Avaliação dos efeitos cardiovasculares do peptídeo A-1317, um novo agonista do receptor MAS

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E BIOFÍSICA

JANAÍNA FÉLIX BRAGA

A

E

C

P

A-1317,

N

A

M

BELO HORIZONTE -MG

ii JANAÍNA FÉLIX BRAGA

A

E

C

P

A-1317,

N

A

M

Tese de doutorado apresentada ao

Departamento de Fisiologia e Biofísica do

Instituto de Ciências Biológicas da

Universidade Federal de Minas Gerais,

como requesito para obtenção do título

Doutor em Ciências Biológicas (Fisiologia).

ORIENTADOR:PROF.DR.ROBSON AUGUSTO SOUZA DOS SANTOS

BELO HORIZONTE -MG

iii AGRADECIMENTOS

À Deus, por estar presente em todos os momentos da minha vida.

Aos meus pais, que tanto amo, Edson e Maria Aparecida, pelo exemplo de vida, pela

dedicação constante aos filhos e por todo incentivo. Eu não chegaria tão longe sem

o apoio de vocês.

Aos meus queridos irmãos, Bruno e Fernanda pelo carinho e companheirismo.

Ao meu amado marido, Rodrigo, pela força, imenso carinho e compreensão.

Obrigada pela paciência, apoio e respeito.

Ao meu orientador Prof. Robson, os meus sinceros agradecimentos. Muito obrigada

por acreditar em mim. Sua confiança e orientação foram essenciais para chegar até

aqui.

Aos amigos e companheiros do laboratório de Hipertensão, pela convivência e pelo

aprendizado diário, em especial: Neiva, Cynthia, Gisele Maia, Aline Nardoni,

Augusto Peluso, Érica, Analina, Dani, Flavinha, Priscila.... e a TODOS os outros que

de alguma forma fizerem parte dessa conquista.

À Marilene e ao Zezé, por estarem sempre disponíveis em todos os momentos

necessários.

À Neiva pela ajuda com o experimento de vaso isolado.

Ao Rodrigo Silva, pela ajuda nos ensaios de cultura celular.

À Luiza, Bônia, Mônica e Silvio pelo cuidado e ajuda com os animais.

Aos colegas e funcionários do Departamento de Fisiologia.

Às amigas Renatinha, Beth e Fran, sempre presentes em minha vida.

A toda minha família, pela força e pelos bons momentos que sempre passamos

iv LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Visão clássica do sistema renina-angiotensina e seus principais efeitos fisiológicos induzidos pela Angiotensina II através da estimulação do receptor AT1.

Figura 2: Visão atual do SRA com seus novos componentes.

Figura 3: (a) Estrutura das ciclodextrinas, onde N corresponde ao número de unidades de glicose. (b) Estrutura tridimensional das ciclodextrinas, representando os arranjos das unidades de glicose.

Figura 4: Representação da formação de complexo de inclusão fármaco:ciclodextrina com uma estequeometria de 1:1.

Figura 5: Protocolo experimental I: administração aguda intravenosa in bolus do

A-1317, Ang-(1-7) ou salina em ratos acordados.

Figura 6: Protocolo experimental II: administração aguda, por via oral, do HPβCD/A

-1317, HPβCD/Ang-(1-7) ou HPβCD em ratos acordados.

Figura 7: Efeito vasodilatador do A-1317 e da Ang-(1-7) em anéis de aorta de ratos Wistar, contendo endotélio funcional.

Figura 8: Efeito vasodilatador do A-1317 e Ang-(1-7) em anéis de aorta de SHRs, contendo endotélio funcional.

Figura 9: Efeito vasodilatador do A-1317 e da Ang-(1-7) em anéis de aorta de camundongos WT FVB/N, contendo endotélio funcional.

Figura 10: Variação da PAM de SHRs acordados durante 5 horas após a administração aguda in bolus do A-1317, Ang-(1-7) ou salina nas doses de 0,1; 0,5;

2,5 e 12,5 nmol/kg (Figuras A, B, C e D, respectivamente).

Figura 11: Variação máxima da PAM de SHRs acordados após 5 horas da administração aguda in bolus de cada dose de A-1317, Ang-(1-7) ou salina.

Figura 12: Variação da FC de SHRs acordados durante 5 horas após a administração aguda in bolus do A-1317, Ang-(1-7) ou salina nas doses de 0,1; 0,5;

2,5 e 12,5 nmol/kg (Figuras A, B, C e D, respectivamente).

Figura 13: Variação da PAM (A) e FC (B) de ratos Wistar acordados durante 5 horas após a administração aguda in bolus de A-1317, Ang-(1-7) ou salina na dose de 0,5

nmol/kg.

Figura 14: Variação da PAM (A) e FC (B) de SHRs acordados durante 5 horas após a administração aguda, por via oral, de HPβCD/A-1317, HPβCD/Ang-(1-7) ou

v Figura 15: Variação da PAM (A) e FC (B) de ratos Wistar acordados durante 5 horas após a administração aguda, por via oral, de HPβCD/A-1317, HPβCD/Ang-(1-7) ou

HβBCD na dose de 10 µgl/kg.

Figura 16: Efeito induzido pelo A-1317 em anéis de aorta de SHRs, contendo endotélio funcional, na ausência ou presença de L-NAME (10-7 M).

Figura 17: Efeito induzido pelo A-1317 em anéis de aorta de SHRs, contendo endotélio funcional, na ausência ou presença de indometacina (10-5 M).

Figura 18: Efeito induzido pelo A-1317 em anéis de aorta de SHRs, contendo endotélio funcional, na ausência ou presença de A-779 (10-6 M) (A) ou de D-PRO (10-6 M) (B).

Figura 19: Efeito induzido pelo A-1317 em anéis de aorta de camundongos KO-Mas contendo endotélio funcional.

Figura 20: Efeito induzido pelo A-1317 em anéis de aorta de camundongos KO-AT2

contendo endotélio funcional.

Figura 21: Produção de óxido nítrico em resposta a incubação com A-1317 ou Ang-(1-7) em células CHO transfectadas com o receptor Mas.

Figura 22. Representação da fluorescência relativa em microscopia confocal usando DAF-FM em células CHO-MAS incubadas com Ang-(1-7) ou A-1317.

Figura 23. Deslocamento da ligação da FAM-Ang-(1-7) pela Ang-(1-7) e A-1317 em células CHO transfectadas com o receptor Mas (A e B). A) Fluorescência relativa capturada em microscopia confocal. B) Porcentagem em que a Ang-(1-7) e o A-1317 foram capazes de deslocar a FAM-Ang-(1-7).

vi LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Valores basais da PAM de SHRs antes da administração aguda in bolus

de diferentes doses de A-1317 ou Ang-(1-7).

Tabela 2: Valores basais da FC de SHRs antes da administração aguda in bolus de

diferentes doses de A-1317 ou Ang-(1-7).

Tabela 3: Valores basais da PAM e FC de ratos Wistar antes da administração aguda in bolus de 0,5 nmol/kg de A-1317 ou Ang-(1-7).

Tabela 4: Valores basais da PAM e FC de SHRs antes da administração aguda, por via oral, de 10µg/kg de HPβCD/A-1317 ou HPβCD/Ang-(1-7).

vii LISTA DE ABREVIATURAS

A-779 [d-Ala7_{]-Ang-(1-7) (antagonista seletivo do receptor Mas)}

Ach Acetilcolina

AMPc Monofostafo de adenosina cíclica

Ang Angiotensina

Ang I Angiotensina I

Ang II Angiotensina II

Ang III Angiotensina III

Ang-(1-4) Angiotensina-(1-4)

Ang-(1-7) Angiotensina-(1-7)

Ang-(1-9) Angiotensina-(1-9)

AOG Angiotensinogênio

AT1 Receptor de angiotensina II tipo 1

AT2 Receptor de angiotensina II tipo 2

AT4 Receptor da Angiotensina-(1-4)

AVE 0991 Agonista não-peptídico sintético do receptor Mas

Bpm Batimentos por minuto

B2 Receptor tipo 2 de bradicinina

CaCl2 Cloreto de cálcio

CD Ciclodextrina

CEBIO Centro de Bioterismo

CEUA Centro de Ética no Uso de Animais

CGEN-856 Agonista peptídico sintético do receptor Mas

viii CHO-Mas Células ovarianas de hamster chinês transfectadas com o

receptor Mas

DAF-FM 4,5 diacetato de diaminofluoresceina

D-MEM-F12 Dulbeccos’s Modified Eagle Medium

D-PRO D-Pro7-Ang-(1-7) (antagonista seletivo do receptor Mas)

ECA Enzima conversora de angiotensina

ECA2 Enzima conversora de angiotensina II

eNOS Enzima óxido nítrico sintase endotelial

ERK 1/2 Quinase regulada por sinal extracelular

FAM-Ang-(1-7) Angiotensina-(1-7) fluorescente

FC Frequência cardíaca

FE Fenilefrina

HAS Hipertensão arterial sistêmica

HPβCD Hidroxipropil beta-ciclodextrina (composto de inclusão)

HPβCD/Ang-(1-7) Ang-(1-7) incluída em Hidroxipropil beta-ciclodextrina

HPβCD/A-1317 A-1317 incluída em Hidroxipropil beta-ciclodextrina

IP3 1,4,5 Inositol trifosfato

JG Justaglomerulares

KCl Cloreto de potássio

Kg Quilogramas

KH2PO4 Fosfato de potássio

KO Nocaute

KO-AT2 Nocaute para o receptor AT2

KO-Mas Nocaute para o receptor Mas

ix

M Molar

MAP Mean arterial pressure

MAPK Quinase ativada por mitógeno

Mas Protooncogene Mas

MgSO4 Sulfato de magnésio

mmHg Milímetros de mercúrio

MrgD Receptor relacionado ao Mas

NaCl Cloreto de Sódio

NaHCO3 Bicarbonato de sódio

NEP Endopeptidase neutra

NO Óxido nítrico

nmol Nanomol

PA Pressão arterial

PAI-1 Inibidor do ativador do plasminogênio

PAM Pressão arterial média

PAP Pressão arterial pulsátil

PCP Prolilcarboxipeptidase

PD 123319 Antagonista do receptor AT2

PE Polietileno

PEP Prolilendopeptidase

pH Concentração hidrogeniônica

PI3K Fosfatidilinositol 3 quinase

PKC Proteína quinase C

RNAm Ácido ribonucleico mensageiro

x SHR(s) Rato espontaneamente hipertenso(s)

SRA Sistema renina-angiotensina

TFA Ácido trifluoroacético

Vs. Versus

WT Wild type