UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
MAYRA FONTES FURLAN
ESTUDOS DOS METABÓLITOS VOLÁTEIS DE FUNGOS INIBIDORES DE FITOPATÓGENOS EM PLANTAS POR HS-SPME E GC×GC-QMS
CAMPINAS 2016
ESTUDOS DOS METABÓLITOS VOLÁTEIS DE FUNGOS
INIBIDORES DE FITOPATÓGENOS EM PLANTAS POR HS-SPME
E GC×GC-QMS
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Química na área de Química Analítica.
Orientador: Prof. Dr. Fabio Augusto
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA MAYRA FONTES FURLAN, E ORIENTADA PELO PROF. DR. FABIO AUGUSTO.
CAMPINAS 2016
À Deus, aos meus pais Mercedes e Luiz, ao meu querido irmão Matheus, aos meus avós maternos Nilce e Fernando (in memoriam), aos meus avós paternos Albina (in memoriam) e Jair, ao meu tio Anésio e meu amor Bruno.
Ao professor Fabio Augusto, pela orientação, pela confiança em meu trabalho, pela paciência e por ser sempre mais do que um orientador.
A CAPES pela bolsa de mestrado e ao Instituto de Química da Universidade de Campinas pela oportunidade de cursar a graduação e a pós-graduação.
Ao Projeto SisBiota, ao professor Dr. Sérgio Florentino Pascholati (ESALQ/USP) pela oportunidade e ao professor Luiz Gusmão (UEFS) pelo fornecimento do material biológico em estudo.
À minha grande amiga e companheira de trabalho Paula Lima, pela amizade, paciência e por todo o trabalho que fizemos juntas. Sem sua ajuda, paciência e carinho, nada disso teria sido possível.
À Soraia Braga, por sua amizade de tantos anos, por todos os momentos em laboratório que fizeram toda a diferença no meu trabalho, e por todo o carinho e trabalho em grupo.
À Lucília Vilela, que caminhou comigo desde o começo de tudo e passou de amiga para irmã, sendo minha companheira de trabalho de sempre.
À Mariana Sato, pelo companheirismo, pelas risadas, pelas boas idéias, por tornar meus dias de trabalho mais alegres e pela grande amizade de sempre. Ao Jadson Reis, pela amizade, por toda ajuda com os moduladores, pela paciência, por todas as gentilezas.
À Gabriela Salazar, pela amizade de anos, pela companhia até tarde da noite, pelas orações e principalmente pelas risadas intermináveis.
À Paloma Prata, pela amizade e por me ajudar a começar a desbravar a quimiometria.
À minha mãe Mercedes, meu pai Luiz, meu irmão Matheus, minha avó Nilce e meu tio Anésio, por todo apoio, amor, carinho e incentivo durante todo o tempo. Ao meu namorado Bruno, pelo apoio, paciência, amor, carinho e por todas as vezes que me ajudou como podia.
ESTUDOS DOS METABÓLITOS VOLÁTEIS DE FUNGOS INIBIDORES DE FITOPATÓGENOS EM PLANTAS POR HS-SPME E GC×GC-QMS
No cenário da agricultura, observou-se que várias culturas comercialmente importantes são acometidas por doenças causadas por microrganismos patógenos como a ferrugem em eucalipto, causada pelo fungo Puccinia psidii, ou o mofo branco em soja, causado pelo microrganismo Sclerotinia sclerotiorum. Assim, diversos estudos vêm explorando o uso de agentes de controle biológico (biocontrole) como uma alternativa aos fungicidas comerciais. Para explorar de forma representativa o metabolismo desses agentes de biocontrole são necessárias técnicas analíticas de extração, separação e detecção compatíveis com a magnitude de concentrações e diversidade de compostos produzidos. Neste trabalho, para obter de forma inédita a fração volátil e semi-volátil do metabolismo secundário do fungo do gênero Myrothecium, responsável por combater o mofo branco em soja, utilizaram-se as técnicas de Microextração em Fase Sólida no modo headspace (HS-SPME) aliada à técnica de Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente acoplada à Espectrometria de Massas Quadrupolar (GC×GC-qMS). O uso da ferramenta quimiométrica MPCA (Análise de Componentes Principais Multi-modo) foi possível avaliar a cinética de produção de voláteis em função do tempo, identificando o dia de mais diversidade metabólica do fungo. Com essa informação em mãos, foram identificados tentativamente compostos químico dos quais se destacam o Feniletilálcool, α-Curcumeno, α-Terpineno, Diepi-α-Cedreno, Cis-α-Bisaboleno, α-Farneseno e β-Elemeno. Estes possuem conhecida ação de controle de patógenos, podendo ser estudados a fim direcionar os estudos em relação a biofungicidas e indução de resistência em plantas.
STUDY OF VOLATILE METABOLITES OF PHYTOPATHOGENS INHIBITORS FUNGI ON PLANTS BY HS-SPME AND GC×GC-QMS
In agriculture scenario, there are several commercially important crops that are affected by diseases caused by pathogenic microorganisms like the rust in eucalyptus caused by Puccinia psidii fungus or white mold on soybeans, caused by the microorganism Sclerotinia sclerotiorum. Thus, there are several studies exploring the use of biological control (Biocontrol) agents as an alternative to commercial fungicides. In order to representatively explore the metabolism of these biocontrol agents analytical techniques for extraction, separation and detection are required and should be compatible with concentration magnitude and diversity of the produced compounds. In this work, in order to get a volatile and semi-volatile fraction of fungal secondary metabolism in an unprecedented way of Myrothecium species, responsible for combating white mold in soybeans, were used Solid Phase Microextraction technique in headspace mode (HS-SPME) coupled with the comprehensive two-dimensional gas chromatography technique coupled to mass spectrometry quadrupole (GC×GC-QMS). The use of the chemometric tool MPCA (Principal Component Analysis Multi-Mode) made possible to evaluate the kinetics of volatile production as a time function, identifying the day of major metabolic fungus diversity. With this information in hands, the chemical compounds were tentatively identified among which are the phenilethyl alcohol, α-curcumene, α-terpinene, Diepi-α-cedrene, cis-α-bisabolene, α-farnesene and β-elemene. These compounds have known pathogens control activity and can be guide and direct the biofungicides and plant resistence induction studies.
Figura 2: Comparativo entre as capacidades de pico (n) das técnicas de
separação GC, GC-GC e GC×GC. ... 29
Figura 3: Esquema geral de um sistema GC×GC, contendo a coluna capilar de GC convencional da ¹D, seguido do modulador e da coluna capilar da ²D, que apresenta dimensões reduzidas. ... 30
Figura 4: Esquema simplificado do funcionamento de um modulador criogênico de quatro jatos, onde os passos de A a D ilustram o processo de modulação. ... 31
Figura 5: Obtenção e visualização de cromatogramas de GC×GC.53 ... 33
Figura 12: Cromatogramas dos brancos contendo somente os meios de cultura BDA (A) e CMA (B), bem como os cromatogramas dos metabólitos voláteis do fungo CUI nos meios de cultura BDA (C) e CMA (D). Condições de extração, separação e detecção conforme item 4.5.2... 52
Figura 13: Cromatogramas dos metabólitos voláteis do fungo CUI inoculado com o disco do micélio (A) e com a suspensão de esporos (B). Condições de extração, separação e detecção conforme item 4.5.2... 54
Figura 14: Comparação entre um corte dos dados brutos (A) e desses mesmos dados depois de alinhados (B) pelo algoritmo COW. ... 56
Figura 15: Gráfico de número de componentes principais versus variância explicada (%). ... 57
Figura 16: Gráfico de Hotelling T² versus resíduos. ... 58
Figura 17: Gráfico de escores da CP1 versus CP2. ... 59
Figura 18: Gráfico de escores da CP1 em função dos dias de cultivo. ... 60
Figura 19: Gráfico de escores da CP2 em função dos dias de cultivo. ... 61 Figura 20: Cromatograma da fração volátil do metabolismo do fungo MYL inoculado em meio de cultura BDA (A) e amostra controle (branco) contendo apenas o meio de cultura BDA (B) após três dias de transferência para o
Figura 21: Gráfico de pesos positivos da segunda componente principal (CP2) do modelo de MPCA. ... 63
metabólico volátil. ... 41
Tabela 2: Patossistemas do projeto SISBIOTA. ... 42 Tabela 3: Condições de separação e detecção mantidas nos ensaios de análise da fração volátil dos fungos sapróbios avaliados. ... 49
Tabela 4: Identificação tentativa dos metabólitos voláteis produzidos pelo fungo MYL nas extrações realizadas no 3º dia de cultivo do fungo...64
LISTA DE ABREVIATURAS ¹D: primeira dimensão
¹tR: tempo de retenção na primeira dimensão
²D: segunda dimensão
²tR: tempo de retenção na segunda dimensão
SupelcoWax: coluna capilar contendo fase estacionária de polietilenoglicol
DVB/CAR/PDMS: recobrimento da fibra de SPME contendo divinilbenzeno, carboxeno e polidimetilsiloxano
GC: Cromatografia Gasosa
GC×GC: Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente
GC-MS: Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas
GC×GC-qMS: Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente acoplada à Espectrometria de Massas Quadrupolar
HP-5MS: coluna capilar contendo fase estacionária de 5% fenil-95% polidimetilsiloxano
HS-SPME: Microextração em Fase Sólida por Headspace LLE: Extração líquido-líquido
LTPRI: Índice de Retenção com Programação Linear de Temperatura
m/z: razão massa-carga
MDGC: Cromatografia Gasosa Multidimensional por Frações Parciais MS: Espectrometria de Massas
n: capacidade de pico
n1: capacidade de pico na primeira dimensão
n2: capacidade de pico na segunda dimensão PM: período de Modulação
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 15
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 21
2.1. Metabolismo de Fungos – Compostos Voláteis ... 21
2.1.1. Fungos e o Controle Biológico ... 21
2.1.2. Metabolômica ... 22
2.2. Abordagem Analítica no Estudo do Metaboloma ... 23
2.2.1. Preparo de Amostras Biológicas e suas Aplicações no Estudo do Metaboloma ... 23
2.2.1.1. Aplicações de SPME em amostras biológicas... 26
2.2.2. Técnicas Analíticas no Estudo dos Metabólitos Voláteis e Semi-voláteis .. 27
2.2.2.1. Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente (GC×GC) – Mudança de Paradigma em GC ... 27
2.3. Metabolômica e GC×GC – Abordagem Estatística Multivariada ... 34
3. OBJETIVOS ... 40
3.1. Geral: ... 40
3.2. Específicos: ... 40
4. MATERIAIS E MÉTODOS ... 41
4.1. Seleção dos Fungos ... 41
4.2. Preparo do meio de cultura ... 43
4.3. Manutenção do Material Biológico... 43
4.4. Inoculação dos Fungos e Extração do Headspace ... 44
4.5. Equipamentos e Otimização de Condições de Extração e Separação dos Perfis Voláteis dos Fungos Sapróbios ... 47
4.5.1.Extração dos Metabólitos Voláteis por HS-SPME ... 47
4.6. Modelagens quimiométricas ... 49
4.7. Identificação Tentativa dos Metabólitos Voláteis ... 50
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 51
6. CONCLUSÕES ... 68
1. INTRODUÇÃO
Atualmente, várias culturas economicamente importantes são afetadas por patógenos, que levam a grandes perdas na produtividade agrícola. Neste cenário, a ferrugem, quando causada pelo fungo Puccinia psidii, compromete plantações de eucalipto bem como a produção de café, quando infestado por
Hemileia vastatrix, gerando perdas entre 35 a 40% no setor cafeeiro. De maneira análoga, a citricultura sofre com prejuízos em suas plantações devido a ação do
greening, causado pela bactéria Candidatus Liberibacter asiaticus, que leva a
assimetria e diferença de coloração nos frutos além do amarelecimento das folhas e frutos.1-3
Assim, cada vez mais se faz necessário o uso de medidas eficientes de controle de tais doenças no setor agrícola, uma vez que seu controle é difícil em virtude de sua rápida disseminação no campo. Diversos trabalhos relatam o grande potencial de uso de agentes biológicos como ferramenta no controle de doenças na agricultura, ocasionadas principalmente pela ação de fitopatógenos. Conhecido como controle biológico (ou biocontrole), tal procedimento tem ganhado destaque por ser um processo no qual os efeitos indesejáveis um organismo patogênico são reduzidos pela ação do outro organismo, que inibe o progresso, infecção e reprodução da doença no hospedeiro (planta).4-7
O biocontrole pode dar-se de três formas: competição pro nutrientes do nicho em que microorganismos encontram-se, produção de metabólitos tóxicos aos outros microorganismos (inibindo a esporulação do fungo patógeno, por exemplo), micoparasitismo e produção extracelular de enzimas. No caso de produção de metabólitos tóxicos, estes ainda podem ser voláteis e não voláteis.7,8
Neste cenário, o emprego de fungos no controle biológico vem recebendo destaque por se mostrar como uma abordagem atrativa e real com vistas à substituição de fungicidas comerciais que representam um dos principais meios de contaminação de alimentos e do solo.5,6,9
Atualmente, inúmeros fungos já foram identificados e veem sendo utilizados como biofungicidas (agentes de biocontrole) de maneira promissora na substituição de fungicidas químicos comerciais.10
O fato destes micro-organismos atuarem secretando compostos químicos com ação antibiótica e antifúngica, como enzimas e metabólitos voláteis e não voláteis, é o que leva ao sucesso do uso desses fungos como biofungicidas, uma vez que vários desses metabólitos secundários produzidos são tóxicos para os patógenos de plantas, mesmo em baixas concentrações.6,11,12
Outra forma de controlar doenças em plantas é pela indução de resistência contra fitopatógenos que consiste ativar mecanismos de defesa no vegetal. Assim, a resistência de uma planta pode ser definida como o processo que evita ou atrasa a entrada e atividade de um fitopatógeno nos tecidos vegetais, sendo este processo regulado por genes que codificam proteínas relacionadas à patogênese e enzimas envolvidas na síntese de substâncias como lignina e fitoalexinas.13
Dessa forma, os metabólitos voláteis produzidos por micro-organismos benéficos com potencial de controle biológico e seus modos de ação tem sido estudados de forma crescente devido à sua aplicabilidade na agricultura e importância no controle de pragas e doenças em plantas.6
Um ser vivo pode produzir centenas de metabólitos em quantidade e diversidade bastante variáveis, dependendo da espécie. Assim, pode-se definir o metaboloma como uma coleção de pequenas moléculas (os metabólitos), menores que 1000 Da, biossintetizadas no metabolismo de uma célula, tecido ou organismo.14 Várias podem ser as abordagens com relação ao estudo dos metabólitos como análise de metabólito alvo (análise somente de alguns metabólitos restritos), análise de perfil metabólico (análise focada em certos grupos de metabólitos), fingerprinting de metabólitos (classificação das amostras em função da proveniência, pertinência ou origem biológica), metabolômica (estudo compreensivo dos metabólitos em um sistema bológico) ou ainda metabonômica (medida do fingerprint de uma perturbação bioquímica causada por doenças, toxinas e drogas).15,16
Assim como a genômica, transcriptômica e a proteômica, a metabolômica deve compreender a identificação e quantificação de metabólitos em determinadas condições, ou até mesmo as mudanças do perfil metabólico com a variação destas. O estudo dessas mudanças é importante uma vez que o metaboloma varia com alterações genéticas e perturbações externas. Nesse
sentido, diversas são as plataformas analíticas disponíveis que possibilitam o estudo do metaboloma de maneira extensiva abrangendo uma gama de compostos com possíveis relações a tais alterações externas e/ou genéticas. Dessa forma, o estudo se torna bastante complexo e há várias técnicas analíticas que possibilitam abranger uma diversa gama de compostos.16,17
Nesse sentido, o projeto denominado de “Bioprospecção de fungos no PPBIO/semi-árido nordestino para o controle de doenças infecciosas em plantas: indução de resistência” (processo FAPESP 10/52343-0) inserido em um projeto maior denominado SISBIOTA (apoio FAPESP e CNPq), coordenado pelo professor doutor Sérgio Florentino Pascholati (ESALQ/USP), tem por objetivo analisar a possível indução de resistência, desenvolvimento de bioprodutos eliciadores de resistência em plantas e o uso de fungos sapróbios, em especial os provindos do semi-árido do nordeste brasileiro já disponíveis na Coleção de Microrganismos da Bahia (CCMB).
Assim, para que seja possível compreender a dinâmica de produção de metabólitos desses fungos do semi-árido nordestino com potencial de produção de bioprodutos para indução de resistências e controle biológico,se faz necessário o uso de técnicas analíticas de amostragem e separação precisas, sensíveis e exatas, para que o perfil seja o mais confiável possível, uma vez que o metaboloma (tanto o primário quanto o secundário) é uma mistura complexa de compostos de várias classes, como os carboidratos, aminoácidos, ácidos orgânicos, lipídios, vitaminas, fenilpropanóideis, terpenóides e alcalóides. Muitos destes compostos tem evidenciado o envolvimento em processos de controle biológico, o que sugere a participação na mediação de mecanismos de defesa de plantas contra a ação de predadores e doenças.18-20
O método de extração tradicionalmente usado para obter o perfil volátil do metaboloma fúngico é a extração por destilação simultânea (SDE –
Simultaneous Distillation Extraction), embora hoje se mostre uma técnica
inadequada para a determinação do perfil metabólico dos fungos, comparado a microextração em fase sólida (Solid Phase Microextraction – SPME) por não mostrar o perfil real da fração volátil, uma vez que os analitos extraídos dependem do solvente utilizado.6,21,22
Além do grande número de compostos, de maneira geral vários metabólitos são encontrados em baixas concentrações, e sem técnicas de extração e pré-concentração adequadas, metabólitos importantes podem não serem detectados. De maneira análoga, análises in-vitro podem não revelar a realidade do metabolismo a ser estudado, sendo necessária a análise in vivo, que neste caso requer o uso de técnicas que levam a menor perturbação possível no sistema.18 Dessa forma, a SPME se torna uma opção promissora, uma vez que combina extração e pré-concentração em apenas uma etapa, não sendo necessário qualquer preparo de amostra, principalmente se realizada no modo
headspace (HS-SPME), onde não há contato direto da fibra extratora com a
amostra em estudo.23,24
Quanto às técnicas analíticas de separação, a cromatografia gasosa com detecção por espectrometria de massas (Gas Chromatography-Mass
Spectrometry - GC-MS) é bastante empregada em estudos envolvendo
metabolomas de fungo.20-22 Entretanto, as misturas de compostos orgânicos voláteis (Volatile Organic Compounds – VOCs) são bastante complexas quando se trata de uma amostra biológica, tanto pelo próprio perfil volátil do fungo como o
background da matriz do mesmo. Assim coeluições podem comprometer o
processo de identificação dos analito, não revelando o real perfil volátil a ser estudado.25
Para amostras com mais de 150 compostos, muitas vezes a cromatografia gasosa unidimensional (Gas Chromatography - GC) se torna uma técnica de separação limitada, e nesse sentido, a Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente (Comprehensive Two Dimensional Gas Chromatography - GC×GC) pode ser uma ferramenta analítica alternativa, uma
vez que a GC×GC aumenta a capacidade de pico bem como o poder de separação em detrimento a GC convencional.26,27 Na GC×GC, o fato da separação se dar por duas colunas de tamanhos e polaridades distintas, é estabelecido um plano de retenção, acomodando um maior número de picos.27
Outra característica da GC×GC é o aumento de sinal, que acontece pela própria forma como o sistema bidimensional é montado, uma vez que um modulador entre as colunas coleta, comprime e remobiliza as frações que eluem da primeira dimensão (¹D) antes de serem reinjetadas na segunda (²D).27,28Isso
gera picos mais estreitos, evitando coeluições que normalmente ocorreria em GC. Por fim, outra característica da técnica é a estruturação cromatográfica, onde os analitos podem ser agrupados por classes, pelo fato dos mecanismos de separação serem diferentes em cada dimensão. Essa característica se torna uma ferramenta que auxilia a identificação dos compostos por uma análise visual comparativa.27,28
Entretanto, a quantidade de informações geradas pelas análises de GC×GC-QMS é elevada o que torna a interpretação destas bastante complexa. Neste sentido, o uso de ferramentas quimiométricas ganha destaque tornando-se indispensável no auxílio da interpretação e processamento dessas informações de forma mais rápida e confiável em relação à simples inspeção visual do cromatograma.29,30
Nesse sentido, estratégias usadas em investigações na área de metabolômica consistem basicamente de pré-processamentos para correção de ruído e alinhamento dos tempos de retenção (no caso de análises cromatográficas), seguidos de métodos multi-modo (Análise de Fatores Paralelos – PARAFAC, Resolução Multivariada de Curvas - MCR) ou métodos de reconhecimento de padrão supervisionados (Razão de Fisher, Análise Discriminante por Mínimos Quadrados Parciais – PLS-DA) e não supervisionados (Análise de Componentes Principais – PCA, Análise de Agrupamentos Hierárquicos – HCA).31 Ainda é possível utilizar o método de reconhecimento de padrões não supervisionado de Análise de Componentes Principais Multimodo (MPCA - Multiway Principal Component Analysis), uma vez que esta ferramenta é mais adequada para análises de dados de ordem superior quando comparada à PCA.25
A análise completa do metaboloma requer o uso de várias técnicas analíticas, uma vez que há uma grande variedade de compostos com propriedades distintas e concentrações diversas. Dessa forma, uma combinação adequada de técnicas de extração, separação e identificação para cada amostra biológica se faz necessária.
Assim, a procura por métodos analíticos para tornar possível o estudo de metabólitos voláteis e semi-voláteis de micro-organismos capazes de induzir resistência e/ou atuar como agentes de biocontrole de doenças em culturas de
plantas economicamente importantes, como os fungos sapróbios do semi-árido nordestino, é de grande importância. Nesse sentido, a utilização de HS-SPME-GC×GC-MS pode propiciar um maior entendimento da produção desses metabólitos com propriedades antibióticas.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Metabolismo de Fungos – Compostos Voláteis2.1.1. Fungos e o Controle Biológico
Com o crescimento da população mundial cresce também a demanda por alimento, bem como a necessidade de controlar as pragas que assolam as plantações comercialmente importantes para que essa demanda seja atendida.32 Nesse sentido, defensivos agrícolas, como fungicidas comerciais são usados em larga escala. Entretanto, o uso dessas substâncias tem levado a um problema fitossanitário que é o aparecimento, cada vez mais comum, de fitopatógenos resistentes aos defensivos.33
A soja, por exemplo, que atualmente é produzida em larga escala no Brasil, sofre com uma doença chamada mofo branco, causada pelo fungo
Sclerotinia sclerotiorum, que gera grandes perdas de produção devido ao difícil
controle da mesma. Esse fungo também toma como hospedeiros mais de 400 espécies de vegetais como feijão, girassol, algodão e outros.34
Outra doença importante é a ferrugem, causada por diferentes fungos em diferentes espécies vegetais (produtoras de alimento ou não) como no café, causada pelo fungo Hemileia vastatrix, sendo causadora de perdas avaliadas em milhões de dólares em países da América Latina; ou nas plantações de eucaliptos, causada pelo fungo Puccinia psidii, que também afeta mais de 100 espécies de plantas distribuídas por países no mundo todo, principalmente na América Latina.35,36
Neste cenário é crescente o interesse em alternativas de controle dessas doenças que sejam mais sustentáveis e menos danosos à saúde humana. Nesse contexto o controle biológico tem destaque, uma vez que os danos ao meio ambiente são menores.33,37,38
O controle biológico, ou biocontrole, consiste em um processo no qual, por meio do uso de um micro-organismo, a infecção causada por um patógeno na planta hospedeira e a disseminação da doença na mesma são reduzidas.6 O biocontrole pode ocorrer de formas diferentes, podendo dar-se por competição pro nutrientes do nicho em que os micro-organismos patógeno e de biocontrole se
encontram, produção de metabólitos tóxicos aos outros microorganismos (inibindo a esporulação do fungo patógeno, por exemplo), micoparasitismo e produção extracelular de enzimas. No caso de produção de metabólitos tóxicos, estes podem ser voláteis e não voláteis.6,8
Vários estudos utilizando micro-organismos como agentes de biocontrole estão sendo realizados na atualidade como no caso de Bacillus
subtilis que foi capaz de inibir 84,2% do fitopatógeno Fusarium coeruleum,
causador da podridão na batata, considerando o potencial de inibição distal da taxa de crescimento do patógeno, assim como a inibição do crescimento do micélio na vizinhança do agente de biocontrol e em zona de cultura mista (contato entre as duas culturas).39
Outro exemplo é o estudo acerca dos metabólitos voláteis produzidos por duas cepas de Aureobasidium pullulans contra cinco patógenos pós colheita em frutas. Em estudo in vitro, os VOCs produzidos por esse micro-organismo foram capazes de inibir totalmente a germinação de conídios de algumas espécies de Penicillium. Já em estudos in vivo, diminuição de cerca de 88% a lesão causada pelo patógeno Botrytis cinerea em maçãs inoculadas com o mesmo foi alcançada.33
2.1.2. Metabolômica
Metabólitos voláteis e semi-voláteis são moléculas pequenas (< 300 Da) originados do metabolismo que ocorre no interior de células, tecidos ou organismo.14,40 Esse conjunto de moléculas, por sua vez, faz parte de um conjunto ainda maior denominado metaboloma, que consiste numa coleção de compostos orgânicos voláteis e não voláteis, orgânicos e inorgânicos. Por ser uma mistura de moléculas bastante diversa, há várias formas de abordagem a fim de estudar o conjunto de metabólitos de um ser vivo, como:15,16
Análise de metabólito alvo: apenas alguns metabólicos específicos são monitorados.
Análise de perfil metabólico: essa análise é focada em grupos de metabólitos com propriedades físico-químicas próximas, como por exemplo, um perfil de metabólitos voláteis.
Fingerprinting de metabólitos: abordagem que visa classificação das amostras em função da proveniência, pertinência ou origem biológica.
Metabolômica: consiste no estudo compreensivo dos metabólitos em um sistema bológico, abrangendo diferentes classes de compostos químicos e utilizando mais de uma técnica analítica para tal fim.
Metabonômica: é um fingerprinting de uma perturbação bioquímica causada por doenças, toxinas e drogas.
Dessa forma, a Metabolômica compreende análises tanto qualitavivas como quantitativas dos metabólitos produzidos em condições bem definidas ou até mesmo a mudança da coleção de metabólitos sob mudanças nessas condições de estudo.16
O metaboloma (conjunto de metabólitos de um organismo) é sensível e pode sofrer modificações frente a alterações genéticas e perturbações provindas do meio externo. Como há uma grande diversidade de fatores influenciam nessas mudanças, muitas vezes de forma simultânea, o estudo do conjunto de metabólitos se torna uma tarefa árdua devido à sua complexidade. Assim, técnicas de análise compatíveis tanto com essa complexidade bem como com a diversidade de polaridade, volatilidade e massa molecular são necessárias.17,41
2.2. Abordagem Analítica no Estudo do Metaboloma
Uma vez que há grande diversidade de compostos químicos numa coleção de metabólitos produzidos por um determinado organismo, uma abordagem analítica correta, desde o preparo de amostra até o tratamento dos dados gerados, se faz necessária, visto que nos últimos tempos há uma crescente busca pela análises mais compreensivas desses metabólitos.41
2.2.1. Preparo de Amostras Biológicas e suas Aplicações no Estudo do Metaboloma
A etapa de preparo de amostra consiste em isolar e obter em concentrações apreciáveis de componentes de interesse (analitos) a partir da matriz em que os mesmos se encontram.42
Amostras biológicas podem ser desafiadoras já que, por vezes, os analitos de interesse se encontram em pequenas quantidades em meio a uma matriz complexa. Assim, a etapa de preparo de amostra é crucial e merece atenção especial.41
O preparo de amostras considerado ideal consiste da mínima ou nenhuma manipulação da amostra, para que perdas sejam evitadas culminando na modificação de sua composição original. Entretanto, a fim de minimizar o efeito matriz quase sempre leva à manipulação da amostra. Dessa forma, é necessário a otimização da abordagem analítica de preparo de amostra e extração a fim de acessar de forma satisfatória o completo perfil bioquímico em estudo.41,43
As técnicas mais utilizadas nas análises de metaboloma são as de extração em fase sólida (SPE – Solid Phase Extraction) e a extração líquido-líquido (LLE - Liquid-Liquid Extraction), além de uma técnica bastante específica para extrair a fração volátil do metabolismo de micro-organismos, em especial os fungos, que é extração por destilação simultânea (SDE – Simultaneous Distillation
Extraction).6,21,22,43
Todas essas técnicas utilizam grandes quantidades de solventes orgânicos, o que é uma desvantagem devido a elevação dos custos das análises e principalmente com relação à geração de grandes quantidades de resíduos. Além disso, não pode ser ignorado o fato de que as extrações que utilizam solventes acabam por serem seletivas no sentido de que cada analito (ou classes de analitos) tem afinidades diferenciadas com o solvente em questão, havendo extração mais efetiva de alguns compostos químicos em detrimento de outros presentes na amostra, não mostrando assim o metaboloma real do organismo em estudo. 6,21,22,43
As técnicas supracitadas são classificadas como técnicas de extração exaustivas, onde os analitos de interesse são extraídos várias vezes da matriz através do uso de diferentes solventes como fase extratora (quantidade muito maior do que o tamanho da amostra), ou seja, de forma exaustiva a fim de se obter uma quantidade apreciável dos compostos de interesse.43
Nesse cenário, técnicas como a microextração em fase sólida (SPME –
Solid-Phase Microextraction) ganham destaque, pois é uma técnica de equilíbrio
amostra pela fase extratora (quantidade muito menor que a amostra).43 Nesse caso, a quantidade de analito extraído (n) depende da constante de distribuição do composto de interesse entre a matriz da amostra e do recobrimento da fibra de SPME, a qual pode ser representada pela equação 1:
(Equação 1)
Onde Kfs é a constante de distribuição entre a fase extratora e a amostra, C0 é a concentração inicial do analito da amostra, n é a quantidade extraída de analito, VS é o volume da amostra e Vf é o volume da fase extratora da fibra. Como o termo KfsVS é negligenciável em relação a VS , podemos simplificar a equação 1:43
(Equação 2)
A quantidade de analito extraída pelo recobrimento da fibra (n) depende apenas da afinidade química entre a fase extratora e os compostos de interesse, sob o ponto de vista termodinâmico. Já em termos cinéticos, o equilíbrio entre as fases depende do tempo e da transferência de massa entre as fases.18
A extração por SPME pode ser realizada no modo direto, onde o recobrimento entra em contato direto com a amostra (líquida) e os analitos deixam a matriz e são extraídas pelo recobrimento polimérico da fibra, assim como o modo direto protegido por membrana. Já no modo por headspace a fibra fica alocada fora/acima da amostra (líquida ou sólida) e somente os compostos químicos voláteis e semi-voláteis são extraídos pelo polímero da fibra (Figura 1).23
Figura 1: Modos de extração por SPME.
2.2.1.1. Aplicações de SPME em amostras biológicas
Estudos utilizando a técnica de SPME tem crescido cada vez mais para amostras biológicas, como em análises toxicológicas e de drogas de abuso em fluidos corporais, amostras forenses e, em especial, amostras in vivo, como análises de feromônios ou compostos orgânicos voláteis de micro-organismos como fungos e bactérias.43,44
Esse aumento se deve a algumas características como a fácil extração de VOCs, análise de toda a quantidade amostrada, amostragem em uma só etapa, e ainda, principalmente no modo headspace, um clean-up bastante eficiente da amostra devido ao volume reduzido da fase extratora (Vf) da fibra de SPME. De forma complementar, a seletividade do recobrimento da fibra também auxilia nesse processo de clean-up. Assim, o efeito da matriz é diminuído visto que o fato da fibra não entrar em contato direto com amostra permite que somente os analitos de interesse sejam extraídos. 43,44
A vantagem desta técnica para amostras biológicas, mais especificamente as amostras in vivo, é a mínima perturbação do sistema no
processo da extração, o que possibilita uma extração representativa dos analitos da amostra. Outra vantagem, também devida ao fato do pequeno tamanho da fase extratora é que n<<Vs, é a possibilidade de extrações seqüenciais sem que haja interferência significativa no sistema, permitindo a avaliação de mudanças do metabolismo em função do tempo, por exemplo.43,45
2.2.2. Técnicas Analíticas no Estudo dos Metabólitos Voláteis e Semi-voláteis
O estudo de metabólitos, sejam eles quais forem, necessitam de técnicas analíticas de separação e detecção compatíveis com suas propriedades físico-químicas, como volatilidade, polaridade e massa molecular.
Quando o objetivo é identificação e/ou quantificação metabólitos voláteis e semi-voláteis, a abordagem mais comumente utilizada é a Cromatografia Gasosa (Gas Chromatography – GC) como técnica principal de separação e a Espectrometria de Massas (Mass Spectrometry – MS) como técnica de detecção.
A GC se beneficiou de várias inovações importantes nas últimas décadas, como por exemplo, o advento das colunas capilares que levaram à diminuição do diâmetro interno e espessura da fase estacionária, resultando em um aumento significativo de eficiência.29
Entretanto, muitas vezes, a complexidade da mistura de compostos presentes no metaboloma de uma espécie pode superar a capacidade de resolução da técnica de GC, visto que são amostras que tem mais de 150 compostos, dos quais (por vezes) todos apresentam significativa importância no estudo. Nesse sentido, houve a necessidade de apostar em novas ferramentas para ampliação o desempenho em GC, como as separações multidimensionais.29,46
2.2.2.1. Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente (GC×GC) – Mudança de Paradigma em GC
As técnicas de separações multidimensionais consistem em técnicas poderosas nas quais estão presentes duas ou mais etapas sequenciais de
separação. Para que seja possível a realização dessas separações, dois critérios devem ser obedecidos:47
Os mecanismos de separação de cada etapa devem ser distintos.48
As separações obtidas em cada etapa devem ser preservadas, de forma a haver ganho de resolução cromatográfica do sistema multidimensional em detrimento das etapas separadas.48
Uma das primeiras técnicas a utilizar a separação bidimensional foi a cromatografia planar bidimensional, onde a amostra é aplicada em um canto da placa e é eluída em uma fase móvel, em seguida é girada em um ângulo de 90º e eluída novamente com uma fase móvel diferente da primeira. As separações nesse exemplo obedecem às exigências supracitadas.29
Nesse cenário surgiu também a cromatografia gasosa multidimensional (Multidimensional Gas Chromatography - MDGC), definida por Marriot e colaboradores como uma técnica onde há um processo de seleção de zonas específicas e limitadas do eluato da primeira coluna de separação (¹D) que, por sua vez, são submetidas a uma segunda separação cromatográfica (²D).49
As primeiras aplicações de MDGC foram feitas por Simmons e Snyder em 1958, com um cromatógrafo a gás de dois estágios onde as frações não resolvidas do eluato eram submetidas, por meio de um sistema bastante complexo de válvulas, a uma segunda etapa de separação. 29,49 Já em 1968, a MDGC teve um avanço com o dispositivo conhecido como inversor de Deans, que consistia de um dispositivo pneumático responsável por fazer a transferências das frações do eluato da primeira dimensão para a segunda, o que expandiu a aplicação da MDGC, dando origem à cromatografia gasosa multidimensional de frações parciais ou de heart-cutting (GC-GC).29
Na GC-GC, a capacidade de pico se dá pela soma da capacidade de pico da primeira dimensão (n1) e o produto da capacidade de pico da segunda
dimensão (n2) com o número de frações transferidas para a mesma (x) (Figura
2).50 Em relação à capacidade de pico da GC (n1), há um ganho no uso da
GC-GC que pode ser bastante útil quando se tem poucas áreas de coeluição na primeira dimensão e/ou estas são conhecidas. Entretanto, o fato de apenas algumas frações serem reinjetadas na segunda dimensão e passarem por uma
nova separação não elimina a possibilidade da ocorrência sobreposição de picos em outras regiões.50
Figura 2: Comparativo entre as capacidades de pico (n) das técnicas de separação GC, GC-GC e GC×GC.
Dessa forma, alternativas de técnicas cromatográficas multidimensionais tiveram que ser estudadas e em 1991, Liu e Phillips apresentaram a GC×GC como um novo sistema de separação bidimensional em cromatografia gasosa.29,49 O impacto da GC×GC é de extrema importância, podendo ser comparado ao advento das colunas capilares em separações por GC em detrimento do uso das colunas empacotadas.50
A técnica utiliza um sistema composto por uma coluna capilar de dimensões convencionais na ¹D (geralmente 30 m × 0,25 mm × 0,25 µm) conectada a uma coluna curta (1 m) e fina (diâmetro interno de 0,1mm e 0,1 µm de espessura de filme) na ²D por meio de um dispositivo denominado modulador (Figura 3).
Figura 3: Esquema geral de um sistema GC×GC, contendo a coluna capilar de GC convencional da ¹D, seguido do modulador e da coluna capilar da ²D, que apresenta dimensões reduzidas.
O conjunto de colunas deve apresentar dimensões que tenham seletividades distintas entre si para que a segunda separação seja de fato uma vantagem. Nos conjuntos mais utilizados, a ¹D possui fases estacionárias com baixas polaridades como a estritamente apolar, composta por 100% polidimetilsiloxano e a de baixa polaridade composta por 95% polidimetilsiloxano e 5% fenil. Já na ²D, são utilizadas fases estacionárias mais polares sendo as mais comumente usadas as de composição 35-50% fenileno, 50-65% dimetilpolisiloxano, polietilenoglicol ou cianopropil-fenil-dimetilpolisiloxano.25,51
Assim, é possível dizer que a GC×GC é uma técnica multidimensional devido à combinação de colunas com mecanismos distintos de separação em cada dimensão, o que resulta na separação de compostos que continuariam coeluídos na técnica de GC convencional, por exemplo. É importante ressaltar que a correlação dos mecanismos de separação das fases estacionárias
utilizadas nas colunas deve ser a mínima possível para haver, de fato, ganho de separação ao se utilizar a técnica de GC×GC.
Na GC×GC, todo o eluato provindo da ¹D é fracionado continua e periodicamente pelo modulador e reinjetado na ²D para ser submetido a uma separação distinta da primeira, sendo esse processo chamado de modulação (Figura 4). Dessa forma, pode-se afirmar que se trata de uma técnica de separação compreensiva e diferente da GC-GC, onde apenas algumas frações coeluidas específicas são submetidas a uma segunda etapa de separação.46
Figura 4: Esquema simplificado do funcionamento de um modulador criogênico de quatro jatos, onde os passos de A a D ilustram o processo de modulação.
Assim, a técnica alcança uma capacidade de pico ainda maior que a GC e a GC-GC, sendo esta o produto da capacidade de pico da ¹D (n1) pela
capacidade pico da ²D (n2) (Figura 2). Na GC×GC a separação obtida na primeira
separação deve ser mantida (mesmo que parcialmente) na segunda, sendo assim imprescindível o uso de uma coluna curta e de alta eficiência na ²D.46
O maior poder de separação e capacidade de pico obtida na GC×GC em detrimento das demais técnicas citadas anteriormente se deve não somente à
uma boa escolha do conjunto de colunas, mas também do processo de modulação. Pode-se dizer que o modulador é o “coração” dessa técnica, sendo este o responsável por coletar pequenas frações do eluato da ¹D e reinjetar na ²D. O processo de modulação, o qual tem duração de poucos segundos, acontece de forma contínua e periódica. Nesse processo, primeiro o eluato da ¹D é fracionado pelo modulador em um processo chamado coleta (Figura 4A), seguido pelo processo de focalização (Figuras 4B e 4C) onde há o estreitamento da banda cromatográfica e, por fim, essa banda estreita é reinjetada (Figura 4D) na ²D.
Além da separação adicional que ocorre na banda cromatográfica reinjetada, uma vantagem da GC×GC decorrente do processo de modulação é o ganho de detectabilidade. Há uma elevação da relação sinal/ruído, pois, os analitos são eluídos na forma de picos muito mais estreitos e intensos devido ao processo de focagem, onde ocorre a compressão das bandas cromatográficas.29
Os moduladores podem ser funcionar de diversas formas, podendos ser baseados em válvulas diversoras comandadas eletronicamente ou térmicos. Atualmente, os mais utilizados são os moduladores criogênicos. Os moduladores criogênicos alternam jatos de gás (nitrogênio) resfriados (por N2 ou CO2 líquido) e
jatos aquecidos (por resistências), incididos na superfície externa da coluna, para efetuar o processo de modulação. Os jatos resfriados são responsáveis por coletar as frações do eluato da ¹D, e em seguida o eluato focalizado é reinjetado na ²D por meio de um jato aquecido.29,46
As configurações de moduladores criogênicos mais comuns são a de quatro jatos (Figura 4) e a de loop, onde um capilar de sílica desativado conecta as duas dimensões de separação.52
Além da maior capacidade de pico obtida e do aumento da relação sinal/ruído, há uma peculiaridade da GC×GC, que auxilia no processo de identificação dos compostos separados, chamada estruturação cromatográfica. A estruturação ocorre no plano cromatográfico (facilmente visualizada em representações dos cromatogratogramas em duas dimensões) devido à formação de agrupamentos de compostos que possuem similaridade química, o que facilita e aumenta a confiabilidade do processo de identificação utilizando índices de
retenção (a partir dos tempos de retenção na ¹D e ²D), podendo ser determinantes em alguns casos.46
Por fim, os dados gerados por GC×GC podem ser visualizados de diversas formas, uma vez que são obtidos dados de tempo de retenção na ¹D e ²D (¹tR e ²tR) e intensidade de sinal. Na Figura 5, é possível visualizar de forma
clara a separação dos compostos químicos através das representações em duas e três dimensões.
2.3. Metabolômica e GC×GC – Abordagem Estatística Multivariada
Os estudos envolvendo análises de metabólitos, assim como quaisquer outras análises necessitam, muitas vezes, de uma análise estatística dos dados. Atualmente as técnicas analíticas tem se tornado cada vez mais complexas, gerando assim um volume de dados cada vez maior e nesse cenário, técnicas quimiométricas ganham destaque por sua capacidade de tratar essas grandes quantidades de dados de forma eficaz.
A quimiometria, que teve origem em análise multivariada de dados de psicologia (psicometria) e ecomomia (econometria), tem o objetivo de extrair informações concretas de dados de origem química por meio do uso da matemática e da estatística, bem como planejar/otimizar experimentos.54,55
Na cromatografia, os desvios mais comumente encontrados são coeluições, deslocamento de tempo de retenção, drift da linha de base e baixa relação sinal/ruído, os quais podem ocorrer de uma só vez. Muitas vezes, devido a ruídos (inerentes ou não da técnica) e interferências a interpretação dos dados se torna uma tarefa difícil, podendo mascarar o resultado.56 Assim, antes mesmo de se utilizar de métodos quimiométricos avançados, o uso de pré-processamentos dos dados se faz necessário. Os pré-pré-processamentos utilizados para cromatografia são a correção de linha base, suavização do ruído e, principalmente, o alinhamento dos tempos de retenção.
Os deslocamentos de tempo (time shift) de retenção em GC pode ocorrer devido a parâmetros conhecido e controláveis, como a mudança de comprimento da coluna de separação, vazamentos no sistema de injeção e devido às injeções realizadas de forma manual, e na GC×GC a extensão desses deslocamentos ocorridos depende desses parâmetros cromatográficos bem como da repetibilidade intrínseca do sistema, que é um fator aleatório.46,51
Desde o primeiro trabalho publicado em 1998, o método para a correção desses deslocamentos de tempo de retenção (também chamado de alinhamento) mais utilizado é o método Correlation Optimised Warping (COW). Alinhamento para dados cromatográficos é definido como uma operação matemática que reposiciona características químicas similares a fim de fazer com
que apareçam em tempos de retenção iguais em diferentes corridas cromatográficas.56,57
O método COW alinha os cromatogramas sincronizando os sinais e usa um cromatograma de referência para comprimir e expandir os segmentos de cada amostra no conjunto de dados, mas deve manter a informação de área intacta. A flexibilidade desses ajustes pode ser alterada de acordo com a necessidade sendo que uma maior flexibilidade implica em um maior ajuste bem como maior o risco de introduzir artefatos nos dados, da mesma forma que pequenos deslocamentos (uma menor flexibilidade) evita a introdução de um grande número de artefatos, porém diminui o ajuste.31,56
Dados de GC×GC são bastante volumosos e complexos se comparados com dados obtidos por GC e quando utilizados em investigações de cunho biológico, como o estudo de um grupo específico de matabólitos de determinado organismo, é necessário que se utilize tratamentos de dados que permitam evidenciar até mesmo as variações e diferenças mais sutis entre os perfis.31
Dados de GC×GC possuem informações de tempo de retenção (tR) na
¹D e ²D (¹tR e ²tR, respectivamente) se tornando uma estrutura em duas
dimensões. Quando essa técnica é acoplada a um espectrômetro de massas como detector, por exemplo, cada ponto do plano cromatográfico, o qual possui informações únicas de ¹tR e ²tR, o espectro de massas para aquele ponto do
cromatograma contribui para um arranjo tridimensional do arranjo de dados. Assim, para um grupo de amostras com tríades de dados, tem-se um arranjo em quatro dimensões (dados de ordem superior), tornando a interpretação uma tarefa mais difícil, e é por esse motivo que a quimiometria é tão importante em estudos envolvendo GC×GC.25
Em uma análise univariada de um sistema o objetivo é identificar se uma amostra é estatisticamente diferente de outra amostra por meio de um teste
t, por exemplo. Entretanto, em uma abordagem dentro do escopo da
metabolômica, vários metabólitos podem não apresentar significância estatística individualmente, gerando falsos resultados. Dessa forma, uma abordagem multivariada, ou seja, avaliando vários (ou todos) os compostos químicos de
forma simultânea, é possível alcançar resultados mais significativos e representativos do sistema.15
Diversos são os métodos quimiométricos multivariados sendo suas aplicações as mais variadas. De maneira geral, na química analítica são aplicados métodos de regressão multivariada, métodos de decomposição de dados, reconhecimento de padrões dentre outros.25,58
Em dados de metabolômica, as análises de reconhecimento de padrões podem ser uma alternativa útil para entender o funcionamento de um sistema biológico em função do tempo, por exemplo, ou ainda mediante a perturbações externas. Como a quantidade e diversidade de metabólitos presentes nas amostras são variáveis, as análises de reconhecimento de padrões podem auxiliar no melhor entendimento de quais são os compostos responsáveis por diferenciar os agrupamentos de amostras.31 Para uma visão mais ampla do sistema, geralmente desconhecido, análises multivariadas utilizando métodos não supervisionados de reconhecimento de padrões são realizadas, como a Análise de Componentes Principais (Principal Component Analysis – PCA) e análise discriminante por mínimos quadrados parciais (Partial Least Squares
Discriminant Analysis – PLS-DA), sendo estes os métodos de reconhecimento de
padrões mais representativos.25
O PCA é um método baseado na decomposição da matriz de covariância das variáveis originais, e assim transforma os dados de forma a reduzir sua dimensionalidade (variáveis), representando-os em um espaço mais simples, com menos dimensões. Essas novas variáveis devem conter a maior variância possível do sistema inicial e são formadas a partir da combinação linear das variáveis originais correlacionadas, conhecidas assim como componentes principais (Principal Components – PCs).15,58
A matriz de dados X (I×J) pode ser decomposta nas matrizes de escores (T), pesos (P) e resíduos (E) onde J é o número de colunas as quais são relaciona das com o número de variáveis e I é o número de linhas as quais se relacionam ao número de amostras, nas quais h é o número de componentes principais.
Matriz de Escores (T): possui dimensionalidade (I×h) e expressa a relação entre as amostras;
Matriz de Pesos (P): possui dimensionalidade (J×h) e expressa a relação entre as variáveis do sistema:
Matriz de Resíduos (E): possui dimensionalidade (I×J) assim como a matriz X, e contém resíduos aleatórios, dados não explicados pelo PCA.
Em dados de metabolômica, os gráficos de escores explicitam a relação e o agrupamento natural das amostras avaliadas, e os gráficos de pesos indicam a relação entre as variáveis, que nesse caso correspondem os tempos de retenção dos picos dos metabólitos encontrados; a combinação das informações desses gráficos mostra quais metabólitos estão envolvidos na similaridade dessas amostras em estudo.
A primeira PC (PC1), assim como as demais PCs, é a combinação linear de todas as variáveis e contém a maior quantidade de variância explicada dos dados originais dentre todas as PCs. A segunda PC (PC2) é ortogonal à PC1 e, da mesma forma que esta, é uma combinação das variáveis originais e explica a maior quantidade de variância dos dados restantes (figura 6). As PCs restantes seguem a mesma lógica que as primeiras.58
Figura 6: Representação matemática da decomposição dos dados da matriz X em componentes principais. Adaptado de Kumar 2014.58
Em dados de GC×GC, a PCA pode ser utilizada para encontrar agrupamentos de amostras por suas correlações utilizando tabela de integração de picos cromatográficos, uma vez que o algoritmo utilizado para tal análise é incompatível com dados de duas ou mais dimensões.25,60,61
Nesse sentido, para dados de ordem superior como os de GC×GC, a Análise de Componentes Principais Multimodo (MPCA - Multiway Principal
No MPCA os dados, originalmente tridimensionais, serão desdobrados em matrizes, para que o mesmo tratamento matemático de PCA possa ser aplicado25,54,62
3. OBJETIVOS
3.1. Geral:Aplicação de extração por SPME e separação e identificação por GC×GC-QMS dos metabólitos voláteis de fungos sapróbios com potencial de biocontrole e/ou indução de resistência a fitopatógenos de culturas de interesse comercial.
3.2. Específicos:
Desenvolver método cromatográfico por Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente com detecção por Espectrometria de Massas (GC×GC-QMS) para o estudo do metaboloma volátil de fungos com potencial ação biocontrole à fitopatógenos de plantas.
Aplicação e otimização modelos quimiométricos para auxiliar a identificação do perfil de Compostos Orgânicos Voláteis (VOCs) produzidos pelo fungo, bem como definição da melhor performance na eficiência de produção de metabólitos voláteis.
Identificação de possíveis biomarcadores de controle e/ou a indução de resistência presentes no perfil de VOCs do fungo.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Seleção dos FungosInicialmente foi feita a seleção dos fungos sapróbios (Coleção de Microrganismos da Bahia, CCMB) a serem estudados neste trabalho, a partir da avaliação do potencial de cada fungo com relação ao seu poder em inibir doenças em diversos patossistemas (interação patógeno-hospedeiro). Na reunião do projeto SisBiota, em maio de 2013, dos vários fungos avaliados pelos demais grupos do projeto, sete apresentaram uma melhor resposta de controle de patógenos em várias culturas como citros, soja, uva, eucalipto, goiaba, tomate, feijão-fava, sorgo, café e couve-manteiga (Tabela 1).
Tabela 1: Identificação dos fungos sapróbios cultivados para estudo do perfil metabólico volátil.
Identificação do fungo Espécies Número de depósito*
CUI Curvularia sp. 0005/06 MEE Memnoniella sp. 0004/07 MEL Memnoniella sp. 0033/08 MYL Myrothecium sp. 0069/06 PHM Phialomyces sp. 0053/09 STC Stachybotrys sp. 0156/11 STG Stachybotrys sp. 0011/10
* Número de depósito da Coleção de Culturas de Microorganismos da Bahia (CCMB)
A seleção dos fungos acima citados foi realizada pelos participantes do projeto SisBiota “Bioprospecção de fungos sapróbios no PPBIO/ semi-árido
nordestino para o controle de doenças infecciosas em plantas: indução de resistência” coordenado pelo professor doutor Sérgio Florentino Pascholati. Os
ensaios para escolha dos fungos foram realizados de modo a avaliar o grau de inibição da germinação de esporos dos fitopatógenos pela ação dos fungos sapróbios acima listados em determinados patossistemas, representados da Tabela 2.
Nos ensaios para avaliar a inibição dos fungos realizados pelas demais equipes envolvidas no projeto, duas bases de placas de Petri foram unidas, vedadas hermeticamente e mantidas a 22 °C no escuro, onde uma delas contém meio ágar-água e 100 μL de suspensão de esporos (2105 esporos/mL) do patógeno e a outra placa contém o meio de cultura batata-dextrose-ágar (BDA) e um disco de micélio do fungo sapróbio a ser estudado foi posicionado no centro da placa. Após 48 horas realiza-se a contagem dos esporos germinados para verificação da porcentagem de fitopatógeno inibido pelo fungo sapróbio. O material biológico utilizado na análise da fração volátil foi fornecido pela CCMB.
Tabela 2: Patossistemas do projeto SISBIOTA.
Cultura Doença Patógeno
Eucalipto Ferrugem Puccinia psidii
Citros Podridão do fruto Phytophthora nicotianae
Greening Candidatus Liberibacter asiaticus
Soja Mofo branco Sclerotinia sclerotiorum
Café
Ferrugem Hemileia vastatrix
Mancha aureolada Pseudomonas syringae
Antracnose Colletotricum gloeosporioides
Trigo Brusone do trigo Magnaporthe grisea
Tomate
Podridão negra Xanthomonas vesicatoria
Requeima-do-tomateiro Phytophthora infestans
Pinta-preta Alternaria solani
Pinta-preta-pequena Septoria lycopersia
Uva Antracnose Elsinae ampelina
Podridão-da-uva madura Colletotricum gloeosporioides
Sorgo Antracnose Colletotricum sublineolum
Feijão-fava Antracnose Colletotricum truncatum
Couve-manteiga Mancha de Alternaria Alternaria brassicicola
4.2. Preparo do meio de cultura
Os meios de cultura utilizados nos experimentos e na manutenção dos fungos foram:
Cenoura-Milho-Ágar (CMA): (30,0 ± 0,5) g de cenoura ralada, (30,0 ± 0,5) g de milho verde e (16,0 ± 0,1) g de ágar (Difco,BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ – USA). Todos os ingredientes foram batidos em liquidificador (cerca de 10 minutos) com um pouco de água destilada (300 mL), e ao final o volume foi ajustado para 1 L.
Batata-Dextrose-Ágar (BDA): (39,0 ± 0,1) g de meio de cultura comercial (Difco, BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ – USA) em quantidade suficiente para 1L água destilada.
Ambos os meios de cultura foram esterilizados em autoclave a 121 °C por 20 minutos. Após este tempo, o meio foi levado (ainda no estado líquido e quente) a uma câmara de fluxo vertical VECO modelo FUV 06, e vertido em placas de Petri (para manutenção do fungo) e em tubos de 50 mL tipo Falcon (para a condução dos experimentos). Após solidificação, placas e tubos contendo meio de cultura foram armazenados em geladeira por até 30 dias. Para evitar contaminações durante o tempo de armazenamento as placas de Petri foram ainda envoltas em papel filme.
4.3. Manutenção do Material Biológico
A matriz do fungo vinda da CCMB em forma de pequenos discos de meio de cultura contendo o micélio (Figura 7) do mesmo eram colocados mantidos em placas de Petri (90×15 mm), contendo 20 mL de meio CMA (assim como os demais grupos participantes do Sisbiota). Discos de 5 mm de diâmetro contendo inóculo (retirado de uma outra placa de Petri contendo a matriz secundária) foram cortados usando uma ponteira para pipeta descartável de 1 mL e usados para repicar cada fungo durante sua manutenção. Esse processo foi realizado em estufa de crescimento BOD (Eletrolab, modelo EL 202), com a temperatura em (25,0 ± 1,0) ºC e fotoperíodo de 12 horas (quatro lâmpadas fluorescentes com potência de 20 W).
Figura 7: Esquema do processo de manutenção do material biológico utilizado.
4.4. Inoculação dos Fungos e Extração do Headspace
A inoculação foi realizada em um dispositivo como mostrado na Figura 8, com tubos de polipropileno de 50 mL (tipo Falcon), os quais tiveram as tampas furadas com orifícios de 15 mm de diâmetro, possibilitando a extração por SPME. Para manter a vedação dos tubos, foram colocados septos de Teflon® e anéis de alumínio com orifício central com o mesmo diâmetro para manter o septo no lugar correto, evitando vazamentos ou contaminações externas.
Figura 8: Dispositivo de extração do headspace. (A) Dispositivo desmontado; (B) Tampa no dispositivo montada com o septo e o anel de alumínio; (C) Dispositivo montado.
Aproximadamente 25 mL de meio de cultura foram vertidos nos tubos, usando angulação (uma elevação de cerca de 1,5 cm da boca do tubo) que não causasse derramamento e promovesse uma área superficial maior para o crescimento dos fungos (Figura 9C).
Figura 9: Preparo do meio de cultura nos dispositivos de extração na câmara de fluxo laminar: (A) Tubos na posição adequada para solidificação do meio; (B) Meio sendo vertido nos tubos de 50 mL; (C) Meios de cultura secando na posição correta.
A inoculação foi realizada de duas formas sendo uma delas utilizando discos de 5 mm do micélio do fungo cultivado em meio sólido (como no procedimento de manutenção do material biológico) e a outra utilizando uma
suspensão de esporos do fungo de modo a avaliar forma que obtivesse melhores resultados.
Para a inoculação utilizando a suspensão de esporos foram utilizadas placas de Petri com o fungo já crescido (a placa completamente preenchida com o fungo) e água destilada estéril, a qual foi utilizada para lavar a superfície da placa. Com ajuda de uma alça de vidro, a placa foi raspada para a obtenção da suspensão de esporos. A suspensão foi agitada e uma pequena alíquota foi colocada na câmara de Neubauer (Figura 10A).
Figura 10: Câmara de Neubauer: (A) Esquema de uso da câmara; (B) Especificação das dimensões de cada quadrante.63
Os esporos foram identificados de acordo com a ilustração da Figura 11 que mostra as diferentes formas dos esporos de cada fungo.
Figura 11: Ilustração dos esporos dos fungos CUI (A) e MYL (B).
A concentração de esporos foi calculada conforme os padrões de volume da câmara Neubauer (Figura 10B) seguido de diluição para obtenção de concentração de 2,4 × 105 esporos/mL. Assim, 50 μL da suspensão de esporos foram transferidos e, com ajuda de alça de vidro, espalhados pela superfície do meio de cultura (alocado no dispositivo de extração, Figura 8C). Os tubos foram mantidos abertos sob fluxo laminar até toda a suspensão de esporos secar e a seguir foram vedados com tampa e septo (Figura 8B e 8C).
4.5. Equipamentos e Otimização de Condições de Extração e Separação dos Perfis Voláteis dos Fungos Sapróbios
4.5.1.Extração dos Metabólitos Voláteis por HS-SPME
As extrações da fração volátil produzida pelos fungos foram conduzidas através de SPME utilizando fibra extratora de revestimento triplo DVB/CAR/PDMS (Divinilbenzeno/Carboxeno/Polidimetilsiloxano 50/30 m, Supelco). Desta forma, a fibra foi exposta ao headspace (estático) presente no dispositivo de extração contendo o fungo inoculado a ser estudado, por um tempo de 35 min. A extração foi conduzida dentro da própria BOD (a 25 ºC) para evitar qualquer estresse ao fungo e manter as condições de cultivos dos mesmos. Após o tempo de extração,
a fibra foi retraída e levada ao cromatógrafo para dessorção dos voláteis no injetor por 5 minutos.
4.5.2. Condições de Separação e Equipamentos Utilizados
As separações cromatográficas foram conduzidas usando cromatografia gasosa bidimensional abrangente com detecção por espectrometria de massas (GC×GC-QMS). O equipamento utilizado foi GC-QMS, modelo QP2010 Plus da SHIMADZU, adaptado para GC×GC-QMS.
Nos ensaios preliminares foi empregando um modulador criogênico de quatro jatos e um conjunto de colunas que consistia em coluna HP-5MS de 30 m × 0,25 mm × 0,25 m (Supelco) conectado a uma Supelcowax de 1 m × 0,10 mm × 0,10 m (Supelco), utilizando período de modulação de 6 s.
Nos ensaios para o fungo MYL foi empregando um modulador criogênico na configuração de loop e um conjunto de colunas que consistia em coluna HP-5MS de 30 m × 0,25 mm × 0,25 m (Supelco) conectado a uma Supelcowax de 1 m × 0,10 mm × 0,10 m (Supelco), sendo alocado entre estas um capilar de sílica desativado de 1 m × 0,25 mm. Nesses ensaios foi utilizado um período de modulação de 5 s.
Para a aquisição dos dados GC×GC-QMS foi utilizado o software GCMSsolution versão 5.3 (Shimadzu, Tóquio, Japão e para a análise dos cromatogramas bidimensionais foi empregado o software GCImage versão 2.0 (Zoex - Houston, TX, USA). As condições de operação otimizadas para os ensaios por GC×GC-QMS encontram-se descritas na Tabela 3.
