Vivian Inês dos Santos
OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE MEMBRANAS BICAMADAS DE BIOCOMPÓSITOS DE PLGA E FOSFATOS
DE CÁLCIO PARA APLICAÇÃO EM REGENERAÇÃO GUIADA DE OSSOS E TECIDOS
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciência e Engenharia de Materiais da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de Mestre em Engenharia de Materiais.
Orientador: Prof. Dr. Ing. Márcio Celso Fredel
Coorientadora: Profa. Dra. Claudia Merlini
Florianópolis 2019
Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor através do Programa de Geração Automática da Biblioteca Universitária
Este trabalho é dedicado a todos os aventureiros. Aos que se arriscam a cruzar os limites da engenharia. Aos que dedicam suas carreiras e vidas à quebra de dogmas, paradigmas e preconceitos.
AGRADECIMENTOS
Ciência é construída através de colaborações.
Dito isso, gostaria de usar esse espaço para agradecer primeiramente àqueles que me propiciaram essa oportunidade. Professores Márcio Celso Fredel, Claudia Merlini e Àguedo Aragones, obrigada pela constante presença, atenção e incentivo.
Fica aqui meu agradecimento também à outra parte responsável por essa oportunidade, a Coordenação de Pós-Graduação em Ciência e Engenharia de Materiais. Rogério Antônio Campos e professor Guilherme Mariz de Oliveira Barra, sempre presentes e tão cuidadosos, com sua incessante busca de melhorias vocês nos incentivam através do exemplo a darmos nosso máximo no que fazemos, por isso, obrigada.
Agradeço à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) pelo aporte financeiro que possibilitou esse estudo.
Gostaria de agradecer também à Dr. Karina Cesca, a qual foi de vital importância na condução dos testes biológicos, me ensinando com paciência, dedicação e carinho conhecimentos valiosíssimos os quais elevaram a qualidade desse estudo.
Agradeço aos colaboradores dos laboratórios da UFSC: Laboratório Central de Microscopia Eletrônica (LCME), Laboratório de Polímeros e Compósitos (POLICOM), Grupo de Estudo em Materiais Poliméricos (POLIMAT), Central de Análises da Engenharia Química, Laboratório de Materiais (LabMat) e Laboratório de Engenharia Biológica (Lieb), pela realização das análises e ensaios apresentados nesse estudo.
Aqueles que dividiram dias e laboratório comigo já não posso chamar de colegas, já que os considero amigos. Aldemir Luiz Dall-Astra, Francesca Albino, Maria Ester Alfaro Cuervo, Rafael Vidal Eleutério, Roberta de Farias e Thaiane Balestreri Knopf, obrigada por tornarem cada dia mais leve através da sua presença e é meu desejo genuíno que vocês sejam muito felizes no trajeto que escolherem seguir.
Fica aqui meu agradecimento em especial à Paula Faust Gouveia, a qual iluminou todos os dias da trajetória desse projeto tanto com sua companhia quanto com suas risadas, ambas constantes.
Agradeço por último àquela sem a qual nada disso seria possível, minha família. Silvio, Odete, Lilian e Billie, obrigada pelo apoio e por
estarem sempre presentes. Vocês são essenciais para que eu vá cada vez mais longe.
i stand on the sacrifices of a million women before me thinking
what can i do to make this mountain taller so the women after me can see farther
RESUMO
Perdas dentais nas quais não é realizada a terapia do implante comumente resultam em reabsorção óssea, o que leva à formação de um defeito ósseo. Nesses casos, as membranas para regeneração guiada representam um importante recurso, pois auxiliam na devolução do volume ósseo anatômico e de um resultado esteticamente agradável, buscando também impedir que fibroblastos proliferem para dentro da região do defeito ósseo em detrimento dos osteoblastos, uma vez que esses últimos se proliferam mais lentamente. Dentro desse contexto, membranas eletrofiadas têm sido o foco de muitos estudos por mimetizarem a matriz extracelular óssea, porém as mesmas não apresentam resistência mecânica suficiente para não colapsarem em uso para dentro do defeito ósseo. Uma alternativa para contornar essa limitação é a fabricação de uma membrana bicamada (uma camada densa e outra porosa eletrofiada). Dentre os materiais, destaca-se o PLGA (poli(ácido lático-co-ácido glicólico)) por ser um polímero biodegradável e com propriedades muito versáteis. A adição de fosfatos de cálcio a esse polímero é essencial para a neutralização de produtos ácidos oriundos da degradação do mesmo e para o aumento da bioatividade e osteocondução. Com base neste contexto, o presente estudo visa desenvolver membranas bicamadas, com uma camada densa composta de PLGA:HAp (hidroxiapatita) na proporção de 95:05 (% em peso) e uma camada eletrofiada de PLGA com HAp:β-TCP (β-fosfato tricálcico) nas proporções de 60:40, 70:30 e 85:15, caracterizando-as e correlacionando suas estruturas e propriedades. Para tal, a membrana densa foi obtida pelo processo de inversão de fase e o processo de eletrofiação foi realizado, posteriormente, sobre a mesma resultando em uma membrana bicamada. Os resultados mostraram que as membranas não apresentam potencial citotóxico e que as mesmas têm módulo de armazenamento (E’) constante até uma temperatura de aproximadamente 55 ᵒC. Houve um aumento de 128,4% do E’ para a membrana bicamada em relação à membrana densa e de 52,9% em relação à membrana eletrofiada, o que indica a melhor capacidade da membrana bicamada em armazenar energia e demonstra a boa adesão alcançada na interface entre as camadas. A adição à camada eletrofiada de HAp:β-TCP na proporção de 70:30 resultou no melhor módulo de armazenamento (131,90 MPa) entre todos os grupos avaliados. Não houve diferença significativa de atividade metabólica entre membranas sem e com fosfatos de cálcio, porém, morfologicamente, as membranas com fosfatos de cálcio apresentaram células mais espalhadas, maiores e que migraram muito
mais para o interior das membranas. Em termos de atividade metabólica, a adição à camada eletrofiada de HAp:β-TCP na proporção de 60:40 teve a melhor resposta. Esses resultados indicam o potencial mecânico e biológico das membranas bicamadas na regeneração guiada óssea, contribuindo para a devolução do volume ósseo anatômico e do bem-estar do paciente.
Palavras-chave: membrana, bicamada, regeneração guiada, inversão de fase, eletrofiação, PLGA, hidroxiapatita, HAp, β-fosfato tricálcico, β- TCP, fosfatos de cálcio, biocompósito.
ABSTRACT
Dental losses in which implant therapy is not performed usually result in bone resorption, which leads to a bone defect formation. On such cases,
membranes for guided regeneration represent an important resource, since they aid in the reconstruction of the anatomical bone volume and an aesthetically pleasing result, also preventing fibroblasts from proliferating into the region of the bone defect in detriment of the
osteoblasts, since the latter proliferate more slowly. In this context,
electrospun membranes have been the focus of many studies, once they mimic the extracellular bone matrix, but they lack enough mechanical resistance to avoid collapsing into the bone defect. One alternative to overcome this limitation is the fabrication of a bilayer membrane (one dense and one porous electrospun layer). Among the materials, PLGA (poly(lactic-co-glycolic acid)) stands out as a biodegradable polymer with versatile properties. The addition of calcium phosphates to this polymer is essential for the neutralization of acidic products resulting from the degradation of PLGA and for increased bioactivity and osteoconduction. Based on this context, the present study aims to develop membranes with a dense layer composed of PLGA: HAp (hydroxyapatite) in the proportion of 95:05 (% wt.) and an electrospun layer of PLGA with HAp: β-TCP (β-tricalcium phosphate) in the proportions of 60:40, 70:30 and 85:15, evaluating its applicability in guided bone regeneration. For this, the dense layer of the membranes was obtained through phase inversion process and the electrospinning process was performed, afterwards, over
this dense membrane resulting on a bilayer membrane. The results
showed that the membranes have no cytotoxic potential and that they have a constant storage modulus (E’) up to a temperature of 55 ᵒC. There was a 128.4% increase of E' for the bilayer membrane in relation to the dense membrane and an increase of 52.9% in relation to the electrospun membrane, which indicates a better capacity of the bilayer membrane to store energy and demonstrates the good adhesion achieved at the interface between layers. The addition of HAp: β-TCP at the ratio of 70:30 to the electrospun layer resulted in the best storage modulus (131.90 MPa) among all groups evaluated. There was no significative difference between membranes with and without calcium phosphates however, morphologically, membranes with calcium phosphates showed more scattered, larger cells that migrated much more into the membranes. In terms of metabolic activity, the addition of HAp: β-TCP in the ratio of 60:40 to the electrospun layer had the best biological response. These
results indicate the mechanical and biological potential of bilayer membranes in guided bone regeneration, contributing to the reconstruction of the anatomical bone volume and the patient's well-being.
Keywords: Membrane, bilayer, guided regeneration, phase inversion, electrospinning, PLGA, hydroxyapatite, HAp, β-tricalcium phosphate, β- TCP, calcium phosphates, biocomposite.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Matriz extracelular do osso. ... 36
Figura 2. Osso compacto e osso trabecular. ... 38
Figura 3. Diagrama de um segmento do osso compacto. ... 39
Figura 4. Ilustração de um ósteon. ... 40
Figura 5. Micrografia de fibras de colágeno na superfície de osso trabecular. ... 40
Figura 6. Esquema de organização hierárquica da estrutura do osso. .. 42
Figura 7. Tecido juncional gengival e dentogingival: gengiva marginal, gengiva anexada, epitélio sulpático e epitélio juncional. ... 43
Figura 8. Ilustração esquemática da aplicação de uma membrana bicamada no defeito ósseo. ... 45
Figura 9. Ilustração esquemática da membrana colocada em um cenário de regeneração guiada. ... 45
Figura 10. Estrutura química do poli(ácido lático-co-ácido glicólico) e os monômeros de ácido lático e ácido glicólico. Na estrutura do PLGA “n” representa o número de unidades de ácido lático e “m” o número de unidades de ácido glicólico. ... 49
Figura 11. Degradação do PLGA. ... 50
Figura 12. Tempo de meia vida in vivo de L-PLGA com diferentes proporções de LA/GA. ... 51
Figura 13. Grau de cristalinidade em função da porcentagem de ácido glicólico no L-PLGA. ... 52
Figura 14. Estrutura cristalina da HAp. Átomos: Ca (verde), P (laranja), O (vermelho) e H (branco). ... 54
Figura 15. Estrutura cristalina do β-TCP. Átomos: Ca (verde), P (laranja) e O (vermelho). ... 55
Figura 16. Esquema representativo de: (A) principais componentes de um aparato de eletrofiação; (B) morfologia das cadeias poliméricas dentro de uma fibra eletrofiada. ... 58
Figura 17. Esquema de síntese da Hidroxiapatita nanoestruturada. ... 62
Figura 18. Fluxograma de obtenção das membranas densas. (A) D PLGA e (B) D 95:05. ... 65
Figura 19. Fluxograma de obtenção das membranas eletrofiadas. (A) Eletrofiação somente com PLGA e (B) Eletrofiação com PLGA e fosfatos de cálcio. ... 66
Figura 20. Fluxograma de obtenção das membranas bicamadas: (A) Membranas bicamadas em que a camada eletrofiada é somente de PLGA; (B) Membranas bicamadas em que a camada eletrofiada é de PLGA e fosfatos de cálcio. ... 67
Figura 21. Curva de DSC do PLGA utilizado como matéria-prima. ... 77
Figura 22. Distribuição do tamanho de partícula dos fosfatos de cálcio. (A) HAp e (B) β-TCP. ... 78
Figura 23. Espectro de FTIR obtido para o PLGA. ... 80
Figura 24. Espectros de FTIR dos fosfatos de cálcio. ... 82
Figura 25. Espectro de FTIR das membranas densas. ... 83
Figura 26. Espectro de FTIR das membranas eletrofiadas. ... 84
Figura 27. Comparação entre os espectros de FTIR de D PLGA e E PLGA. ... 85
Figura 28. Difração de raios-X dos fosfatos de cálcio. ... 86
Figura 29. Difração de raios-X das membranas densas. ... 87
Figura 30. Comparação de difração de raios-X entre D PLGA e E PLGA. ... 88
Figura 31. Difração de raios-X das membranas eletrofiadas. ... 89
Figura 32. Micrografias das membranas densas. (A) D PLGA, aumento de 500x (B) D PLGA transversal, aumento de 1000x; (C) D 95:05, aumento de 500x; (D) D 95:05 transversal, aumento de 1000x. ... 91
Figura 33. Micrografias da membrana eletrofiada E PLGA. Aumentos de 100 e 3000x respectivamente. ... 92
Figura 34. Micrografias da membrana eletrofiada E 60:40. Aumentos de 100 e 3000x respectivamente. ... 93
Figura 35. Micrografias da membrana eletrofiada E 70:30. Aumentos de 100 e 3000x respectivamente. ... 93
Figura 36. Micrografias da membrana eletrofiada E 85:15. Aumentos de 100 e 3000x respectivamente. ... 93
Figura 37. Diâmetro das fibras das membranas eletrofiadas. Gráfico obtido por meio dos resultados com análise de variância (ANOVA) com um único fator, p ≤ 0,05. ... 95
Figura 38. Micrografias da membrana bicamada BIC PLGA. Aumentos de 3000x e 1000x na transversal, respectivamente. ... 95
Figura 39. Micrografias da membrana bicamada BIC D95:05. Aumentos de 3000x e 1000x na transversal, respectivamente. ... 96
Figura 40. Micrografias da membrana bicamada BIC 60:40. Aumentos de 3000x e 1000x na transversal, respectivamente. ... 96
Figura 41. Micrografias da membrana bicamada BIC 70:30. Aumentos de 3000x e 1000x na transversal, respectivamente. ... 96
Figura 42. Micrografias da membrana bicamada BIC 85:15. Aumentos de 3000x e 1000x na transversal, respectivamente. ... 97
Figura 43. Diâmetro médio das fibras eletrofiadas das membranas bicamadas. Gráfico obtido por meio dos resultados com análise de variância (ANOVA) com um único fator, p ≤ 0,05. ... 97
Figura 44. Comparação dos diâmetros das fibras com o processo de eletrofiação acontecendo sem e sobre membrana densa. (A) E PLGA, BIC PLGA e BIC D95:05; (B) E 60:40 e BIC 60:40; (C) E 70:30 e BIC 70:30 e (D) E 85:15 e BIC 85:15. Gráfico obtido por meio dos resultados com análise de variância (ANOVA) com um único fator, p ≤ 0,05. ... 98 Figura 45. Porosidade das membranas densas, eletrofiadas e bicamadas. Gráfico obtido por meio dos resultados com análise de variância (ANOVA) com um único fator, p ≤ 0,05. ... 100 Figura 46. Curvas de E’ e tan δ da análise termodinâmica-mecânica para (A) D PLGA; (B) E PLGA; (C) BIC PLGA; (D) BIC D95:05; (E) BIC 60:40; (F) BIC 70:30 e (G) BIC 85:15. ... 101 Figura 47. Diferença de massa para todos os grupos de amostra após 20, 30 e 60 dias no teste de degradação. Gráfico obtido por meio dos resultados com análise de variância (ANOVA) com um único fator, p ≤ 0,05. ... 105 Figura 48. Análise de ângulo de contato das membranas densas antes do teste de degradação in vitro. ... 107 Figura 49. Micrografias do grupo D PLGA submetido ao teste de degradação por 60 dias. Aumentos de 500 e 3000x, respectivamente. 108 Figura 50. Micrografias do grupo D 95:05 submetido ao teste de degradação por 60 dias. Aumentos de 500 e 3000x, respectivamente. 108 Figura 51. Micrografias do grupo E PLGA submetido ao teste de degradação por 60 dias. Aumentos de 500 e 3000x, respectivamente. 109 Figura 52. Micrografias do grupo E 60:40 submetido ao teste de degradação por 60 dias. Aumentos de 500 e 3000x, respectivamente. 109 Figura 53. Micrografias do grupo E 70:30 submetido ao teste de degradação por 60 dias. Aumentos de 500 e 3000x, respectivamente. 109 Figura 54. Micrografias do grupo E 85:15 submetido ao teste de degradação por 60 dias. Aumentos de 500 e 3000x, respectivamente. 110 Figura 55. Micrografias do grupo BIC PLGA submetido ao teste de degradação por 60 dias. Aumentos de 500 e 3000x, respectivamente. 110 Figura 56. Micrografias do grupo BIC D95:05 submetido ao teste de degradação por 60 dias. Aumentos de 500 e 3000x, respectivamente. 110 Figura 57. Micrografias do grupo BIC 60:40 submetido ao teste de degradação por 60 dias. Aumentos de 500 e 3000x, respectivamente. 111 Figura 58. Micrografias do grupo BIC 70:30 submetido ao teste de degradação por 60 dias. Aumentos de 500 e 3000x, respectivamente. 111 Figura 59. Micrografias do grupo BIC 85:15 submetido ao teste de degradação por 60 dias. Aumentos de 500 e 3000x, respectivamente. 111 Figura 60. Micrografia e análise de EDX do acumulado residual encontrado no grupo E PLGA. ... 112
Figura 61. Micrografia e análise de EDX do acumulado residual encontrado no grupo E 60:40. ... 113 Figura 62. Micrografia e análise de EDX do acumulado residual encontrado no grupo E 70:30. ... 113 Figura 63. Micrografia e análises de EDX do acumulado residual encontrado no grupo E 85:15. ... 113 Figura 64. Micrografia e análise de EDX do acumulado residual encontrado no grupo BIC PLGA. ... 114 Figura 65. Micrografia e análise de EDX do acumulado residual encontrado no grupo BIC D95:05. ... 114 Figura 66. Micrografia e análise de EDX do acumulado residual encontrado no grupo BIC 60:40. ... 114 Figura 67. Micrografia e análise de EDX do acumulado residual encontrado no grupo BIC 70:30. ... 115 Figura 68. Micrografia e análise de EDX do acumulado residual encontrado no grupo BIC 85:15. ... 115 Figura 69. Comparação entre os diâmetros das fibras eletrofiadas antes e depois do teste de degradação por 60 dias. Gráfico obtido por meio dos resultados com análise de variância (ANOVA) com um único fator, p ≤ 0,05. ... 117 Figura 70. Comparação entre a porosidade antes e depois do teste de degradação por 60 dias. Gráfico obtido por meio dos resultados com análise de variância (ANOVA) com um único fator, p ≤ 0,05. ... 118 Figura 71. Porcentagem de atividade metabólica no teste de citotoxicidade após 1, 3 e 7 dias. Gráfico obtido por meio dos resultados com análise de variância (ANOVA) com um único fator, p ≤ 0,05. ... 119 Figura 72. Atividade metabólica após 1 e 7 dias do teste de adesão e proliferação de osteoblastos. Gráfico obtido por meio dos resultados com análise de variância (ANOVA) com um único fator, p ≤ 0,05. ... 121 Figura 73. Micrografias de E PLGA (Grupo Controle) após teste de adesão e proliferação de osteoblastos. (A e B) Após 1 dia de teste e (C e D) Após 7 dias de teste. Aumentos de 500 e 2000x, respectivamente, para cada um dos tempos. ... 122 Figura 74. Micrografias de E 60:40 após teste de adesão e proliferação de osteoblastos. (A e B) Após 1 dia de teste e (C e D) Após 7 dias de teste. Aumentos de 500 e 2000x, respectivamente, para cada um dos tempos. ... 123 Figura 75. Micrografias de E 70:30 após teste de adesão e proliferação de osteoblastos. (A e B) Após 1 dia de teste e (C e D) Após 7 dias de teste. Aumentos de 500 e 2000x, respectivamente, para cada um dos tempos. ... 124
Figura 76. Micrografias de E 85:15 após teste de adesão e proliferação de osteoblastos. (A e B) Após 1 dia de teste e (C e D) Após 7 dias de teste. Aumentos de 500 e 2000x, respectivamente, para cada um dos tempos. ... 125
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Fração de cada um dos componentes presentes em cada grupo de membranas produzido. ... 63 Tabela 2. Análises realizadas em cada matéria-prima e grupo de amostras... 68 Tabela 3. Composição química do PBS utilizado. ... 72 Tabela 4. Dados de distribuição de tamanho de partícula dos fosfatos de cálcio. ... 79 Tabela 5. Designações das bandas de absorção observadas no espectro de FTIR do PLGA. ... 81 Tabela 6. Designações das bandas de absorção observadas nos espectros de FTIR dos fosfatos de cálcio. ... 82 Tabela 7. Valores de cristalinidade calculados pela análise de DRX. .. 90 Tabela 8. Espessura média e diâmetro médio dos poros das membranas densas. ... 91 Tabela 9. Espessura média da membrana e diâmetro médio das fibras das membranas eletrofiadas. ... 94 Tabela . Diâmetro médio das fibras das membranas bicamadas. ... 98 Tabela 11. Valores de porosidade das membranas densas, eletrofiadas e bicamadas. ... 99 Tabela 12. Valores de Tg, faixa de temperaturas em que o módulo de armazenamento é constante (ΔTE’ constante) e módulo de armazenamento em 37 ºC oriundos da análise de DMTA. ... 102 Tabela 13. Diferença de massa após teste de degradação por 20, 30 e 60 dias. ... 105 Tabela 14. Diâmetro das fibras das membranas eletrofiadas e bicamadas após 60 dias do teste de degradação in vitro. ... 117 Tabela 15. Porosidade das membranas densas e eletrofiadas após 60 dias do teste de degradação in vitro ... 118 Tabela 16. Valores de atividade metabólica após 1, 3 e 7 dias no teste de citotoxicidade. ... 120 Tabela 17. Valores de atividade metabólica após 1 e 7 dias do teste de adesão e proliferação de osteoblastos. ... 120
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ᵒ Graus; °C Graus Celsius; % Porcentagem; %m Porcentagem em massa; Å Angstrons;
α-MEM α-Modified Eagle’s Medium; β-TCP β-Fosfato Tricálcico;
ΔHexp Entalpia de fusão experimental; ΔHc Entalpia de fusão teórica;
ΔTE’ constante Faixa de temperaturas em que o módulo de armazenamento é constante;
λ Comprimento de onda;
θ Ângulo de feixe incidente na difração de raios-X;
μA Microampère;
μL Microlitros;
μm Micrometros;
ABS Absorbância;
ABSamostra Absorbância da amostra; ABScontrole Absorbância do controle;
ANOVA Análise de Variância One-WAY; ATR Reflectância Total Atenuada;
Au Ouro;
BIC D95:05 Membrana bicamada com camada densa de 95% PLGA e 5% de HAp e camada eletrofiada de PLGA;
BIC PLGA Membrana bicamada com camada densa de PLGA e camada eletrofiada de PLGA;
BIC 60:40 Membrana bicamada com camada densa de 95% PLGA e 5% de HAp e camada eletrofiada com 70% PLGA e 30% fosfatos de cálcio (60% HAp e 40% β-TCP);
BIC 70:30 Membrana bicamada com camada densa de 95% PLGA e 5% de HAp e camada eletrofiada com 70% PLGA e 30% fosfatos de cálcio (70% HAp e 30% β-TCP);
BIC 85:15 Membrana bicamada com camada densa de 95% PLGA e 5% de HAp e camada eletrofiada
com 70% PLGA e 30% fosfatos de cálcio (85% HAp e 15% β-TCP); cm Centímetros; C Carbono; C3H6O Acetona; Ca Cálcio; Ca2+ Íon de cálcio;
CaCO3 Carbonato de cálcio; CaHPO4 Hidrogenofosfato de cálcio; Ca(NO3)2.4H2O Nitrato de cálcio tetrahidratado;
CERMAT Núcleo de Pesquisa em Materiais Cerâmicos e Compósitos;
Cl Cloro;
CO2 Dióxido de Carbono;
CO32- Carbonato;
Cu-Kα Radiação Kα do Cobre;
dL/g Decilitros por grama;
D PLGA Membrana densa composta somente de PLGA; D 95:05 Membrana densa com 95% de PLGA e 5% de
HAp;
DCE Dicloretano;
DFDBA Alográfico Inorgânico Bovino; DL Mistura racêmica de estereoisômeros;
DLS Espalhamento Dinâmico da Luz;
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium;
DMF Dimetilformamida;
DMTA Análise Termodinâmica-Mecânica;
DRX Difração de Raios-X;
DSC Calorimetria Diferencial de Varredura;
E’ Módulo de armazenamento;
E PLGA Membrana eletrofiada composta somente de PLGA;
E 60:40 Membrana eletrofiada com 70% PLGA e 30% fosfatos de cálcio (60% HAp e 40% β-TCP); E 70:30 Membrana eletrofiada com 70% PLGA e 30%
fosfatos de cálcio (70% HAp e 30% β-TCP); E 85:15 Membrana eletrofiada com 70% PLGA e 30%
fosfatos de cálcio (85% HAp e 15% β-TCP); ECM Matriz extracelular óssea;
EDX Espectroscopia de raios-X por dispersão em energia;
ePTFE Politetrafluoretileno expandido;
exo Exotérmico;
FDA Food and Drug Administration;
FTIR Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier;
g Gramas;
g/L Gramas por litro;
GA Ácido glicólico;
GBR Guided Bone Regeneration (Regeneração
Guiada de Ossos);
GTR Guided Tissue Regeneration (Regeneração
Guiada de Tecidos);
h Horas;
H Hidrogênio;
Hz Hertz;
HAp Hidroxiapatita;
Ibackground Área integrada da linha base (região amorfa) do difratograma de DRX;
Iobs Área total integrada do difratograma de DRX; ImageJ Software livre de processamento de imagens;
ISO International Organization for Standardization;
J/g Joules por gramas;
JCPDS Joint Committee on Powder Diffraction Standards; KCl Cloreto de potássio; KH2PO4 Dihidrogenofosfato de potássio; kV Quilovolts; L Litros; L Levogiro;
L-PLGA PLGA levogiro;
LA Ácido lático;
LabMat Laboratório de Materiais;
LCME Laboratório Central de Microscopia Eletrônica; Lieb Laboratório de Engenharia Biológica;
L929 Linhagem de fibroblastos de tecido conjuntivo de camundongo;
m Metros;
m Número de unidades de ácido glicólico;
MC3T3 Linhagem de osteoblastos;
MEV Microscopia Eletrônica de Varredura; MF Massa final - Após teste de degradação; MI Massa inicial - Antes teste de degradação;
min Minutos;
mL Mililitros;
mL/h Mililitros por hora;
mm Milímetros;
MPa Megapascal;
MTS Atividade Metabólica;
nm Nanômetros;
n Número de unidades de ácido lático;
Na Sódio;
NaCl Cloreto de sódio;
Na2HPO4 Hidrogenofosfato dissódico; (NH4)2HPO4 Fosfato diamônico;
O Oxigênio;
p Probabilidade de significância do teste ANOVA;
P Fósforo;
PA66 Poliamida 6,6;
PBS Tampão Fosfato Salino (Phosphate Buffered
Saline);
PCL Policaprolactona;
PDF Powder Diffraction File;
PDI Índice de polidispersão;
PDLLA Poli(D,L-ácido láctico);
PGA Poliácido glicólico;
pH Potencial Hidrogeniônico;
PHB Poli-hidroxibutirato;
PLA Poli(ácido láctico);
PLLA Poli(L-ácido láctico);
PLGA Poli(ácido lático-co-ácido glicólico);
PO31- Metafosfatos;
PO43- Ortofosfatos;
P2O74- Pirofosfatos;
POLIMAT Grupo de Estudo em Materiais Poliméricos;
rpm Rotações por minuto;
SBF Soro fetal bovino;
SD Gota séssil;
Tm Temperatura de fusão;
tan δ Tangente de perda;
u.a Unidade arbitrária;
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 31 1.1. MOTIVAÇÃO E JUSTIFICATIVA ... 31 1.2. OBJETIVOS ... 33 1.2.1.Objetivo Geral ... 33 1.2.2.Objetivos Específicos ... 33 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 35 2.1. TECIDOS ÓSSEO E GENGIVAIS ... 35 2.1.1.Tecido Ósseo ... 35 2.1.1.1.Matriz Óssea ... 35 2.1.1.2.Células do Tecido Ósseo ... 37 2.1.1.3.Estrutura do Tecido Ósseo ... 38 2.1.2.Tecidos Gengivais ... 42 2.2. REGENERAÇÃO PERIODONTAL ... 44 2.2.1.Membranas GTR/GBR ... 44 2.3. BIOMATERIAIS ... 48 2.3.1.Poli(ácido lático-co-ácido glicólico) – PLGA ... 48 2.3.2.Fosfatos de cálcio ... 53 2.3.2.1.Hidroxiapatita (HAp) ... 54 2.3.2.2.β-Fosfato Tricálcico (β-TCP) ... 55 2.4. PROCESSAMENTO ... 56 2.4.1.Inversão de Fase ... 56 2.4.2.Eletrofiação ... 57 3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 61 3.1. MATERIAIS ... 61 3.2. MÉTODOS DE PREPARAÇÃO... 61 3.2.1.Síntese da Hidroxiapatita Nanoestruturada... 61 3.2.2.Síntese do β-Fosfato Tricálcico ... 62 3.2.3.Obtenção das Membranas ... 62 3.2.3.1.Obtenção das Membranas Densas ... 64 3.2.3.2.Obtenção das Membranas Eletrofiadas ... 65 3.2.3.3.Obtenção das Membranas Bicamadas ... 67 3.3. MÉTODOS DE CARACTERIZAÇÃO ... 68 3.3.1.Análise de Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) .. 69 3.3.2.Análise de Distribuição do Tamanho de Partícula – Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) ... 69 3.3.3.Análise de Espectroscopia de Infravermelhos por Transformadas de Fourier (FTIR) ... 70 3.3.4.Análise de Difração de Raios-X (DRX) ... 70
3.3.5.Análise de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) .. 71 3.3.6.Análise Termodinâmica-Mecânica (DMTA) ... 71 3.3.7.Avaliação da Degradação in vitro ... 72 3.3.8.Avaliação da Citotoxicidade ... 73 3.3.9.Avaliação da Adesão e da Proliferação de Células Osteoblásticas ... 74 3.3.10.Análise Estatística ... 75 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 77 4.1. ANÁLISE DE CALORIMETRIA EXPLORATÓRIA DE VARREDURA (DSC) ... 77 4.2. ANÁLISE DE DISTRIBUIÇÃO DO TAMANHO DE PARTÍCULA – ESPALHAMENTO DINÂMICO DE LUZ (DLS) 78 4.3. ANÁLISE DE ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHOS POR TRANSFORMADAS DE FOURIER (FTIR) ... 80 4.4. ANÁLISE DE DIFRAÇÃO DE RAIOS-X (DRX) ... 85 4.5. ANÁLISE DE MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (MEV) ... 90 4.6. ANÁLISE TERMODINÂMICA-MECÂNICA (DMTA) ... 100 4.7. AVALIAÇÃO DA DEGRADAÇÃO IN VITRO ... 104 4.8. AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE ... 119 4.9. AVALIAÇÃO DA ADESÃO E DA PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS OSTEOBLÁSTICAS ... 120 5. CONCLUSÕES ... 127 6. REFERÊNCIAS ... 133 ANEXOS...147 ANEXO A – CURVAS DE DIFRAÇÃO DE RAIOS-X
UTILIZADAS PARA O CÁLCULO DE
1. INTRODUÇÃO
1.1. MOTIVAÇÃO E JUSTIFICATIVA
A remodelação óssea após extração dentária muitas vezes leva à um dimensionamento ósseo inadequado para a posição tridimensional ideal para que seja feita a terapia do implante. Isto pode resultar numa restauração protética final esteticamente inaceitável e/ou em dificuldades na realização de uma higiene oral adequada, colocando assim em risco o prognóstico a longo prazo (ROCCHIETTA, FERRANTINO e SIMION, 2018).
Como consequência dessa dificuldade em intervenções odontológicas, surgiram estudos relacionados à regeneração tanto óssea como tecidual. Dentre esses estudos, membranas representam um importante recurso, pois auxiliam na devolução do volume ósseo anatômico e de um resultado esteticamente agradável, atuando como barreira para evitar a invasão de células intrusas à área defeituosa e permitindo, quando não há volume suficiente de osso saudável no local do implante, a obtenção de espaços que devem ser posteriormente preenchidos com osso novo (RAD et al., 2017). Nesse contexto, as membranas GTR/GBR (Guided Tissue Regeneration/Guided Bone
Regeneration) buscam permitir a regeneração óssea impedindo que
fibroblastos proliferem para dentro da região do defeito ósseo em detrimento dos osteoblastos, uma vez que esses últimos se proliferam mais lentamente. Caso ocorra, essa infiltração de fibroblastos não permitiria a proliferação adequada de osteoblastos, células que são responsáveis pela regeneração do tecido ósseo.
No que diz respeito aos materiais mais estudados para essa aplicação, constam o PCL (policaprolactona) (DA SILVA, BERTRAN e GONÇALVES, 2015; THOMAS et al., 2006; YANG et al., 2009), materiais de natureza biológica, tais como colágeno (THOMAS et al., 2007; LIAO et al., 2005), quitosana (TENG et al., 2009), proteína da seda (LU et al., 2015) e alginato (MILELLA et al., 2001) e também poliésteres sintéticos, como PLA (poli(ácido láctico)), PGA (poliácido glicólico) e seus copolímeros (PARK et al., 2000; FU et al., 2017; KIKUCHI et al., 2004).
Dentre os poliésteres sintéticos, o poli(ácido lático-co-ácido glicólico) (PLGA) apresenta uma grande variedade de aplicações na área biomédica devido a sua rápida taxa de degradação e a seus produtos de degradação não serem tóxicos e serem metabolizados por processos
naturais do organismo. Todavia, quando o PLGA é utilizado de forma pura, esses produtos tornam o meio ácido, o que pode ocasionar reações adversas ao paciente. Assim, a incorporação de biocerâmicas, como a hidroxiapatita (HAp) e o β-fosfato tricálcico (β-TCP), a este polímero visa melhorar a bioatividade e osteocondutividade do material, além de evitar que o meio fisiológico do paciente se torne ácido com a degradação do PLGA.
Os métodos geralmente utilizados para a obtenção das membranas GTR/GBR incluem a inversão de fase (MILELLA et al., 2001; PARK et
al., 2000; LI et al., 2009; DA SILVA, BERTRAN e GONÇALVES,
2015; LIAO et al., 2005), filtração dinâmica (TENG et al., 2009), prensagem (heat-kneading method) (KIKUCHI et al., 2004) e eletrofiação (LU et al., 2015; RAD et al., 2017; MOUTHUY, CROSSLEY e YE, 2013; BOTTINO, THOMAS e JANOWSKI, 2011; YANG, BEST e CAMERON, 2009; THOMAS et al., 2006).
Dentro desse contexto, a utilização do processo de eletrofiação permite a obtenção de membranas constituídas de uma rede tridimensional de fibras contínuas de uma ampla gama de polímeros, os quais ainda podem conter diversos aditivos (HUANG et al., 2003). Esses fatores, juntamente com a elevada porosidade e área de superfície das membranas eletrofiadas, são de grande importância quando se almeja obter um arcabouço tridimensional capaz de conduzir e promover a regeneração óssea. Todavia, membranas eletrofiadas possuem baixa rigidez, fator que é prejudicial quando se almeja obter uma membrana que tenha força de sustentação suficiente para não colapsar em uso.
De modo a superar essa limitação, pretende-se com esse estudo, aliar as vantagens já citadas de uma membrana eletrofiada com a utilização de uma membrana mais densa aderida à mesma, aumentando a rigidez e garantindo uma maior força de sustentação. Optou-se por obter essa membrana densa pelo método de inversão de fase, o qual tem baixo custo e alta praticidade e produz membranas com um grau de porosidade muito baixo. Quando utilizada sozinha, uma membrana com porosidade muito baixa, como a obtida por esse método, pode fazer com que o local de regeneração óssea não receba irrigação suficiente e apresente necrose (DA SILVA, BERTRAN e GONÇALVES, 2015), porém em uma membrana bicamada, essa característica pode ser muito vantajosa na função de barrar a infiltração de fibroblastos. O desenvolvimento de uma membrana bicamada oriunda desses dois processos tem, dessa maneira, potencial de conciliar as vantagens de cada processo e de superar as limitações acima citadas.
Logo, o presente estudo visa desenvolver membranas híbridas, sendo estas compostas de: (1) uma camada densa produzida por inversão de fase composta de PLGA e HAp e (2) uma camada eletrofiada de PLGA, HAp e β-TCP, com três diferentes concentrações de HAp/β-TCP.
1.2. OBJETIVOS 1.2.1. Objetivo Geral
▪ Desenvolver, caracterizar e correlacionar estrutura e propriedades de membranas bicamadas de PLGA/HAp/β-TCP para aplicação em regeneração guiada de ossos e tecidos.
1.2.2. Objetivos Específicos
▪ Fabricar membranas bicamadas de PLGA/HAp/β-TCP com diferentes frações desses fosfatos de cálcio na camada eletrofiada, as quais apresentem uma adequada interface entre as camadas densa e eletrofiada;
▪ Verificar a influência dos fosfatos de cálcio e do processamento na morfologia e no comportamento mecânico das membranas, definindo se membranas bicamadas apresentam melhor comportamento do que membranas densas e membranas eletrofiadas em termos mecânicos;
▪ Avaliar o perfil de degradação das membranas, de modo a entender como será sua degradação;
▪ Avaliar a citotoxicidade das membranas de maneira a validar sua aplicabilidade como biomaterial;
▪ Avaliar a capacidade de adesão e proliferação de células osteoblásticas nas membranas, a fim de se entender melhor como se dará essa relação quando da sua aplicação no corpo humano e, consequentemente, a capacidade de regeneração óssea da membrana, definindo qual proporção de HAp/β-TCP apresenta melhor resposta.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. TECIDOS ÓSSEO E GENGIVAIS
A fim de se desenvolver uma membrana capaz de guiar e promover a regeneração de tecidos é preciso primeiro entender quais são os constituintes desses tecidos e de que maneira eles se organizam, foco dessa seção.
2.1.1. Tecido Ósseo
O tecido ósseo é o componente principal do esqueleto, tendo como função o suporte para tecidos moles e proteção de órgãos vitais, como os contidos nas caixas craniana e torácica e no canal raquidiano. Aloja e protege a medula óssea, formadora das células do sangue, proporciona apoio aos músculos esqueléticos, transformando suas contrações em movimentos úteis, e constitui um sistema de alavancas que amplia as forças geradas na contração muscular (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2013).
Além dessas funções, os ossos funcionam como depósito de cálcio, fosfato e outros íons, armazenando-os ou liberando-os de maneira controlada, para manter constante a concentração desses importantes íons nos líquidos corporais. São capazes ainda de absorver toxinas e metais pesados, minimizando assim seus efeitos adversos em outros tecidos (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2013).
Assim como outros tecidos conjuntivos, o tecido ósseo consiste de células separadas por uma matriz extracelular. Porém, diferentemente de outros tecidos conjuntivos, o osso tem componentes orgânicos e inorgânicos. Os componentes orgânicos são as células, as fibras e a substância fundamental, enquanto os componentes inorgânicos são os sais minerais que invadem a matriz óssea, fazendo com que o tecido ósseo se torne mais rígido (MARIEB e HOEHN, 2013).
2.1.1.1. Matriz Óssea
Assim como outros tecidos conjuntivos, é a composição única da matriz que proporciona ao osso suas propriedades físicas excepcionais (MARIEB e HOEHN, 2013). A matriz extracelular óssea, como a maioria dos tecidos conjuntivos, consiste de uma substância fundamental na qual
numerosas fibras de colágeno estão presentes, comumente de maneira ordenada (Figura 1). Do seu peso seco, 60-70% é composto por sais minerais inorgânicos, 30-40% é colágeno e o restante (~5%) são proteínas e carboidratos não colagenosos, principalmente na forma de glicoproteínas (STRANDING, 2005).
Figura 1. Matriz extracelular do osso.
Fonte: Adaptado de GAHARWAR et al., 2016.
A parte orgânica da matriz é formada por fibras colágenas constituídas de colágeno do tipo I e por pequena quantidade de proteoglicanos e glicoproteínas. As glicoproteínas do osso podem ter alguma participação na mineralização da matriz, uma vez que outros tecidos ricos em colágeno tipo I, mas que não contêm essas glicoproteínas, normalmente não se calcificam (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2013). Essas substâncias orgânicas contribuem tanto para a estrutura do osso como para a flexibilidade e resistência à tração (MARIEB e HOEHN, 2013; STRANDING, 2005).
A porção mineral dos ossos é composta grandemente de cristais feitos de uma substância geralmente chamada de hidroxiapatita (mas com um importante teor de carbonato e uma razão Ca/P menor do que hidroxiapatita pura (Ca10(PO4)6(OH)2) juntamente com uma pequena porção de fosfatos de cálcio. Os cristais do osso são pequenos, mas têm uma alta área de superfície. Eles assumem a forma de placas finas ou estruturas que se assemelham a folhas e variam de tamanho até 150 nm de comprimento x 80 nm de largura x 5 nm de espessura, apesar de a maioria ter metade desse tamanho. Eles geralmente estão bem próximos, com seu eixo de comprimento quase paralelo ao eixo das fibras de colágeno (STRANDING, 2005). Os pequenos espaços entre os cristais
contêm macromoléculas orgânicas e água associada, a qual facilita a troca de íons entre o líquido intersticial e o cristal (STRANDING, 2005; JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2013). Esses cristais são responsáveis pela característica mais notável do osso - sua dureza excepcional, que lhe permite resistir à compressão (STRANDING, 2005; MARIEB e HOEHN, 2013).
A combinação adequada de elementos orgânicos e inorgânicos (fibras colágenas e hidroxiapatita) permite que o osso seja extremamente durável, forte e resistente, sem ser quebradiço (MARIEB e HOEHN, 2013).
2.1.1.2. Células do Tecido Ósseo
Cinco grandes tipos celulares estão presentes no tecido ósseo: células osteogênicas, osteoblastos, osteócitos, células do revestimento ósseo e osteoclastos. Cada tipo de célula é essencialmente uma forma especializada do mesmo tipo de célula básica que se transforma em uma forma madura ou funcional que atua no crescimento ósseo de maneira específica. As células ósseas, como outras células do tecido conjuntivo, são cercadas por uma matriz extracelular de sua própria confecção (MARIEB e HOEHN, 2013; STRANDING, 2005).
As células osteogênicas, também chamadas de células osteoprogenitoras, são células mitoticamente ativas que, quando estimuladas, se diferenciam em osteoblastos ou células de revestimento ósseo, enquanto outras persistem como células osteogênicas (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2013; MARIEB e HOEHN, 2013).
Os osteoblastos são células ativamente mitóticas que formam osso e secretam a matriz óssea. A matriz óssea não mineralizada que eles secretam inclui colágeno (90% da proteína óssea) e proteínas de ligação ao cálcio que compõem o osso inicial não metabolizado ou osteóide. Os osteoblastos também desempenham um papel na calcificação da matriz. Quando os osteoblastos ficam completamente rodeados pela matriz sendo secretada, eles se tornam osteócitos (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2013; MARIEB e HOEHN, 2013).
Os osteócitos são células ósseas maduras que ocupam espaços (lacunas), as quais se adequam à sua forma. Osteócitos monitoram e mantêm a matriz óssea e, uma vez que morrem, a matriz circundante é reabsorvida. Osteócitos também atuam como "sensores" de tensão e respondem a estímulos mecânicos (carga óssea, deformação óssea). Eles comunicam esta informação às células responsáveis pela remodelação óssea (osteoblastos e osteoclastos) para que a matriz óssea possa ser feita
ou degradada conforme necessário para preservar a homeostase do cálcio (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2013; MARIEB e HOEHN, 2013).
As células do revestimento do osso são células planas encontradas nas superfícies dos ossos onde a remodelação óssea não está acontecendo e, como osteócitos, ajudam a manter a matriz (MARIEB e HOEHN, 2013).
Osteoclastos são células multinucleadas gigantes localizadas em locais de reabsorção óssea. Quando estão ativamente ressorvendo osso (quebrando), os osteoclastos exibem uma borda enrugada distinta que entra diretamente em contato com o osso. As inflexões profundas da membrana plasmática dessa borda enrugada aumentam tremendamente a área de superfície para degradar enzimaticamente os ossos e selar essa área da matriz circundante (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2013; MARIEB e HOEHN, 2013).
2.1.1.3. Estrutura do Tecido Ósseo
Todo osso tem uma camada externa densa que parece lisa e sólida a olho nu. Esta camada externa é chamada de osso compacto/cortical (Figura 2). Mais internamente está o osso esponjoso/trabecular, um favo de mel (“honeycomb”) de pequenas peças de formato agulhar ou planar chamadas trabéculas. Nos ossos vivos, os espaços abertos entre as trabéculas são preenchidos com medula óssea vermelha ou amarela (MARIEB e HOEHN, 2013).
Figura 2. Osso compacto e osso trabecular.
Fonte: (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2013).
Osso compacto/cortical
Embora o osso compacto pareça sólido, ele está cheio de passagens que servem de conduíntes para nervos e vasos sanguíneos (Figura 3).
Figura 3. Diagrama de um segmento do osso compacto.
Fonte: Adaptado de MARIEB e HOEHN, 2013.
A unidade estrutural do osso compacto é chamada de ósteon ou de sistema haversiano (Figuras 3 e 4). Cada ósteon é um cilindro alongado orientado paralelamente ao eixo longo do osso. Funcionalmente, eles são pequenos pilares de suporte de peso. Um ósteon é um grupo de tubos ocos de matriz óssea, onde cada tubo de matriz é uma lamela, e por isso o osso compacto é também chamado de osso lamelar. Embora todas as fibras de colágeno em uma lamela particular funcionem em uma única direção (Figuras 1 e 5), as fibras de colágeno em lamelas adjacentes sempre correm em direções diferentes (Figura 4). Este padrão alternante é projetado para suportar tensões de torção - as lamelas adjacentes reforçam uma a outra para resistir à torção. As fibras de colágeno não são a única parte das lamelas ósseas ordenada. Os minúsculos cristais de sais ósseos se alinham entre as fibrilas de colágeno e também alternam sua direção em lamelas adjacentes (MARIEB e HOEHN, 2013; HAM, 1977; STRANDING, 2005).
Figura 4. Ilustração de um ósteon.
Fonte: Adaptado de MARIEB e HOEHN, 2013.
Figura 5. Micrografia de fibras de colágeno na superfície de osso trabecular.
Fonte: (STRANDING, 2005).
Através do núcleo de cada osteon se encontra o canal central, ou o canal de Havers, contendo pequenos vasos sanguíneos e fibras nervosas que atendem as células do osteon. Os canais de um segundo tipo,
chamados de canais de perfuração, ou os canais de Volkmann, situam-se perpendiculares ao eixo longo do osso e ligam o fornecimento de sangue e nervos do periósteo (células osteogênicas) aos canais centrais e cavidades medulares. Osteócitos ocupam lacunas nas junções das lamelas, enquanto canalículos conectam a lacuna entre si e com o canal central (MARIEB e HOEHN, 2013; TUREK, 1991). Como não existe difusão de substâncias através da matriz calcificada do osso, a nutrição dos osteócitos depende desses canalículos que existem na matriz, os quais possibilitam a troca de moléculas e íons entre os capilares sanguíneos e os osteócitos (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2013).
Osso esponjoso/trabecular
Em contraste com o osso compacto, o osso esponjoso parece um tecido mal organizado, no entanto, as trabéculas no osso esponjoso se alinham precisamente ao longo das linhas de tensão e ajudam o osso a resistir à tensão (MARIEB e HOEHN, 2013; STRANDING, 2005).
Com apenas algumas células de espessura, as trabéculas contêm lamelas irregulares e osteócitos interconectados por canalículos, não havendo nenhum osteon presente. Os nutrientes atingem os osteócitos do osso esponjoso através da difusão pelos canalículos dos capilares na porção que circunda as trabéculas (endósteo) (MARIEB e HOEHN, 2013).
Dito isso, os diferentes níveis da estrutura óssea podem ser organizados da seguinte forma (RHO, KUHN-SPEARING e ZIOUPOS, 1998), conforme ilustrado pela Figura 6:
- Macroestrutura: osso trabecular e osso cortical/compacto;
- Microestrutura (10-500 μm): sistema de Havers, ósteons, trabéculas simples;
- Sub-microestrutura (1-10 μm): lamelas concêntricas;
- Nanoestrutura (~0,001-1 μm): fibrila colágena embebida de mineral; - Sub-nanoestrutura (menor que 0,001 μm): estrutura molecular dos elementos constituídos como proteínas orgânicas colágenas e não colágenas e minerais.
Como essas estruturas têm arranjo e orientação de seus componentes de forma irregular, porém organizada, o osso é um material heterogêneo e anisotrópico (RHO, KUHN-SPEARING e ZIOUPOS, 1998).
Figura 6. Esquema de organização hierárquica da estrutura do osso.
Fonte: Adaptado de WANG et al., 2016. 2.1.2. Tecidos Gengivais
Os tecidos gengivais, os quais cercam os dentes, foram projetados para fornecer um selo em torno dos mesmos, para resistir às forças de fricção da mastigação e para defender o espaço potencial entre os dentes e os tecidos moles contra invasores estrangeiros, como microorganismos (SCHROEDER e LISTGARTEN, 2000).
Estruturalmente, a gengiva é composta de dois epitélios estratificados diferentes (juncional e oral) e uma lâmina própria densamente colágena que inclui o aparelho de fibra supra-alveolar, vasos sanguíneos e linfáticos e nervos (Figura 7) (SCHROEDER e LISTGARTEN, 2000). Uma gengiva clinicamente saudável consiste, em média, em 4% de epitélio juncional, 27% de epitélio gengival oral e 69% de tecido conjuntivo (SCHROEDER, MUNZEL-PEDRAZZOLI e PAGE, 1973).
A lâmina própria gengival consiste principalmente de uma rede densa de feixes de fibras de colágeno que representam cerca de 55 a 60% do volume do tecido conjuntivo. Esta rede é chamada de aparelho de fibra supragingival. Esses feixes variam em sua orientação preferencial, disposição arquitetônica e locais de inserção. Eles são densamente povoados por fibroblastos (cerca de 200 x 106 / cm3 de tecido conjuntivo (SCHROEDER e LISTGARTEN, 2000)) e consistem principalmente em colágeno tipo I e III (NARAYANAN e PAGE, 1976; NARAYANAN e PAGE, 1983). O tipo de colágeno I representa principalmente fibras densas, enquanto o tipo III está relacionado ao tecido conjuntivo solto, subepitelial e ao redor dos vasos sanguíneos (CHAVRIER et al., 1984).
Mastócitos também são residentes regulares (cerca de 17x106 cm-3 (SCHROEDER, MUNZEL-PEDRAZZOLI e PAGE, 1973)), enquanto que linfócitos, monócitos e macrófagos variam em número com a necessidade e o grau de atividade protetora.
Figura 7. Tecido juncional gengival e dentogingival: gengiva marginal, gengiva
anexada, epitélio sulpático e epitélio juncional.
Fonte: Adaptado de Gingival and Dentogingival Junctional Tissue, 2017. O aparelho de fibra supragingival não só liga a gengiva aos dentes e aos ossos, mas também fornece uma estrutura densa que é responsável pela rigidez e a resistência biomecânica da gengiva (SCHROEDER e LISTGARTEN, 2000).
2.2. REGENERAÇÃO PERIODONTAL
Regeneração periodontal é definida como a regeneração dos tecidos que suportam os dentes, incluindo cemento, ligamento periodontal e osso alveolar (CORTELLINI e TONETTI, 2000). O desenvolvimento de novo cemento com fibras de ligamento periodontal conectando-o ao osso alveolar é o principal objetivo da regeneração periodontal (POLIMENI et al., 2008; SCULEAN, NIKOLIDAKIS e SCHWARZ, 2008).
Volume ósseo adequado é crucial para um resultado bem-sucedido de implantes dentários e superestruturas protéticas e para assegurar estética e prognóstico a longo-prazo satisfatórios e previsíveis (CHIAPASCO e ZANIBONI, 2009; MAGHAIREH, SAAD e ASSAF, 2012). Para aumentar o volume ósseo na mandíbula, vários métodos tais como osteodistração (ILIZAROV, 1989), osteoindução (REDDI, WIENTROUB e MUTHUKUMARAN, 1987), osteocondução (BURCHARDT, 1983), e regeneração guiada óssea (GBR) (HÄMMERLE e KARRING, 1998; CHIAPASCO, CASENTINI e ZANIBONI, 2009) foram apresentados.
Dentre essas abordagens, o uso de membranas oclusivas para regeneração guiada tecidual (GTR) é geralmente indispensável, uma vez que, apesar dos tecidos ósseos terem um alto potencial de auto cura, a regeneração de osso compacto em lesões de tamanho crítico é frequentemente retardada ou comprometida pela penetração de tecidos fibrosos ou epiteliais (LEE, 2013).
2.2.1. Membranas GTR/GBR
O princípio básico da GBR (regeneração guiada de ossos) envolve a colocação de barreiras mecânicas (Figuras 8 e 9) para proteger coágulos sanguíneos e para isolar o defeito ósseo, fornecendo às células formadoras de osso (osteoblastos) acesso a um espaço isolado destinado à regeneração óssea (FU et al., 2017).
A técnica GBR é um procedimento cirúrgico que usa uma membrana de barreira com ou sem materiais de enxertia e foi reconhecido como o método que fornece os resultados mais previsíveis para a nova regeneração óssea em locais de defeitos ósseos peri-implantares (WON
et al., 2016). Essa técnica pode ser combinada com enxerto ósseo
particulado e/ou com substitutos ósseos, os quais auxiliam no processo de regeneração óssea (LIU e KERNS, 2014).
Figura 8. Ilustração esquemática da aplicação de uma membrana bicamada no
defeito ósseo.
Fonte: Adaptado de RAD et al., 2017.
Figura 9. Ilustração esquemática da membrana colocada em um cenário de
regeneração guiada.
Fonte: Adaptado de BOTTINO et al., 2012.
As membranas de regeneração óssea guiada são amplamente utilizadas para apoiar a formação de novo osso em procedimentos periodontais, enxertos ósseos e implantes dentários (BOTTINO et al., 2012). Devido à taxa de crescimento mais rápida dos tecidos gengivais moles do que a dos ossos, as membranas GBR são colocadas entre o tecido mole e o osso que está se regenerando para impedir que os tecidos gengivais adentrem o local do osso alveolar (BOTTINO et al., 2012; YANG et al., 2009).
Em poucas palavras, no processo GBR, as membranas cobrem o defeito ósseo e a porção em contato com a gengiva tem a função de
impedir o crescimento de tecido conjuntivo para dentro da área do defeito, enquanto a porção em contato com o defeito ósseo habilita as células (osteoblastos) a colonizar a membrana e promover a regeneração óssea.
As membranas GBR atuais são feitas de politetrafluoretileno expandido (ePTFE), colágeno ou poli(ácido láctico) (PLA), já os materiais mais estudados são o PCL (policaprolactona) (DA SILVA, BERTRAN e GONÇALVES, 2015; THOMAS et al., 2006; YANG et al., 2009), materiais de natureza biológica, tais como colágeno (THOMAS et
al., 2007; LIAO et al., 2005), quitosana (TENG et al., 2009), proteína da
seda (LU et al., 2015) e alginato (MILELLA et al., 2001) e também poliésteres sintéticos, como PLA, PGA e seus copolímeros (PARK et al., 2000; FU et al., 2017; KIKUCHI et al., 2004). As deficiências dessas membranas incluem a necessidade de um segundo procedimento cirúrgico para remoção das membranas de ePTFE, degradação prematura e imprevisível das membranas de natureza biológica e produtos de degradação ácida das membranas de PLA, PGA e seus copolímeros, os quais podem levar à redução da regeneração óssea (LEVINGSTONE et
al., 2014; UEMATSU et al., 2005; KARFELD-SULZER e WEBER,
2012; URBAN, JOVANOVIC e LOZADA, 2009; MOSES et al., 2008). Os métodos geralmente utilizados para a obtenção das membranas GTR/GBR incluem a inversão de fase (MILELLA et al., 2001; PARK et
al., 2000; LI et al., 2009; DA SILVA, BERTRAN e GONÇALVES,
2015; LIAO et al., 2005), filtração dinâmica (TENG et al., 2009), prensagem (heat-kneading method) (KIKUCHI et al., 2004) e eletrofiação (LU et al., 2015; RAD et al., 2017; MOUTHUY, CROSSLEY e YE, 2013; BOTTINO, THOMAS e JANOWSKI, 2011; YANG, BEST e CAMERON, 2009; THOMAS et al., 2006). Suas vantagens e desvantagens serão discutidos mais à frente.
2.2.2. Membrana GBR/GTR ideal
Idealmente, as membranas GBR devem (TROMBELLI, 2005; TABA et al., 2005; KARRING, 2000; KIKUCHI et al., 2004; LIAO et
al., 2005):
I. Ser biocompatíveis para permitir integração com os tecidos do hospedeiro sem desencadear respostas inflamatórias;
II. Ser biodegradáveis com perfil de degradação apropriado para se equiparar ao processo de cicatrização ou
regeneração e ainda evitar uma segunda cirurgia para remoção;
III. Ter propriedades físicas e mecânicas adequadas para permitir sua colocação in vivo;
IV. Ter força de sustentação suficiente para evitar o colapso da membrana e cumprir sua função como barreira; V. Ter alta porosidade interconectada na faixa nanométrica
para ser oclusiva às células fibroblásticas e permitir a permeação de nutrientes;
VI. Ter estrutura de nanofibra para mimetizar estruturas naturais de nanofibras na matriz extracelular.
Como podemos ver, a taxa de degradação da membrana é um fator vital no processo GBR. O processo normal de cicatrização dura geralmente 40 dias, já o tempo para uma regeneração completa e bem-sucedida de um defeito ósseo requer de 3 a 4 meses, em média (LIU e KERNS, 2014). A membrana utilizada deve ser funcional no mínimo até o fim do período de cicatrização. Nesse contexto, membranas de PLGA possuem a vantagem de possuírem taxa de degradação controlada, dentre outros fatores, pela proporção de seus monômeros e pela composição estereoisomérica do ácido lático. O tempo de degradação pode variar, por exemplo, de cerca de 1,5 mês para o poli (DL-ácido láctico-co-glicólico) 50/50, para cerca de 4 meses no caso do poli (L-ácido láctico-co-glicólico) 80/20 (ZHANG et al., 2016).
Já boas propriedades mecânicas são desejáveis para evitar que as membranas se rompam, mantendo e protegendo, assim, o defeito ósseo a ser regenerado. Estudos na literatura mostram membranas fibrosas de colágeno comercial apresentando módulo de elasticidade de 15,7 MPa e resistência máxima à tração de 4,8 MPa (ORTOLANI et al., 2015) e membranas eletrofiadas de PLGA com valores similares, com resistência máxima à tração de 5,3 MPa (ZHANG et al., 2016).
No que diz respeito à adesão celular na superfície da membrana, a mesma é influenciada pela morfologia e pela porosidade, o que no caso de membranas eletrofiadas se reflete no diâmetro das fibras. Dos aspectos morfológicos, o tamanho de poro garante a oclusão celular contra a invasão de células epiteliais e conjuntivas para dentro defeito ósseo. Estudos na literatura constataram apenas penetração superficial de fibroblastos em membranas eletrofiadas de PLLA/quitosana com tamanho de poros ~3 μm (CHEN et al., 2013) e em membranas eletrofiadas de PDLLA/PLGA e com tamanho de poros de 10 - 15 μm (ZHANG et al., 2016). Já a influência do diâmetro da fibra na adesão
celular está relacionada diretamente com sua área de superfície e aumentos significativos na adesão e proliferação de fibroblastos já foram constatados para membranas com fibras na faixa de 350-1100 nm (KUMBAR et al., 2008).
2.3. BIOMATERIAIS
Por definição, biomateriais são materiais usados para fabricar dispositivos com o objetivo de substituir uma parte ou função do corpo de uma maneira segura, confiável, econômica e fisiologicamente aceitável (PARK e LAKES, 2007). O sucesso de um biomaterial ou um implante é altamente dependente de três fatores: as propriedades e biocompatibilidade do material, o estado de saúde do paciente e a competência do cirurgião que implanta e monitora o progresso da recuperação do paciente (PARK e LAKES, 2007).
Sua composição pode se dar por apenas uma ou por duas ou mais substâncias de natureza sintética ou natural. Quanto ao seu emprego, este pode ser de forma temporária, com o intuito de melhorar ou substituir inteira ou parcialmente tecidos e órgãos, ou de forma permanente, a qual busca substituir tecidos perdidos ou danificados (RATNER et al., 2004).
2.3.1. Poli(ácido lático-co-ácido glicólico) – PLGA
O PLGA é um poliéster alifático sintético, biocompatível, biodegradável e bireoabsorvível, pertencente ao grupo dos poli (α-hidróxi ésteres) saturados (GENTILE et al., 2014), como pode ser observado na Figura 10.
Polímeros derivados dos ácidos lático e glicólico têm recebido muita atenção em pesquisas em polímeros biodegradáveis alternativos, já que eles já receberam aprovação da Food and Drug Administration (FDA) para uso em sistema de liberação de fármacos. Uma grande variedade de estudos foi publicada demonstrando sua baixa toxicidade (STEVANOVIC et al., 2009; STEVANOVIC e SKOKOVIC, 2009; ERBETTA et al., 2012).
Figura 10. Estrutura química do poli(ácido lático-co-ácido glicólico) e os
monômeros de ácido lático e ácido glicólico. Na estrutura do PLGA “n” representa o número de unidades de ácido lático e “m” o número de unidades de ácido glicólico.
Fonte: Adaptado de GENTILE et al., 2014.
O PLGA apresenta uma versatilidade em propriedades físico-químicas, mecânicas e taxa de degradação, a qual provém principalmente da manipulação de três fatores: proporção de seus monômeros de ácido lático (LA) e ácido glicólico (GA) (LA/GA); composição estereoisomérica do ácido lático, L (levogiro) ou DL (mistura racêmica) e massa molar (AVGOUSTAKIS, 2005). A variação desses fatores possibilita a formação de diversos copolímeros, denotando, assim, um caráter versátil ao PLGA e tornando-o útil a uma grande gama de aplicações (PELEIAS JUNIOR, 2013).
A maior vantagem do PLGA sobre os outros polímeros bioreabsorvíveis é que esse copolímero requer um tempo mais curto para sua degradação completa, implicando em uma menor probabilidade de reações adversas, que geralmente são resultado de fragmentos cristalinos liberados pelos polímeros cujo tempo de degradação é excessivamente longo (SILVA et al., 2015).
O PLGA degrada-se por hidrólise das ligações ésteres, através de erosão em massa (heterogênea), a qual pode ser descrita sucintamente em quatro etapas (ENGINEER, PARIKH e RAVAL, 2011):
(i) hidratação, em que há penetração de água nas regiões amorfas, reduzindo a temperatura de transição vítrea (Tg); (ii) degradação inicial, através da clivagem de ligações
(iii) degradação, clivagem por autocatálise, resultando perda de integridade e
(iv) solubilização, gerando fragmentos ainda menores.
A degradação extracelular do PLGA, gera como subprodutos metabólicos o ácido lático e o ácido glicólico (Figura 11) que serão posteriormente hidrolizados em lactado e glicolato e então fagocitados. Esses subprodutos são convertidos em piruvato dentro das células e entram no Ciclo de Krebs, terminando sua rota metabólica em gás carbônico e água, os quais podem ser eliminados através da respiração e da urina (BARBANTI, ZAVAGLIA e DUEK, 2005; AVGOUSTAKIS, 2005). No processo de recuperação do tecido ósseo, a degradação do polímero deve ocorrer de forma gradativa, para que haja transferência das solicitações mecânicas do material de forma progressiva, no intuito de evitar o stress shielding (SANTOS, 2011; MEYER et al., 2012).
Figura 11. Degradação do PLGA.
Fonte: Adaptado de TALUJA, YOUN e BAE, 2007.
A taxa de degradação do PLGA é influenciada por diversos fatores, dentre eles estão (AVGOUSTAKIS, 2005; WU e WANG, 2001):
i) a massa molar: o aumento da massa molar aumenta o tempo de degradação, podendo ser de algumas semanas a meses; ii) a proporção LA/GA: PLGA com maior percentual de LA é
que dificulta o acesso de água (impedimento estérico). Absorvendo menos água, o polímero degrada mais lentamente;
iii) a estereoquímica/cristalinidade: regiões amorfas permitem a penetração de água, o que acelera a degradação do PLGA; iv) os grupos finais: grupos ésteres possuem maior tempo de
degradação de meia vida quando comparados com grupos finais carboxílicos;
v) as características do produto: tamanho, forma e porosidade, influenciam na área de contado do material com o meio; vi) o ambiente de degradação: a temperatura e o pH (potencial
hidrogeniônico) do meio também podem interferir na taxa de degradação.
O efeito da proporção LA/GA no tempo de meia vida do L-PLGA, por exemplo, pode ser observado na Figura 12.
Figura 12. Tempo de meia vida in vivo de L-PLGA com diferentes proporções
de LA/GA.
Fonte: Adaptado de MILLER, BRADY e CUTRIGHT, 1977.
O grau de cristalinidade do PLGA, o qual é dependente da composição química, da proporção (LA/GA) e da composição estereoisomérica dos monômeros, influencia diretamente em propriedades como a resistência mecânica, o comportamento de turgescência, a capacidade de se submeter a hidrólise e,
Tem po d e m ei a v ida (m es es ) Proporção LA/GA
subsequentemente, a taxa de biodegradação do polímero (MAKADIA e SIEGEL, 2011; CAMPOS, 2013). A Figura 13 ilustra essa dependência para o L-PLGA.
Figura 13. Grau de cristalinidade em função da porcentagem de ácido glicólico
no L-PLGA.
Fonte: Adaptado de AVGOUSTAKIS, 2005.
A temperatura de transição vítrea (Tg) é uma propriedade que favorece a aplicação do PLGA em seres humanos. A Tg do PLGA é em torno de 45–55 °C, acima, então, da temperatura corporal de 37 °C, o que faz com que este se mantenha na forma vítrea no corpo humano, mantendo a estrutura relativamente rígida de suas cadeias. Desse modo, essa propriedade confere significativa resistência mecânica ao material, permitindo seu uso em sistemas de liberação de fármacos e como
scaffolds e membranas (BARBANTI, ZAVAGLIA e DUEK, 2005; JAIN,
2000; CAMPOS, 2013).
Já as desvantagens do PLGA, incluem principalmente a hidrofobicidade e a falta de sítios de reconhecimento celular. Além disso, apesar da não-toxicidade do PLGA, o acúmulo de produtos de degradação e o inchamento do polímero podem alterar o pH local, provocando irritação mecânica no tecido e, em alguns casos, uma resposta inflamatória (JUNG et al., 2011). Para superar esses problemas, estratégias utilizam membranas contendo fosfatos de cálcio, como por exemplo a HAp e o β-TCP, cujas propriedades são discutidas a seguir.
G rau d e cr ist al ini dade ( % )
