Ana Cristina de Bem Alves
EFEITOS DA ATIVIDADE FÍSICA SOBRE O COMPORTAMENTO TIPO-DOENTIO E ATIVAÇÃO CORTICAL DO INFLAMASSOMA NLRP3 INDUZIDO
POR LIPOLISSACARÍDEO EM CAMUNDONGOS
Dissertação submetida ao Programa de Pós-graduação em Neurociências da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de Mestre em Neurociências
Orientador: Prof. Dr. Aderbal Silva Aguiar Junior
Co-orientadora: Profa. Dra. Roberta de Paula Martins
Florianópolis 2018
Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor,
através do Programa de Geração Automática da Biblioteca Universitária da UFSC.
Alves , Ana Cristina de Bem
Efeitos da atividade física sobre o comportamento tipo-doentio e ativação cortical do inflamassoma NLRP3 induzido por lipopolissacarídeo em camundongos / Ana Cristina de Bem Alves ; orientador, Aderbal Silva Aguiar Junior, coorientadora, Roberta de Paula Martins , 2018.
58 p.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2018.
Inclui referências.
1. Neurociências. 2. Atividade física . 3. Neuroinflamação . 4. Lipopolissacarídeo. 5. Comportamento tipo-doentio. I. Silva Aguiar Junior, Aderbal . II. de Paula Martins , Roberta . III. Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Neurociências. IV. Título.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por ser caminho, verdade e luz na minha vida.
Agradeço especialmente ao meu orientador e pai cientifico Prof. Dr. Aderbal Aguiar Silva Junior, por toda a dedicação e orientação durante esses anos, e a minha coorientadora Profa. Dra. Roberta de
Paula Martins pela atenção dispendida e igual dedicação. Na figura do Prof. Dr. Adair Roberto Soares dos Santos, coordenador do Programa de Pós-Graduação em Neurociências da
UFSC, agradeço a todos os docentes do PPGNeuro, que contribuíram para minha formação como mestre. Aproveito para agradecer também aos colegas do PPGNeuro pela amizade e troca
de conhecimento.
Aos colegas do Laboratório de Bioenergética e Estresse Oxidativo (LABOX) pela parceria e ajuda na realização deste trabalho,
principalmente Débora e Ananda. Em especial à Profa. Dra. Alexandra Susana Latini pela oportunidade de fazer parte do grupo
e participar de seus projetos. Agradeço também a doutoranda Samantha Lopes e o Prof. Dr. Rui Prediger do LEXDON pela
ajuda e orientação durante a execução desse projeto. Aos amigos, especialmente Nicole, Julia, Raul e Pedro pelo suporte
psicológico durante esta jornada.
Ao CNPq, CAPES e FAPESC pelo apoio financeiro. E por último, mas não menos importante, agradeço principalmente à minha família, por ser minha base de apoio e amor incondicional. Ao meu pai, Santana, por ser meu exemplo de esforço. À minha
mãe, Nizete, por ser meu exemplo de amor. Ao meu irmão, Gabriel, por ser minha referência de paciência. À minha irmã, Maria Luiza, por me fazer rir em todos os momentos. E ao meu
irmão, Mateus, por ser meu exemplo de companheirismo. Sem vocês eu nada seria.
O sucesso nasce do querer, da determinação e persistência em se chegar a um objetivo. Mesmo não atingindo o alvo, quem busca e vence obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis (José de Alencar, 1829-1877)
RESUMO
INTRODUÇÃO: A resposta inflamatória persistente acarreta danos celulares no sistema nervoso central. A neuroinflamação, por sua vez, desencadeia um comportamento tipo-doentio, caracterizado pela anedonia, isolamento social e prejuízo no comportamento alimentar. Entre as citocinas pró-inflamatórias mais estudadas está a IL-1β que necessita ser clivada pelo complexo inflamassoma NLRP3 para se tornar ativa. Em contrapartida, a atividade física possui efeitos anti-inflamatórios e antioxidantes contribuindo para funções neuronais normais. OBJETIVOS: Analisar o efeito de seis semanas de atividade física em rodas de correr sobre o comportamento tipo-doentio e ativação cortical do inflamassoma NLRP3 pelo lipopolissacarídeo (LPS). MÉTODOS: 135 camundongos suíços machos, 8-9 semanas de idade, massa corporal 47,1±0,7 gramas, foram divididos em grupo atividade física [(RC) roda de corrida livre] e grupo sedentário [(SED) roda de corrida bloqueada]. Após seis semanas, metade dos animais recebeu lipopolissacarídeo (0,33 mg/kg, via intraperitoneal) para indução de neuroinflamação, enquanto a outra metade dos animais recebeu salina [(SAL) NaCl 0,9%, 10 mL/kg via intraperitoneal] para controle. Quatro horas após as administrações foram realizados o teste do campo aberto e interação social. O conteúdo proteico de NLRP3 no córtex pré-frontal dos animais foi analisado por Western blot. RESULTADOS: A atividade física protegeu contra o comportamento tipo-doentio induzido pelo LPS, mas não afetou a ativação cortical do inflamassoma NLRP3. CONCLUSÃO: Nossos resultados fortalecem a indicação da atividade física em doenças com patologia neuroinflamatória, como a doença de Parkinson e a doença de Alzheimer.
Palavras-chave: Atividade física. Roda de corrida. Neuroinflamação. Lipopolissacarídeo. NLRP3. Comportamento tipo-doentio.
ABSTRACT
INTRODUCTION: The persistent inflammatory response causes cellular damage in the central nervous system. Neuroinflammation, in turn, triggers a sickness behavior, characterized by anecdotal, social isolation and decreased food intake. One of the most studied proinflammatory cytokines is IL-1β which needs to be cleaved by the inflammatory complex NLRP3 to become active. In contrast, physical activity has anti-inflammatory and antioxidant effects contributing to normal neuronal functions. OBJECTIVES: To analyze the effect of six weeks of physical activity on running wheels on the sickness behavior and cortical activation of the NLRP3 inflammassome by lipopolysaccharide (LPS). METHODS: 135 Swiss male mice, 8-9 weeks old, body mass 47.1 ± 0.7 grams, were divided into physical activity group [(RC) free running wheel] and sedentary group [(SED) blocked running wheel] . After six weeks, half of the animals received lipopolysaccharide (0.33 mg/kg, intraperitoneal) for induction of neuroinflammation, while the other half of the animals received saline [(SAL) NaCl 0.9%, 10 mL/kg intraperitoneal] as control. Four hours after the administrations, the open field and social interaction tests were performed. The protein content of NLRP3 in the prefrontal cortex of the animals was analyzed by Western blot. RESULTS: Physical activity protected against LPS-induced sickness behavior, but did not affect the cortical activation of the NLRP3 inflammassome. CONCLUSION: Our results support the indication of physical activity in diseases with neuroinflammatory pathology, such as Parkinson's disease and Alzheimer's disease
Keywords: Physical activity. Running wheel. Neuroinflammation. Lipopolysaccharide. NLRP3. Sickness behavior.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - A cascata de sinalização do inflamassoma NLRP3 ...6 Figura 2 - Cascata de sinalização pró-inflamatória induzida pelo LPS...8 Figura 3 - Linha do tempo esquemática do modelo de lipopolissacarídeo (LPS) na depressão...11 Figura 4 - Rodas de corrida...17 Figura 5 - Desenho
experimental...19 Figura 6 - Efeito da atividade física sobre o desempenho físico dos animais nas rodas de corrida e a massa corporal dos animais...23 Figura 7 - Efeito da atividade física no campo aberto após administração de LPS...24 Figura 8 - Efeito da atividade física no campo aberto após administração de LPS...25 Figura 9 - Efeito da atividade física no teste comportamental interação social após administração de LPS...26 Figura 10 - Efeito da atividade física sobre o conteúdo de NLRP3 após administração de LPS...27
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 5-HT – 5-hidroxitriptamina (serotonina)
ASC – Proteína adaptadora associada a apoptose BDNF – Fator neurotrófico derivado do encéfalo CEUA – Comitê de ética no uso de animais
COX2 – Prostaglandina-endoperóxido sintase2 (ciclo-oxigenase2)
DA – Doença de Alzheimer
DAMPs – Padrões moleculares associados ao perigo DCs – Células dendríticas
DP – Doença de Parkinson
EDTA – Ácido etilenodiaminotetracético EPM – Erro padrão da média
HPA – Eixo hipotálamo-pituitária-adrenal i.p. – Intraperitoneal
IDO – Indoleamina 2,3 dioxigenase IL – Interleucina
IL-1β – Interleucina 1 beta
iNOS – Óxido nítrico sintase induzível LPS – Lipopolissacarídeo
LTD – Depressão de longa duração LTP – Potenciação de longa duração
MAPKs – Proteínas cinases ativadas por mitógeno NaCl – Cloreto de sódio
NF-kB – Fator nuclear kappa B
PAMPs – Padrões moleculares associados ao patógeno PMSF – Fluoreto de fenilmetilsulfonil
PRRs – Receptores de reconhecimento padrão SAL – Salina
SNC – Sistema Nervoso Central SNP – Sistema Nervoso Periférico TBS – Solução salina tris-tamponada
TBS-T – Solução salina tris-tamponada, 0.1% + tween 20 TLRs – Receptores do tipo toll
TLR-4 – Receptores do tipo toll-like4 TNF-α – Fator de necrose tumoral alfa
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO... 1
1.1 NEUROINFLAMAÇÃO... 2
1.1.1 Inflamassoma NLRP3 ... 4
1.1.2 Modelo de neuroinflamação induzida por Lipopolissacarídeo (LPS) ... 7
1.1.3 Comportamento tipo doentio ... 9
1.2 ATIVIDADE FÍSICA ... 11
2 OBJETIVOS ...15
2.1 OBJETIVO GERAL ... 15
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 15
3 METODOLOGIA ...16
3.1 ANIMAIS E PROTOCOLO EXPERIMENTAL ... 16
3.2 TESTES COMPORTAMENTAIS ... 18
3.2.1 Teste do Campo Aberto e Interação Social .... 18
3.3 EUTANASIA E ANÁLISES BIOQUÍMICAS ... 20
3.3.1 Western blot ... 20
3.3.1.1 Preparação e análise das amostras ... 20
3.3.2 Dosagem de proteínas ... 21
3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 21
4 RESULTADOS ...23
4.1 DESEMPENHO FÍSICO DOS ANIMAIS NAS RODAS DE CORRIDA E MASSA CORPORAL ... 23
4.2 EFEITOS DA ATIVIDADE FÍSICA E LPS NOS TESTES COMPORTAMENTAIS DO CAMPO ABERTO E INTERAÇÃO SOCIAL ... 24
4.3 EFEITO DA ATIVIDADE FÍSICA E DO LPS SOBRE O CONTEÚDO PROTEICO DE NLRP3 NO CÓRTEX PRÉ-FRONTAL DOS CAMUNDONGOS ... 27
5 DISCUSSÃO ... 28 6 CONCLUSÃO ... 32 REFERÊNCIAS ... 33
1
1 INTRODUÇÃO
Por muitos anos, o cérebro foi considerado um órgão privilegiado, que funcionava autonomamente e isoladamente do sistema imune (DI BENEDETTO et al., 2017). Atualmente, é aceito que frente a fatores intrínsecos e ambientais o cérebro é capaz de alterações estruturais e funcionaisdurante a vida (LÖVDÉN et al., 2013). O sistema imune e o Sistema Nervoso Central (SNC) representam os dois principais sistemas adaptativos do corpo. Neste contexto, o prolongamento da resposta inflamatória é resultado do desajuste entre esses dois sistemas na resolução de um processo inflamatório fisiológico (ELENKOV et al., 2005). De fato, a neuroinflamação crônica influencia no desenvolvimento de doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (DA) e a doença de Parkinson (DP) (EXALTO et al., 2012; LEDESMA; DOTTI, 2012; MISIAK; LESZEK; KIEJNA, 2012). Além disso, alguns estudos demonstram que o processo inflamatório decorrente de infecções periféricas representa fator de risco importante para o desenvolvimento da DA e DP esporádicas (MAGRONE; MARZULLI; JIRILLO, 2012; SU; FEDEROFF, 2014).
Assim, a inflamação periférica é uma abordagem experimental promissora na pesquisa pelo tratamento e prevenção de doenças neurodegenerativas. O modelo animal de inflamação por injeção periférica de lipopolissacarídeo (LPS) é um dos métodos mais utilizados mundialmente para a indução de neuroinflamação (NAVA CATORCE; GEVORKIAN, 2016). Diversas intervenções farmacológicas e não farmacológicas, com propriedades anti-inflamatórias, têm sido testadas em modelos animais de neuroinflamação e neurodegeneração (NAVA CATORCE; GEVORKIAN, 2016; QIN et al., 2007). O cenário clínico atual recomenda a prática de atividade física em pacientes com doenças inflamatórias crônicas, entretanto seus mecanismos ainda
2 não estão totalmente elucidados (NADER; LUNDBERG, 2009).
Os efeitos anti-inflamatórios da atividade física são mediados por vias multidirecionais e afetam tanto os músculos esqueléticos como estruturas do SNC. Dentre os efeitos da atividade física destacam-se a modulação do perfil de citocinas anti-inflamatórias e pró-inflamatórias, fatores de transcrição sensíveis ao estado redox, enzimas antioxidantes e pró-oxidantes e proteínas de reparo (MAJKA et al., 2009). Estudos com roedores e humanos demonstram que a atividade física desempenha um papel importante na alteração das redes metabólicas, estruturais e funcionais do cérebro, conferindo proteção contra prejuízo cognitivo e melhora do humor (BARRIENTOS et al., 2011; DALLAGNOL et al., 2017; EYRE; BAUNE, 2012; KIM et al., 2010; LECKIE et al., 2014; MOYLAN et al., 2013; SNIGDHA et al., 2014; SPEISMAN et al., 2013). Embora a maioria dos estudos envolvendo atividade física em animais analisem o hipocampo, o córtex pré-frontal (CPF), participa ativamente no planejamento motor e comportamental (BASSO; MORRELL, 2015). O CPF é o local de convergência de informações de várias áreas cerebrais, atuando como um circuito de integração de sinais aferentes, confluindo informações em um único ponto. Desta forma, o CPF é responsável pelo controle neural de tarefas comportamentais simples e/ou complexas (TANJI; HOSHI, 2001)
1.1 NEUROINFLAMAÇÃO
A inflamação é uma resposta protetora fisiológica do organismo, que tem por objetivo remover o estímulo nocivo e iniciar o reparo tecidual (LI et al., 2017). Entretanto, quando persistente, a inflamação acompanha alterações no parênquima cerebral e ruptura da barreira hematoencefálica (MCMANUS; HENEKA, 2017). Durante a neuroinflamação
3 ocorre aumento da secreção de citocinas pró-inflamatórias, aumento no estresse oxidativo e até morte neuronal cerebral (LI et al., 2017). Sendo a neuroinflamação uma característica importante na patogênese e progressão da DA, DP, demência frontotemporal e esclerose lateral amiotrófica (AMOR et al., 2014; EIKELENBOOM et al., 2012; EVANS et al., 2013; HENEKA; KUMMER; LATZ, 2014; KRSTIC; KNUESEL, 2013; MURTA; FERRARI, 2013; PHILIPS; ROBBERECHT, 2011).
O sistema imune de mamíferos se defende de ameaças internas e externas usando a imunidade inata e a imunidade adaptativa (NEILL et al., 2010). A resposta imune inata responde através de receptores de reconhecimento padrão (PRRs) para se defender de patógenos endógenos e exógenos. Os PRRs são expressos principalmente em células imunes e inflamatórias como monócitos, macrófagos, neutrófilos, e células dendríticas (DCs) (SCHRODER; TSCHOPP, 2010). Os padrões moleculares associados ao patógeno (PAMPs), que são antígenos comuns de um determinado grupo de patógenos (ABDERRAZAK et al., 2015; MEDZHITOV, 2009), são normalmente reconhecidos por ao menos três PRRs: receptores tipo Toll (TLRs), lectinas tipo C (CTLs), e galactinas (BOURGEOIS; KUCHLER, 2012; DZOPALIC et al., 2012).
Os TLRs são expressos em células imunes, neurônios, astrócitos e microglia (CRACK; BRAY, 2007; HANKE; KEILIAN, 2011), e desencadeiam cascatas inflamatórias que regulam a homeostase do SNC (MEDZHITOV, 2001). O TLR mais estudado é o TLR-4, que responde predominantemente ao LPS, um componente da membrana externa de bactérias gram-negativas (TAKEDA; KAISHO; AKIRA, 2003). Na presença de um ligante, o TLR-4 ativa proteínas cinases específicas, incluindo as proteínas cinases ativadas por mitógeno (MAPKs), resultando na transcrição de genes que codificam mediadores inflamatórios, como citocinas pró-inflamatórias e enzimas pró-oxidativas (GUHA; MACKMAN, 2001; MARTÍN-HERNÁNDEZ et
4 al., 2018). Um exemplo clássico de cascata inflamatória estimulada pela ativação dos TLRs inclui o fator nuclear kappa B (NF-κB). A sinalização por NF-κB induz a transcrição de genes que codificam citocinas e enzimas associadas à inflamação, como TNF-α, interleucina-1 beta (IL-1β), IL-6, iNOS, e COX2 (HANKE; KEILIAN, 2011; KUMAR; KAWAI; AKIRA, 2009).
As citocinas são moléculas sinalizadoras que possuem funções imunomodulatórias. Elas atuam no sistema neuroendócrino, metabolismo de neurotransmissores e neuroplasticidade, afetando por consequência o comportamento e a cognição (DI BENEDETTO et al., 2017). As citocinas podem exercer suas funções de forma sinérgica ou antagônica (ALBONI; MAGGI, 2016). Durante o processo inflamatório algumas citocinas participam no aumento da inflamação, especialmente IL-1, IL-6 e TNF, enquanto outras atenuam o processo inflamatório, como a IL-4 e IL-10 (OWNBY, 2010). Estudos demonstram que existe transporte bidirecional de citocinas entre o SNC e a periferia (KHAIROVA et al., 2009; SCHEINERT et al., 2015). Embora se desconheçam os mecanismos exatos, as citocinas da circulação sanguínea podem afetar o cérebro. Uma observação comum dessa relação é a produção de comportamento tipo-doentio durante doenças infecciosas sistêmicas, como a gripe (OWNBY, 2010).
1.1.1 Inflamassoma NLRP3
A IL-1β, é uma das principais citocinas envolvidas na neuroinflamação. Ela medeia mudanças fisiológicas e comportamentais associadas com o comportamento tipo-doentio (HENRY et al., 2009). Entretanto essa citocina é produzida na sua forma imatura, pró-IL-1β, e precisa ser clivada em IL-1β pelo inflamassoma para se tornar ativa e exercer suas funções (SHAO et al., 2015). Os inflamassomas são sensores citosólicos que detectam patógenos e moléculas liberadas em situações de estresse. De forma geral, eles são
5 formados por um receptor que, quando ativado, recruta outras proteínas, formando um complexo multiproteico que ativa a caspase-1, enzima capaz de clivar e ativar citocinas pró-infamatórias, como a IL-1β e IL-18. Estes complexos são expressos principalmente em fagócitos, como os macrófagos e células dendríticas (DCs), mas também já foram detectados em outros tipos celulares, como neurônios (INOUE; SHINOHARA, 2013).
Atualmente, o NLRP3, também chamado de criopirina, é o inflamassoma mais caracterizado. Ele é composto por três proteínas diferentes: o receptor NLRP3, a proteína adaptadora associada a apoptose (ASC), e a pró-caspase-1 (INOUE; SHINOHARA, 2013).A ativação desse inflamassoma parece ocorrer em dois passos (OZAKI;
CAMPBELL; DOYLE, 2015; SUTTERWALA;
HAASKEN; CASSEL, 2014; ZHONG; KINIO; SALEH, 2013). O primeiro passo envolve um sinal de iniciação decorrente do reconhecimento de PAMPs ou DAMPs (padrões moleculares associados a perigo) por TLRs. A ligação aos TLRs leva a ativação da sinalização mediada por NF-κB, que então regula a transcrição do NLRP3 inativo, pró-IL-1β e pró-IL-18 (BAUERNFEIND et al., 2010; FRANCHI; MUÑOZ-PLANILLO; NÚÑEZ, 2012). O segundo passo da ativação do inflamassoma é a oligomerização do NLRP3 e subsequente montagem do complexo, formado por NLRP3, ASC e pró-caspase-1. Por último, o inflamassoma NLRP3 ativo cliva a pró-caspase-1 em caspase-1, assim como acarreta a produção e secreção de IL-1β e IL-18 maduras (figura 1) (KIM et al., 2015; OZAKI; CAMPBELL; DOYLE, 2015).
6 Figura 1. A cascata de sinalização do inflamassoma NLRP3.
A ativação do inflamassoma NLRP3 requer um sinal inicial (sinal 1), como a ativação do receptor TLR ou TNF, que ativam o NF-κB. Esse sinal inicial induz transcrição do NLRP3 e pró-IL-1β. Um segundo sinal de ativação específico do NLRP3 desencadeia mudanças de conformação que resultam na oligomerização do NLRP3 (sinal 2) . Ao final de uma série de alterações, a caspase-1 torna-se ativa. Caspase-1 ativa processa pró-IL-1β e pró-IL-18 em suas formas maduras ativas, que são secretadas. Abreviações: ASC (Proteína adaptadora associada a apoptose); IL (Interleucina); NF-kB (Fator nuclear kappa B); TLRs (Receptores do tipo toll); TNF (Fator de necrose tumoral).
Fonte: Adaptado de https://www.researchgate.net/The-NLRP3-
inflammasome-signaling-pathway-NLRP3-inflammasome-activation-requires-an_fig3_301238097. Acessado em 17 de Outubro de 2018.
7 1.1.2 Modelo de neuroinflamação induzida por
Lipopolissacarídeo (LPS)
O LPS é um PAMP que se liga especificamente ao TLR4. O reconhecimento do LPS mediado pelo TLR4, inicia cascatas de sinalização intracelular que acarretam na produção e liberação de citocinas pró-inflamatórias (figura 2), como mencionado anteriormente (LU; YEH; OHASHI, 2008; YI et al., 2013). Experimentalmente, desafiar o sistema imune inato resulta em um estado denominado comportamento tipo-doentio, que pode progredir para o comportamento tipo depressivo (PITYCHOUTIS; PAPADOPOULOU-DAIFOTI, 2010). Sintomas tipo-doentio seguidos da administração de LPS em roedores têm sido tipicamente avaliados de 1 a 6 horas após o desafio imune (DANTZER et al., 2010).
8
O LPS se liga ao TLR4 e ativa cascatas inflamatórias que culminam na liberação de fatores pró-inflamatórios, como TNFα, IL-1β, IL-6, NOS e COX2. Abreviações: AP1 (Proteína ativadora 1); COX2 (Ciclo-oxigenase 2); ERK (Cinase reguladora de sinal extracelular); IKB (Cinase I kappa B); IKK (Cinase inibidora do fator nuclear kappa B); IL (Interleucina); JNK (Cinase c-Jun N-terminal); MAPKs (Proteínas cinases ativadas por mitógeno); MYD88 (Fator de diferenciação mielóide 88); NF-kB (Fator nuclear kappa B); NOS (Óxido nítrico sintase); P38 (Proteína p38); TLR4 (Receptore do tipo toll 4); TNFα (Fator de necrose tumoral alfa); TRAF6 (Fator 6 associado ao receptor de fator de necrose tumoral).
Figura 2. Cascata de sinalização pró-inflamatória induzida pelo LPS.
Fonte: Adaptado de Yi et al. 2013. Disponível em: http://drjacklee.pixnet.net/blog/post/187244893485. Acessado em: 17 de outubro de 2018.
9 Está bem estabelecido que a administração sistêmica de LPS via intraperitoneal (i.p.) nas doses de 0,33 mg/kg; 0,5 mg/kg; 1 mg/kg; 2 mg/kg; 5 mg/kg e 10 mg/kg resulta em aumento na concentração periférica e central de citocinas pró-inflamatórias, como a IL-1β, além do aumento na expressão gênica e conteúdo proteico em tecido cerebral (LAYE et al., 1994; NAVA CATORCE; GEVORKIAN, 2016; VAN DAM et al., 1992), mesmo quando foram administradas doses de LPS que não causam sepse (DANTZER et al., 2010).Durante um episódio inflamatório periférico, citocinas e outros mediadores inflamatórios atuam também a nível cortical, estimulando a produção de prostaglandinas e mais citocinas pró-inflamatórias in situ (PITYCHOUTIS; PAPADOPOULOU-DAIFOTI, 2010). Por sua vez, a indução de mediadores pró-inflamatórios por células da glia afeta: (1) o metabolismo de neurotransmissores (por exemplo: serotonina (5-HT) e dopamina (DA)); (2) a reatividade do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA); assim como (3) a integridade neuronal e a plasticidade sináptica em regiões cerebrais sensíveis ao estresse, como o hipocampo. De uma maneira geral, o processo inflamatório central causa um espectro amplo de efeitos, que, em última instância, leva a indução de sintomatologia tipo depressiva (PITYCHOUTIS; PAPADOPOULOU-DAIFOTI, 2010; SENS et al., 2017). 1.1.3 Comportamento tipo doentio
O comportamento tipo-doentio é uma condição decorrente de processos inflamatórios (BERG et al., 2004; D’MELLO et al., 2017; KOLMOGOROVA; MURRAY; ISMAIL, 2017; SENS et al., 2017). Ele é caracterizado por comportamentos que se sobrepõem com os sintomas clínicos da depressão, como anedonia, fadiga, redução no consumo de comida e alterações no sistema monoaminérgico cerebral (DANTZER et al., 2010). Já foi demonstrado que a liberação de citocinas pró-inflamatórias provocam alterações
10 neuroendócrinas e neuroquímicas que contribuem para o desenvolvimento da depressão (ZHAO et al., 2017). Durante os últimos anos, se estabeleceu que citocinas pró-inflamatórias induzem não apenas depressão, mas também sintomas doentios em pacientes fisicamente doentes sem história de doença mental (DANTZER et al., 2010).
Experimentos farmacológicos demonstraram que a administração sistêmica ou central de IL-1β, em ratos e camundongos, induz o comportamento tipo-doentio em uma maneira dose e tempo dependentes (DANTZER, 2001). Em geral, animais injetados com IL-1β ficam no canto de sua caixa em uma postura curvada, e mostram pouco ou nenhum interesse em ambiente físico ou social. Especificamente, eles apresentam atividade motora diminuída, isolamento social, diminuição no consumo de comida e água, aumento nas ondas lentas de sono e cognição alterada (DANTZER et al., 2010).
A literatura apresenta dois espectros de comportamentos induzidos pelo processo inflamatório decorrente da intervenção com LPS (figura 3). De 1–6 horas após a injeção periférica, os animais apresentam aumento nas concentrações de citocinas pró-inflamatórias e exibem sintomas do tipo-doentio, como a redução da ingesta de alimento e água, anedonia e falta de interesse social. Cerca de 24 horas após o LPS, ocorre a incorporação de outros fatores além da liberação de citocinas, como o aumento da atividade enzimática da indoleamina 2,3 dioxigenase (IDO), que converte o triptofano em quinurenina. O aumento da IDO marca a transição do comportamento tipo-doentio para o comportamento tipo depressivo. Isso ocorre porque a sua ativação leva a concentrações diminuídas de triptofano, o precursor da serotonina (5-HT), reduzindo então a síntese central de 5-HT. Outro papel da IDO nesse cenário é devido ao fato de que os metabólitos das quinureninas, como 3-hidroxi-quinurenina e ácido quinolínico, terem efeitos tóxicos na função cerebral (REMUS; DANTZER, 2016; WICHERS; MAES, 2004; YI et al., 2013).
11
1.2 ATIVIDADE FÍSICA
A atividade física é uma intervenção não farmacológica promissora que pode prevenir ou retardar o declínio cognitivo (KIM; KIM; SONG, 2018). Estudos com animais mostram que a atividade física acarreta efeitos benéficos em marcadores fisiológicos do envelhecimento cerebral, tais como potenciação de longa duração (LTP), De 1 a 6 horas após a administração de LPS, ocorre um aumento de citocinas periféricas como IFNy e TNFα, acarretando comportamento tipo doentio, que inclui a falta de movimento e diminuição da ingestão de alimentos e água. As citocinas pró-inflamatórias causam elevação da enzima IDO 24 horas após a injeção de LPS. Durante o mesmo tempo em que a IDO é elevada, os animais ficam anedônicos e passam mais tempo imóveis. Abreviações: IDO (indoleamina 2,3 dioxigenase); IFNy (Interferon gamma); LPS (Lipopolissacarídeo); TNFα (Fator de necrose tumoral alfa).
In ten sid ad e d o s sin to m as
Figura 3. Linha do tempo esquemática do modelo de lipopolissacarídeo (LPS) na depressão.
12 depressão de longa duração (LTD), excitabilidade celular e desempenho cognitivo (KUMAR et al., 2012). Barrientos e colegas observaram uma inibição da neuroinflamação (causada por infecção) em ratos fisicamente ativos, e aumento na expressão de BDNF (fator neurotrófico derivado do encéfalo) no cérebro de animais sedentários submetidos à atividade física (BARRIENTOS et al., 2011). Estudos com camundongos revelaram que a atividade física em rodas de corrida inibia o estado pró-inflamatório da microglia e sua habilidade de proliferar, induzindo fenótipo pró-neurogênico (KOHMAN et al., 2012). Os achados de Speisman e colaboradores demonstraram que a atividade física também regula a neurogênese em ratos velhos (SPEISMAN et al., 2013). Além disso, foi demonstrado que um programa de atividade física em ratos inibiu respostas pró-inflamatórias no hipocampo, como o nível de expressão gênica e conteúdo proteico de IL-1β, conferindo neuroproteção(CHENNAOUI et al., 2015).
Efeitos da atividade física em medidas estruturais cerebrais e neuroquímicas foram demonstrados em seres humanos também, tanto em jovens quanto em adultos (DUZEL; VAN PRAAG; SENDTNER, 2016), e mesmo se iniciado no decorrer da vida adulta (TOLPPANEN et al., 2015). Os músculos em contração liberam miocinas (DISHMAN et al., 2006; MINTER et al., 2016; MÜLLER; PAWELEC, 2014; PEDERSEN; HOFFMAN-GOETZ, 2000; PHILIPS; ROBBERECHT, 2011), que afetam a síntese de BDNF no giro denteado do hipocampo (PHILIPS; ROBBERECHT, 2011). O BDNF facilita o reparo neural (YANG et al., 2014), induz potenciação de longa duração (DIÓGENES et al., 2011), aumenta o aprendizado e a memória (PANG; LU, 2004) e promove plasticidade sináptica e neurogênese (OLIFF et al., 1998; PANG; LU, 2004; VAYNMAN; YING; GOMEZ-PINILLA, 2004), contribuindo na melhora do humor e da cognição (SILVERMAN; DEUSTER, 2014). Uma meta-análise baseada em 29 estudos estimou a força de associação entre a
13 atividade física e níveis aumentados de BDNF em humanos. A análise do tamanho do efeito apoiou o papel da atividade física como uma estratégia bem sucedida para aumentar a atividade do BDNF em humanos (SZUHANYA, KRISTIN L. , BUGATTIA, MATTEO OTTO, 2015). Além do aumento na síntese de BDNF, a atividade física também está associada à redução de citocinas pró-inflamatórias, como a IL-1β, aumento na produção de citocinas anti-inflamatórias como a IL-10, diminuição no número de monócitos pró-inflamatórios e sua expressão de TLR pró-pró-inflamatórios (TRL1, TRL2 e TRL4) (BURDETTE et al., 2010; GLEESON et al., 2011; PONTZER, 2018).
Em estudos com camundongos e ratos, as rodas de corrida livre fornecem uma medida de atividade física voluntária em um ambiente conhecido (COBOS et al., 2012). Resultados usando uma roda de correr por animal mostram o aumento da formação de novos neurônios causados pela corrida, indicando que os animais experimentaram a corrida como prazerosa, especialmente porque eles eram socialmente privados e a roda servia como enriquecimento ambiental (BROWN et al., 2003; KEMPERMANN; KUHN; GAGE, 1997; VAN PRAAG; KEMPERMANN; GAGE, 1999). Nesse sentido, outros autores também demonstraram que o efeito do enriquecimento ambiental usando apenas uma roda de corrida é o suficiente para induzir mecanismos de plasticidade celular, que são críticos para um efeito antidepressivo (ROGERS et al., 2017; SMITH et al., 2018). Greenwood e colaboradores (2003) demonstraram que 4–6 semanas de atividade física nas rodas, preveniam o estresse induzido pela depleção de norepinefrina em certos tecidos corporais (GREENWOOD et al., 2003). Da mesma forma, Campisi e colaboradores também relataram que a atividade física nas rodas de corrida está associada com o aumento da resistência ao estresse em ratos (CAMPISI et al., 2003).
Entretanto, embora a atividade física seja relatada como benéfica para o SNC, seus efeitos podem variar muito, dependendo das características do indivíduo, assim como do
14 tipo, intensidade, frequência e duração da atividade (DI BENEDETTO et al., 2017; MAJKA et al., 2009). Além disso, pouco se sabe sobre seus efeitos em marcadores neuroimunes específicos, como marcadores de imunosenescência (BEUREL et al., 2014; EYRE; BAUNE, 2012; MOYLAN et al., 2013), e ativação do complexo inflamassoma NLRP3 (GLEESON et al., 2011; MARTIN et al., 2014).
15 2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Investigar os efeitos da atividade física sobre o comportamento tipo-doentio e inflamassoma NLRP3 induzido por LPS em camundongos.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Investigar os efeitos de seis semanas de atividade física em rodas de corrida sobre o comportamento tipo-doentio induzido pelo LPS, avaliando:
I. Comportamento exploratório (locomoção e levantamentos sobre as patas traseiras) e autocuidado (grooming) utilizando o teste do campo aberto;
II. Interação social entre os machos (grupos experimentais) e fêmeas (naïve);
III. Conteúdo proteico de inflamassoma NLRP3 no córtex pré-frontal através da técnica de Western
16
3 METODOLOGIA
3.1 ANIMAIS E PROTOCOLO EXPERIMENTAL Este projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Santa Catarina – protocolo n° 1958010616 (ANEXO I).
Foram utilizados 135 camundongos Suíços, machos, adultos, com 8-9 semanas de idade, massa corporal 47,1±0,7 gramas, provenientes do biotério central da UFSC e mantidos no biotério setorial do Departamento de Bioquímica do CCB/Bloco C/UFSC. Primeiramente os animais foram alocados em caixas coletivas (38 x 31 x 17 cm), 10 animais por caixa, em ambiente com temperatura de 22±1ºC e ciclo de luz de 12 horas claro/escuro (com início do ciclo claro às 07h00min da manhã). Foram disponibilizadas ração e água ad libitum.
Após uma semana de ambientação no biotério, os animais foram isolados em caixas individuais (28 x 17 x 13 cm) para exposição ao modelo experimental de atividade física (rodas de corrida livres, figura 4) ou seus controles ambientais (rodas bloqueadas, figura 5). A próxima etapa foi a seleção de animais com boa adesão à atividade física regular. Foram fixadas rodas de corrida (12,7 cm de diâmetro) às caixas individuais. A distância percorrida por cada animal foi mensurada diariamente em intervalos de 24 horas, através de contadores digitais acoplados às rodas (figura 4), ao meio-dia. Os animais que percorreram mais de 2 km/dia durante os cinco primeiros dias, foram selecionados para compor o grupo experimental atividade física em rodas de correr livres (RC). Enquanto os animais que percorreram menos de 500 m/dia compuseram o grupo sedentário (SED), tendo suas rodas bloqueadas (figura 5). A exposição dos animais às rodas de correr livres e às rodas bloqueadas teve duração de seis semanas, conforme dados da literatura (AGUIAR et al., 2014; BAVARESCO, 2015; NADERI et
17 al., 2015; PIRES, 2017; ROCKL et al., 2007; SPEAKER et al., 2014).
Após as seis semanas de exposição às rodas (42º dia), os animais foram tratados com LPS (lote 3129, sorotipo 0127: B8, Sigma) na dose de 0,33 mg/kg através da via i.p.. Esta dose foi selecionada com base em estudos que demonstraram que uma única dose de 0,33 mg/kg de LPS via i.p., após 4 horas da administração, induz quadro inflamatório sistêmico com aumento nas concentrações de
Caixa com roda de corrida livre, acoplada a um contador digital, que permite atividade física e enriquecimento ambiental (A). Esta roda é semelhante à roda de corrida, mas não possui eixo para rotação, o que permite apenas o enriquecimento ambiental (B).
A
B
Figura 4. Rodas de corrida.
18 IL-1β e IL-6 em camundongos adultos jovens e velhos (HENRY et al., 2009; NAVA CATORCE; GEVORKIAN, 2016). O grupo controle foi tratado com veículo NaCl 0,9% (Salina, i.p.) no volume de 10 mL/kg de peso corporal. O resultado foi quatro grupos experimentais ao final de 10 experimentos independentes:
a. Sedentário + Salina (SED SAL) = 7; b. Sedentário + LPS (SED LPS) = 8; c. Roda de correr + Salina (RC SAL) = 7; d. Roda de correr + LPS (RC LPS) = 8. 3.2 TESTES COMPORTAMENTAIS
No 42º dia, os animais foram transportados (9:00h da manhã) para a sala de comportamentos de camundongos no departamento de Farmacologia do CCB/Bloco D/UFSC. A sala foi aclimatada com temperatura de 22ºC e iluminação de 10 lux e. As injeções i.p. de LPS e SAL foram realizadas após 1 hora de ambientação na sala. Quatro horas após administração de LPS e SAL, os animais foram submetidos ao teste do campo aberto por 5 minutos, seguido pelo teste de interação social por mais 5 minutos (Figura 6). Ambos os testes foram gravados em vídeo para análise no software
ANY-maze Behavioral Tracking®.
19
Para o teste do campo aberto, os camundongos machos foram colocados no centro do aparato circular (60 cm de diâmetro) e permitidos a explorar o mesmo durante 5 minutos (entre cada animal o aparato foi limpo utilizando álcool 20%). Comportamento exploratório (distância percorrida e levantamento) e de autocuidado (autolimpeza) foram analisados. O teste de interação social foi conduzido no mesmo aparato usado para o teste do campo aberto, de acordo com estudos prévios encontrados na literatura (BERG et al., 2004; GODBOUT et al., 2008; PROVENZANO; CHELINI; BOZZI, 2016). Após os 5 minutos de duração do campo aberto, uma fêmea adulta (idade semelhante a dos animais machos) foi adicionada ao aparato onde o macho já se encontrava, e a interação entre estes foi permitida durante
Figura 5. Desenho experimental.
Fonte: Imagem da autora.
Os animais foram divididos em dois grupos: sedentários (SED) e rodas de correr (RC). Durante 6 semanas, estes foram expostos às rodas bloqueadas ou livres, respectivamente. No 42º dia, foi injetado LPS ou Salina i.p., formando 4 grupos, SED SAL, SED LPS, RC SAL E RC LPS. 4 horas após o tratamento os animais foram submetidos ao teste do campo aberto (5 minutos) e, em seguida, ao teste de interação social (5 minutos). Ao final do teste os animais foram eutanasiados e o córtex pré-frontal foi coletado. Abreviações: LPS (Lipopolissacarídeo); SAL (Salina); RC (Roda de correr); SED (Sedentário); i.p. (intraperitoneal).
20 5 minutos. Foi utilizada uma fêmea diferente para cada animal macho. Parâmetros como: aproximação do macho à fêmea, seguir a fêmea, subir na fêmea, passar por cima da fêmea e cheirar o nariz (nariz-nariz) ou a região anogenital desta (HSIEH et al., 2017; WINKLER et al., 2017), foram classificados como interações sociais e desta forma, o número, tempo e a latência de contatos foram analisados. 3.3 EUTANASIA E ANÁLISES BIOQUÍMICAS
Os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical após o teste comportamental de interação social. O córtex pré-frontal foi dissecado e imediatamente congelado em nitrogênio líquido, sendo armazenado em temperatura de -80°C até análise de Western blot.
3.3.1 Western blot
3.3.1.1 Preparação e análise das amostras
O córtex pré-frontal foi homogeneizado em 2,5 volumes (1:2,5, p/v) de tampão de homogeneização (Tris 50 mM pH 7,0 contendo EDTA 1 mM, fluoreto de sódio (NaF) 100 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF) 0,1 mM, ortovanadato de sódio (Na3VO4) 2 mM, Triton X- 100 a 1%, glicerol a 10% e coquetel de inibidores de protease [Roche, Mannheim, Alemanha]). Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 10.000 × g, durante 10 min a 4°C e o sobrenadante foi coletado e diluído em um volume (1:1, v/v) de tampão Tris 100 mM, pH 6,8 contendo EDTA 4 mM e dodecil sulfato de sódio (SDS) a 8%. Após, as amostras foram aquecidas a 100°C durante 5 minutos e adicionou-se o tampão de diluição (Tris 100 mM, com 40% de glicerol e azul de bromofenol, pH 6,8), numa proporção 25:100 (v/v), e β-mercaptoetanol (na concentração final de 8%)
Para quantificação do inflamassoma NLRP3 por
21 foram separadas através de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS, utilizando gel de separação com concentração de 8% e gel de entrada de 4%. A eletroforese foi realizada com corrente de 40 mA e voltagem máxima de 120 mV (constante) durante aproximadamente 2-3 horas. Após a corrida, as proteínas dos géis foram transferidas para membranas de nitrocelulose usando um sistema úmido (1 hora). Em seguida, as membranas foram bloqueadas com 5% de albumina em TBS (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) e lavadas com TBS-T (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 0,1%, pH 7,5). Posteriormente, as membranas foram incubadas com o anticorpo primário anti-NLRP3 (Santa Cruz, na concentração de 1:500) e seu respectivo anticorpo secundário (anti-cabra Santa Cruz na concentração de 1:2000). O imunocomplexo foi visualizado usando o sistema de detecção por quimiolumininescência ECL (GE Healthcare, São Paulo, SP, Brazil), e as membranas foram reveladas através do aparelho ChemiDoc™ Imaging System disponível no Laboratório Multiusuário de Estudos em Biologia (LAMEB) do CCB/UFSC. As bandas imunorreativas foram quantificadas usando o software ImageLabTM .
3.3.2 Dosagem de proteínas
O método de Lowry modificado (PETERSON, 1977), que usa albumina sérica bovina (BSA) como padrão, foi utilizado para dosagem de proteínas totais das amostras do córtex pré-frontal (AGUIAR et al., 2014; BAVARESCO, 2015; DALLAGNOL et al., 2017; MARTINS, 2016; PIRES, 2017).
3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os valores fora da curva de normalidade foram detectados usando o teste de Grubbs (conhecido como ESD:
22 análise. Os resultados foram descritos como média ± erro padrão da média (EPM). A inferência foi realizada através de análise da variância (ANOVA) de duas vias e teste post
hoc de Bonferroni. As diferenças foram consideradas
significativas quando P<0,05. A plataforma estatística utilizada foi o software GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., La Jolla California USA).
23 4 RESULTADOS
4.1 DESEMPENHO FÍSICO DOS ANIMAIS NAS RODAS DE CORRIDA E MASSA CORPORAL A adesão dos animais às RC foi de 9,4% ± 2,8%, e a distância percorrida em média 2,3 ± 0,4 km/dia (figura 6A). A figura 6B mostra a massa corporal dos animais dos grupos sedentários e corredores após as seis semanas de atividade física antes do tratamento com LPS (0,33 mg/kg, i.p.). Os grupos não apresentaram diferenças estatísticas quanto à massa corporal (F(1,26) =0,2; P=0,6; figura 6B).
D is t â n c i a p e r c o r r id a n a s r o d a s 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 0 1 0 0 0 2 0 0 0 3 0 0 0 4 0 0 0 5 0 0 0 m e t r o s d ia s S E D S A L S E D L P SR C S A L R C L P S 0 2 0 4 0 6 0 8 0 M a s s a c o r p o r a l g r a m a s
Durante as seis semanas de atividade física nas rodas de corrida os animais correram 2,3 ± 0,4 km/dia (A). No dia da injeção i.p. de salina ou LPS, os animais sedentários (n=15) e corredores (n=15) foram pesados e não houve diferença quanto a massa corporal entre estes grupos (B). Os dados representam a média ± EPM. (ANOVA de duas vias). Abreviações: LPS (Lipopolissacarídeo); SAL (Salina); RC (Roda de correr); SED (Sedentário).
Figura 6. Efeito da atividade física sobre o desempenho físico dos animais nas rodas de corrida e a massa corporal dos animais anterior ao tratamento com salina e LPS.
B A
24 4.2 EFEITOS DA ATIVIDADE FÍSICA E LPS NOS
TESTES COMPORTAMENTAIS DO CAMPO
ABERTO E INTERAÇÃO SOCIAL
As figuras 7, 8 e 9 apresentam os resultados dos testes comportamentais para a avaliação do efeito da atividade física no comportamento tipo-doentio induzido pelo LPS. A figura 7 mostra os resultados da locomoção e velocidade média no teste do campo aberto. O LPS diminuiu significativamente a locomoção (F1,26=11,6; P<0,05; figura 7A) e a velocidade média dos animais (F1,26=11,9; P<0,05; figura 7C). Além disso, o LPS induziu maior locomoção na periferia do aparato, uma característica da tigmotaxia (preferencia de animais à periferia ou paredes de um ambiente) (F1,20=6,4; P<0,05; figura 7B). A atividade física preveniu os prejuízos locomotores de distância percorrida (figura 7A) e velocidade média (figura 7C).
C a m p o a b e r t o d is tâ n c ia t o ta l p e rc o rr id a (m e tr o s ) S E D S A L S E D L P S R C S A L R C L P S 0 1 0 2 0 3 0 4 0 * C a m p o a b e r t o d is tâ n c ia ( % c e n tr o /p e r if e ria ) S E D S A L S E D L P S R C S A L R C L P S 0 2 0 4 0 6 0 * * C a m p o a b e r t o v e lo c id a d e m é d ia ( m e tr o s /s e g u n d o s ) S E D S A L S E D L P S R C S A L R C L P S 0 .0 0 0 .0 5 0 .1 0 0 .1 5 0 .2 0 *
Figura 7. Efeito da atividade física no campo aberto após administração de LPS.
A B
As análises foram realizadas nos grupos SED/SAL (n=7), SED/LPS (n=8), RC/SAL (n=7), e RC/LPS (n=8). O LPS alterou os parâmetros: distância total percorrida (A), distância percorrida no centro versus distância percorrida na periferia (B) e velocidade média (C) avaliados no teste. A atividade física aumentou a distância total percorrida (A) e a velocidade média (C) percorrida pelos animais. Os dados representam a média ± EPM. * P<0,05 (ANOVA de duas vias seguido pelo post hoc de Bonferroni). Abreviações: LPS (Lipopolissacarídeo); SAL (Salina); RC (Roda de correr); SED (Sedentário).
25 A figura 8 mostra os resultados dos levantamentos e autocuidado no teste do campo aberto. O LPS diminuiu significativamente o número de levantamentos (F1,26=26,4;
P<0,05; figura 8A) e o tempo de levantamento dos animais
(F1,18=9,1; P<0,05; figura 8B). Além disso, o LPS também diminuiu significativamente o número de autolimpeza dos animais (F1,26=15,1; P<0,05; figura 8C). Enquanto a atividade física preveniu a diminuição no número e tempo de levantamentos (figura 8A e 8B respectivamente), bem como no número de autolimpeza (figura 8C).
C a m p o a b e r t o n ú m e ro d e l e v a n ta m e n to s S E D S A L S E D L P S R C S A L R C L P S 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 * * * C a m p o a b e r t o te m p o d e l e v a n ta m e n to s ( s e g u n d o s ) S E D S A L S E D L P S R C S A L R C L P S 0 2 0 4 0 6 0 * C a m p o a b e r t o n ú m e ro d e a u to li m p e z a S E D S A L S E D L P S R C S A L R C L P S 0 1 2 3 4 5 *
A análise foi feita nos grupos SED/SAL (n=7), SED/LPS (n=8), RC/ SAL (n=7), e RC/LPS (n=8). O LPS diminuiu o número de levantamentos (A), o tempo de levantamentos (B), e o número de autolimpezas (C) dos animais. A atividade física aumentou o número de levantamentos (A), o tempo de levantamentos (B) e o número de autolimpezas (C). Os dados representam a média ± EPM. * P<0,05; *** P<0,0001; (ANOVA de duas vias seguido pelo post hoc de Bonferroni). Abreviações: LPS (Lipopolissacarídeo); SAL (Salina); RC (Roda de correr); SED (Sedentário).
B
A C
Figura 8. Efeito da atividade física no campo aberto após administração de LPS.
26
A análise foi feita nos grupos SED/SAL (n=7), SED/LPS (n=8), RC/ SAL (n=7), e RC/LPS (n=8). O LPS não teve efeito sobre o número de interações sociais (A) e latência para primeira interação(C), mas diminuiu o tempo de interações sociais (B). A atividade física preveniu o tempo de interações sociais (B) e diminuiu a latência para a primeira interação (C). Os dados representam a média ± EPM. * P<0,05; *** P<0,0001 e # P<0,05 RC LPS vs SED LPS (ANOVA de duas vias seguido pelo post hoc de Bonferroni). Abreviações: LPS (Lipopolissacarídeo); SAL (Salina); RC (Roda de correr); SED (Sedentário).
A figura 9 mostra os resultados do teste de interação social. O LPS não alterou o número de interações sociais (F1,26=3; P=0,09; figura 9A) e a latência para primeira interação (F1,23=2,8; P=0,10; figura 9C). Entretanto, o LPS diminuiu significativamente o tempo das interações sociais (F1,26=27,2; P<0,05; figura 9B). A atividade física aumentou o tempo de interações sociais (F1,26=6,3; P<0,05; figura 9B), bem como diminuiu a latência para a 1ª interação (F1,23=6,9;
P<0,05; figura 9C). In t e r a ç ã o s o c i a l n ú m e ro S E D S A L S E D L P S R C S A L R C L P S 0 1 0 2 0 3 0 4 0 In t e r a ç ã o s o c i a l te m p o ( s e g u n d o s ) S E D S A L S E D L P S R C S A L R C L P S 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 * * * # In t e r a ç ã o s o c i a l la tê n c ia p a ra 1 ª i n te ra ç ã o s o c ia l (s e g u n d o s ) S E D S A L S E D L P S R C S A L R C L P S 0 5 1 0 1 5 2 0 # B A C
Figura 9. Efeito da atividade física no teste comportamental interação social após administração de LPS.
27
4.3 EFEITO DA ATIVIDADE FÍSICA E DO LPS SOBRE O CONTEÚDO PROTEICO DE NLRP3 NO CÓRTEX PRÉ-FRONTAL DOS CAMUNDONGOS
A figura 10 mostra o resultado da análise de
Western blot. O LPS não teve efeito sobre o conteúdo de
NLRP3 no córtex pré-frontal dos camundongos. Por outro lado, a atividade física também não teve efeito sobre o NLRP3 (F1,4=6; P=0,06). C ó r t e x p r é - f r o n t a l C o n te ú d o d e N L R P 3 (i n te n s id a d e r e la ti v a ) S E D S A L S E D L P S R C S A L R C L P S 0 1 0 2 0 3 0
SED SAL SED LPS RC SAL RC LPS NLRP3
Actina NLRP3 (118 kDa)
β-Actin (42 kDa)
A proteína do inflamassoma foi avaliada no córtex pré-frontal de camundongos Suíços machos adultos dos grupos SED/SAL (n=2), SED/LPS (n=2), RC/SAL (n=2), e RC/LPS (n=2). Não houve diferença entre os grupos. Os dados representam a média ± EPM (ANOVA de duas). Abreviações: LPS (Lipopolissacarídeo); SAL (Salina); RC (Roda de correr); SED (Sedentário).
RC LPS Figura 10. Efeito da atividade física sobre o conteúdo de NLRP3
28 5 DISCUSSÃO
De modo geral, a neuroinflamação induzida pelo LPS prejudicou a função motora, a interação social e o autocuidado dos animais, características do comportamento tipo-doentio. O LPS também foi ansiogênico, como demonstrado pela tigmotaxia no campo aberto. Por outro lado, a atividade física regular foi ansiolítica e preveniu o comportamento tipo-doentio induzido pela inflamação por LPS.
Hines e colaboradores (2013), também observaram que a administração sistêmica de LPS (0,2 mg/mL; i.p.) reduziu a velocidade média, distância total percorrida e número de levantamentos de ratos no teste do campo aberto (HINES et al., 2013). Saeidienik descreveu resultados semelhantes na dose de 0,1mg/kg de LPS i.p. (SAEIDIENIK et al., 2018). Kirsten e colaboradores também relataram em seu estudo que ratas grávidas tratadas com LPS (0,1mg/kg; i.p.) no 9º dia de gestação, apresentavam função motora prejudicada e também menor autolimpeza (KIRSTEN et al., 2010). Além de avaliar as ratas gestantes, esses pesquisadores também investigaram os filhotes machos na idade adulta, e relataram que o LPS reduziu significativamente a interação social nesses animais (KIRSTEN et al., 2010). Em camundongos a administração de LPS (0,1mg/kg e 0,33mg/kg i.p.) também induziu comportamento tipo-doentio, observados no teste do campo aberto e de interação social, como descrito nos estudos de Berg (BERG et al., 2004) e Catorce e colaboradores (NAVA CATORCE; GEVORKIAN, 2016). Estes dados corroboram os resultados obtidos em nosso estudo, onde a neuroinflamação por LPS prejudicou a função motora, a interação social e a autolimpeza dos animais. De modo geral, a análise desses resultados converge com a explicação de que o LPS ativa cascatas inflamatórias sistêmicas, e leva ao aumento na anedonia, letargia e diminuição da locomoção, características do comportamento tipo-doentio (DANTZER et al., 2008).
29 Por outro lado, alguns estudos demonstram os benefícios da atividade física sobre parâmetros locomotores e comportamentais. Aguiar e colaboradores em 2009, mostraram que 5 semanas de atividade física em rodas de corrida melhorou os prejuízos motores induzidos pelo modelo de neuroinflamação por reserpina (5mg/kg via subcutânea de ratos) (AGUIAR et al., 2009). Foi demonstrado que 21 dias de atividade física na roda de corrida diminuiu o tempo de imobilidade de camundongos no teste de suspensão pela cauda e nado forçado, indicando o efeito antidepressivo da atividade física (CUNHA et al., 2013). Em um estudo de 2017, oito semanas de atividade física nas rodas de corrida teve efeito ansiolítico, melhorou o comportamento motor, aumentou a expressão de BDNF e reduziu a expressão de IL-1β no hipocampo de camundongos velhos (DALLAGNOL et al., 2017). Assim como, 12 semanas de corrida também restaurou a densidade pré-sináptica no giro denteado e aumentou a neurogênese no hipocampo dos animais fisicamente ativos (SIETTE et al., 2013). Kohman e colaboradores relataram que oito semanas de atividade física nas rodas aumenta a sobrevivência de novos neurônios no hipocampo de camundongos (KOHMAN et al., 2012). Assim como 10 semanas nas rodas também melhorou a tolerância à glicose, aumentou marcadores de biogênese mitocondrial e reduziu a expressão de mRNA IL-1β no tecido adiposo de camundongos, após 6 horas do tratamento com LPS (2 mg/kg) (PEPPLER et al., 2017). Esses resultados corroboram nossos achados de que a atividade física voluntária é útil na prevenção de alterações motoras e cognitivas.
Embora a maioria dos estudos com rodas de correr analisem o hipocampo, o córtex pré-frontal (CPF), participa ativamente no planejamento motor e comportamental. Um estudo feito em 2015 demonstrou que a própria adesão às rodas de corrida ocorre por ação do córtex pré-frontal e do núcleo accumbens (BASSO; MORRELL, 2015). O CPF é o local de convergência de informações de várias áreas
30 cerebrais, de modo que ele atua como um circuito de integração de sinais aferentes, confluindo informações em um único ponto. Desta forma, o CPF é responsável pelo controle neural de tarefas comportamentais simples e/ou complexas (TANJI; HOSHI, 2001). Um estudo de 2017, analisando neurônios piramidais do córtex pré-frontal após somente duas semanas de atividade física em rodas de corrida, revelou uma maior densidade de espinhos dendríticos nos animais corredores em comparação com os sedentários, demonstrando o efeito da atividade física na estrutura e função do córtex pré-frontal (EDDY; GREEN, 2017). O córtex pré-frontal também desempenha um papel importante na interação social (WILSON; KOENIG, 2014), como demonstrado por Espejo em 2003, onde a perda de dopamina pré-frontal por injeção de 6-hidroxidopamina reduziu significativamente a interação social em ratos jovens e adultos (ESPEJO, 2003).
Zhang e colaboradores demonstraram que a ativação do inflamassoma NLRP3 está associada com sintomas de fadiga em camundongos durante a neuroinflamação (ZHANG et al., 2017). Wang e colaboradores realizaram um estudo onde o exercício físico atenuou o comportamento tipo-depressivo de camundongos através da supressão da ativação do NLRP3 (WANG et al., 2016). Em nosso a ativação do inflamassoma NLRP3 não foi afetada pelo tratamento com LPS nem pela atividade física. Martin e colaboradores em 2013, observaram um aumento cerebral de mRNA TNFα e IL-1β em decorrência da inflamação por LPS (0,33 mg/kg; i.p.) em camundongos. Entretanto, a atividade física nas rodas de corrida durante 30 dias não teve efeito sobre essas citocinas pró-inflamatórias (MARTIN et al., 2013). Estes autores sugeriram que a resposta inflamatória no comportamento tipo-doentio é fundamental para a sobrevivência dos animais, e pode superar os benefícios comportamentais da atividade física nas rodas.
Existem poucos estudos sobre o papel da atividade física na ativação do inflamassoma NLRP3. E os próprios
31 efeitos da atividade física sobre o comportamento tipo-doentio e neuroinflamação são controversos e limitados ao desenho experimental utilizado. Nossos resultados somam informações à literatura, reforçando os efeitos benéficos da atividade física no comportamento tipo-doentio induzido pelo LPS. Além disso, outras estruturas cerebrais e componentes da cascata inflamatória precisam ser estudados a fim de esclarecer os mecanismos pelos quais a atividade física interfere no inflamassoma NLRP3.
32
6 CONCLUSÃO
Nossos resultados demostraram que a atividade física regular preveniu o comportamento tipo-doentio decorrente do processo de neuroinflamação em camundongos. Entretanto, a ativação do inflamassoma foi inconclusiva devido ao baixo número amostral utilizado. Desta forma, estes resultados fortalecem a indicação da atividade física como intervenção não farmacológica em doenças neuroinflamatórias.
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