UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
LARA MESQUITA PINHEIRO
NOVA ASSOCIAÇÃO CRÍPTICA ENTRE NEMATOPSIS SP. (APICOMPLEXA, ALVEOLATA) E POPULAÇÕES DE ANFÍBIOS (VERTEBRATA)
FORTALEZA 2015
LARA MESQUITA PINHEIRO
NOVA ASSOCIAÇÃO CRÍPTICA ENTRE NEMATOPSIS SP. (APICOMPLEXA, ALVEOLATA) E POPULAÇÕES DE ANFÍBIOS (VERTEBRATA)
Monografia apresentada ao Programa de Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas. Área de concentração: Genômica e Evolução.
Orientador: Prof. Dr. Thomas A. Richards. Co-orientadora: Dr. Aurèlie Chambouvet.
FORTALEZA 2015
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará
Biblioteca Universitária
Gerada automaticamente pelo módulo Catalog, mediante os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
P72n Pinheiro, Lara Mesquita.
Nova associação críptica entre nematopsis sp. (Apicomplexa, Alveolata) / Lara Mesquita Pinheiro. – 2015.
27 f. : il. color.
Trabalho de Conclusão de Curso (graduação) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências, Curso de Ciências Biológicas, Fortaleza, 2015.
Orientação: Prof. Dr. Thomas A. Richards. Coorientação: Prof. Dr. Aurèlie Chambouvet.
1. Anfíbio filogenia. 2. Protozoologia veterinária. I. Título.
LARA MESQUITA PINHEIRO
NOVA ASSOCIAÇÃO CRÍPTICA ENTRE NEMATOPSIS SP. (APICOMPLEXA, ALVEOLATA) E POPULAÇÕES DE ANFÍBIOS (VERTEBRATA)
Monografia apresentada ao Programa de Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas. Área de concentração: Genômica e Evolução.
Aprovada em: 02/06/2015.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________ Prof. Dr. Thomas A. Richards (Orientador)
University of Exeter (UK)
_________________________________________ Prof. Dr. Mark van der Giezen
University of Exeter (UK)
_________________________________________ Prof. Dr. Ivana Gudelj
Aos meus pais, Eliane e Egídio, e a minha amada tia Dadaia.
AGRADECIMENTOS
Ao CNPq, pelo apoio financeiro com a manutenção da bolsa de auxílio na University of Exeter, na Inglaterra (United Kingdom).
Ao Prof. Dr. Thomas A. Richards e Dr. Aurèlie Chambouvet e os demais integrantes do Laboratory of Evolutionary Genomics, pela excelente orientação, apoio e paciência.
Ao meu tutor e participante da banca examinadora Prof. Dr. Mark van der Giezen, pelo tempo e pelos bons conselhos.
Aos integrantes do LABPLANT (UFC), pelo carinho, aprendizado e alegrias que me proporcionaram.
Aos meus lindos colegas de turma e amigos, no Brasil e na Inglaterra. Vocês são a melhor parte de mim.
“Somos o resultado dos livros que lemos, das viagens que fazemos, e das pessoas que amamos.” (Airton Ortiz)
RESUMO
Os anfíbios são conhecidos por serem particularmente suscetíveis a fatores abióticos, como a poluição e as mudanças climáticas. Além disso, uma grande variedade de doenças também contribui para o declínio das populações dos anfíbios. Um único trabalho relativo a uma infecção de macrófagos de girinos causado por Nematopsis temporaria (Gregarina, Apicomplexa) está disponível até agora. Como gregarinas não são descritos como patógenos de vertebrados, uma investigação mais profunda desta associação foi realizada. Para detectar esta associação, uma análise microscópica foi realizada, mostrando muitos indivíduos de Gregarina dentro macrófagos de girinos. Além disso, as reações de PCR amplificaram com sucesso uma região entre o rDNA 18S e rDNA 28S de Nematopsis sp., região essa que tem sido demonstrada por contêm regiões que ajudam a discriminar protozoários muito relacionados. Árvores filogenéticas foram construídas de modo a mostrar a topologia das sequências de Nematopsis sp. encontradas em cada hospedeiro e de outros patógenos de Apicomplexa. Os resultados mostraram evidências de uma associação entre Nematopsis sp. e macrófagos de girinos de Rana temporaria e Hyla arborea, indicando uma nova ameaça para as das populações de anfíbios.
ABSTRACT
Amphibians are known to be particularly susceptible to abiotic factors such as pollution and climate changes. In addition, a variety of diseases is also contributing to amphibians’ populations decline. A single work concerning an infection to tadpoles’ macrophages caused by Nematopsis temporaria (Gregarina, Apicomplexa) is available so far. As gregarines are not described as vertebrates’ pathogens, a deeper investigation of this association was performed. To detect this association, microscopic analysis was performed, showing many Gregarina individuals inside tadpoles’ macrophages. In addition, PCR reactions successfully amplified a region between 18S rDNA and 28S rDNA from Nematopsis sp., which has been shown to contain regions that helps to discriminate close related protozoans. Phylogenetic trees were constructed to show the topology of the sequences from the Nematopsis sp. found in each host and from other apicomplexan pathogens. The results showed evidences of an association between Nematopsis sp. with tadpoles’ macrophages from Rana temporaria and Hyla arborea, indicating a new threat to amphibians’ populations.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 14
2 MÉTODOS... 15
2.1 Amostragem de tecido de sapo para triagem molecular de Nematopsis e Microscopia de amostras frescas de fígado de sapo... 15
2.2 Amplificação das sequências rDNA 18S - ITS1 - rDNA 5.8S - ITS2 de Nematopsis sp. ... 17
2.3 Barcoding do rDNA 16S SSU mitocondrial de amostras de girinos... 19
2.4 Alinhamento das sequências de Gregarina... 19
2.5 Alinhamento das sequências dos hospedeiros... 20
2.6 Analise filogenética 20 3 RESULTADOS ... 21 3.1 Microscopia... 21 3.2 Analise filogenética... 23 3.3 Barcoding de girinos... 25 4 DISCUSSAO... 27 5 CONCLUSÃO ... 28 REFERÊNCIAS ... 29
14 1 INTRODUÇÃO
As populações de anfíbios estão sofrendo uma crise sem precedentes na sua biodiversidade, com um declínio de espécies estimado de 48% [1]. A destruição do habitat, poluição e as mudanças climáticas são alguns dos fatores que são pensados para ser a causa desta crise. Os anfíbios também são muito suscetíveis a doenças oportunistas emergentes (ex. doenças fúngicas e ranavírus), que contribuíram para esse declínio [2].
O sistema imunológico dos anfíbios é uma importante linha de defesa contra patógenos microbianos. Notavelmente, girinos e formas adultas exibem sistemas imunes distintos. Embora ambos girinos e adultos sejam imunocompetentes, as os girinos têm uma imunidade adaptativa mais fraca, com menos classes de anticorpos e mais pobre em função dos linfócitos B e T (revisto em [3]). Girinos, portanto, tem que contar com o sistema imune inato, que proporciona proteção rápida e não específica fornecida por células fagocíticas, tais como macrófagos, que podem atacar diretamente os patógenos. Assim, é de fundamental importância estudar os fatores que podem influenciar a resposta imune, especificamente a função dos macrófagos e, assim, o fitness das populações de girinos a fim de gerir estratégias de conservação.
Em 1920, Nöller e colaboradores descreveram uma nova associação entre um parasita de Gregarina chamado Nematopsis temporaria, infectando os macrófagos presentes no tecido do fígado do sapo Rana temporaria. Os gregarinas são uma linhagem de parasitas unicelulares que permanece pouco compreendida [4]. Estes protistas monoxênicos são conhecidos por habitar o intestino e outros espaços extracelulares de quase todos os grupos de invertebrados, em particular anelídeos e insetos [5]. Em árvores filogenéticas, estes protistas formam um ramo profundamente derivado do superfilo Apicomplexa, que é composto de parasitas obrigatórios incluindo importantes parasitas de vertebrados (ex. Plasmodium spp., Toxoplasma spp., e Babesia spp.) [6, 7]. Cavalier-Smith propôs em 2014 que houvesse uma reclassificação do superfilo Apicomplexa em três classes: Paragregarea, contendo principalmente parasitas de invertebrados marinhos; Gregarinomorphea Grassé, 1953, que inclui parasitas de invertebrados terrestres e marinhos; e Coccidiumorphea Doflein, 1901, contendo parasitas de vertebrados como Toxoplasma gondii [7, 8].
Apenas uma publicação, por Nöller e colaboradores em 1920, está disponível sobre Nematopsis temporaria, com poucos dados moleculares ou de ultraestrutura [9]. Como tal, uma melhor compreensão deste grupo vai melhorar consideravelmente nossa compreensão de características da vida deste patógeno putativo e das primeiras etapas da evolução em Apicomplexa. Durante uma pesquisa de monitoramento da população dos anfíbios na República Checa, uma nova associação putativa patogênica entre sapos e Gregarina (Apicomplexa, Alveolata) foi identificada em amostras de fígado de seis girinos de duas diferentes espécies de sapo (Rana temporaria, Hyla arborea).
15 2 MÉTODOS
2.1 Amostragem de tecido de sapo para triagem molecular de Nematopsis e Microscopia de amostras frescas de fígado de sapo
A amostragem foi feita antes deste estudo nas áreas e datas indicadas na Tabela 1. Os girinos foram preservados em etanol. O fígado de cada girino foi dissecado usando equipamento de dissecção estéril e colocado num novo tubo de 1,5 ml contendo etanol a 100%. O DNA total foi extraído a partir de todas as amostras de tecido de girino utilizando o kit DNeasy Blood and Tissue extraction® (Qiagen, Limburg, Holanda) seguindo o protocolo do fabricante, com uma incubação durante a lise durante a noite a 55 ° C.
Também antes deste estudo, foram feitas preparações de esmagamento de várias vísceras, oocistos enriquecidos por flotação, e cortes histológicos foram examinadas por microscopia de luz, utilizando um microscópio Olympus AX 70 equipado com Nomarski interferência óptica de contraste (NIC).
16 Tabela 1 – Identidade dos sapos, data e localização da amostra e os respectivos clones usados para construir a arvore filogenética.
ID dos sapos BLAST ID dos sapos Localizacao Data da amostragem ID do clone
NemE1 Rana temporaria
Zajěčí potok, Brno, República Tcheca, 49°14'15.00"N, 16°36'23.00"E 25/06/2004 Rt_E1_A1 Rt_E1_C1 Rt_E1_H1
NemE2 Rana temporaria
Zajěčí potok, Brno, República Tcheca, 49°14'15.00"N, 16°36'23.00"E 25/06/2004 Rt_E2_A3 Rt_E2_D3 Rt_E2_E3
NemE3 Rana temporaria
Zajěčí potok, Brno, República Tcheca, 49°14'15.00"N, 16°36'23.00"E 25/06/2004 Rt_E3_A5 Rt_E3_B5 Rt_E3_G5
NemE4 Hyla arborea
Zajěčí potok, Brno, República Tcheca, 49°14'15.00"N, 16°36'23.00"E 15/07/2004 Ha_E4_B7 Ha_E4_E7 Ha_E4_C7
NemE5 Hyla arborea
Zajěčí potok, Brno, República Tcheca, 49°14'15.00"N, 16°36'23.00"E 15/07/2004 Ha_E5_A9 Ha_E5_C9 Ha_E5_D9
NemE6 Hyla arborea
Zajěčí potok, Brno, República Tcheca, 49°14'15.00"N, 16°36'23.00"E 15/07/2004 Ha_E6_B11 Ha_E6_C11 Ha_E6_F11
17 2.2 Amplificação das sequências rDNA 18S - ITS1 - rDNA 5.8S - ITS2 de Nematopsis sp.
Antes deste estudo, o primer específico Nem1F que tem como alvo a subunidade menor do ribossomo (SSU) de Nematopsis foi projetado (ver Tabela 2 para detalhes de primers). O DNA extraído a partir de tecido de fígado de girino foi usado para configurar a amplificação por PCR utilizando o primer Nem1F recentemente concebido, pareado com o primer reverse eucariótico universal 28SR1, que tem como alvo o gene da subunidade maior ribossomal (LSU, Figura 2 e Tabela 2 para detalhes de primers). A temperatura de hibridação foi determinada usando a temperatura de melting (Tm) para cada primer dada pelo fabricante. A hibridação ocorre melhor a temperaturas cerca de 5 ° C abaixo do Tm para evitar ligação não específica do iniciador de ligação ou nenhuma ligação.
A amostra NemE1, onde as células de Nematopsis sp. foram detectadas por microscopia, foram usadas como controle positivo para o protocolo de PCR configurado. Cada reação de PCR para o DNA de fígado incluiu um controle negativo (água destilada) e foi realizada em um volume total de 25 µl usando a DNA polimerase GoTaq® G2 Flexi (Promega, Madison, EUA) com o seguinte programa: 2 minutos a 95 ° C seguido de 30 ciclos de 30 segundos a 35 ° C, 30 segundos a 50 ° C, 120 segundos a 72 ° C e um passo final de 5 minutos a 72 ° C. A PCR foi verificada em 1% de gel de agarose. Quando uma única banda foi observada no gel, significava que a sequência de Nematopsis sp. havia sido amplificada com êxito, de modo que a amostra era positiva para a presença deste organismo.
Três produtos de PCR positivos e independentes foram misturados para evitar viés devido à amplificação. Em seguida, foram purificados utilizando Wizard SV gel e kit PCR Clean-Up System (Promega, Madison, EUA) para remover as proteínas solúveis e os outros ácidos nucleicos. Então, as amostras foram clonadas usando Strata Clone PCR Cloning Kit (Stratagene, Santa Clara, EUA). Esta clonagem envolve a inserção do produto de purificação de PCR num vetor contendo sequências de resistência à ampicilina e para o fragmento α da enzima β-galactosidase. β-galactosidase é uma enzima que cliva os polissacarídeo galactose (X-gal) produzindo uma coloração azul característica. Como o produto de PCR é inserida no meio do fragmento α da β-galactosidase, a transcrição do gene com a inserção no meio resulta para a produção de uma enzima inativa. Assim, as células competentes de Escherichia coli que contêm o vetor com o inserto podem crescer num meio contendo ampilicina porque eles abrigam o vetor e não irão produzir β-galactosidase. Assim, em presença de substrato X-gal no meio, essas colônias aparecerão brancas.
18 usando os primers M13F e M13R que tem como alvo o vetor com o inserto, usando o seguinte programa: 2 minutos a 95°C seguido por 30 ciclos de 30 segundos a 35°C, 30 segundos a 52°C, 120 segundos a 72°C e um passo final de 5 minutos a 72°C. Esse protocolo foi projetado para obter uma sequência contendo o rDNA SSU, o espaçador transcrito interno 1 (ITS1), o rDNA 5S, o espaçador transcrito interno 2 (ITS2), e o rDNA LSU.
Três clones positivos de cada fígado de sapo foram purificados usando o kit de purificação GeneJET™ PCR e mandados para o sequenciamento (Eurofins Genomics, Ebersberg, Germany) usando os primers V9F, V9R, M13F e M13R para obter a sequência final que incluia parcialmente o rDNA SSU, o ITS1, o rDNA 5S, o ITS2 e parte do gene rDNA LSU de Gregarina. As sequências consenso foram montadas e editadas manualmente com o Sequencher® software (Genecodes, Ann Arbor, US). Assim, cada mutação foi verificada individualmente usando os cromatogramas de cada sequência.
Tabela 2 – Primers utilizados neste estudo.
Primer Sequencia (5’-3’) Espeficidade Referencia
Nem1F AGTCTCTGTGRAWATCATTACTAC Clado Nematopsis Este estudo
28SR1 CGGTACTTGTTCGCTATCGG Eucariotos [26]
M13F GTAAAACGACGGCCAGT Vetor bacteriano -
M13R AACAGCTATGACCATG Vetor bacteriano -
V9F TTGTACACACCGCCC Eucariotos [10]
V9R CCTTCYGCAGGTTCACCTAC Eucariotos [10]
16Sar-F CGCCTGTTTATCAAAACAT Vertebrados [11]
19 2.3 Barcoding do rDNA 16S SSU mitocondrial de amostras de girinos
Extratos de DNA de fígado de sapo foram submetidos a reação de PCR usando os primers 16Sar-F e 16Sar-R [11], que amplificam uma região de 600 pares de base do gene rDNA 16S SSU. Reações de amplificação por PCR foram feitas num volume total de 25µL usando a enzima polimerase de DNA GoTaq® G2 Flexi DNA polymerase (Promega, Madison, US) com o seguinte programa: 2 minutos a 95°C seguido de 30 ciclos de 30 segundos a 35°C, 30 segundos a 55°C, 120 segundos a 72°C e um passo final de 10 minutos a 72°C. O produto da PCR foi checado em um gel de agarose a 1% e purificado usando o kit SV Gel and PCR Clean-up System (Promega, Madison, US). O sequenciamento foi feito externamente pela empresa Beckman Coulter Genomics (Hertfordshire, United Kingdom). As sequências finais foram unidas e editadas manualmente usando Sequencher® software (Genecodes, Ann Arbor, US).
2.4 Alinhamento das sequências de Gregarina
O foco da análise filogenética foi a região de rDNA SSU, já que faltam informações relacionadas as sequências ITS no Genbank. As sequências presentes em Wakeman et al. (2014) foram usadas como base de referência, juntamente com as sequências de melhores hits usando BLAST do gene 18S rDNA de Nematopsis sp. Ainda, o conjunto de sequências continha 18 sequências de clones únicos e específicos das amostras de fígado de girinos. Essas sequências foram unidas em um alinhamento múltiplo com 55 outras sequências de Colpodelídeos, Cromerídeos, Apicomplexa e Gregarina. Uma sequência de rDNA SSU de Amoebophrya sp. (AF472555) e outra de Hematodinium perezi (EF065717) foram usadas como grupo externo.
As sequências foram alinhadas usando MUSCLE [12], disponível através do programa de alinhamento de múltiplas sequências Seaview v4.2.12 [13]. O alinhamento foi checado e mascarado manualmente resultando numa matriz de dados de 75 sequências e 1314 posições de alinhamento.
20 2.5 Alinhamento das sequências dos hospedeiros
As sequências de rDNA 16S de anfíbios foram obtidas como descrito previamente usando os primers 16SF e 16SR. As sequências foram alinhadas com 67 sequências de genes de rDNA SSU de sapos com 4 sequências como grupo externo (EF107170, DQ283407, DQ283445, DQ092266). O alinhamento foi checado e mascarado manualmente resultando em uma matriz de dados de 73 sequências e 498 posições de alinhamento.
2.6 Analise filogenética
O modelo de substituição de nucleotídeos mais adequada para cada alinhamento foi obtido utilizando Modelgenerator 0.85 [14, 15]. Para o alinhamento de Gregarina e sapos, as substituições GTR + Γ e GTR + I + Γ foram selecionadas com parâmetros α para as distribuições gama de 0,40 e 0,36, respectivamente, com oito categorias de taxa em ambos os casos.
Para a filogenia de Gregarina e de sapos, a topologia RAxML usando RAxML-HPC2 em XSEDE v8.1.11 (disponível em http://www.phylo.org/) foi selecionada com 1000 pseudo-réplicas. O suporte para a topologia de árvore RAxML foi avaliado usando os métodos descritos anteriormente para bootstrap de RaxML e usando as probabilidades Bayesianas posteriores (PP) da corrida MrBayes. Análise Bayesiana foi avaliada usando MrBayes v3.2.3 com os seguintes parâmetros: LSet, nst = 6 = taxas gama com o parâmetro covarion. As cadeias foram executadas por 1.000.000 gerações com duas pesquisas de réplicas de árvores, ambas com quatro cadeias MCMC com um parâmetro de calor 2. As árvores foram amostradas a cada 250 gerações. Em ambas as análises, as pesquisas MCMCMC convergiram dentro dos primeiros 25% das gerações amostradas, tal como o primeiro ¼ dos resultados da pesquisa foram descartados (como burnin). As topologias de consenso e probabilidades posteriores de cada nó foram então calculadas a partir das árvores remanescentes.
21 3 RESULTADOS
3.1 Microscopia
O exame microscópico dos tecidos girino, realizados antes deste estudo, confirmou que o fígado era o único órgão onde o protista Gregarina foi identificado regularmente. Alguns indivíduos de Gregarina foram encontrados no intestino, mas isso se devia possivelmente a uma contaminação durante a dissecção. Esporozoítos livres podiam ser vistos dentro dos macrófagos, com uma frequência de 1 a cada 9 macrófagos. Além disso, os oocistos vazios de Gregarina puderam ser observados dentro dos mesmos macrófagos que os esporozóitos (Fig. 1B-b). Estes oocistos eram ovoides, assimétricos e com uma parede espessa envolvendo um único esporozoíto. Além disso, os oocistos de organismos do género Goussia, um coccídeo de Apicomplexa, poderia ser encontrado em girinos de Rana temporaria, mas não em Hyla arborea (Fig. 1B-c).
22 Figura 1- A: Arvore filogenética das sequências analisadas de Nematopsis (grupo no triângulo em laranja) e outras sequências de Apicomplexa (Alveolata). B: Fotomicrografias de amostras de fígado de girinos de Rana temporária contendo esporozoitos (a) e oocistos (b) de Nematopsis.
23 3.2 Análise filogenética
Atualmente, existe apenas uma sequência de DNA do fragmento operon ribossomal pertencente a um gregarina disponível no GenBank (Gregarina sp. JF412725, janeiro de 2015). Decidiu-se incluir na análise filogenética, portanto, apenas o gene rRNA SSU parcial englobando os loops V4 e V9 do gene SSU rRNA. Estas regiões hipervariáveis são agora usados para analisar diversidade genética de eucariotos no ambiente utilizando sequenciamento de genes da próxima geração [16, 17]. Foram incluídos na análise as 58 sequências publicadas que foram anteriormente usadas por Wakeman et al. 2014 [18]. A análise filogenética abrangeu 1.314 caracteres de nucleotídeos alinhados. Conseguiu-se obter a mesma topologia de árvore filogenética geral tal como a de Wakeman et al., 2014 [18] (Fig. 1A). Todas as sequências de gene rRNA 18S neste estudo formaram um clado altamente suportado (bootstrap 1/100) e se agruparam com altos valores de bootstrap (1/84) no grupo de gregarinas terrestres descrito por Wakeman et al. 2014 ou a superfamília dos Actinocephaloidea Léger 1982 da classe de Gregarinomorphea Grassé 1953 descrita por Cavalier-Smith em 2014 [7, 18]. Este grupo abrange Hoplorhynchus acanthatholius (FJ459750), Monocystis agilis (AF457127), Syncystis mirabilis (DQ176427), Prismatospora evansi (FJ459756), Ascogregarina culicis (DQ4622456), A. taiwanensis (EF666482), Ophriocystis elektroscirrha (AF129883) e Mattesia germinata (AY334568).
O fragmento de operon de DNA ribossomal SSU - ITS1 - 5S - ITS2 foi sequenciado para acessar a diversidade genética dentro dessa da região. Neste estudo postulou-se que polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs) seriam considerados reais se ocorressem mais de uma vez na sequência de clones a partir da mesma amostra, e não seria um erro de sequenciamento. Portanto, foram consideradas apenas as mutações que ocorreram em pelo menos duas sequências clonadas. Foram gerados 18 clones independentes, três para cada uma das seis amostras de fígado de girino, com uma percentagem de identidade variando de 96% a 99% do fragmento operon de DNA ribossomal SSU - ITS1 - 5S - ITS2 (Fig. 2). As sequências foram agrupadas de forma independente da espécie hospedeira ou de cada amostra. A análise filogenética revelou duas populações independentes (Fig. 2). A análise dos polimorfismos do DNA na sequência ribossomal revelou que a principal região de polimorfismo foi observada dentro das sequências ITS1, com dois motifs independentes que foram recuperadas em diferentes clones, enquanto que o polimorfismo observado no resto do operon é composto principalmente de SNPs.
24 Figura 2 – A: Arvore filogenética das sequências analisadas. Diferentes cores indicam diferentes hospedeiros e espécies. B: Detalhe do operon sequenciado de Nematopsis, com a sequência ITS1 em evidência.
25 3.3 Barcoding de girinos
A análise das sequências de rDNA 16S de girinos foi realizada a fim de identificar as espécies de girinos utilizados neste estudo. A árvore filogenética mostra ambos os clados formados pelos girinos analisados com um elevado bootstrap (>0,9/80) (fig. 3). As amostras NemE1, NemE2 e NemE3 foram identificadas como Rana temporaria, um membro da superfamília Ranoidea. Anfíbios deste grupo são conhecidos como sapos verdadeiros e são geralmente aquáticos. As amostras NemE4, NemE5 e NemE6 foram designados como Hyla arborea, da superfamília Hyloidea. Os espécimes deste grupo são conhecidos como pererecas devido aos seus discos adesivas nos dedos, que são usados para subir em árvores. Estes dois conjuntos de girinos pertencem as duas principais superfamílias de Neobatrachia (Ranoidea e Hyloidea).
26 Figura 3 – Arvore filogenética das sequências de hospedeiros onde Nematopsis foi encontrado e outras sequências de Neobatrachia (Anura).
27 4 DISCUSSÃO
A identificação do parasita estudado foi possível devido a confecção de um primer específico que tem como alvo uma sequência de rDNA SSU de Nematopsis sp. e a subsequente amplificação por PCR. Além disso, a análise filogenética confirmou que o organismo pertence ao clado dos gregarinas terrestres descrito por Wakeman et al. 2014 ou à superfamília dos Actinocephaloidea Léger 1982 da classe de Gregarinomorphea Grassé 1953 descrito por Cavalier-Smith em 2014 [7, 18]. Este grupo abrange Hoplorhynchus acanthatholius (FJ459750), Monocystis agilis (AF457127), Syncystis mirabilis (DQ176427), Prismatospora evansi (FJ459756), Ascogregarina culicis (DQ4622456), A. taiwanensis (EF666482), Ophriocystis elektroscirrha (AF129883) e Mattesia germinata (AY334568), que infectam uma grande variedade de invertebrados (ex.: minhocas, libélulas, mosquitos, moscas) (Fig. 1A). Em geral, o presente trabalho mostrou as relações filogenéticas dentro de Gregarina semelhantes a trabalhos anteriores nesta área [7, 18, 19]. O fato de dois gregarinas de Sipunculida terem sidos agrupados separadamente (Filipodium phascolosomae (FJ832163) e Selenidium vivax (AY196708)) pode indicar uma classificação errônea destes organismos até agora, ja que isso também foi encontrado anteriormente [18]. Estudos futuros sobre essas espécies são necessários.
Operons do gene de RNA ribossômico eucarióticos (genes de rRNA) estão tipicamente presentes em múltiplas cópias por genoma e estão organizados em unidades repetitivas em matrizes in tandem. Cada unidade é constituída por uma região transcrita conservada que inclui os genes das subunidades 18S, 28S e 5.8S e duas regiões hipervariáveis: os espaçadores internos transcritos (ITS1 e ITS2) [27]. ITSs podem ser usados como marcadores para discriminar espécies de protozoários estreitamente relacionados, como por exemplo Trypanosoma rangeli [20]. A análise de polimorfismos na sequência ribossomal de DNA revelou que os polimorfismos foram observados principalmente nas sequências ITS1, com 2 motifs independentes que foram recuperados em diferentes clones, enquanto que os polimorfismos observados no resto do operon são compostos principalmente de SNPs. A sequência ITS1 está sob menos pressão de seleção evolutiva do que os outros genes ribossomais como 18S, 5.8S e 28S. Isto é possível porque esta região sofre splicing durante a transcrição. No entanto, porque o splicing depende da estrutura secundária da região ITS, pode haver algum grau de conservação [21]. Individualmente, a sequência ITS1 tem sido amplamente utilizada para identificar variabilidade genética entre strains ou populações de vários parasitas de Apicomplexa que
28 infectam vertebrados, como Neospora sp. [22] ou Cryptosporidium sp. [23]. O presente conjunto de dados apresenta duas populações independentes. No entanto, não pode discutir se a variação genética observada representa a diversidade genética intra ou entre indivíduos. Na verdade, o parasita da malária Plasmodium falciparum possui cinco cópias dos conjuntos de genes rRNA formando dois tipos, o tipo A (duas cópias) e do tipo S (três cópias) de genes rRNA 18S que são expressos de forma independente durante as diferentes fases da vida (fase sanguínea e esporozoito). A diversidade genética das sequências ITS1 de P. falciparum reflete, portanto, o polimorfismo dentro das cinco sequências distintas de ITS1 de cinco loci diferente de um único parasita indivíduo [24].
Em seguida, foi confirmada a posição filogenética de Nematopsis temporaria dentro de Gregarinas terrestres, como descrito por Wakeman et al. 2014 ou dentro da superfamília de Actinocephaloidea Léger 1892 [7, 18] (Fig. 1A). Por estas observações, estes gregarinas não parecem infectar a fase de vida adulta de sapos, mas outros estudos precisam ser realizados para se ter confirmação. Como Adino et al. (2012) demonstraram, girinos têm uma maior susceptibilidade a patógenos como o ranavírus 3 (FV3) por causa da fraqueza ou imaturidade das funções imunes adaptativas [25]. Então, essa deficiência no sistema imunológico provavelmente afeta a capacidade dos girinos para defender de outros grupos de patógenos.
5 CONCLUSÃO
Este estudo apresentou as primeiras evidências desde 1920 de uma infecção em um vertebrado por organismos pertencentes ao grupo Gregarina. Do ponto de vista evolutivo, estes resultados indicam que esse parasita pode representar um elo perdido na filogenia entre Gregarina e outros grupos dentro Apicomplexa que infectam vertebrados, como Coccídeos e hematozoários. Do ponto de vista ecológico, uma nova ameaça para o sistema imunológico de girinos é um achado preocupante, já que os anfíbios são um grupo tão ameaçado. Estudos futuros são necessários para caracterizar esta associação e para desenvolver estratégias adequadas para proteger populações de anfíbios.
29 REFERÊNCIAS
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