Caracterização molecular de isolados de Aschersonia spp. associados a Mosca Negra dos Citros

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Caracterização molecular de isolados de Aschersonia spp. associados

a Mosca Negra dos Citros

Bárbara Mota de Alcântara (PIBIC/FAPITEC), e-mail: islandiamegg@gmail.com;

Iedo Silva da Cruz (PROSUP/CAPES), e-mail: iedo_cruz@hotmail.com; Marcelo

da Costa Mendonça (Orientador), e-mail:

marcelo.mendonca@colaborador.embrapa.br

Universidade Tiradentes/Ciências Biológicas/Aracaju, SE. (Embrapa-

Laboratório de Entomologia e Fitossanidade), Aracaju, SE.

00.00.00-4 - Ciências Agrárias 5.01.02.00-1- Fitossanidade

Pesquisa executada com recursos da FAPITEC

RESUMO: A citricultura vem sofrendo danos

causados pela Aleurocanthus woglumi (Ashby,1915) (Hemiptera: Aleyrodidae), conhecida como mosca negra dos citros, um inseto picador-sugador que ao se alimentar, debilitam suas plantas hospedeiras, causando murchamente e até a morte destas. O controle biológico, vem adotando a utilização de fungos entomopatogênicos como uma alternativa ao controle químico, visando reduzir os danos ao meio ambiente. Fungos do gênero Aschersonia são conhecidos por causar mortalidade em insetos da família Aleyrodidae, no entanto, são poucos os estudos das espécies que ocorrem sobre estes insetos no Brasil. Técnicas moleculares baseadas no uso de genes das regiões conservadas LSU do rDNA (Large subunit ribossomal) são importantes ferramentas na análise da diversidade genética, podendo esta ser adotada para o gênero Aschersonia. Este trabalho teve por objetivo caracterizar a variabilidade genética de isolados de Aschersonia spp., utilizando-se de técnicas moleculares na seleção de linhagens com potencial controle de A. woglumi. O fungo foi coletado em pomares cítricos de Sergipe, com posterior isolamento e armazenamento em condições controladas. As colônias foram inoculadas em placas de Petri (90x15mm) com meio BDA (Batata Dextrose Ágar) e incubadas por 15 dias, obtendo-se 10 isolados do fungo. Para a extração do DNA, micélios do fungo foram utilizados para obtenção de DNA genômico. Primers foram desenhados para a amplificação dos produtos da PCR para obtenção do perfil de bandas para uso em analises de sequenciamento. Os dados obtidos mostram que o método adotado foi eficiente para o desenvolvimento da pesquisa.

Palavras-chave:

Aschersonia spp., diversidade,

LSU rDNA.

INTRODUÇÃO

O Brasil é líder mundial na produção de citros e exportação de suco de laranja, apresenta uma área plantada do fruto de 770.138 hectares e produção superior a 16 milhões de toneladas de laranja, exibindo o estado de São Paulo como o maior produtor do fruto. A região nordeste por sua vez, detém cerca de 9,6% da produção nacional, com 1.556.592 toneladas de laranja produzida (IBGE, 2016), sendo os estados da Bahia e Sergipe os principais produtores da região. Em Sergipe, a citricultura é considerada uma das principais atividades agrícolas, sendo o suco de laranja o principal produto exportado. As plantações de citros, como toda grande cultura, estão suscetíveis à ocorrência de pragas, que afetam seu desenvolvimento e, consequentemente, a qualidade dos frutos e a produtividade dos principais polos citrícolas do país (NEVES et al., 2011;).

O controle biológico se destaca como um dos mais eficientes para combater a mosca negra dos citros, tem como base a utilização de inimigos naturais da praga que podem ser descritos como predadores, parasitas e microrganismos entomopatógenos. O controle microbiano representa um ramo do controle biológico de insetos e trata da utilização racional de patógenos com o objetivo de manter populações de insetos-praga a níveis não econômicos (ALVES, 1998). Inseticidas microbianos são especialmente valiosos porque sua toxicidade para animais não alvos e seres humanos é extremamente baixa, sendo seguros tanto para o aplicador quanto para consumidores das culturas tratadas (PENA et al., 2009).

Pesquisas que envolvem a variabilidade molecular e filogenia entre as espécies de Aschersonia utilizam técnicas de Subunidade ribossomal (LSU) nuclear de rDNA para verificação

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Anais 2016: 18ª Semana de Pesquisa da Universidade Tiradentes. “A prática interdisciplinar alimentado a Ciência”. 24 a 28 de outubro de 2016.

ISSN: 1807-2518

exata das relações genéticas interligando a morfologia das espécies com estes marcadores (JUN-ZHI et al, 2005). Sendo assim este trabalho teve por objetivo caracterizar e selecionar diferentes isolados de Aschersonia spp., provenientes de pomares comerciais de laranja localizados no Polo Citrícola Sergipano, por meio de técnicas moleculares.

MATERIAL E MÉTODOS Origem e isolamento do fungo

O fungo foi obtido por meio de coleta de campo, de folhas de Citrus sinensis provenientes dos municípios de Arauá, Boquim, Cristinápolis, Itabaianinha, Lagarto, Santa Luzia do Itanhy, Umbaúba, Pedrinhas e Salgado esses municípios são responsáveis por produzirem Lima-ácida (Citrus aurantifolia Swingle), Tangerina (Citrus reticulata Blanco) e o principal produto produzido é a Laranja (Citrus sinensis L.). Os trabalhos foram realizados nos laboratórios de Fitossanidade e laboratório de Biologia molecular da Embrapa Tabuleiros Costeiros, em que se extraíram as colônias de fungos das folhas e passaram por um processo de higienização. Após a limpeza, fragmentos do fungo foram inoculados em placas de Petri (90 x 15 mm), contendo meio de cultura do tipo BDA (Batata Dextrose Ágar), sendo incubadas em câmara do tipo BOD (Demanda Bioquímica de Oxigênio) por 15 dias.

Extração de DNA genômico

Para a extração de DNA genômico, micélios do fungo foram obtidos através do crescimento das colônias em meio de cultura do tipo BDA (26 ± 1°C, 12/12 horas de foto período) em câmara BOD por um período de 15 dias. Posteriormente, o fungo foi extraído do meio de cultura com o auxílio de espátulas esterilizadas e transferidas para micro tubos, sendo as amostras maceradas em nitrogênio líquido com auxílio de bastão de vidro para obtenção de um pó do fungo de cada isolado e posterior processamento com uso de kit de extração para solo FastDNA® SPIN adaptado, sendo os produtos testados quanto qualidade de extração por meio de eletroforese em gel de agarose a 0,8%.

Amplificação por PCR da sequência LSU do rDNA

Os Primers foram desenhados com uso de ferramenta de bioinformática e desenvolvidos pela empresa Exxtend - Solução em Oligos (Campinas/SP). Para a realização da reação foram utilizados os primers LSA F (5'

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PCR (reação em cadeia da polimerase) em termociclador, sendo a reação constituída por um volume de 25 µl. Os produtos gerados foram amplificados por meio de eletroforese em gel de agarose a 1%, sendo as bandas geradas analisadas.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os dados obtidos com a amplificação das amostras fazem parte dos resultados preliminares para analise em sequenciamento. A constatação de divergências genéticas entre os isolados testados terá por finalidade a seleção de linhagens que serão avaliadas em bioensaios posteriores para avaliação de parâmetros biológicos de Aschersonia spp. A extração de DNA feita com o uso do Kit FastDNA® SPIN adaptado obteve bons resultados, sendo o método de extração apropriado para essa pesquisa (Figura 1). O mesmo é observado para os produtos da PCR avaliados em três dos isolados do fungo apresentando bandas na faixa esperada pela amplificação dos primers com cerca de 494 pb (Figura 2).

CONCLUSÃO

No presente trabalho, observou-se que o gene 28S do rDNA obteve resultados satisfatórios em sua amplificação, obtendo o número esperado de bases, obtido por meio de desenho dos primers (494 pb). Três das dez amostras foram testadas e obtiveram similaridades em seus perfis de banda, comprovando a eficiência dos primers utilizados.

REFERÊNCIAS

ALVES, S. B. FUNGOS ENTOMOPATOGÊNICOS. 1998. IN:

ALVES, S.B. (ED.). CONTROLE MICROBIANO DE INSETOS.

PIRACICABA: FEALQ, P. 289-381, 1998.

IBGE. Sistema IBGE de Recuperação Automática: Levantamento sistemático da produção agrícola - SIDRA. Disponível:<http:// www.sidra.gov.br >. Acesso em: 17 jan. 2016.

JUN-ZHI, Q.; ZHI-PENG, H.; JIE-RU, P.; XUE-QIN, X.; YAN-PING, Z.; FANG, F.; SHENG, S.; XIONG, G. RAPD

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ISSN: 1807-2518

and large subunit nuclear rDNA sequence analyses of the entomogenous fungus Aschersonia.Chinese Journal of Agricultural Biotechnology,v.2005,p.85-90,2005.

MARTINS, M. K.; Variabilidade genética de isolados de

Fusarium spp. e estudo da interação com a planta

hospedeira. Tese de Doutorado. Universidade de São Paulo, 2005.

NEVES, M. F; TROMBIN, V. G.; MILAN, P.; LOPES, F. F.; CRESSONI, F.; KALAKI, R. O Retrato da Citricultura Brasileira. Ribeirão Preto: Markestrat, p. 12-13, 2011. PENA, M. R. Biologia da mosca-negra-dos-citros,

Aleurocanthus woglumi Ashby 1915 (Hemiptera: Aleyrodidae) em três plantas hospedeiras e uso do fungo

Aschersonia sp., como agente entomopatogênico. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal do

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Figura 01 – Amplificação de DNA genômico pós extração de isolados de Aschersonia spp. em Gel de

agarose 0,8%.

Figura 02 – Amplificação de bandas dos produtos da PCR de 3 isolados de Aschersonia spp. em Gel de agarose 1,0%.