Alice Heidrich Prompt
ASSOCIAÇÃO DOS POLIMORFISMOS DA REGIÃO PROMOTORA E 3´ NÃO TRADUZIDA DO GENE HLA-G COM
DOENÇAS AUTOIMUNES E INFLAMATÓRIA CRÔNICA
Tese de Doutorado apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento da Universidade Federal de Santa Catarina, como requisito parcial para obtenção de grau de Doutora em Biologia Celular e do Desenvolvimento.
Orientadora Profª. Drª. Yara Costa Netto Muniz.
Florianópolis 2018
AGRADECIMENTOS
E se passaram quatro anos... alguns momentos ótimos e outros nem tanto..., mas com certeza, todos valeram a pena! Por isso, não posso deixar de agradecer quem esteve comigo nestes anos, e também, quem deixou de estar. Assim, agradeço:
À Universidade Federal de Santa Catarina, onde realizei meu Mestrado e Doutorado.
Aos órgãos de fomento CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior), FAPESC (Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação do Estado de Santa Catarina) e CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), pelo financiamento da minha bolsa de estudo de doutorado e pelos financiamentos dos projetos de pesquisa desenvolvidos no LAPOGE (Laboratório de Polimorfismos Genéticos).
À minha orientadora Yara Costa Netto Muniz. Meu primeiro “muito obrigada” é pelo voto de confiança a mim concedido. Por ter aceitado me orientar mesmo com um tempo reduzido para conclusão do Doutorado. Obrigada por ser sempre positiva e por me fazer ter certeza de que tudo iria dar certo. Obrigada por sua paciência, tranquilidade em ensinar e por todas as conversas. Você me faz acreditar que é possível ser professora, pesquisadora e orientadora de grande competência e empatia ao mesmo tempo. Sempre torcerei pelo seu sucesso profissional e pessoal!
Às demais professoras do LAPOGE, Profª. Drª. Ilíada Rainha de Souza e Profª. Drª. Andrea Marrero e a Pós-Doutoranda Sara Löfgren pelas conversas e contribuições com este trabalho.
Aos demais membros da equipe LAPOGE, principalmente ao grupo da prof. Drª. Yara Muniz: Mari Dalva Staffen, Clisten Staffen, Leili Hausmann, Bibiana Almeida e Emily Justino, por toda a ajuda, contribuição e amizade. Emily, agradeço por termos trocado juntas de orientação e por você ser sido minha “dupla” nestes dois anos de trabalho. Agradeço pela amizade que formamos, que certamente irá além do laboratório.
Aos meus alunos de Iniciação Científica Ian Novy e Josué Junior por toda a ajuda na realização deste trabalho.
Às “Irenes”, amigos do LACERT, laboratório onde comecei meu Doutorado. Bianca Teixeira, Clarissa Taufer, Diana Heck, Diego Amarante, Michele Rode, Rafaela Grecco, Talita Jeremias, nossa amizade certamente será para o resto das nossas vidas. Obrigada por todos os momentos de alegrias, risadas, angústias, tristezas! Vocês foram essenciais para eu conseguir finalizar este trabalho.
Às demais amizades que começaram na UFSC e ultrapassaram as paredes dos laboratórios.
Às minhas amigas de Porto Alegre, que são essenciais em minha vida. Pela amizade incondicional, pelo carinho e momentos de descontração que passamos durante o tempo deste trabalho.
A minha família, mãe, pai, irmãs e sobrinhos. Sem vocês nada disso seria possível. Não importa se o momento é bom ou ruim; se é de mudanças, dúvidas, separações ou de conquistas e alegrias... a única certeza que tenho é que são vocês que estarão ao meu lado para me apoiar e cuidar de mim, sempre! E eu estarei sempre ao lado de vocês. Amo vocês!
Aos demais professores da Pós-Graduação pelas contribuições científicas. Ao meu primeiro orientador do doutorado, pela contribuição com meu crescimento científico e pessoal.
Aos pacientes que aceitaram participar desse estudo.
Aos membros da banca examinadora, Dra. Renana Toscano Simões, Dra. Norma Machado da Silva, Dra. Ilíada, Dra. Juliana Doblas Massaro e Dr. Geison de Souza Izídio, que gentilmente aceitaram participar e contribuir com este trabalho.
Ao Laboratório de Protozoologia e seu responsável Dr. Edmundo Grisard pela disponibilidade de equipamentos, que permitiram a realização deste trabalho.
À Dra. Sandra Rachadel Torres, pela ajuda na realização deste trabalho. Aos funcionários do Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento pelo apoio e esclarecimento prestado durante o doutorado.
“Não existe um caminho para felicidade, a felicidade é o caminho” (Mahatma Gandhi)
RESUMO
Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) e Artrite Reumatoide (AR) são doenças reumáticas inflamatórias crônicas de origem autoimune. Psoríase (PSO) é uma doença de pele comum, também inflamatória crônica, porém de origem desconhecida. As três doenças são multifatoriais e relacionadas ao sistema imunológico, às interações com o meio ambiente e à suscetibilidade genética. As moléculas de HLA-G são de grande importância na indução da tolerância imunológica e o estudo do gene
HLA-G em doenças inflamatórias e reumatológicas é importante. O gene HLA-G possui sítios de variação (SNVs) em suas regiões regulatórias
5´URR e 3´UTR, que influenciam na expressão proteica. O presente estudo teve como principal objetivo estudar os SNVs da 5´URR em pacientes com LES, AR e PSO e indivíduos sem o histórico das doenças (466 indivíduos no total) e nove SNVs da 3´UTR em pacientes com LES e indivíduos controle (236 indivíduos no total) do Estado de Santa Catarina, visando compreender o papel desse gene no desenvolvimento das doenças e suas manifestações clínicas. Após sequenciamento das amostras e análises das sequências, foram realizadas análises de associação considerando cada locus em estudo caso-controle e caso-caso. No estudo da 3´UTR, os SNVs +3010CG, +3027AC, +3035CT,
+3142CG e +3196CG foram associados ao risco de desenvolvimento de
LES. As manifestações clínicas de LES também foram associadas aos SNVs da 3´UTR. A análise dos haplótipos, associou a UTR1 e as combinações UTR1+UTR1 e UTR1+UTR7 à proteção para o desenvolvimento de LES. Para a 5´URR, 17 SNVs foram associados ao risco de desenvolvimento de pelo menos uma das doenças, à LES
(725C>G>T, 483G>A, 297G>A e 284G>A), à AR (762C>T, 725C>G>T, 540InsG a 533DelA, 509C>G, 486C>A, 483G>A e 297G>A) e à PSO (762C>T, 725C>G>T, 716G>T, 689G>A, 646A>G, 633A>G, 509C>G, 483G>A, 443GA, 540InsG a -533DelA, -400G>A, -391G>A, -369A>C, -355G>A e -297G>A). As
manifestações clínicas das três doenças também foram associadas aos SNVs da 5´URR. Ainda, o haplótipo 5 da 5´URR foi associado ao risco de desenvolvimento de LES e AR. Concluímos que os SNVs das regiões 5´UR e 3´UT do HLA-G são associados à LES, AR e PSO bem como aos dados clínicos analisados neste trabalho. Assim, SNVs nestas regiões devem estar relacionadas com os níveis de expressão da molécula e consequentemente, com a imunorregulação, local ou sistêmica. Palavras-chave: Lúpus Eritematoso Sistêmico, Artrite Reumatoide, Psoríase, associação genética, imunorregulação.
ABSTRACT
Systemic Lupus Erythematosus (SLE) and Rheumatoid Arthritis (RA) are chronic inflammatory rheumatic diseases of autoimmune origin. Psoriasis (PSO) is a common skin disease, also chronic inflammatory, but of unknown origin. The three diseases are multifactorial, related to the immune system, to environmental interactions and genetic susceptibility. HLA-G molecules were described as of great importance in the induction of immune tolerance and the study of HLA-G gene in inflammatory diseases and processes have become a challenge for researchers. The gene
HLA-G has single nucleotide variations (SNV) in regulatory regions
5´URR and 3´UTR, described as having influence on protein expression. The present study had as main objective to study the SNV of 5´URR in SLE, AR and PSO patients and individuals without history of diseases (466 individuals in total) and nine 3´UTR SNV in SLE patients and control subjects (236 individuals in total) in the State of Santa Catarina, aiming to understand the role of this gene in the development of diseases and their clinical manifestations. After sequencing samples and analyzing the sequences, association analysis was carried out considering each locus in case-control and case-case study. The study of 3´UTR, the SNV
+3010CG, +3027AC, +3035CT, +3142CG and +3196CG has been
associated with the risk of development of LES. The clinical manifestations of LES were also associated to the 3´UTR SNV. The analysis of haplotypes associated UTR1 and the combinations UTR1 and UTR1 + UTR1 + UTR7 to protection against development of LES. For the 5´URR, 17 SNV were associated with risk of development for any disease; SLE 725C>G>T, -483G>A, -297G>A and -284G>A), RA
(762C>T, 725C>G>T, 540InsG a 533DelA, 509C>G, 486C>A, -483G>A and -297G>A) and the PSO (-762C>T, -725C>G>T, -716G>T, 689G>A, 646A>G, 633A>G, 509C>G, 483G>A, 443GA, 540InsG a 533DelA, 400G>A, 391G>A, 369A>C, 355G>A and -297G>A). The clinical manifestations of LES, RA and PSO were also
associated to the 5´URR SNV. Still, the 5-haplotype of 5´URR was associated with the risk of development of LES and AR. We conclude that the SNV of the 5'UR and 3'UT regions of HLA-G are associated to SLE, RA and PSO as well as to the clinical data analyzed in this study. Thus, SNVs in these regions must be related to the expression levels of the molecule and consequently, to local or systemic immunoregulation. Keywords: Systemic Lupus Erythematosus, Rheumatoid Arthritis, Psoriasis, genetic association, immunoregulation.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Mapa esquemático do MHC humano. A localização da região do MHC humano no cromossomo 6 (6p.21.3), a disposição dos genes dentro das classes I, II e III; e em amarelo destaque para o locus HLA-G. ... 41 Figura 2 - Estrutura de uma molécula de MHC de classe I. ... 42 Figura 3 - Representação esquemática do gene HLA-G e das sete isoformas proteicas geradas após processamento alternativo do HLA-G, sendo quatro ligadas à membrana plasmática e três solúveis. ... 44 Figura 4 - Lista de todos os pontos de variação encontrados na região promotora do gene HLA-G, suas posições no cromossomo e no gene, sequência referência (Gene ID: 3135 - NCBI) e seus alelos com suas respectivas frequências considerando toda população do projeto 1000Genomes. ... 46 Figura 5 - Haplótipos da região promotora do gene HLA-G detectados nas populações de Brasil e Cyprus. ... 49 Figura 6 – Esquema da região promotora do gene HLA-G, mostrando os 32 sítios polimórficos descritos. ... 50 Figura 7 – Esquema representativo da sequência de nucleotídeos da região 3’UTR do gene HLA-G. Estão destacados em retângulo vermelho os 10 sítios de variações polimórficas analisados no presente trabalho. ... 54 Figura 8 - Haplótipos mais frequentes da região 3’UT do gene HLA-G de acordo com dados do 1000Genomes. ... 54 Figura 9 – Ilustração de um cromatograma resultante do alinhamento de uma das amostras sequenciadas do presente trabalho. Para o primeiro SNP (S do código IUPAC, do inglês International Union of Pure and Applied Chemistry), o indivíduo é heterozigoto (CG, nas cores azul e preta) e para o segundo SNP (Y do código IUPAC), o indivíduo é homozigoto (TT, na cor rosa). ... 66 Figura 10 - Resumo dos alelos e genótipos com resultados significativos (p≤0,05) obtidos após análise de associação entre os polimorfismos da 3´UTR do HLA-G e o desenvolvimento de LES na população de Santa Catarina. ... 150 Figura 11 - Resumo dos alelos e genótipos com resultados significativos (p≥0,05) obtidos após análise de associação entre os polimorfismos da 3´UTR do HLA-G e o desenvolvimento de manifestações clínicas em pacientes com LES da população de Santa Catarina. ... 151 Figura 12 - Imagem ilustrativa dos sítios polimórficos da 5´URR associados à LES, AR e PSO... 160
Figura 13 - Resumo dos resultados significativos (p≤0,05) obtidos após análise de associação entre os polimorfismos da 5´URR do HLA-G e o desenvolvimento de manifestações clínicas em pacientes com LES da população de Santa Catarina. ... 168 Figura 14 - Resumo dos resultados significativos (p≤0,05) obtidos após análise de associação entre os polimorfismos da 5´URR do HLA-G e o desenvolvimento de manifestações clínicas em pacientes com AR da população de Santa Catarina. ... 169 Figura 15 - Resumo dos resultados significativos (p≤0,05) obtidos após análise de associação entre os polimorfismos da 5´URR do HLA-G e o desenvolvimento de manifestações clínicas em pacientes com PSO da população de Santa Catarina. ... 169 Figura 16 - Resumo para comparação do resultado do presente trabalho entre os haplótipos da 5´URR do gene HLA-G associado ao risco de manifestação à LES e AR (Haplótipo 5) e dados da literatura. ... 172
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Critério de classificação de LES do The American College of
Rheumatology. ... 32
Tabela 2 - Critérios de classificação de Artrite Reumatoide estabelecidos pelo American College of Rheumatology e European League Against
Rheumatism em 2010. ... 35
Tabela 3 - Detalhamento da amostra do presente trabalho... 62 Tabela 4 - Sequência nucleotídica dos iniciadores utilizados para amplificação da região 5’UR do gene HLA-G. ... 63 Tabela 5 - Polimorfismos da região 5´UR do gene HLA-G analisados no presente trabalho... 65 Tabela 6 - Sequência nucleotídica dos iniciadores utilizados para amplificação da região 3’UT do gene HLA-G. ... 67 Tabela 7 - Polimorfismos da região 3´UR do gene HLA-G analisados no presente estudo. ... 68 Tabela 8 - Classificação da amostra, de acordo com o sexo e idade, entre pacientes com LES (caso) e indivíduos saudáveis (controle). Amostras utilizadas para estudo da região 5´UR e 3´UT do HLA-G. ... 71 Tabela 9 - Frequências das manifestações clínicas nos pacientes com LES. ... 72 Tabela 10 - Alelos e genótipos da 3´UTR mais frequentes para os grupos caso (pacientes com LES) e controle (indivíduos sem doença autoimune). ... 72 Tabela 11 - Valor de p após análise do modelo de EHW para os nove loci da região 3´UT em pacientes com LES e indivíduos controle. ... 73 Tabela 12 - Frequências alélicas e genotípicas para pacientes e indivíduos controle, cálculos de associação (OR) entre a presença dos polimorfismos e desenvolvimento de Lúpus Eritematoso Sistêmico, valores de intervalo de confiança (IC 95%) e valor de p estimados para os sítios de variações polimórficas da região 3’UT do gene HLA-G. ... 75 Tabela 13 - Haplótipos inferidos para a 3´UTR do gene HLA-G, suas frequências para as populações de casos e controles, análises de associação (OR) entre haplótipos e o desenvolvimento de Lúpus Eritematoso Sistêmico, valores de p e intervalo de confiança (IC 95%). ... 80 Tabela 14 - Combinações haplotípicas inferidas para 3’UTR do gene
HLA-G, suas frequências para as populações de casos e controles, análises
de associação (OR) entre as combinações haplotípicas e o desenvolvimento de Lúpus Eritematoso Sistêmico, valores p de intervalo de confiança (IC 95%). ... 81
Tabela 15 - Frequências alélicas e genotípicas dos dados clínicos para o grupo caso (+) (pacientes que apresentam as manifestações clínicas) e grupo controle (-) (pacientes que não apresentam as manifestações clínicas), cálculos de associação (OR) entre a presença dos polimorfismos e desenvolvimento das manifestações clínicas em pacientes com Lúpus Eritematoso Sistêmico, valores de intervalo de confiança (IC 95%) e valor de p estimados para os sítios de variações polimórficas da região 3’UT do gene HLA-G. ... 84 Tabela 16 - Alelos e genótipos da 5´URR mais frequentes para os grupos caso (pacientes com LES) e controle (indivíduos sem doença autoimune). ... 90 Tabela 17 - Valor de p após análise do modelo de EHW para os 22 loci da região 5´UR em pacientes com LES e indivíduos controle. ... 91 Tabela 18 - Frequências alélicas e genotípicas para pacientes e indivíduos controle, dados significativos (p≤0,05) dos cálculos de associação (OR) entre a presença dos polimorfismos e desenvolvimento de Lúpus Eritematoso Sistêmico, valores de intervalo de confiança (IC 95%) e valor de p estimados para os sítios de variações polimórficas da região 5’UR do gene HLA-G. ... 93 Tabela 19 - Haplótipos da região promotora do gene HLA-G presentes nesse trabalho e a legenda numérica utilizada para sua representação. . 96 Tabela 20 - Haplótipos inferidos para a 5´URR do gene HLA-G, suas frequências para as populações de casos e controles, análises de associação (OR) entre haplótipos e o desenvolvimento de Lúpus Eritematoso Sistêmico, valores de p e intervalo de confiança (IC 90%). ... 98 Tabela 21 - Combinações haplotípicas inferidas para 5’URR do gene
HLA-G, suas frequências para as populações de casos e controles, análises
de associação (OR) entre as combinações haplotípicas e o desenvolvimento de Lúpus Eritematoso Sistêmico, valores de intervalo de confiança (IC 90%) e p. ... 98 Tabela 22 - Frequências alélicas e genotípicas dos dados clínicos para o grupo caso (+) (pacientes que apresentam a manifestação clínica) e grupo controle (-) (pacientes que não apresentam a manifestação clínica), cálculos de associação (OR) entre a presença dos polimorfismos e desenvolvimento das manifestações em pacientes com Lúpus Eritematoso Sistêmico, valores de intervalo de confiança (IC 95%) e valor de p estimados para os sítios de variações polimórficas da região 5’UR do gene
Tabela 23 - Classificação da amostra, de acordo com o sexo e idade, entre pacientes com Artrite Reumatoide (caso) e indivíduos saudáveis (controle)... 110 Tabela 24 - Alelos e genótipos da 5´URR mais frequentes para os grupos caso (pacientes com AR) e controle (indivíduos sem doença autoimune). ... 111 Tabela 25 - Valor de p após análise do modelo de EHW para os 22 loci da região 5´UR em pacientes com AR e indivíduos controle. ... 112 Tabela 26 - Frequências alélicas e genotípicas para pacientes e indivíduos controle, dados significativos (p≤0,05) dos cálculos de associação (OR) entre a presença dos polimorfismos e desenvolvimento de Artrite Reumatoide, valores de intervalo de confiança (IC 95%) e valor de p estimados para os sítios de variações polimórficas da região 5’UR do gene
HLA-G. ... 114
Tabela 27 - Haplótipos inferidos para a 5´URR do gene HLA-G, suas frequências para as populações de casos e controles, análises de associação (OR) entre haplótipos e o desenvolvimento de Artrite Reumatoide, valores de p e intervalo de confiança (IC 90%). ... 119 Tabela 28 - Combinações haplotípicas inferidas para 5’URR do gene
HLA-G, suas frequências para as populações de casos e controles, análises
de associação (OR) entre as combinações haplotípicas e o desenvolvimento de Artrite Reumatoide, valores de p e intervalo de confiança (IC 90%). ... 119 Tabela 29 - Frequências alélicas e genotípicas dos dados clínicos para o grupo caso (+) (pacientes que apresentam a manifestação clínica) e grupo controle (-) (pacientes que não apresentam a manifestação clínica), cálculos de associação (OR) entre a presença dos polimorfismos e desenvolvimento das manifestações em pacientes com Artrite Reumatoide, valores de intervalo de confiança (IC 95%) e valor de p estimados para os sítios de variações polimórficas da região 5’UR do gene
HLA-G. ... 122
Tabela 30 - Classificação da amostra, de acordo com o sexo e idade, entre pacientes com Psoríase (caso) e indivíduos saudáveis (controle). ... 125 Tabela 31 - Alelos e genótipos da 5´URR mais frequentes para os grupos caso (pacientes com PSO) e controle (indivíduos sem doença autoimune). ... 126 Tabela 32 - Valor de p após análise do modelo de EHW para os 22 loci da região 5´UR em pacientes com PSO e indivíduos controle. ... 127 Tabela 33 - Frequências alélicas e genotípicas para pacientes e indivíduos controle, dados significativos (p≤0,05) dos cálculos de associação (OR)
entre a presença dos polimorfismos e desenvolvimento de Psoríase, valores de intervalo de confiança (IC 95%) e valor de p estimados para os sítios de variações polimórficas da região 5’UR do gene HLA-G. ... 130 Tabela 34 - Haplótipos inferidos para a 5´URR do gene HLA-G, suas frequências para as populações de casos e controles, análises de associação (OR) entre haplótipos e o desenvolvimento de Psoríase, valores de p e intervalo de confiança (IC 90%)... 138 Tabela 35 - Combinações haplotípicas inferidas para 5’URR do gene
HLA-G, suas frequências para as populações de casos e controles, análises
de associação (OR) entre as combinações haplotípicas e o desenvolvimento de Artrite Reumatoide, valores de p intervalo de confiança (IC 90%). ... 138 Tabela 36 - Frequências alélicas e genotípicas dos dados clínicos para o grupo caso (+) (pacientes que apresentam a manifestação clínica) e grupo controle (-) (pacientes que não apresentam a manifestação clínica), cálculos de associação (OR) entre a presença dos polimorfismos e desenvolvimento das manifestações em pacientes com Psoríase, valores de intervalo de confiança (IC 95%) e valor de p estimados para os sítios de variações polimórficas da região 5’UR do gene HLA-G. ... 141
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS A Alelo equivalente ao nucleotídeo com adenina anti-CCP Anti-peptídeos citrulinados cíclicos
APC Células apresentadoras de antígenos, do inglês Antigen-presenting
cells
AR Artrite Reumatoide
C Alelo equivalente ao nucleotídeo citosina CCP Peptídeos citrulinados cíclicos
CEPSH-UFSC
Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos da Universidade Federal de Santa Catarina
CI Intervalo de confiança
CTL Linfócitos T citotóxico, do inglês Cytotoxic T lymphocytes Del Alelo deleção
Del/In Inserção e deleção
DelA Deleção de adenina na região -540InsG a -533DelA
DNA Ácido desoxirribonucleico, do inglês Desoxyribonucleic acid DTAR Diretrizes de Tratamentos para Artrite Reumatoide
EDTA Ácido etilenodiaminotetraacético, do inglês Ethylenediamine
tetraacetic acid
EnhA Enhancer-A
ESR1 Receptor de estrogênio, do inglês, Estrogen Receptor 1 EWH Equilíbrio de Hardy-Weinberg
FR Fator Reumatoide
G Alelo equivalente ao nucleotídeo guanina
HLA Antígeno Leucocitário Humano, do inglês Human Leucocyte Antigen HSE Elemento de choque térmico, do inglês Heat Shock Element
HSP Proteínas de choque térmico, do inglês Heat Shock Protein
HU-UFSC Hospital Universitário Professor Polydoro Ernani de São Thiago, da Universidade Federal de Santa Catarina
IFN Interferon
IFN-ISRE Elemento de resposta estimulado por interferon, do inglês
Interferon-Stimulated Response Rlement
IFR Fatores de transcrição da família de reguladores de interferon, do inglês Interferon Regulatory Factors
IgG Imunoglobulina G IL Interleucina
ILT Receptor de leucócito semelhante à imunoglobulina In Alelo inserção
INF- γ Interferon gama
InsG Inserção de guanina na região −540InsG a -533DelA JAK Janus cinase, do inglês Janus Kinase
KIR Receptor semelhante à imunoglobulina das células Natural Killer, do inglês Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor
LAPOGE Laboratório de Polimorfismos Genéticos LES Lúpus Eritematoso Sistêmico
MHC Complexo principal de histocompatibilidade, do inglês Major
Histocompatibility Complex
miRNA micro RNA mRNA RNA mensageiro
NCBI Centro Nacional de Informação Biotecnológica, do inglês, The
National Center for Biotechnology Information
NF-kβ Factor nuclear kappa Beta, do inglês Nuclear Factor NF-κB NGS Sequenciamento de Nova Geração, do inglês Next-Generation
Sequencing
NK Células Natural Killer
NSG Sequenciamento de nova geração, do inglês Next-Generation
Sequencing
OR Razão de Chances, do inglês Odds Ratio p Braço curto, do francês petit
pb Pares de base
PCR Reação em cadeia da polimerase, do inglês Polymerase Chain
Reaction
PSO Psoríase
PSORS Suscetibilidade à Psoríase, do inglês, Psoriasis Susceptibility PTK Proteína Tirosina cinase, do inglês Protein Tyrosine Kinases RCF Força Centrífuga Relativa, do inglês Relative Centrifugal Force RPM Rotações por minuto
SNP Polimorfismo de nucleotídeo único, inglês Single Nucleotide
Polymorphism
SNV Variações de nucleotídeo único, do inglês Single Nucleotide
Variations
Sp1 Proteína específica 1, do inglês, Specificity Protein 1 T Alelo equivalente ao nucleotídeo timina
TCLE Termo de consentimento livre e esclarecido
URR Região promotora, do inglês Upstream Regulatory Region UTR Região não traduzida, do inglês Untranslated Region β2m β2-microglobulina
SUMÁRIO
1
Introdução ... 27
2
Revisão Bibliográfica ... 29
2.1 Sistema Imunológico e Doenças Autoimunes ... 29
2.1.1 Genética de Doenças Autoimunes ... 30
2.2 Lúpus Eritematoso Sistêmico ... 31 2.3 Artrite Reumatoide... 34 2.4 Psoríase ... 37
2.5 Complexo Principal de Histocompatibilidade ... 39
2.5.1 HLA-G: do Gene à Proteína ... 42
2.5.2 Polimorfismos das regiões reguladoras do HLA-G ... 44
2.6 HLA-G e Resposta Imune ... 55
3
Objetivos ... 59
3.1 Objetivo geral ... 59 3.2 Objetivos específicos ... 59
4
Material e métodos ... 61
4.1 Aspectos éticos e abordagem aos pacientes... 61
4.2 Caracterização da Amostra... 61 4.3 Preparação da Amostra ... 62
4.4 Sequenciamento da Região 5´UR do gene HLA-G ... 62
4.4.1 Extração do DNA genômico ... 62 4.4.2 Sequenciamento ... 62 4.4.3 PCR para Reação de Sequenciamento ... 63 4.4.4 Precipitação da Amostra ... 63 4.4.5 Sequenciamento da Amostra ... 64 4.4.6 Análise das Sequências ... 64
4.5 Sequenciamento da Região 3´UT do Gene HLA-G ... 66
4.5.1 Extração do DNA genômico ... 66 4.5.2 Sequenciamento ... 66
4.5.3 Purificação das Amostras... 67 4.5.4 Análise das Sequências ... 67
4.6 Análise dos Dados ... 68
5
Resultados ...71
5.1 Lúpus Eritematoso Sistêmico... 71
5.1.1 Caracterização da Amostra ... 71 5.1.2 Polimorfismos da região 3´UT do Gene HLA-G em pacientes com Lúpus Eritematoso Sistêmico ... 72 5.1.3 Polimorfismos da região 5´UR do Gene HLA-G em pacientes com Lúpus Eritematoso Sistêmico ... 89
5.2 Artrite Reumatoide ... 110
5.2.1 Caracterização da Amostra ... 110 5.2.2 Polimorfismos da região 5´UR do Gene HLA-G em pacientes com Artrite Reumatoide ... 110
5.3 Psoríase ... 125
5.3.1 Caracterização da Amostra ... 125 5.3.2 Polimorfismos da região 5´UR do Gene HLA-G em pacientes com Psoríase ... 126
6
Discussão ...145
6.1 Caracterização Epidemiológica ... 1466.1.1 Lúpus Eritematoso Sistêmico ... 146 6.1.2 Artrite Reumatoide ... 147 6.1.3 Psoríase ... 148
6.2 Análises de associação dos polimorfismos da 3´UTR do
HLA-G em pacientes com Lúpus Eritematoso Sistêmico ... 149
6.3 Análises de associação dos polimorfismos da 5´URR do
HLA-G em Pacientes com Lúpus Eritematoso Sistêmico, Artrite Reumatoide e Psoríase ... 158
7
Conclusões...173
Referências ...175
Anexo 1 ...203
Anexo 2 ...205
Anexo 3 ... 206
Anexo 4 ... 207
Anexo 5 ... 209
Anexo 6 ... 213
Anexo 7 ... 219
Anexo 8 ... 225
Anexo 9 ... 227
Anexo 10 ... 228
Apêndice A ... 229
Apêndice B ... 240
Apêndice C ... 251
Apêndice D ... 262
Apêndice E ... 346
Apêndice F... 386
Apêndice G ... 430
1 INTRODUÇÃO
HLA-G (Antígeno Leucocitário Humano, do inglês, Human Leukocyte Antigen) é um gene localizado no braço curto do cromossomo
6 (6p), no Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC, do inglês
Major Histocompatibility Complex). O gene é classificado como um HLA
não clássico, classe Ib. O HLA-G codifica uma proteína de mesmo nome que possui até sete isoformas, sendo essas solúveis ou de membrana. Em condições saudáveis a proteína possui expressão tecidual restrita, porém ela pode ser expressa em condições patológicas, como em casos de abortos espontâneos, rejeição de órgãos transplantados, tecidos de tumores malignos ou em casos de doenças infecciosas, inflamatórias e autoimunes (MOREAU; FLAJOLLET; CAROSELLA, 2009; GIMENES et al., 2014).
A proteína HLA-G tem função imunossupressora e foi descrita inicialmente em estudos de casos de abortos recorrentes. A presença da molécula auxilia a implantação do embrião, pois ela tem a capacidade de se ligar em receptores de membrana de células imunes e desativar suas funções, levando à diminuição da resposta imune. Essa característica da HLA-G tem feito desta molécula um alvo atrativo de estudos para compreensão de situações clínicas relacionadas à imunidade, como estudos com doenças inflamatórias e autoimunes (GOUGH; SIMMONDS, 2007; CAROSELLA; HOWANGYIN; et al., 2008; RIZZO et al., 2008; AMODIO; SALES DE ALBUQUERQUE; GREGORI, 2014; GREGORI, 2016).
A expressão dessa proteína tem sido descrita em tecidos, cuja presença não é normalmente relatada, e está associada a diversas patologias (LARSEN; HVIID, 2009; CURIGLIANO et al., 2013; CASTELLI, E. C. (B) et al., 2014; GINEAU et al., 2015). Desta forma, as regiões reguladoras do gene HLA-G, promotora (5´URR, do inglês,
upstream regulatory region) e 3´não traduzida (3´UTR, do inglês, untranslated region) se tornaram alvo de estudos e, deste então, diversos
polimorfismos foram descritos. Esses polimorfismos podem influenciar a expressão desse gene, por estarem localizados em regiões similares ou próximas a fatores de transcrição, no caso da região promotora, ou por modificação da afinidade das sequências-alvo do gene por fatores pós-transcricionais, como microRNA (miRNA), no caso da região 3´não traduzida (CASTELLI et al., 2011; DONADI et al., 2011; CASTELLI, E. C. et al., 2014).
Dentre as várias doenças associadas ao HLA-G temos a Artrite Reumatoide (AR) e Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) que são doenças
reumáticas inflamatórias crônicas de origem autoimune e a Psoríase (PSO), uma doença de pele relativamente comum, cíclica, crônica e de origem desconhecida. Apesar da heterogeneidade das manifestações clínicas e incerteza quanto suas etiologias, sabe-se que as três patologias desencadeiam processos inflamatórios crônicos e estudos mostram que variantes gênicas do HLA-G parecem ser comuns em pacientes que manifestam algumas dessas doenças (GOUGH; SIMMONDS, 2007; SCRIVO et al., 2007; CASTRO et al., 2008; PERERA; MEGLIO, DI; NESTLE, 2012; EYRE; OROZCO; WORTHINGTON, 2017). Portanto, estudos que identifiquem associações polimórficas das regiões regulatórias do HLA-G e essas patologias, são importantes para auxiliar no prognóstico das doenças, visto que a aumento da expressão da proteína
HLA-G em pacientes causaria um efeito inibitório da resposta imune
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 SISTEMA IMUNOLÓGICO E DOENÇAS AUTOIMUNES
O termo imunidade é derivado da palavra latina imunitas, que se referia à proteção contra processos legais oferecida aos senadores romanos durante seus mandatos. O sistema imune é constituído por células e moléculas responsáveis pela imunidade, e a sua resposta coletiva e coordenada à entrada de substâncias estranhas é denominada de resposta imune. Assim, como uma definição mais inclusiva de resposta imune, temos que é uma reação a microrganismos, pequenos agentes químicos e macromoléculas reconhecidos como estranhos; podendo essas moléculas serem próprias do organismo (resposta autoimune) (TRAVIS, 2009).
As reações imunológicas contra antígenos próprios (autoantígenos) desencadeiam as doenças autoimunes. Essas doenças apresentam características gerais, como (1) serem sistêmicas ou órgão-específicas, dependendo da distribuição tecidual dos autoantígenos que são reconhecidos; (2) possuírem diversos mecanismos efetores responsáveis pela lesão do tecido, incluindo complexos imunológicos e linfócitos T autorreativos; e (3) elas tendem a ser crônicas, progressivas e de autoperpetuação. Todos os indivíduos possuem potencial para autoimunidade, e é a combinação de algumas anormalidades imunológicas que leva a doenças autoimunes (GRAVINA et al., 2017)
A falha nos mecanismos de autotolerância (não-responsividade a um autoantígeno, induzida pela exposição de linfócitos especializados a esse antígeno) depende da suscetibilidade genética e da reação a estímulos ambientais. Essa falha pode ocorrer se linfócitos autorreativos não forem eliminados ou desativados durante ou após a sua maturação, ou se as células apresentadoras de antígenos (APC, do inglês antigen presenting
cells) forem ativadas, de modo que antígenos próprios sejam apresentados
ao sistema imunológico de forma imunogênica. Além dessa anormalidade imunológica, as doenças autoimunes podem apresentar inflamação e apresentação anormal de autoantígenos (CASTIGLI; GEHA, 2006; CONLEY et al., 2009; DURANDY; KRACKER; FISCHER, 2013; PARVANEH et al., 2013).
As células especializadas nas respostas imunes, inata e adaptativa, incluem fagócitos, células dendríticas, linfócitos específicos para antígeno e vários outros leucócitos que agem para eliminar os antígenos. Os fagócitos, incluem os neutrófilos e macrófagos, células cuja função primária é destruir microrganismos e digerir tecidos danificados. Além disso, pelo contato direto e secreção de citocinas, os fagócitos se
comunicam com outras células a fim de promover ou regular as respostas imunes. As células dendríticas, são o principal tipo celular que apresenta antígenos aos linfócitos T, portanto é uma APC. Sua principal função, portanto, é capturar microrganismos e outros antígenos e apresentá-los aos linfócitos, além de fornecer sinais que estimulem a proliferação e diferenciação dos mesmos. Os linfócitos são as células exclusivas no corpo que expressam receptores específicos para um determinado antígeno diferente. Os linfócitos são subdivididos em subgrupos: linfócitos B, linfócitos T auxiliar, linfócitos T citotóxico (CTL, do inglês
cytotoxic T lymphocytes) e linfócitos T regulatório. Os linfócitos B
reconhecem antígenos solúveis e se desenvolvem em células secretoras de antígenos. Os linfócitos T auxiliares reconhecem antígenos na superfície das APC e secretam citocinas que estimulam diferentes mecanismos de imunidade e inflamação. Essas células expressam em sua superfície a proteína CD4. Os CTL reconhecem antígenos nas células infectadas, levando-as a morte celular; e expressam a proteína de superfície CD8. Por fim, os linfócitos T regulatórios suprimem e previnem as respostas imunes, por exemplo, aos próprios antígenos (SURH; SPRENT, 2008; GEISSMANN et al., 2010; CHOW; BROWN; MERAD, 2011; DAVIES et al., 2013; WYNN; CHAWLA; POLLARD, 2013; FARBER; YUDANIN; RESTIFO, 2013).
Os linfócitos T têm uma especialidade restrita para antígenos; eles reconhecem peptídeos derivados das proteínas estranhas que estão ligadas às proteínas do MHC, expressas na superfície de outras células. Portanto, as células T reconhecem e respondem aos antígenos associados à superfície celular e não aos antígenos solúveis (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2015).
2.1.1 Genética de Doenças Autoimunes
As doenças autoimunes têm origem multifatorial, fato amplamente confirmado nos dias atuais. Diversos estudos demonstraram que existe uma interação genética e ambiental para o desenvolvimento da autoimunidade. Recentemente, estudos do genoma permitiram a identificação de diversos loci gênicos associados não apenas ao desenvolvimento às doenças autoimunes, mas também às manifestações clínicas das mesmas. Proteínas codificadas por genes associados às doenças autoimunes estão envolvidas em diversos mecanismos inflamatórios, como apresentação de antígenos, sinalização NF-kβ, função das células B e T, apoptose e formação de complexos imunes. Variantes genéticas poderiam induzir a modificação proteica, seja por
modificação da taxa de produção ou modificação de função, favorecendo a manifestação de doenças autoimunes (COSTENBADER et al., 2012; NAGY et al., 2015; CECCARELLI; AGMON-LEVIN; PERRICONE, 2016).
Diversos genes do MHC estão sendo associados às doenças inflamatórias e autoimunes. Estudos relatam a associação de alelos de genes HLA clássicos com essas patologias. Alelos dos genes HLA-DRB1 e HLA-DRB13 foram associados à LES, AR, Artrite Psoriásica, Esclerose Múltipla, Esclerose Sistêmica e Miastenia grave (DUFFIN; WOODCOCK; KRUEGER, 2010; ALCINA et al., 2012; JACOB; JACOB, 2012; CRAMPTON; MORAWSKI; BOLLAND, 2014; MARIASELVAM et al., 2015; SANTOS et al., 2017). Os estudos de associação de doenças autoimunes com genes HLA não-clássicos, como o HLA-G são mais recentes, entretanto, trabalhos vêm associando polimorfismos das regiões regulatórias destes genes com essas patologias (RIZZO et al., 2008; CASTELLI et al., 2010, 2017; LUCENA-SILVA et al., 2013; TURECK et al., 2014; MARIASELVAM et al., 2015; CATAMO, E. et al., 2015; ALBUQUERQUE, DE et al., 2016; GERASIMOU et al., 2016; HACHIYA et al., 2016; HASHEMI et al., 2016; SMITH et al., 2017; CATAMO et al., 2017).
Estima-se que até hoje apenas cerca de 15% dos fatores genéticos que contribuem para a suscetibilidade às doenças autoimunes foram identificados. Portanto, há uma necessidade de que novos estudos sejam realizados, a fim de avaliar o impacto genético, tanto na suscetibilidade às doenças inflamatórias e autoimunes, como nos fenótipos acarretados por elas (CECCARELLI et al., 2016).
2.2 LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO
Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) é uma doença reumática inflamatória crônica de natureza autoimune caracterizada pela formação descontrolada de autoanticorpos que levam a formação excessiva de complexos imunes em diferentes tecidos, causando inflamação e dano tecidual (MANSON; RAHMAN, 2006; CASTRO et al., 2008). LES é 9 a 10 vezes mais frequente em mulheres do que em homens, sendo afetadas principalmente mulheres em idade reprodutiva, entre 20 e 45 anos (MURPHY; ISENBERG, 2013). Sua prevalência estimada varia entre 12 e 64 casos por 100.000 pessoas de origem europeia, mas é mais comum em população afrodescendente (CERVERA et al., 2003; CASTRO et al., 2008).
A doença é considerada de diagnóstico heterogêneo podendo afetar a pele, articulações, rins, cérebro, superfícies serosas, vasos e células sanguíneas, fígado e coração (LIPSKY, 2001; UVA et al., 2012; CHIEWCHENGCHOL et al., 2015; FAYYAZ et al., 2015). Devido à presença de múltiplos sintomas, incluindo sintomas não específicos para LES, como febre, fadiga, perda de peso, perda de cabelo, azia, dor de estômago ou abortos espontâneos, o The American College of
Rheumatology definiu critérios de classificação para o diagnóstico da
doença. O diagnóstico se fundamenta na presença de pelo menos, quatro dos onze critérios citados na Tabela 1 (PETRI; MAGDER, 2004). A manifestação clínica varia em cada paciente e o desenvolvimento da LES depende das interações genética, hormonal, imunológica e ambiental, podendo ser desencadeada por vírus, drogas e exposição solar (MANSON; ISENBERG, 2003; MANSON; RAHMAN, 2006; CASTRO et al., 2008).
Tabela 1 - Critério de classificação de LES do The American College of
Rheumatology.
Fonte: Adaptado de (PETRI; MAGDER, 2004).
Em pacientes com LES ocorre o depósito de complexos imunes em diversos órgãos e hiperatividade dos linfócitos B, produção de numerosos autoanticorpos dirigidos contra antígenos nucleares e mau funcionamento de células T (LIPSKY, 2001; RENAUDINEAU et al., 2004; MURPHY; ISENBERG, 2013).
Apesar da heterogeneidade da LES, vem sendo elucidado que algumas regiões cromossômicas e variantes genéticas específicas
1. Eritema Malar 2. Lesão discoide 3. Fotossensibilidade 4. Úlceras orais/nasais 5. Artrite 6. Serosite (pleurite/percardite)
7. Comprometimento renal (proteinúria persistente/cilindrúria anormal) 8. Alterações neurológicas (convulsões/psicose)
9. Alterações hematológicas (anemia hemotítica/ leucopenia/linfopenia) 10. Alterações imunológicas (anticorpos DNA/
anti-Sm/anticoagulante lúpico 11. Anticorpos antinucleares
parecem ser comuns entre os pacientes que manifestam a doença (CASTRO et al., 2008).
O aumento da incidência em mulheres pode ser atribuído ao hormônio estrogênio. Foi demonstrado que mulheres que tiveram menarca precoce e usaram contraceptivos orais ou terapias hormonais apresentaram um risco aumentado ao desenvolvimento de LES (COSTENBADER et al., 2007). Esse hormônio age por meio da ligação aos seus receptores; e uma superexpressão desses receptores foi identificada em pacientes com diferentes doenças autoimunes (RAY; FICEK, 2012). Um artigo publicado pelo grupo de pesquisa do Laboratório de Polimorfismos Genéticos da Universidade Federal de Santa Catarina (LAPOGE-UFSC) demonstrou por meio de análises de associação que a presença do alelo C em uma variante gênica do gene receptor de estrógeno (ESR1, do inglês estrogen receptor 1) está associada à suscetibilidade às manifestações clínicas em pacientes com LES de Santa Catarina (DREHMER et al., 2017).
Ainda, três regiões do genoma (6p21, 20p11 e 16p13) foram altamente relacionadas com LES (FORABOSCO et al., 2006). A região 6p21 corresponde ao MHC, onde estão os genes que codificam para os
HLA incluindo o HLA-G, gene objeto de estudo do presente trabalho. Esse
gene codifica uma parte importante de proteínas de membrana e proteínas solúveis, caracterizadas por expressão tecidual restrita. Essas proteínas são capazes de se ligar a receptores inibitórios, sugerindo que o HLA-G é componente do processo de imunossupressão (CAROSELLA; HOWANGYIN; et al., 2008).
A associação dos genes do MHC com doenças autoimunes e inflamatórias, incluindo LES, AR e PSO, vem sendo elucidada. A associação de LES com o MHC é um achado consistente em populações derivadas do norte europeu (CASTRO et al., 2008; CRISWELL, 2008). Os genes do MHC, como alelos das regiões HLA de classe I (incluindo
HLA-G) e de classe II, foram descritos por contribuir para a
suscetibilidade à doença em população de origem europeia (FERNANDO et al., 2012). Estudos caso-controle recentes vêm associando os polimorfismos das regiões 5´UR e 3´UT do HLA-G com LES; como é o caso do realizado em uma população brasileira de Recife/PE (CATAMO, E. et al., 2015) e em uma população japonesa (HACHIYA et al., 2016). O presente trabalho é o primeiro a estudar a associação das variantes gênicas das regiões 5´UR e 3´UT do HLA-G em pacientes com LES do estado de Santa Catarina.
2.3 ARTRITE REUMATOIDE
Artrite Reumatoide (AR) é uma doença autoimune inflamatória crônica caracterizada pela inflamação articular progressiva e hiperplasia do tecido sinovial, levando à destruição de cartilagens (SCRIVO et al., 2007). Os sintomas mais comuns de AR são os da artrite (dor, edema, calor e vermelhidão) em qualquer articulação do corpo, sobretudo nas mãos e punhos. As articulações inflamadas provocam rigidez matinal e fadiga nos pacientes; e com a progressão da doença ocorre a destruição da cartilagem articular, levando a deformidades nas articulações periféricas, como dedos em “pescoço de cisne”, em “botoeira”, desvio ulnar e hálux valgo (joanete). Além das articulações, outros tecidos e órgãos, como unhas, músculos, rins, coração, pulmão, sistema nervoso, olhos e sangue podem apresentar alterações (HARRISON, 1979; MCINNES, 2011; GIBOFSKY, 2012).
AR é a uma doença de impacto social e econômico, considerando as deformidades articulares irreversíveis e o significativo declínio na capacidade funcional do paciente. AR acomete aproximadamente 1% da população mundial, sendo uma das doenças reumáticas mais frequentes na clínica médica (MOTA, DA et al., 2011; JACOB; JACOB, 2012). A doença é duas a três vezes mais frequente em mulheres, principalmente entre quarenta e cinquenta anos. Entretanto, AR pode se manifestar em qualquer faixa etária, sendo mais severa quanto mais prematura for. A prevalência em mulheres indica o fator hormonal como importante para o desenvolvimento de AR (ALAMANOS; DROSOS, 2005; CARMONA et al., 2010; TOBÓN; YOUINOU; SARAUX, 2010; CHAUDHARI; RIZVI; SYED, 2016).
O diagnóstico precoce e início imediato do tratamento são fundamentais para o controle da atividade da doença, prevenção da incapacidade funcional e lesão articular e o retorno ao estilo de vida normal do paciente. O diagnóstico para a doença é baseado nos critérios estabelecidos pelo American College of Rheumatology e European
League Against Rheumatism (Tabela 2), sendo necessária a presença de
pelo menos quatro critérios por pelo menos seis semanas para o diagnóstico positivo para AR.
Tabela 2 - Critérios de classificação de Artrite Reumatoide estabelecidos pelo
American College of Rheumatology e European League Against Rheumatism em
2010.
Pontuação de corte de 6 pontos ou mais para a artrite reumatoide*. Os pacientes também podem ser classificados como tendo artrite reumatoide se apresentarem: (a) erosões típicas; (b) doença de longa data prévia que satisfaz os critérios de classificação. * uma pontuação ≥ 6 indica diagnóstico de AR; ᵃdefinição de pequenas articulações: metacarpofalangeal, interfalangeal proximal, 2º ao 5º metatarsofalangeal e articulações interproximais do polegar e pulsos; ᵇdefinição de grandes articulações: ombros, cotovelos, quadris, joelhos e tornozelos. ACPA – anticorpo anti-peptídeo citrulinado; CRP – proteína C-reativa; FR – fator reumatoide; VHS – velocidade de hemossedimentção. Adaptado de (ALETAHA et al., 2010).
A presença de autoanticorpos no soro e líquido sinovial de pacientes é característica da doença. Entre eles, podemos destacar o fator reumatoide (FR) e o antipeptídeo citrulinado (anti-CCP, do inglês anti-
cyclic citrullinated peptides). FR é um anticorpo contra a porção Fc do
anticorpo Imunoglobulina G (IgG). FR e IgG se unem e formam complexos imunes que contribuem para causar doenças reumatológicas, como AR. FR está presente em aproximadamente 70% dos pacientes diagnosticados com AR, sendo relacionado a um pior prognóstico da
A) Comprometimento de articulaçõesa,b Pontos
1 articulação média a larga 0
2-10 articulações médias a largas 1
1-3 pequenas articulações 2
4-10 pequenas articulações 3
>10 articulações (pelo menos uma pequena articulação)
5 B) Sorologia
RF e anti-CCP negativos 0
RF baixo positivo ou anti-CCP baixo positivo
2 RF alto positivo ou anti-CCP alto positivo 3 C) Reagentes de fase aguda
CRP normal e ESR normal 0
CRP anormal ou ESR anormal 1
D) Duração dos sintomas
< 6 semanas 0
doença. No início da doença, os pacientes podem apresentar teste negativo para FR, podendo alterar o resultado durante o avanço da mesma (MOTA, DA et al., 2011). O teste para anti-CCP revela ser mais específico para o diagnóstico de AR quando comparado ao teste de FR, sendo identificado precocemente no curso da doença, podendo inclusive preceder a eclosão da mesma (BIZZARO et al., 2001; SILVA, DA et al., 2006; VOS et al., 2017). Por se tratar de uma doença com caráter inflamatório, testes de marcadores inflamatórios também auxiliam no prognóstico e diagnóstico de AR. O teste de detecção de proteína C (Proteína C reativa - CRP, do inglês C Reactive Protein) é utilizado para detecção de inflamação, onde em fase aguda da doença, a concentração sérica de proteína C aumenta significativamente. Entretanto, no contexto clínico o teste tem caráter inespecífico, pois não se pode determinar com precisão a origem da inflamação. Mais do que critérios para diagnósticos, os testes servem, portanto, para avaliar o prognóstico e monitorar a eficácia dos tratamentos para AR (TAYLOR et al., 2011; NIELSEN et al., 2012; AGUIAR et al., 2013; ALETAHA; ALASTI; SMOLEN, 2015). Em setembro de 2017, a Sociedade Brasileira de Reumatologia (SBR) anunciou as novas Diretrizes de Tratamento para Artrite Reumatoide (DTAR), que inclui princípios básicos de conduta e abordagem terapêutica, conforme o histórico clínico do paciente, a gravidade da doença e sustentabilidade do tratamento. A nova DTAR inclui como abordagem inicial: uso de medicamentos sintéticos convencionais, sendo o metotrexato de primeira escolha; oito opções de medicamentos biológicos, que deve ser adotado quando o paciente não responde ao tratamento inicial e a inclusão de medicamento de nova classe, um inibidor de janus cinase (JAK, do inglês janus kinase), proteína da família das tirosina cinase (PTK, do inglês protein tyrosine kinases), com papel fundamental no desenvolvimento de AR (https://www.reumatologia.org.br/).
A causa da AR ainda é desconhecida, entretanto há evidências de que fatores genéticos, ambientais e imunológicos estejam envolvidos no processo de manifestação da doença.
Visto que AR, assim como LES, está relacionada ao sexo feminino, estudos que associam variantes dos genes que codificam receptores do hormônio estrógeno e essa patologia vêm sendo desenvolvidos (DZIEDZIEJKO et al., 2011; DOUKAS et al., 2013; MA et al., 2015). Um artigo do grupo de pesquisa do LAPOGE-UFSC, submetido para publicação em 2017, cuja autora da presente tese é coautora, mostra que a variante rs2234693 do gene receptor de estrógeno ESR1 foi associada a AR em pacientes de Santa Catarina. Após estratificação das amostras, a
variante genética foi associada à presença de hipertensão arterial, osteoporose e cardiopatia nos pacientes (Löfgren et. al., 2017, no prelo) (Anexo 9).
Ainda, diversos estudos de associação genética e AR estão associando variantes genéticas do MHC à doença (BRENOL et al., 2012; DANILA; LAUFER, 2017; DAS et al., 2017; EYRE et al., 2017; SCALLY et al., 2017; SONG; LIN, 2017; VIATTE; BARTON, 2017; WU et al., 2017).
Um trabalho de mestrado do grupo de pesquisa do LAPOGE-UFSC demonstrou que as variantes +3196G/C e AluyHGInDel da região 3´UT do HLA-G são associados à AR em pacientes da população de Santa Catarina. As manifestações clínicas positivas para os testes de anti-FR e anti-CCP também foram associadas a alelos e genótipos específicos dos polimorfismos +3003C/T, +3010G/C e +3196G/C (KARASIAK, 2015). Algumas variantes do HLA-G também foram associadas à suscetibilidade ou proteção de AR em pacientes da população brasileira de Recife/PE (CATAMO et al., 2014). O presente trabalho descreve o estudo inédito das variantes da 5´URR do HLA-G em pacientes com AR do estado de Santa Catarina.
2.4 PSORÍASE
A psoríase (PSO) é uma doença de pele comum, crônica, não transmissível, dolorosa e incapacitante, com grande impacto negativo na qualidade de vida do paciente. Psora, do grego, significa coceira, prurido, sintoma frequente em pacientes que possuem essa doença cutânea. A PSO caracteriza-se pelo aparecimento de lesões avermelhadas, localizadas ou generalizadas, simétricas e demarcadas (pápulas); e geralmente cobertas por escamas brancas ou prateadas, que acometem principalmente joelhos, cotovelos e couro cabeludo. Entretanto, essas lesões podem surgir em qualquer parte do corpo (GARDINER; DUNPHY, 2011; PERERA et al., 2012).
PSO afeta ambos sexos igualmente (LEVINE; GOTTLIEB, 2009) e pode se manifestar em qualquer idade, sobretudo nas faixas etárias de 16 a 30 anos e 50 a 69 anos (GRIFFITHS; BARKER, 2007; PERERA et al., 2012). A prevalência de PSO varia de 0,09% a 11,4%, tornando-a um grave problema de saúde global, com pelo menos 100 milhões de indivíduos afetados em todo o mundo (DANIELSEN et al., 2013; WHO, 2016). Entre outubro de 2015 e janeiro de 2016, a Sociedade Brasileira de Dermatologia (SBD) realizou uma pesquisa inédita na América do Sul que mostrou a variação da prevalência da doença nas regiões brasileiras,
indo de 0,92% na região Norte a 1,88% na região Sudeste. Foram contatados, via telefone, 8.947 moradores de 3.002 domicílios de 26 estados brasileiros, constatando-se 117 casos de psoríase com diagnóstico confirmado por médicos, dos quais 59 homens (1,47%) e 58 mulheres (1,15%). Os pacientes diagnosticados têm idades entre 19 e 52 anos (ROMITI et al., 2017).
Dos pacientes diagnosticados com PSO, até 35% podem desenvolver artrite inflamatória crônica (artrite psoriásica) que leva a deformações articulares e deficiência (PARISER et al., 2016) e até 70% dos pacientes desenvolvem alterações nas unhas (REICH et al., 2009; ABDULMOHSEN ALSRISRI et al., 2016). Além desses sinais clínicos, os indivíduos com PSO apresentam risco aumentado de desenvolver outras comorbidades graves, como doenças cardiovasculares, síndrome metabólica, doença inflamatória intestinal e depressão (BOEHNCKE; SCHÖN, 2015).
A etiologia da PSO não é clara, embora haja evidências de predisposição genética e um forte papel do sistema imunológico na causa da psoríase (HARDEN; KRUEGER; BOWCOCK, 2015). Apesar de haver uma sugestão de que a PSO possa ser considerada uma doença autoimune, nenhum autoantígeno que poderia ser o responsável por sua causa foi definido até o momento. A PSO também pode ser provocada por fatores externos e internos, como trauma leve, queimaduras solares, infecções, drogas sistêmicas e estresse (BOEHNCKE; SCHÖN, 2015).
Estudos populacionais têm evidenciado bases genéticas da PSO; como: elevada incidência familial (até 36%), variação de incidência de casos na prole (de 8 a 16% quando apenas um dos pais é afetado pela doença e de até 41% quando ambos são afetados) e concordância quanto à presença da doença em gêmeos monozigóticos (35 a 73%) e dizigóticos (2 a 20%) (GRIFFITHS; BARKER, 2007; DUFFIN et al., 2010; PERERA et al., 2012). A falta de concordância 100% entre gêmeos monozigóticos e a falta de um padrão claro de herança familial sugerem que a doença seja de origem multifatorial, influenciada por fatores genéticos e ambientais, onde a expressão de cada gene relacionado à patologia, individualmente, contribui para o desenvolvimento da mesma (MAK; HUNDHAUSEN; NESTLE, 2009; ROBERSON; BOWCOCK, 2010; HARDEN et al., 2015).
Até o momento, foram descritos muitos loci associados à suscetibilidade à PSO em um segmento denominado de PSORS (psoriasis
susceptibility). A região que corresponde à PSORS1 é considerada o
maior determinante da psoríase (envolvida em 30 a 50% dos casos) e está localizada no MHC, onde estão os genes que codificam os HLA. Análises
de sequências genéticas nessa região têm associado o gene HLA-C à PSO. Foi demonstrado que mais de 60% dos pacientes possuem o alelo
HLA-Cw*0602 no HLA-C. A presença desse genótipo foi associada a um risco
20 vezes maior de desenvolver a doença, quando comparada a indivíduos heterozigotos para esse alelo (TREMBATH et al., 1997; NAIR et al., 2006). Além desse locus, acredita-se que aproximadamente mais 40 loci estão associados à psoríase, tendo a maioria desses genes funções relacionadas ao sistema imunológico inato e adaptativo (NESTLE et al., 2005; CAPON et al., 2012; TSOI et al., 2012).
Trabalho do grupo de pesquisa do LAPOGE-UFSC identificou polimorfismos da região 3´não traduzida do HLA-G associados às manifestações clínicas da PSO em pacientes da população de Santa Catarina. Foi demonstrado que o alelo Del e o genótipo Del/Del do polimorfismo 14pbDel/In estão relacionados à manifestação de artrite psoriásica e que o genótipo CC do polimorfismo +3142G/C e o CT do
+3003C/T estão associados aos indivíduos que manifestaram a doença
antes dos 30 anos (ALMEIDA, 2012). Até a finalização do presente trabalho, não havia sido realizado nenhum estudo de associação entre os sítios polimórficos da região 5´UR do gene HLA-G à PSO e suas manifestações clínicas.
2.5 COMPLEXO PRINCIPAL DE
HISTOCOMPATIBILIDADE
Duas hipóteses são propostas para o surgimento do Complexo Principal de Histocompatibilidade durante a evolução dos animais. A primeira hipótese é de que o MHC surgiu juntamente com o aparecimento da imunidade adaptativa antes da emergência dos animais vertebrados com mandíbula. Essa hipótese se dá em virtude de o complexo ser encontrado apenas em animais vertebrados com mandíbula e não em outros metazoários. Isso pode ser mostrado não apenas no nível funcional, por a imunidade adaptativa existir apenas em vertebrados com mandíbula, mas também a nível molecular, pois moléculas chave no sistema imune adaptativo também são encontradas apenas nesses animais (KLEIN; SATO; MEYER, 2000). A segunda hipótese é de que o MHC surgiu anteriormente ao surgimento desses animais, posteriormente a isso ele foi perdido em todas as linhagens exceto nos vertebrados com mandíbula. Essa hipótese, porém, é a menos aceita atualmente (KLEIN et al., 2000; DANCHIN et al., 2004).
Em mamíferos, o MHC foi descoberto a partir de estudos de transplantes de tecidos (CHESLEY; DUNN, 1936), e somente anos
depois foram elucidadas a estrutura e função das moléculas no MHC. O termo MHC surgiu nos anos 40, a partir de estudos de transplantes em ratos que revelaram o papel de glicoproteínas codificadas pelo MHC na autoidentificação ou histocompatibilidade. Os pesquisadores demonstraram que uma única região gênica é a principal responsável pela rápida rejeição de enxertos de tecidos, e essa região foi então chamada de
locus principal de histocompatibilidade (GORER; LYMAN; SNELL,
1948). Inicialmente, acreditava-se que um único gene era responsável pela compatibilidade dos tecidos, no entanto, após diversos intercruzamentos de diferentes linhagens foi revelado que a região genômica que controlava a rejeição de enxertos continha vários genes interligados (ABBAS et al., 2015). Em 1975, Doherty e Zinkernagel relacionaram o papel das moléculas do MHC com a apresentação de antígenos (DOHERTY; ZINKERNAGEL, 1975a, 1975b).
Os genes do MHC se dispõem em três grupos com base na sua estrutura e função, chamados MHC de classe I, II e III. A principal função das moléculas da classe I clássica (ou de classe Ia) é apresentar peptídeos citosólicos estranhos às células T CD8+ (TOWNSEND; GOTCH; DAVEY, 1985; CRESSWELL, 2005). Além dessa função, as moléculas de classe I não clássicas (ou de classe Ib) possuem outras funções celulares comumente realizadas por células epiteliais, especificamente em áreas de transporte celular e regulação de resposta de linfócitos à células epiteliais alteradas e a antígenos bacterianos (BLUMBERG, 1998). As moléculas do MHC de classe II têm a função de apresentar peptídeos apenas de origem exógena às células T CD4+, desencadeando uma resposta imune, como a ativação da produção de anticorpos por células B (CRESSWELL et al., 2005). As moléculas de classe II também são classificadas em clássicas (ou de classe IIa) e não clássicas (ou de classe IIb) baseadas nas suas habilidades e inabilidades de apresentação de antígenos (UJVARI; BELOV, 2011). A região do MHC de classe III, contém uma variedade de genes que não tem a capacidade de apresentação de antígenos, mas que codificam moléculas com outras funções imunes, como componentes do sistema complemento (C2, C4 e fator B) e citocinas (TNF-α) (ABBAS et al., 2015).
No MHC encontra-se o HLA. O HLA está localizado no braço curto do cromossomo 6 (6p.21.3), ocupando um grande segmento de DNA, que se estende por cerca de 3.500 Kb (quilobases) e compreende mais de 200 genes (Figura 1), onde 40% de seus produtos proteicos estão envolvidos com funções imunes (MEHRA; KAUR, 2003; DANCHIN et al., 2004; HVIID, 2006; CASTELLI et al., 2011).
Figura 1 - Mapa esquemático do MHC humano. A localização da região do MHC humano no cromossomo 6 (6p.21.3), a disposição dos genes dentro das classes I, II e III; e em amarelo destaque para o locus HLA-G.
Fonte: Adaptado de (MEHRA; KAUR, 2003).
Os genes mais conhecidos da região de classe I do MHC são os genes HLA-A, HLA-B e HLA-C (clássicos, ou de classe Ia) que são altamente polimórficos e codificam para três moléculas do MHC com o mesmo nome. Os genes HLA-E, HLA-F e HLA-G fazem parte da região do MHC de classe I não clássico (ou de classe Ib), possuem polimorfismos limitados, são mais conservados, e além disso, alguns dos genes dessa região apresentam expressão tecidual restrita, como o
HLA-G, gene objeto deste estudo. Além desses, o MHC possui pseudogenes,
ou seja, genes que não codificam nenhum produto, são eles: HLA-H,
HLA-J, HLA-K e HLA-L (CAROSELLA; FAVIER; et al., 2008;
CASTELLI et al., 2009; UJVARI; BELOV, 2011). As moléculas proteicas do HLA da classe I (Ia e Ib) são compostas por duas cadeias polipeptídicas ligadas de forma não covalente por uma cadeia α codificada no MHC e por uma subunidade de β2-microglobulina (β2m) codificada por um gene localizado no cromossomo 15 (Figura 2) (ABBAS et al., 2015).
Figura 2 - Estrutura de uma molécula de MHC de classe I.
Fonte: (ABBAS et al., 2015).
2.5.1 HLA-G: do Gene à Proteína
O HLA-G é um gene não clássico de classe Ib apresenta um número de polimorfismos restrito em sua região codificadora, quando comparado aos genes HLA de classe Ia. O gene possui 53 variantes descritas, que codificam 18 proteínas distintas (CASTELLI et al., 2011; DONADI et al., 2011; CASTELLI, E. C. (B) et al., 2014; ROBINSON et al., 2015). Além dos polimorfismos da região codificadora, o HLA-G apresenta polimorfismos nas suas regiões reguladoras 5´UR e 3´UT, descritos no item 2.5.2.
A estrutura gênica do HLA-G consiste em 4.164 pares de bases (pb) (EMBL-EBI, 2017) divididos em regiões reguladoras e codificadora (MOREAU et al., 2009; CASTELLI et al., 2011; DONADI et al., 2011). Inicialmente o gene HLA-G foi dividido em oito éxons e sete íntrons, pois acreditava-se que o gene compartilhava similaridades estruturais com os outros genes HLA clássicos HLA-A, HLA-B e HLA-C. Entretanto, mais tarde foi identificada maior semelhança do HLA-G com o HLA-E (MOREAU et al., 2009; CASTELLI et al., 2011).
Atualmente, a nomenclatura assumida como mais completa se baseia pelo NCBI/Ensembl, na qual o éxon 1 é a parte inicial e o éxon 2 codifica a porção final da 5´UTR (do inglês, 5´untranslated region), que se mantém no mRNA maduro e contém o principal ponto de início da tradução (CASTELLI, E. C. et al., 2014). Os éxons 3, 4 e 5 codificam para domínios extracelulares da proteína, sendo α1, α2 e α3, respectivamente. O éxon 6 codifica para o domínio transmembranar, ausente nas isoformas solúveis e o éxon 7 codifica para a cauda
citoplasmática da proteína. Esse éxon possui um códon de parada, resultando em uma cauda citoplasmática mais curta, comparada as moléculas de HLA clássicas Ia. Por fim, o éxon 8 é considerado como parte da região 3’UTR por não ser traduzido devido ao códon de parada do éxon 7 (MOREAU et al., 2009; DONADI et al., 2011; GIMENES et al., 2014).
O processamento do transcrito primário do HLA-G resulta em 7 diferentes isoformas proteicas, sendo quatro ligadas a membrana (HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3 e HLA-G4) e três isoformas proteicas solúveis (HLA-G5, HLA-G6 e HLA-G7). HLA-G1 a G4 são formas ligadas à membrana devido a presença da cauda transmembranar e citoplasmática codificada pelo éxon 7. HLA-G1 ligada a membrana é a forma completa da molécula, com estrutura similar às moléculas HLA clássicas: uma cadeia pesada formada pelos três domínios α1, α2 e α3 associada a β2m. HLA-G2 não possui o domínio α2 codificado pelo éxon 4. HLA-G3 não apresenta os domínios α2 e α3, codificados pelos éxons 4 e 5, respectivamente. A proteína HLA-G4 não contém o domínio α3, codificado pelo éxon 5. HLA-G5 e HLA-6 são solúveis devido ao códon de parada prematuro que impede a tradução da cauda transmembrana e citoplasmática. O HLA-G7 é uma isoforma solúvel devido a presença do íntron 2, que também contém um códon de parada (ISHITANI; GERAGHTY, 1992; MOREAU et al., 2009; DONADI et al., 2011; GIMENES et al., 2014). A representação esquemática da estrutura gênica do HLA-G e suas respectivas proteínas podem ser visualizadas na Figura 3.
O splicing alternativo do transcrito primário do HLA-G mostra um papel fundamental na sua regulação e indica que a quantidade e o tipo de expressão de HLA-G pode ser célula-dependente. Em indivíduos saudáveis o nível de transcrição basal do HLA-G é observado na maioria dos tecidos, entretanto a tradução em proteína é restrita ao trofoblasto na interface materno-fetal, epitélio do timo, epitélio da córnea, células tronco mesenquimais (MSCs), matriz da unha, células pancreáticas, eritrócitos e células precursoras endoteliais adultas (CAROSELLA et al., 2003; CAROSELLA; FAVIER; et al., 2008). A expressão de HLA-G também pode ocorrer em condições patológicas, como em tecidos de tumores malignos, doenças infecciosas e doenças inflamatórias e autoimunes (AMIOT et al., 2011; CAROSELLA, 2011; GIMENES et al., 2014).
