 75% de mortalidade na espécie humana, no ano de 2012, foram registrados 6.230 casos(INCA, 2014).
O câncer de pele surge devido à exposição solar na infância e na adolescência a qual está associado ao aparecimento de melanoma cutâneo na idade adulta (INCAb, 2010), por fatores ambientais ou herança genética. O melanoma maligno é uma forma de câncer de pele muito agressivo que frequentemente torna-se resistente aos tratamentos atuais como, quimioterapia e radioterapia. Estes métodos são destinados a eliminar células de rápido crescimento, porém acabam afetando células saudáveis, que também têm características de se multiplicar rapidamente acarretando efeitos colaterais fortes como quedas de cabelo, feridas na boca, náuseas, vômitos e dores. Além de se mostrarem insuficientes, uma vez que, as células cancerígenas tornam-se resistentes aos agentes quimioterápicos. Em virtude disso, torna-se primordial o desenvolvimento de novos agentes que não desencadeiem quimiorresistência (CARNEIRO, 2007), que sejam menos tóxicos e que possam ser liberados de forma controlada através de sistemas farmacêuticos.
Um agente de destaque por ter uma ampla variedade de propriedades farmacológicas é a curcumina, derivado do rizoma do açafrão (Curcuma longa Linn). Dentre as suas diversas propriedades pode-se destacar ações anti-inflamatória, antioxidante, anti-metastática, antiangiogênica, cicatrizante da pele e, principalmente, por ser antiproliferativa e antitumoral. Para desenvolver os sistemas farmacêuticos geralmente utilizam-se polímeros, os quais serão responsáveis pelo o controle de liberação da droga in situ desejado. Desta forma, a quitosana se sobressai por ser um biomaterial polimérico com grande variedade de propriedades físicas e químicas e de biodegradação controlada. Pode ser processada varias formas (esferas, filmes, esponjas, etc), também apresenta capacidade de ser modificada químicamente, de fácil acesso e de baixo custo. Portanto, a curcumina é um agente farmacológico não toxico as células saudáveis, logo esta droga associada a quitosana torna-se uma nova perspectiva terapêutica para o câncer.
Neste contexto, tem-se a perspectiva de iniciar os estudos de um sistema farmacêutico que utilize uma droga juntamente com um biopolímero para o tratamento de melanoma.
2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral
Desenvolver e avaliar membranas de quitosana para o uso em sistema de liberação controlada da curcumina para o tratamento de melanoma.
2.2 Objetivos específicos
Obter a membrana quitosana/curcumina.
Avaliar a incorporação e interação da curcumina com a quitosana.
Analisar, comparativamente, as propriedades físico-químicas e estruturais das membranas de quitosana e quitosana/curcumina.
Avaliar o grau de intumescimento e biodegradação das membranas.
Estudar a citotoxicidade das membranas.
Desenvolver e validar o método analítico para quantificação da curcumina a fim de estabelecer o teor real da curcumina na membrana de quitosana/curcumina.
4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 4.1 Câncer
O câncer é responsável por mais de 12% de todas as causas de óbito no mundo: mais de 7 milhões de pessoas morrem anualmente desta doença. Como a esperança de vida no planeta tem melhorado gradativamente, a incidência de câncer, estimada em 2002 em 11 milhões de casos novos, alcançará mais de 15 milhões em 2020. A explicação para este crescimento está na maior exposição dos indivíduos a fatores de risco cancerígenos, à redefinição dos padrões de vida, a partir da uniformização das condições de trabalho, nutrição e consumo desencadeado pelo processo global de industrialização. As alterações demográficas, com redução das taxas de mortalidade e natalidade, indicam o prolongamento da expectativa de vida e o envelhecimento populacional, levando ao aumento da incidência de doenças crônico-degenerativas, especialmente as cardiovasculares e o câncer (INCA,2012).
Entre as várias doenças atribuídas à mortalidade dos seres humanos em todo o mundo, o câncer é uma das principais causas (NAAMA, AL-TEMIMI & AL-AMIER,2010), isso pode ser atribuído a mutações somáticas e o declínio da imunocompetência que acompanha o envelhecimento dos humanos o que intensifica o desenvolvimento de câncer (ROBBINS & COTTRAN, 2010). Segundo o Ministério da Saúde (2012), os cinco tipos de câncer mais frequentes no Brasil são: Colo do útero, Pele, Próstata, Colon e Mama, tendo com mais frequência na faixa etária entre 40 a 69 anos. Observa-se na Figura 1 que o câncer de pele é o segundo mais frequente no Brasil em ambos os sexos no ano de 2012 (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2012). Dentre os diversos tipos de câncer no Brasil, os melanomas no ano de 2012 foram apenas 6.230 casos. No entanto, este figura entre os mais letais, com cerca de 75% de mortalidade na espécie humana (INCAa, 2010).
Figura 1: Os cinco tipos mais frequentes de câncer no Brasil .
Fonte: DATASUS/ Ministério da Saúde, 2012.
Muito embora o câncer tenha recebido destaque nas estatísticas nas últimas décadas, o câncer não é uma doença do mundo moderno. Estudos mostram que seres humanos apresentavam câncer desde tempos antigos. Como por exemplo, no Egito antigo, em 1932, Louis Leakey descobriu um maxilar, a partir de Australopithecus ou o Homoerectus, o qual apresentava um tumor. Especialistas examinaram-no e sugeriram que o tumor era decorrente do linfoma de Burkitt, um tipo de câncer que afeta o sistema imunológico. Outras múmias foram estudadas e revelaram estruturas tumorais que descrevem câncer de mama e câncer ósseo, comprovando que o câncer já comprometia o homem há mais de 3 mil anos antes de Cristo ( INCA, 2012; SO &BOZZONE , 2008)
A palavra câncer foi utilizada pela primeira vez por Hipócrates, o pai da medicina, que viveu entre 460 e 377 a.C. A palavra câncer tem origem a partir do grego - karkínos, que quer dizer caranguejo, a qual foi atribuída por apresentar uma capacidade de aderir a estruturas adjacentes e se espalharem várias direções simultaneamente(ROBBINS & COTTRAN, 2010).
O câncer pode ser definido como um crescimento anormal de células, causado por alterações genéticas que conduzem ao desequilíbrio na proliferação celular. Por fim, evolui para uma população de células que podem invadir os tecidos, se disseminar para locais distantes ocasionando as
2.000 4.000 6.000 8.000 10.000 12.000 14.000 16.000 18.000 20.000 < 1a 1-4a 5-9a 10 -14 a 15 -19 a 20 -24 a 25 -29 a 30 -34 a 35 -39 a 40 -44 a 45 -49 a 50 -54 a 55 -59 a 60 -64 a 65 -69 a 70 -74 a 75 -79 a 80 e+ a N ú m e ro d e c asos
Faixa etária (ano)
Colo do Útero Pele
Próstata Colon Mama
metástases ( Figura 2). Essa proliferação celular desordenada é responsável por uma morbidade significativa e, se não for tratada, pode levar a morte do hospedeiro (RAYMOND &RUDDON, 2007).
A proliferação excessiva e não controlada das células é chamada de neoplasia. Outro termo usado como sinônimo de neoplasia é tumor, que é uma massa anormal de tecido, cujo crescimento é excessivo e não coordenado com aqueles dos tecidos normais. Esta proliferação persiste mesmo com a interrupção do estímulo que o originou. As neoplasias (câncer in situ e câncer invasivo), na prática, são denominadas tumores que podem ser benignas ou malignas (INCA, 2012; ROBBINS & COTTRAN, 2010).
As neoplasias benignas possuem um crescimento de forma organizada, lenta, expansiva e com limites nítidos. Apesar de dificilmente serem responsáveis por metástases, o seu crescimento pode comprimir órgãos e tecidos adjacentes. Porém, pode ser removido por cirurgia local e o paciente geralmente sobrevive. Exemplo de neoplasias benignas são os miomas, os lipomas e os adenomas. Já as neoplasias malignas, que são referidas como cânceres podem invadir e destruir estruturas adjacentes e se disseminar para sítios distantes (metástase). Também podem resistir ao tratamento e causar a morte do paciente. Entretanto, nem todos os cânceres seguem um cursor mortífero. Alguns são descobertos precocemente e são tratados com sucesso. (INCA, 2012; ROBBINS & COTTRAN, 2010 ). Atualmente, câncer é o nome geral dado a um conjunto de mais de 100 doenças (INCA, 2012)
Figura 2: Formação e tipos de câncer.
No estagio atual do conhecimento clinico não há meios para se estabelecer explicações das razões do desenvolvimento do câncer em um determinado grupo de pessoas e outros não. Existem determinados fatores de risco que, geralmente, influenciam na incidência de câncer. Contudo, não causam câncer de forma direta. De forma geral, a herança genética e fatores ambientais têm influência sobre o risco de desenvolver esta doença. Dentre os fatores ambientais, tem-se tabaco, álcool, radiação, toxinas relacionadas ao trabalho, infecções, má alimentação, falta de exercícios físicos e drogas (INCA, 2012; SO &BOZZONE , 2008). Em termos genéticos, o câncer pode ser hereditário ou esporádico (não-hereditário). As alterações genéticas apresentam papel decisivo no aparecimento de várias neoplasias humanas. Na maioria, essas alterações genéticas ocorrem em uma única célula somática, que então se divide e continua se desenvolvendo até formar um câncer. Mais raramente, quando a neoplasia maligna ocorre como parte de uma síndrome de câncer hereditário, as alterações iniciais são herdadas por meio de linhagem germinativa e, portanto, estão presentes em todas as células do organismo. Algumas características estão associadas ao câncer hereditário, como: idade precoce ao diagnóstico, mais de uma neoplasia em um mesmo indivíduo, vários membros de uma mesma família apresentando a mesma neoplasia ou neoplasias relacionadas e múltiplas gerações acometidas (ROBBINS & COTTRAN, 2010).
O envelhecimento é outro fator que está diretamente relacionado ao aumento da incidência de câncer. À medida que as células envelhecem, ocorre uma diminuição na capacidade de reparo às lesões sofridas pelo DNA, bem como dos mecanismos imunológicos responsáveis por impedir a replicações de células defeituosas. Dessa forma, verifica-se um aumento destas, favorecendo a proliferação de células pró-cancerígenas (ROBBINS & COTTRAN, 2010). A Figura 3 ilustra as principais causa de câncer.
Figura 3: Estatística sobre as principais causas de câncer.
Fonte: INCA, 1997(INCA, 2012)
O câncer pode surgir em qualquer parte do corpo. Alguns órgãos são mais afetados do que outros; e cada órgão, por sua vez, pode ser acometido por tipos diferenciados de tumor, mais ou menos agressivos (INCA,2012).
4.1.1Pele
A pele é o maior órgão do corpo humano cobrindo-o completamente, unindo todos os componentes deste de forma compacta, apresentando vários tons de cor. Trata-se de um órgão versátil, atuando sobre a proteção contra agentes físicos, químicos e patógenos (vírus, bactérias e fungos); a termorregulação; o metabolismo de nutrientes (vitamina D). Também apresenta funções neurossensoriais (SAMPAIO &RIVITTI, 2008).
A pele é composta por três grandes camadas de tecidos (Figura4): a mais externa delas, a epiderme, é uma camada translúcida que é visível e está em contato direto com o meio ambiente. Esta camada é formada principalmente por células epiteliais, as quais formam uma barreira intacta e impermeável. A camada intermediária, a derme, consiste de terminações nervosas, vasos sanguíneos, contendo óleo, glândulas sebáceas e folículos pilosos. Esta camada contém ainda as proteínas colágenas e elastina, que conferem a pele resistência e elasticidade, respectivamente. E a camada mais profunda,o tecido celular subcutâneo (hipoderme), é composta principalmente de células de gordura, contém as raízes de folículos capilares e vasos
sanguíneos, e também protege contra o frio e age como amortecedor de pressão ( SAMPAIO &RIVITTI, 2008; SO &BOZZONE , 2008).
Figura 4: Camadas da pele.
Fonte: ANATOMIA E FISIOLOGIA HUMANA, 2013.
Na epiderme existem vários tipos de células não epiteliais como os melanócitos. Estas células produzem o pigmento melanina, que é a substância que confere a cor da pele. Desta forma, as pessoas que são albinas, por produzirem pouca melanina, apresentam hipopigmentação da pele, cabelos e olhos A melanina é de extrema importância, pois, fornece proteção contra a radiação ultravioleta (SO &BOZZONE , 2008).
4.1.2 Câncer de pele: Melanoma
O câncer de pele é bastante frequente no Brasil e corresponde a 25% de todos os tumores malignos registrados no país. Dentre eles, tem-se o melanoma que apesar de representar apenas 4% das neoplasias malignas do órgão, torna-se importante o seu estudo, por ser o mais grave dos cânceres de pele devido, à sua alta possibilidade de metástase (INCA, 2012). O melanoma é uma neoplasia bastante incomum e quando não percebida no estágio inicial pode ser fatal. Esta neoplasia surge geralmente na pele, porém podem surgir na superfície da mucosa oral e anogenital, esôfago e olho. A principal causa de melanoma, em quatro dos cinco casos, é a exposição excessiva à radiação ultravioleta que afeta as células de pigmentação, os melanócitos, cuja função é
produzir o pigmento melanina (ROBBINS & COTTRAN, 2010; SO &BOZZONE , 2008).
Este tipo de câncer ocorre geralmente em pessoas de pele clara, sendo, dez vezes mais prevalente em caucasianos do que em afro-americanos, e possui variações entre populações caucasianas em relação à proximidade ao equador já que, nesta região a incidência de radiação é maior (RAYMOND &RUDDON, 2007). É um tipo câncer que evolui com o tempo, passando de lesões cutâneas para tumores agressivos, que sofrem metástase e são resistentes a terapias. É assintomático, embora o prurido (coceira) ou a dor possam manifestar-se precocemente. Em uma mesma lesão, geralmente, apresenta heterogeneidade na sua coloração(tons pretos, marrom vermelho, azul-escuro e cinza), no tamanho e na forma, e possui diâmetros maiores que 10 mm. A borda geralmente é irregular, não lisa, e esférica (ROBBINS & COTTRAN, 2010).
O crescimento do melanoma é dividido em duas fases: crescimento radial e crescimento vertical conforme ilustrado na Figura 5. Na primeira, ocorre um disseminação horizontal (Fase 1), localizada na epiderme e na derme superficial. Durante esta fase dificilmente ocorre metástase. Posteriormente, pode-se verificar a fase de crescimento vertical (Fase 2). Nesta, as células tumorais invadem as camadas dérmicas mais profundas. Esta fase esta frequentemente, marcada pelo o aparecimento de um nódulo. Além disso, está relacionada ao surgimento de células com potencial metastático (ROBBINS & COTTRAN, 2010).
Figura 5: Crescimento do Melanoma.
Fonte: Adaptação. (ROBBINS & COTTRAN, 2010; PORTAL DE SALUD COMUNIDADE DEL MADRID, 2013
Atualmente, as modalidades terapêuticas convencionalmente utilizadas no tratamento do melanoma abrangem a cirurgia, radioterapia e quimioterapia. Entretanto, esses métodos apresentam algumas desvantagens. Para a cirurgia pode surgir complicações pós-operatórias, que podem gerar sequelas físicas e funcionais e, em casos extremos, a morte. A radioterapia pode provocar muitos efeitos colaterais e aumentar a probabilidade de desenvolvimento de cânceres secundários. Já a quimioterapia afeta direta ou indiretamente as moléculas de DNA de células saudáveis em divisão, possui efeito tóxico sobre as células normais do organismo, apresenta baixa especificidade da droga ao sitio patológico e necessita de elevada dosagem para atingir concentração adequada no local desejado. Devido à toxicidade das drogas empregadas, o paciente apresenta diarreia, vômito, náuseas, perda de cabelo e comprometimento da imunidade. Dessa forma, o tratamento quimioterápico apresenta ainda muitas limitações para a curabilidade das neoplasias (CARNEIRO, 2007).
Apesar dos esforços consideráveis nas pesquisas oncológicas grande parte das terapias contra o câncer permanecem impróprias devido à elevada toxicidade geral dos agentes anticancerígenos e quimioresistência. O melanoma maligno é uma forma de câncer de pele muito agressivo que frequentemente torna-se resistente aos agentes quimioterápicos. Em virtude da baixa eficácia dos agentes empregados atualmente, torna-se primordial o desenvolvimento de novos agentes que não desencadeiem quimioresistência (CARNEIRO, 2007 MICHEL, 2012). Para resolver algumas destas questões substanciais, estudos promissores foram realizados no desenvolvimento de sistemas de liberação de drogas, no quais está bem estabelecido que o fornecimento de drogas específicas é mais eficaz e menos prejudicial do que a entrega sistemática convencional de drogas quimioterapêuticas (WADAJKAR,2012).
4.2 Sistemas de Liberação Controlada de Fármacos( SLC)
O desenvolvimento de novas tecnologias na modificação de liberação de fármacos, a partir de formas farmacêuticas sofreu um acréscimo notório nas últimas décadas na tentativa de maximizar suas vantagens com relação aos
métodos convencionais. Assim, a indústria farmacêutica tem investido fortemente no desenvolvimento de medicamentos de liberação controlada com a geração de novas patentes, o que do ponto de vista empresarial representa retorno financeiro a longo prazo ( HOLANDA, 2011; JAIN, 2008). Um sistema de liberação de Controlada (SLC) é definido como uma formulação ou um dispositivo que permite a introdução de uma substância terapêutica no corpo e melhora a sua eficácia e segurança através do controle da taxa, tempo e local de liberação de drogas no corpo (JAIN, 2008).
Ao comparar os SLC com os sistemas convencionais, observa-se na Figura 6, que a curva (a) referente aos métodos convencionais, está longe do ideal, proporcionando variações consideráveis na concentração do fármaco no plasma sanguíneo, podendo não havendo o efeito farmacológico ou ocasionar intoxicação, pois há uma faixa de concentração efetiva para a ação no organismo. Já o método de liberação controlada a curva (b) proporciona uma pequena variação na concentração do fármaco com o tempo, impossibilitando inefetividade ou toxicidade (HOLANDA, 2011).
Figura 6: Comparação ilustrativa das variações de concentração de fármacos: (a)
administrados por métodos convencionais de multidosagem;(b) sistema de liberação controlada.
Fonte: LYRA. et al, 2007
As principais vantagens ao desenvolver e utilizar os sistemas de liberação controlada são:
Manter nível terapêutico com baixa oscilação;
Impedir níveis tóxicos e efeitos colaterais locais e sistêmicos;
Evitar subníveis terapêuticos, aumentar concentrações plasmáticas de princípios ativos de meia-vida plasmática relativamente curta;
Maior segurança na utilização de alguns fármacos de elevada potência;
Maior comodidade pela diminuição do número de administrações diárias;
Facilita adesão do paciente ao tratamento, administração noturna pode ser evitada, efeitos indesejados reduzidos.
Estas vantagens são obtidas através de sistemas farmacêuticos tais como lipossomas, bombas osmóticas, revestimentos entéricos, sistemas transdérmicos, pró-fármacos, os sistemas matriciais poliméricos, entre outros (LOPES. LOBO & COSTA, 2005; LYRA. et al, 2007).
Para se obter um Sistema de liberação controlada ideal deve-se cumprir os seguintes requisitos ( JAIN, 2008):
Deve aumentar a biodisponibilidade do fármaco.
Deve proporcionar a entrega da droga de forma controlada.
Deve transportar a droga intacta para o sítio de ação, evitando alteração nos tecidos sadios do hospedeiro.
O dispositivo deve ser estável e, deve ser mantido sob as variáveis fisiológicas.
Um alto grau de dispersão do medicamento.
O mesmo método deverá ser aplicável em varias drogas.
Deve ser fácil de administrar aos pacientes.
Deve ser seguro e confiável.
Deve ser rentável.
A obtenção de um SLC é bastante difícil, pois o sistema deve transportar o fármaco para seu sítio de ação, tornando-o disponível na concentração eficaz, em um tempo apropriado, para uma duração de ação adequada. Para se obter tais requisitos são necessários conhecimentos e integrações de uma série de aspectos de natureza diversa, tais como: propriedades físico-químicas,
farmacocinéticas e farmacodinâmicas do fármaco; via de administração e as consequentes barreiras fisiológicas e bioquímicas impostas à absorção das propriedades físico-químicas, biocompatibilidade, comportamento in vivo fármaco; propriedades do material/materiais base do SLC, interações com o fármaco, etc; métodos e tecnologias envolvidas na produção do SLC. Estas várias vertentes envolvem o domínio de conhecimentos associados a áreas científicas como a medicina, farmácia, bioquímica, química, engenharia e outras, tornando-se uma área interdisciplinar (COIMBRA, 2010).
4.2.1 Classificação dos Sistemas de Liberação Controlada
Estes sistemas são frequentemente obtidos por materiais poliméricos, pela sua variedade, versatilidade e propriedades. Uma grande variedade de polímeros sintéticos, naturais ou semi-sintéticos, os quais podem ser hidrofílicos ou hidrofóbicos, biodegradáveis ou não. Os polímeros podem atuar como barreira realizando o controle da liberação da droga. E estes podem
existir na forma de microesferas, matrizes e membranas, podendo ser
administrados por via parenteral, oral, transdérmica, implante, dentre outros (COIMBRA, 2010; GOTHOSKAR, 2013; LEONG &LANGER, 1987).
Ao utilizar um material polimérico para a obtenção do SLC podem ser classificados como matriciais e podem ser divididos em: monolítico e reservatório.
O sistema monolítico é definido como um sistema que possui um ou mais agentes terapêuticos homogeneamente, dispersos ou dissolvidos, em uma matriz polimérica, onde a liberação do fármaco é controlada pela a difusão da matriz. Está matriz pode ser inerte, não intumescível ou totalmente intumescível, e não degradável (RATNER, 2004; LYRA. et al, 2007; PEZZINI; SILVA; FERRAZ, 2007). Já o sistema reservatório é composto por um núcleo de droga (sólido ou líquido) encapsulado ou adsorvido por uma membrana polimérica e a liberação é controlada através da difusão da droga pela membrana (RATNER, 2004; LEONG &LANGER, 1987).
Os SLC preparados a partir de materiais poliméricos podem apresentar um mecanismo/princípio de liberação do fármaco da seguinte forma: difusão
(a); ativados pelo solvente (b): osmose (i) e absorção de agua (ii); ação química (c): sistema de cadeias pendentes (iii) e sistemas biodegradáveis (iv)(COIMBRA, 2010).
Nos sistemas de difusão (a) a taxa de liberação da droga é determinada pela sua difusão através de um polímero (Figura 7). O comportamento de liberação por difusão é altamente dependente das propriedades físicas do fármaco na adição do nível de carregamento e tamanho de partícula dos solutos, solubilidade da droga no polímero e difusividade da droga no polímero, outros parâmetros importantes são: forma do dispositivo, área superficial e o comprimento do percurso de difusão (LEONG &LANGER, 1987).
Os SLC ativados pelo solvente (b) são divididos em dois tipos: sistemas de liberação controlados pela pressão osmótica (i) e sistemas controlados (ii) pela absorção de água (swelling) ( COIMBRA, 2010).
O SLC controlado pela pressão osmótica (i) consiste num reservatório de volume constante, constituído por um invólucro de uma membrana polimérica semi-permeável (permeável ao solvente mas não ao soluto), com um orifício, e com o interior cheio, com o fármaco no estado sólido e uma solução saturada de fármaco ( Figura 7). A pressão osmótica, formada devido à diferença de concentrações do fármaco no exterior e interior da membrana semi-permeável, origina um fluxo de fluido (água) do exterior para interior do dispositivo, forçando desta forma a solução saturada no interior a sair pelo orifício presente na membrana. Já nos dispositivos controlados pela absorção de água (ii) o fármaco encontra-se disperso ou dissolvido numa matriz polimérica constituída por um polímero hidrofílico reticulado (hidrogel). Estas matrizes têm a capacidade de absorver uma grande quantidade de água sem se dissolverem. Ao entrar em contato com a água ou com os fluidos biológicos a superfície da matriz, absorvem pequenas quantidades de água e a liberação do fármaco passa a ser controlado pela sua dissolução e difusão polimérica no meio aquoso interno, até o exterior da matriz (Figura 7). A alta viscosidade da dispersão polimérica nos poros reduz a velocidade no transporte do fármaco através da formação de uma camada de gel. Desta forma, a quantificação do grau de erosão da superfície da matriz intumescida ou a definição das taxas de absorção de água na interface entre o gel e o meio que o cerca podem ser
bastante importantes para determinação das taxas de liberação do fármaco (LEONG &LANGER, 1987; LYRA. et al, 2007;).
Na ação química (c), sistemas de cadeias pendentes (iii), as moléculas de fármaco encontram-se quimicamente ligadas à cadeia de polímero e estas ligações são quebradas por hidrólise ou por ação enzimática, originando assim a liberação do fármaco a uma taxa controlada. Nos sistemas biodegradáveis (iv), o fármaco é disperso ou dissolvido numa matriz polimérica biodegradável, sendo a taxa de liberação controlada pela desintegração da matriz, provocada pela biodegradação do polímero (LEONG &LANGER, 1987; PEZZINI; SILVA; FERRAZ, 2007; COIMBRA, 2010)
Figura 7: Mecanismos de liberação do fármaco em SLC.
Fonte: Adaptado. (LYRA et al,2007; PEZZINI; SILVA; FERRAZ, 2007)
Na prática, alguns SLC não encaixam perfeitamente em nenhuma destas três categorias, pois em muitos casos não existe um mecanismo dominante responsável pela liberação do fármaco, sendo esta determinada por uma combinação dos vários mecanismos possíveis envolvendo processos de
intumescimento do polímero, difusão do fármaco e erosão da matriz. Tem-se como exemplo alguns sistemas matriciais biodegradáveis em que a liberação do fármaco é controlada tanto pela difusão do fármaco como pela biodegradação do polímero ou, em alguns hidrogéis, em que a liberação do fármaco é determinada tanto pela taxa de absorção de água como pela taxa de difusão do polímero através da matriz intumescida pelo solvente (COIMBRA, 2010; PEZZINI; SILVA; FERRAZ, 2007).
Portanto, têm-se desenvolvido modelos matemáticos que contribuí para determinar o tipo de mecanismo de liberação predominante a cinética de liberação do fármaco. Esses modelos também podem contribuir na descrição de equações de dissolução de fármacos, além de explicar a resistência da liberação do fármaco na presença da barreira de gel formada em torno da matriz. Existem atualmente diversos modelos matemáticos aplicados ao controle dos sistemas matriciais de liberação controlada de fármacos, alguns destes estão demonstrados na Tabela 1( LYRA et al, 2007; LOPES, 2005)
Tabela 1: Modelos Matemáticos.
Fonte: LYRA et al, 2007.
Para as matrizes poliméricas de acordo com os critérios para cinética de liberação de solutos a partir de sistemas intumescíveis, o coeficiente difusional
depende da geometria da partícula e fornece informações sobre o mecanismo de liberação. Para sistemas com geometria esférica, um valor de coeficiente difusional n <0,43, indica que o mecanismo de liberação observado é o de difusão do soluto através de camadas da matriz, também conhecido como mecanismo de liberação Fickiano ou “Caso I”. Um valor de n = 0,85 indica que a liberação do soluto é controlada apenas pelo intumescimento/relaxação da cadeia polimérica, isto é, independente do tempo, mecanismo este, também conhecido como “Caso II” de transporte. Quando 0,43 < n < 0,85, obtém-se um transporte não-Fickiano ou anômalo, onde ocorre a superposição dos dois fenômenos, sendo que a liberação é controlada pela difusão e intumescimento, simultaneamente. Para valores de n > 0,85 têm-se um Super Caso II de transporte, no qual ocorre a contribuição simultânea de processos como difusão, intumescimento, relaxação e erosão da matriz polimérica (LOPES, 2005; PARIZE, 2009, COIMBRA, 2010).
Tabela 2: Expoente difusional e mecanismo de liberação para sistemas de liberação
controlada.
Fonte:PARIZE, 2009
Dentre os polímeros utilizados na confecção de SLC, os biopolímeros estão sendo bastante utilizados na indústria farmacêutica por sua versatilidade e por possuírem a capacidade de liberar a droga efetivamente no alvo desejado, potencializando os benefícios terapêuticos do tratamento. Entre os polímeros naturais os polissacarídeos e seus derivados estão sendo largamente utilizados em formas farmacêuticas, devido à baixa toxicidade, baixo custo e disponibilidade. Aliado a isto, a biodegradabilidade, as
características filmogênicas e a facilidade de derivatização têm constituído um elemento de elevado interesse e destaque nas investigações voltadas para os sistemas farmacêuticos ( HOLANDA, 2011).Portanto, nos últimos vintes anos, a quitosana é um dos polímeros orgânicos mais estudados para aplicação em liberação controlada de fármacos (BERNKOP-SCHNÜRCH & DÜNNHAUPT, 2012).
4.3 Biopolímeros: Quitosana
Vários trabalhos, recentes, têm enfatizado o desenvolvimento de um sistema terapêutico multifuncional para o câncer com capacidades de diagnóstico e de tratamento por incorporação de vários polímeros, materiais orgânicos e inorgânicos (WADAJKAR,2012). A quitosana tem sido bastante estudada nos campos da medicina e da farmácia por ser um copolímero não tóxico, biocompatível e biodegradável. É reconhecida por células tumorais (KUMAR et al., 2004) , além de exibir comportamento biológico favorável, tais como bioadesão, permeabilidade, mucoadesividade. Apresentam características fisico-químicas interessantes, onde a quitosana possui grupos funcionais potencialmente reativos como grupamentos amina (-NH2). Além disso, é amplamente aplicada na área farmacêutica, pois podem ser empregados na forma de implantes, esponjas, filmes, grânulos, xerogéis, micro e nanopartículas o que o tornam um material único para design de sistemas de liberação de fármaco. (CAMPANA FILHO, 2007; LI, 2008; VIVEK, 2009; MOHAMMADPOUR,2012; HOLANDA, 2011)
Além das propriedades apresentadas acima, este biopolímero possui atividade antimicrobiana, analgésica, coagulante e cicatrização, o que potencializa a utilização em diversas áreas tais como: indústria de cosméticos, agricultura, indústria de alimentos e na medicina ( HOLANDA, 2011; FIDELES, 2010).
A quitosana é um copolímero semicristalino, formado a partir de unidades de 2-desoxi-N-acetil-D-glucosamina e 2-desoxi-D-glucosamina ligadas por meio de glicosídeo β (1 → 4) ( Figura 8), o qual é obtido a partir da hidólise alcalina da quitina, que é extraída através da casca do camarão, do caranguejo e da parede celular de leveduras. A quitosana comercial contém
cerca de 10-30% de unidades 2-acetamido-2-desoxi-Dglicopiranose (CAMPANA FILHO, 2007; WANG, 2011).
Figura 8: Estrutura química da quitosana.
Fonte: Adaptado (FIDELES, 2010)
A quitosana é um polímero insolúvel em água e solúvel em ácidos orgânicos fracos, sendo os mais usados: ácidos acético e ácido fórmico. Devido a quitosana ser um polímero que em condições de pH neutro e alcalino apresenta, agrupamentos amino livres. Já em pH ácido (pH <6 ) os grupamentos amino são protonados (NH3+), tornando o polissacarídeo solúvel. Portanto, quitosana pode formar complexos eletrostáticos com espécies carregadas negativamente incluindo proteínas, polímeros, fármacos e outros ânions de baixa massa molar (CAMPANA FILHO, 2007; WANG, 2011).
A quitosana apresenta grupos funcionais potencialmente reativos como grupamentos amina (-NH2), vários grupos hidroxilas primários e secundários nas posições C-3 e C-6 que (Figura 8), por sua vez, apresentam forte afinidade com a água. Modificações feitas nestes grupamentos produzem diferentes materiais que podem ser utilizados em diversas aplicações (HOLANDA, 2011).
Outra propriedade que a quitosana possui é a biodegradabilidade. Ela pode ser degradada de duas formas: quando submetida a uma temperatura (i) de 60°C, já que os átomos de hidrogênio na molécula do polímero diminuem a energia entre a ligação C-C favorecendo a hidrólise. A outra forma, é por catálise enzimática, (ii) através da lisozima, que está presente em tecidos, órgãos e fluidos corporais de mamíferos. Os produtos de degradação da quitosana são oligômeros de n-acetil-D-glicosamina os quais são totalmente absorvidos pelo organismo, e não são tóxicos(CAMPANA FILHO, 2007;
HOLANDA, 2011).A biodegradação da quitosana pode ser influenciada pelo: grau de desacetilação, peso molecular, grau de cristalinidade e também pela a forma e estado da superfície do material ( FIDELES, 2010; WANG, 2011).
Estudos recentes revelam que nanopartículas de quitosana são capazes conduzir o DNA no interior de células humanas com resultados muito encorajadores no controle e na diminuição do crescimento desregulado de células cancerígenas (GASPAR et al., 2011). Adicionalmente, estudos in vitro e in vivo demonstram atividade anti-tumoral, atuando diretamente sobre as células tumorais e interferindo no metabolismo, inibindo o crescimento das células, e induzir a apoptose celular (WANG et al., 2011)
Um exemplo do uso da quitosana em estudos para o tratamento do câncer é através da droga doxorrubicina e seus derivados bioativos. A eficácia deste último é limitada devido à toxicidade do fármaco. Portanto, uma maneira de solucionar este problema foi produzir nanoparticulas de quitosana como um sistema de liberação controlada desse fármaco. De fato, estudos realizados com nanopartículas de quitosana mostram que a complexação do doxorrubicina com quitosana é possível e adequada para o tratamento de tumores cancerígenos (CAMPANA FILHO, 2007).
Outra forma de utilizar a quitosana é a produção de filmes onde a liberação do fármaco acontece por via transdérmica. A liberação ocorre a partir da matriz polimérica de forma contínua, sem atingir níveis tóxicos no organismo e danificar as células da membrana epitelial (MOURA, 2012). A administração por via transdérmica do cloritrado oxprenolola β-bloqueador a partir de filmes de quitosana em ratos, mostrou um efeito sistêmico, reduzindo a pressão arterial. Portanto, a eficácia farmacológica da droga não é modificada pela forma de liberação, facilitando a administração transdérmica de medicamentos para o efeito sistêmico. A quitosana pode ser utilizada por apresentar uma capacidade de auxiliar a permeação de várias drogas em toda a pele excisadas, através do aumento da permeabilidade do estrato córneo, possivelmente por oclusão. Este novo modelo pode fornecer uma nova direção de investigação do uso da quitosana na obtenção de sistemas de liberação de entrega de drogas administrado por via transdermica (KUMAR, 2004).
Portanto, baseado nos casos de sucesso citados acima, inúmeras substâncias terapêuticas têm sido estudadas para este fim. Dentre elas, a curcumina.
4.4Curcumina
A curcumina tem sido investigada devido à sua capacidade de matar seletivamente células transformadas em quase todos os tipos de tumores, bem como por apresentar características antioxidante, inflamatória, anti-proliferativa, anti-metastática, antiangiogênica, antidiabética, antitrombótica, anti-aterosclerótica, antiartritica e hepatoprotetora, por uso de anti-séptico e cicatrizante(SRIVASTAVA,2011, MOHAMMADPOUR, 2012).
Estudos recentes têm mostrado que a curcumina, de forma isolada, como em combinação com outros agentes, tem potentes efeitos anticancerígenos. Estudos in vivo e in vitro, demonstraram que a curcumina é capaz de inibir a carcinogênese em três estágios: a promoção do tumor, angiogênese e o crescimento tumoral. Isto foi evidenciado por seus efeitos inibitórios em o crescimento de um número de linhas de células tumorais in vitro e in vivo, incluindo melanoma, linfomas, hepáticas, próstata, ovário e pancreático (MAHESHWARI, 2006; DUAN, et al, 2010). Esta substância é excelente para o tratamento de câncer, pois apresenta propriedades pleiotrópicas, as quais permitem atuar no genoma (DNA), RNA mensageiros e enzimas (proteínas) dentro das células. As ações podem ser sequenciais ou simultâneas. Especificamente, ao contrário de outros agentes quimioterapêuticos, a curcumina exibe propriedades pleiotrópicas que inibe o fator nuclear kappaB (NF-kB). O fator nuclear kaapB é sensibilizado e/ou inativado processos de células tumorais (YALLAPU; JAGGI; CHAUHAN, 2012; ZANOTTO FILHO, 2012).
Esta substância (Figura 9), [1,7-bis (4-hidroxi-3-metoxifenil) -1, 6-heptadieno-3, 5-diona], com formula química C21H20O6, é um polifenol hidrofóbico que exibe tautomerismo na ligação ceto-enólico, tendo predominância em soluções ácidas e neutras forma cetona e, em meio alcalino forma de enol (ANAND, 2008). A curcumina é derivada dos rizomas de cúrcuma (Curcuma longa Linn) e do açafrão, possui baixo peso molecular
(368.37g/mol), ponto de fusão variando entre 170°C – 183°C (VIVEK, 2009;
SRIVASTAVA, 2011,PARIZE et al, 2012; BUZANELLO, 2013,CURR PROBL CANCER, 2013).
Figura 9: Estrutura química da curcumina longa.
Fonte: SRIVASTAVA, 2011.
Além da curcumina, outros componentes podem ser encontrados nos rizomas da Curcuma Longa L, dentre eles destacam-se a demetoxicurcumina e a bis-demetoxicurcumina (Figura 10). Logo a curcumina comercial é uma mistura de curcuminóides, contendo aproximadamente 77% curcumina, 18% demetoxicurcumina, e 5% bis-demetoxicurcumina (PARIZE, 2009; ANAND, 2008, CURR PROBL CANCER, 2013).
Figura 10: Constituintes do corante cúrcuma.
Fonte: AKHTAR; RIZ.M.; KAR, 2012
Esta substância é insolúvel em água e soluções aquosas ácidas. No entanto, tem boa solubilidade em meio básico e em solventes como etanol, acetona, dimetilsulfóxido e clorofórmio. A solubilidade da curcumina pode ser
aumentada através de modificações químicas ou derivatização, tais como complexação ou interação com macromoléculas, surfactantes e a utilização de copolímeros. (PARIZE et al, 2012). Possui estabilidade em pH inferior a 6,5, mas em pH alcalino pode ser degradada. A decomposição depende do pH, com reações mais rápidas de pH neutro e básico. Ela também pode ser degradada por hidrólise ácida, oxidação e fotodegradação (BUZANELLO, 2013). Logo, vários estudos relatam o efeito da exposição à luz e das condições alcalinas na degradação do corante. A Figura 10 ilustra os principais componentes resultantes da degradação da curcumina. O primeiro composto (trans-6-(4‟-hidroxi-3‟-metoxifenil)-4- dioxo-5-hexenal), formado na degradação, forma rapidamente os outros compostos citados. Na maioria dos estudos, encontram-se como principais produtos da degradação a vanilina, o ácido ferúlico, o aldeído ferúlico e o ácido vanílico. Desta forma, torna-se viável estudar métodos alternativos que viabilizem e tornem possível aumentar a solubilidade, a estabilidade e biodisponibilidade da curcumina e que possam ser aplicados em preparações farmacêuticas (PARIZE, 2009).
Figura 11: Principais produtos gerados a partir da degradação da Curcumina.
Fonte: PARIZE, 2009.
Diversos estudos têm demonstrado que a curcumina apresenta baixa absorção, com elevada taxa de metabolismo e eliminação, resultando em baixa biodisponibilidade quando administrado por via oral. Entretanto, têm-se
estudados alternativas para melhorar a biodisponibilidade utilizando outras substancias terapêutica, como por exemplo, a piperina, ou proteger a curcumina da degradação e do metabolismo, até atingir o tumor. Vários tipos de nanopartículas tais como polímero, micelas polimericas, lipossomas / fosfolípido, nano/microemulsões, nanogéis, entre outros (YALLAPU; JAGGI; CHAUHAN, 2012).
Pesquisas realizadas por ODOT e colaboradores ( 2004), avaliaram in vitro a ação citotoxica da curcumina sob o melanoma B16-R. Os resultados obtidos indicam uma inibição substancial do crescimento de melanoma B16 –R.
A curcumina mostra uma elevada atividade citotóxica in vitro e são candidatos potenciais para o tratamento de melanoma. Michel e colaboradores (2012), utilizando-se da baixa solubilidade da curcumina, desenvolveram um agente de entrega (surfactante catiônica gemini conjugada com β-ciclodexitrina) incorporado com curcumina para avaliar a eficiência de entrega da droga, o efeito citotóxico nas células de melanoma e comparando este efeito com o melfalan, é atualmente usado no tratamento deste câncer. As formulações usadas foram eficientes na inibição do crescimento de células de melanoma, apresentando resultados melhores que o melfalan.
Outro estudo realizado por Wadajkar e colaboradores (2012) utilizou o poli (N- isopropilacrilamida -acrilamida - alilamina ) e um núcleo de poli (ácido láctico-co - glicólico ( PLGA ) carreado com curcumina, incorporado com nanopartículas de magnetita para atingir as células cancerosas de melanoma, foram realizados teste in vitro e in vivo. Os resultados obtidos não apresentaram citotoxicidade para os fibroblastos dérmicos humanos. Além disso, apresentou uma liberação sustentada da curcumina a partir do núcleo de PLGA. As nanopartículas foram acumuladas no local do tumor de melanoma B16F10 no grupo de ratos estudados. Os resultados indicam um grande potencial para tratar e monitorar melanoma.
4.5 Quitosana/Curcumina
Devido à baixa disponibilidade e estabilidade da curcumina, vêm- se pesquisando sobre as propriedades da quitosana em busca de melhorar as deficiências do fármaco. Portanto, estudos apresentaram que nanopartículas
de quitosana/curcumina não degradam rapidamente e apresentam uma melhor absorção quando comparadas com a curcumina livre (AKHTA; RIZ & KAR, 2012). Logo, a interação entre a quitosana/curcumina se dá através de forças eletrostáticas, a partir das quais o grupo hidroxiloglicosamina da quitosana pode atrair o grupo neutro ceto-enol da curcumina podendo haver formação de ligações intermolecular de pontes de hidrogênio(BORUAH, SAIKIA & DUTTA, 2012). Segundo Akhta e colaboradores (2012) esta interação depende da faixa de pH. Logo, a maior interação entre a quitosana/curcumina ocorre em pH 4.0.
Estudos realizados por Boruah e colaboradores (2012) avaliaram a extensão da ligação da curcumina com a quitosana na ausência e na presença de surfactantes catiônico e não iônico, acompanhando as mudanças na absorção e fluorescência da curcumina em pH fisiológico com diferentes concentrações de quitosana. Os resultados obtidos indicam claramente que a curcumina interage fortemente com quitosana em pH fisiológico e esta interação aumenta com a presença dos surfactantes, e que a quitosana apresenta capacidade de suprimir a degradação hidrolítica da curcumina. Por fim, os estudos termodinâmicos revelam que o processo de ligação é acionada por entalpia e entropia indicando tanto, a formação da ligação eletrostática curcumina e quitosana.
A quitosana, além de melhorar a estabilidade e a biodisponibilidade da curcumina, também pode ser utilizada para desenvolver sistemas de liberação controlada para o tratamento de câncer. Conforme estudos realizados por Rejinolde e colaboradores (2011), utilizando nanoestruturas de curcumina termosensíveis, altamente estáveis com quitosana-g-PNVCL e estabilizantes químicos, os quais avaliaram a toxicidade in vitro, e a viabilidade de células normais e de câncer de mama humano (MCF7), observaram que a curcumina modificada quimicamente com o tripolifosfato de sódio pode ser mais benéfica para o tratamento do câncer.
Outro estudo realizado por Duan e colaboradoes (2010), utilizaram nanopartículas de poli (butil) cianoacrilato revestidas com quitosana e encapsulado com curcumina com o intuito de investigar a atividade antitumoral das nanoparticulas in vitro e in vivo em células de câncer hepatocelular humano. Os resultados do teste in vitro indicaram que as nanoparticulas
apresentaram uma ação terapêutica eficaz e no teste in vivo a presença das nanoparticulas inibiu o crescimento do tumor. Desta forma, há potencialidade para o tratamento deste tipo de câncer.
Pesquisas mostram que derivados de quitosana também podem ser utilizados como carreadores da curcumina como, por exemplo, o-carboximetilquitosano. Estudos de citotoxicidade por MTT indicaram que curcumina -O- CMC Nps apresentou toxicidade para o câncer e não tóxico para as células normais e a liberação do fármaco in vitro foi eficaz, logo apresenta potencial para a liberação controlada de drogas (ANITHA, 2011).
No estado da arte atual, não foram encontradas pesquisas que apresentem perspectivas de se obter um material que possa promover a liberação da curcumina em membranas de quitosana para tratamento de melanoma.
5. MATERIAIS E MÉTODOS 5.1 Local da Pesquisa
A pesquisa foi realizada no Laboratório de Avaliação e Desenvolvimento de Biomateriais do Nordeste – CERTBIO, localizado na Unidade Acadêmica de Engenharia de Materiais, na Universidade Federal de Campina Grande/ UFCG na Avenida Aprígio Veloso, 882, Bairro Universitário, Campina Grande - PB.
5.2Reagentes e Materiais
Quitosana, médio peso molecular com grau de desacetilação 75 – 85%,Sigma Aldrich
Ácido Acético, Sigma Aldrich
Curcumina Longa, Sigma Aldrich
Etanol, VETC
5.3 Procedimentos experimentais
5.3.1 Preparação das membranas de quitosana
As membranas de quitosana foram preparadas através da técnica de evaporação de solvente mediante a diluição do polímero em pó, em uma solução aquosa de ácido acético (1% v/v) sob temperatura ambiente e agitação mecânica, obtendo uma solução de quitosana a 2 % m/v. A partir da solução obtida foram vertidas 20mL em cada placa petri de dimensões (60x15 mm) e posteriormente colocadas sob circulação de ar por um período de, aproximadamente, 24 horas para secagem e, em seguida o material passou para a caracterização.
Figura 12: Etapas de obtenção da membrana de quitosana.
Fonte: Própria
5.3.2 Preparação das membranas de quitosana/curcumina
Após a diluição do pó da quitosana em uma solução aquosa de ácido acético sob temperatura ambiente e agitação mecânica foi preparada a dissolução da curcumina em etanol (1,2mg/ml). Após a dissolução total da droga foi vertida na solução de quitosana sob agitação mecânica constante por 30 minutos. A partir da solução obtida foram vertidas 20mL em cada placa petri de dimensões (60x15 mm) e posteriormente colocadas sob circulação de ar por um período de, aproximadamente, 24 horas para secagem e, em seguida o material passou para a caracterização.
Figura 13: Etapa de obtenção da membrana de quitosana/curcumina .
5.4 Caracterizações das membranas
Os ensaios para caracterização das membranas de quitosana e quitosana/curcumina foram realizados no Laboratório de Avaliação e Desenvolvimento de Biomateriais do Nordeste- CERTBIO localizado na Universidade Federal de Campina Grande-UFCG.
5.4.1 Caracterização Parcial
5.4.1.1Espectroscopia na Região do Infravermelho por Transformada de Fourier - (FTIR)
A caracterização por FTIR foi usada para identificar os grupos funcionais presentes no fármaco, na membrana de quitosana, e na membrana de quitosana/curcumina, através das vibrações características dos grupos presentes em cada material, que correspondem aos níveis de energia da molécula. E avaliar as possíveis interações entre a quitosana e o fármaco. Utilizou-se um espectrofotômetro Spectrum 400, FT-IR/ FT-NIR Spectrometer Perkin Elmer (CERTBIO/UFCG, com resolução de 4 cm-1 e 20 varreduras, e com varredura de 4000 a 650 cm-1, sem a necessidade de preparação de pastilhas de KBr, por via da utilização do dispositivo ATR (atenuatted total reflectance)
5.4.1.1.2 Difração de Raios X - (DRX)
A caracterização por Difração de Raios X foi realizada a fim de observar o perfil cristalino da membrana de quitosana, fármaco e da membrana de quitosana/curcumina para observar se haveria interferências nesse perfil com a incorporação da droga. As amostras foram submetidas à análise por difração de raios X (DRX) em um difratômetro SHIMADZU modelo XRD
7000(CERTBIO/UFCG) com varredura angular 5º<2θ<80º, na montagem de
Bragg-Brentano, sistema θ-2θ, utilizando-se radiação de Cu (λ =1,54) com varredura no passo de 0,02 (2θ), com intervalo de 0,5 segundo para cada amostra.
5.4.1.1.3 Microscopia Eletrônica de Varredura – MEV
A Microscopia Eletrônica de Varredura foi utilizada para estudar a microestrutura e morfologia dos materiais sólidos. Está técnica foi usada para conhecer o tamanho e a forma da partícula do fármaco estudado e para observar se nas membranas existe presença de micro-macroporos, como o fármaco está distribuído na membrana, topografia e tamanho de partículas.
Para realizar o ensaio da secção transversal das membranas inicialmente passaram pela etapa de congelamento em nitrogênio líquido e posteriormente realizou-se a fratura das mesmas, em seguida foram feitas a analise.
As membranas foram caracterizadas morfologicamente por Microscopia Eletrônica de Varredura, utilizando um microscópio eletrônico de bancada, modelo TM 1000 HITACHI (CERTBIO/UFCG).
5.4.1.1.4 Termogravimetria ( TG)
O ensaio de TG foi realizado para observar a perda de massa dentro de uma faixa de temperatura. As curvas termogravimétricas (TG) das membranas
e do pó da curcumina foram obtidas em um módulo termogravimétrico TG
modelo Q600 (TA - Instruments), com uma faixa de temperatura de 10 a 800 ºC, com uma razão de aquecimento de 10 ºC/min, em atmosfera de nitrogênio, com fluxo de 20 mL/min. Foi utilizado massa de 5,00 ± 0,05 mg acondicionada em cadinho de alumina para cada amostra. A calibração do SDT TG/DTA Q600 foi realizada com padrão de oxalato de cálcio. As curvas TG foram analisadas pelo programa TA Instruments Universal Analysis 2000, versão 4.7A, da TA Instruments, a fim de caracterizar as transições de fase, etapas de decomposição e perda de massa das mesmas.
5.4.1.1.5 Análise de Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)
A análise de Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) foi realizada a fim de observar as transições de fase, avaliar se existem mudanças nas propriedades da membrana de quitosana e se há interações químicas entre a quitosana e a curcumina. As análises por DSC das membranas e do pó da curcumina, foram realizadas em um equipamento DSC PerkinElmer modelo
