FRANCISCO MANUEL BARRALES
EXTRAÇÃO DE ÓLEO DE SEMENTE DE MARACUJÁ (Passiflora edulis sp.) USANDO CO2 SUPERCRÍTCO ASSISTIDO POR ULTRASSOM
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
FRANCISCO MANUEL BARRALES
“EXTRAÇÃO DE ÓLEO DE SEMENTE DE MARACUJÁ (Passiflora edulis sp.) USANDO CO2 SUPERCRÍTICO ASSISTIDO POR ULTRASSOM”
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Engenharia de Alimentos.
Orientador: Prof. Dr. Julian Martínez ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA
DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO FRANCISCO
MANUEL BARRALES E ORIENTADA PELO PROF.
DR. JULIAN MARTÍNEZ.
Assinatura do Orientador ---
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos Helena Joana Flipsen - CRB 8/5283
Barrales, Francisco Manuel,
B272e BarExtração de óleo de semente de maracujá (Passiflora edulis sp.) usando CO2 supercrítico assistido por ultrassom / Francisco Manuel Barrales. – Campinas, SP : [s.n.], 2015.
BarOrientador: Julian Martínez.
BarDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos.
Bar1. Resíduos industriais. 2. Tocoferóis. 3. Tocotrienóis. 4. Microscopia eletrônica de varredura. 5. Ácidos graxos. I. Martínez, Julian,1976-. II.
Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Supercritical CO2 extraction of passion fruit (Passiflora edulis sp.) oil
assisted by ultrasound
Palavras-chave em inglês:
Industrial wastewater Tocopherols
Tocotrienols
Scanning electron microscopy Fatty acids
Área de concentração: Engenharia de Alimentos Titulação: Mestre em Engenharia de Alimentos Banca examinadora:
Julian Martínez [Orientador] Marcio Antonio Mazutti Natália Mezzomo
Fernando Antonio Cabral Renato Grimaldi
Data de defesa: 06-03-2015
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Julian Martínez (Orientador – DEA/FEA/Unicamp)
Prof. Dr. Marcio Antonio Mazutti (Universidade Fereral de Santa Maria)
Profa. Dra. Natália Mezzomo (Universidade Federal de Santa Catarina)
Prof. Dr. Fernando Antonio Cabral (DEA/FEA/Unicamp)
Dr. Renato Grimaldi (FEA/ Unicamp)
RESUMO
O presente trabalho teve como principal objetivo avaliar a influência da aplicação de ultrassom na extração de óleo de semente de maracujá com CO2 supercrítico, focando no rendimento da extração, na cinética do processo, conteúdo de tocoferóis e tocotrienóis, perfil de ácidos graxos, e atividade sequestrante do radical DPPH do óleo, usando como matéria-prima sementes de maracujá misturadas com polpa provenientes da indústria de processamento da fruta. Com esse intuito, a metodologia de superfície de resposta foi empregada, partindo como base de um planejamento experimental de tipo composto central para três fatores. Os fatores avaliados foram temperatura (38; 40; 45; 50 e 52°C), pressão (13; 16; 21; 26 e 29 MPa) e potência de ultrassom (0; 160; 400; 640 e 800 W). Os extratos obtidos apresentaram alto porcentagem de ácidos graxos poli-insaturados (aproximadamente 67%) e teor de tocoferóis e tocotrienóis (entre 60 e 90 mg/100g óleo), atividade sequestrante do radical DPPH (entre 1,8 e 2,6 mg TE/g óleo) que demonstrou correlação com o conteúdo total de tocoferóis e tocotrienóis (r = +0,872). A análise de polifenóis totais não conseguiu detectar a presença de polifenóis nos extratos. A aplicação de ultrassom na menor potência (160 W) resultou vantajosa, gerando incrementos de até 29% no rendimento de SFE. Este efeito foi registrado na temperatura de 40 °C e pressão de 16 MPa. O modelo de Sovová (1994) mostrou-se adequado para descrever o comportamento da cinética de extração, permitindo avaliar os parâmetros ajustados. Quando foi evidenciado grande incremento no rendimento da SFE, decorrente da aplicação do ultrassom, os parâmetros cinéticos foram modificados, sendo o tempo da etapa CER maior, junto com o coeficiente de transferência de massa da fase fluida, houve diminuição
da proporção de extrato de difícil acesso. As imagens obtidas por microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão de campo (FESEM) demonstraram efeitos de atrito e menor tamanho de partículas quando o ultrassom foi aplicado.
Palavras chave: Resíduos industriais, Tocoferóis e Tocotrienóis, Ácidos graxos, Microscopia eletrônica de varredura, Modelagem matemática.
ABSTRACT
The present work had as main objective the evaluation of the effect of the application of ultrasound in the extraction of passion fruit seed oil using supercritical CO2, on the global extraction yield, the process kinetics, the tocopherol and tocotrienol content and DPPH radical scavenging activity, using as raw material passion fruit seeds mixed with pulp, a byproduct of the pulp processing industry. To accomplish that, the response surface methodology was used. The evaluated factors were: temperature (38; 40; 45; 50 and 52 °C), pressure (13; 16; 21; 26 and 29 MPa) and ultrasound power (0; 160; 640 and 800 W). Fatty acids composition, total polyphenolic content, identification and quantification of tocopherols and tocotrienols and the antioxidant activity were evaluated on the extracts, which resulted rich in polyunsaturated fatty acids (about 67%) and tocopherols and tocotrienols (between 60 and 90 mg/100g oil), of high antioxidant activity (between 1,8 to 2,6 mgTE/g oil) that shown correlation with the tocopherol and tocotrienol total content (r = +0,872). The total polyphenol analysis was not able to detect the presence of polyphenols in the extracts. The application of low power ultrasound (160 W) resulted advantageous; the SFE global yield improvement achieved 29%. This effect was registered at a temperature of 40 °C and pressure of 16 MPa. The model of Sovová (1994) was adequate to describe the extraction kinetics behavior, and it was possible to evaluate the adjusted parameters. When a great increase of SFE yield was achieved due to the ultrasound application, the kinetic parameters were modified, being the CER time and the fluid phase mass transfer coefficient increased, also showing reduction of solute ratio inside the cells. . The images obtained by field emission scanning electron microscopy (FESEM)
demonstrated mechanical damage effects and smaller particle size when ultrasound was applied.
Key words: Industrial byproducts, Tocopherol and Tocotrienol, Fatty acids, FESEM, Mathematical modeling.
AGRADECIMENTOS
Ao professor Dr. Julian Martínez pela atenção, incentivo e todas as ideias e correções do trabalho. Muito obrigado.
À professora Dra. Camila Alves de Rezende pela paciência, ideias e o apoio no desenvolvimento nos experimentos de microscopia. Muito obrigado.
Ao Laboratório Nacional de Natotecnologia (LNNano), vinculado ao Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM), pelo apoio nos experimentos de microscopia eletrônica de varredura, que foram realizados no microscópio FESEM Quanta 650F (FEI).
À Juliane Viganó pela amizade, auxílio e apoio durante a realização dos experimentos.
Ao Philipe dos Santos pela amizade e auxílio no início do trabalho. Ao Rúbner Gonçalves Pereira pela amizade e apoio no trabalho. À minha família pela paciência, o amor e incentivo durante curso.
Aos colegas e amigos da Faculdade de Engenharia de Alimentos, em especial Daniel, Abel, Renata, Janclei, Danilo, Pasquel, Arthur, Ana Paula, Ana Carolina.
SUMARIO
RESUMO ... vii
ABSTRACT ... ix
AGRADECIMENTOS ... xi
SUMARIO ... xiii
LISTA DE FIGURAS ... xix
LISTA DE TABELAS ... xxiii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... xxvii
LISTA DE SÍMBOLOS ... xxix
1. Introdução. ... 1
2. Objetivos ... 3
3. Revisão bibliográfica. ... 5
3.1 Maracujá (Passiflora edulis sp.) ... 5
3.2 Polifenóis e atividade antioxidante em maracujá ... 6
3.3 Tocoferóis e tocotrienóis ... 7
3.4 Extração de óleo da semente de maracujá ... 9
3.5 Extração com CO2 supercrítico (SFE) ... 10
3.6 Ultrassom ... 11
3.8 Cinéticas de SFE ... 14
3.9 Modelos cinéticos de curvas de extração ... 16
3.9.1 Modelo de Sovová (1994) ... 17
4. Material e Métodos ... 20
4.1 Matéria-prima ... 21
4.2 Pré-Tratamento e caracterização da matéria-prima ... 21
4.3 Análises de composição centesimal ... 22
4.3.1 Teor de umidade ... 22
4.3.2 Conteúdo de lipídios totais ... 23
4.3.3 Conteúdo de proteínas ... 23
4.3.4 Resíduo mineral fixo (cinzas) ... 24
4.3.5 Carboidratos totais ... 24
4.3.6 Caracterização das partículas e do leito de extração ... 24
4.4 Extração ... 25
4.4.1 Extrações com CO2 supercrítico assistidas por ultrassom ... 26
4.4.2 Extração a baixa pressão ... 30
4.4.5 Otimização do processo de extração ... 33
4.4.6 Escolha das melhores condições para avaliação do efeito do ultrassom na SFE ... 35
4.4.7 Cinética de extração ... 36
4.5 Análises dos extratos ... 38
4.5.1 Determinação do perfil de ácidos graxos ... 38
4.5.2 Determinação de tocoferóis e tocotrienóis ... 39
4.5.3 Polifenóis totais ... 40
4.5.3.1 Extração de fenólicos do óleo. ... 40
4.5.3.2 Construção de curva de calibração. ... 41
4.5.3.3 Determinação de fenólicos em amostras. ... 41
4.5.4 Atividade Antioxidante ... 41
4.5.4.1 Atividade sequestrante do reagente DPPH ... 42
4.6 Microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão de campo (FESEM) ... 43
5. Resultados e Discussão ... 45
5.1 Caracterização da matéria-prima ... 45
5.2 Caracterização das partículas do leito de extração ... 46
5.3 Experimentos prévios ... 47
5.3.2 Determinação do Tempo de Extração ... 48
5.4 Extrações do planejamento experimental ... 50
5.4.1 Modelo Estatístico e ANOVA para Rendimento Global ... 52
5.4.2 Modelo Estatístico e ANOVA para Atividade sequestrante do radical DPPH ... 56
5.5 Avaliação do efeito do ultrassom na SFE ... 58
5.5.1 Perfil de ácidos graxos ... 62
5.5.2 Tocoferóis e Tocotrienóis ... 65
5.5.3 Polifenóis totais ... 66
5.5.4 Atividade sequestrante do radical DPPH e tocoferóis e tocotrienóis .... 67
5.5.5 Cinéticas de SFE ... 70
5.6 Microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão de campo (FESEM) ... 75
6. Conclusões ... 80
7. Sugestões para trabalhos futuros ... 82
8. Referências Bibliográficas ... 83
9.2 Apêndice 2: Dados experimentais de Cinéticas de SFE de semente de
maracujá para determinação do tempo de extração ... 88
9.3 Apêndice 3: Dados experimentais de Cinéticas de SFE de óleo de maracujá para modelagem ... 89
9.4 Apêndice 4: Determinação de solubilidade do óleo no CO2... 91
9.4.1 Determinação de solubilidade para condições de 40 °C e 16 MPa ... 91
LISTA DE FIGURAS
Figura 3.1: Estrutura geral de tocoferóis e tocotrienóis. ... 8
Figura 3.2: Curva de SFE com suas etapas: Taxa de extração constante (CER); taxa de extração decrescente (FER); período difusional (DC). Adaptado de Brunner (1994)... 15
Figura 4.1: Diagrama das atividades desenvolvidas no presente trabalho ... 20
Figura 4.2: Etapas de pré-tratamento da matéria-prima. ... 22
Figura 4.3: Diagrama de fluxo do sistema de SFE assistido por ultrassom. ... 26
Figura 4.4: Esquema da coluna de extração assistida por ultrassom. ... 27
Figura 4.5: Unidade de extração com CO2 supercrítico assistida por ultrassom. ... 29
Figura 4.6: Ilustração do sistema de funcionamento do extrator Soxhlet. ... 31
Figura 5.1: Distribuição granulométrica da matriz vegetal: Bagaço de maracujá submetido a secagem em estufa e moagem em liquidificador, com seus respectivos desvios padrão. ... 46
Figura 5.2: Curvas cinéticas de SFE para determinar o tempo estático, realizadas a 16 MPa e 50 °C, com vazão de CO2 de 1,75x10-4 kg/s e massa de semente de maracujá de aproximadamente 5 g... 48
Figura 5.3: Cinética de SFE para determinação de tempo de extração de óleo de semente de maracujá, realizada a 26 MPa e 50 °C, com vazão de CO2 de 1,75x10-4 kg/s, e massa de semente de maracujá de aproximadamente 5 g. ... 49
Figura 5.4: Superfícies de resposta para Rendimento Global de extração em função de: a) Temperatura-Potência de Ultrassom; b) Pressão-Potência de ultrassom; c) Temperatura-Pressão. ... 54
Figura 5.5: Curva de representação gráfica do modelo estatístico. AS- DPPH: Atividade sequestrante do radical DPPH; TE: trolox equivalente. ... 58
Figura 5.6: Concentração de tocoferóis e tocotrienóis totais versus atividade sequestrante do radical DPPH, apresentando a linha de correlação linear. AS- DPPH: Atividade sequestrante do radical DPPH; TE: Trolox equivalente. ... 69
Figura 5.7: Cinéticas de SFE de óleo de semente de maracujá a 40 °C e 16 MPa, com diferentes potências de ultrassom aplicadas (0 W, 160 W e 640 W), com as respectivas cinéticas obtidas ajustando o modelo de Sovová (1994). ... 71
Figura 5.8: Cinéticas de SFE de óleo de semente de maracujá a 26 MPa e 40 °C, com diferentes potências de ultrassom aplicadas( 0 W, 160 W e 640 W). ... 73
Figura 5.9: Imagens de FESEM de partículas de sementes de maracujá: a) in natura; b) após extração com hexano em um extrator Soxhlet; c) após extração com CO2 supercrítico sem ultrassom e d) após extração com CO2 supercrítico e ultrassom a 160 W. ... 76 Figura 5.10: Imagens de FESEM de semente de maracujá após extração com: a) hexano em um extrator Soxhlet e b) CO2 supercrítico sem ultrassom. Imagens em aumentos pequenos mostrando o panorama geral das partículas de farelo de maracujá. Barra de escala de 500 m em (a) e de 200 m em (b). ... 77
Figura 5.11: Imagens de FESEM de semente de maracujá: a) in natura; b) após extração com hexano em um extrator Soxhlet; c) após extração com CO2 supercrítico sem
Figura 9.1: Cinética de SFE expressada como massa de extrato em função de massa de CO2 consumido, para determinação de solubilidade. Experimentos realizados a 40 °C e 16 MPa. ... 91
Figura 9.2: Cinética de SFE expressada como massa de extrato em função de massa de CO2 consumido, para determinação de solubilidade. Experimentos realizados a 40 °C e 26 MPa. ... 92
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1: Perfil de ácidos graxos do óleo de semente de maracujá, expressado em porcentagem dos ácidos graxos majoritários. ... 9
Tabela 4.1: Parâmetros codificados e sem codificar usados no planejamento experimental. ... 34
Tabela 4.2: Esquema dos ensaios realizados segundo o planejamento experimental. ... 34 Tabela 4.3: Condições experimentais escolhidas para estudo do efeito de diferentes potências de ultrassom aplicadas ao processo SFE para extração de óleo de semente de maracujá... 35
Tabela 5.1: Caracterização do bagaço de maracujá e da semente de maracujá, obtido após secagem e moagem... 45
Tabela 5.2: Características físicas das partículas da semente de maracujá. ... 46 Tabela 5.3: Rendimento global para extração com CO2 supercrítico assistida por ultrassom e não assistido por ultrassom. ... 51
Tabela 5.4: ANOVA do ajuste do modelo estatístico aos dados experimentais de rendimento global. ... 54
Tabela 5.5: Análise de ANOVA para ajuste do modelo estatístico aos dados experimentais de atividade sequestrante do radical DPPH. ... 57
Tabela 5.6: Rendimento global em condições experimentais escolhidas para estudo focado do efeito de diferentes potências de ultrassom aplicadas ao processo SFE para extração de óleo de semente de maracujá. ... 59
Tabela 5.7: Perfil de ácidos graxos de óleo de semente de maracujá, extraído por SFE com e sem ultrassom, em diferentes condições, e extraído por Soxhlet com hexano como solvente. Todos os experimentos SFE foram realizados a 40 °C de temperatura. ... 64
Tabela 5.8: Composição de tocoferóis e tocotrienóis em óleo de semente de maracujá, obtido em diferentes condições de SFE e por Soxhlet com hexano como solvente. ... 65 Tabela 5.9: Tabela comparativa de tocoferóis e tocotrienóis totais, e atividade sequestrante do radical DPPH. ... 68
Tabela 5.10: Parâmetros necessários para ajustar o modelo de Sovová (1994) aos dados de SFE de óleo de semente de maracujá. ... 71
Tabela 5.10: Parâmetros ajustados através do modelo de Sovová (1994) para cinéticas de SFE de óleo de semente de maracujá a 40 °C e 16 MPa. ... 72
Tabela 5.11: Parâmetros ajustados através do modelo de Sovová (1994) para cinéticas de SFE de óleo de semente de maracujá a 40 °C e 26 MPa. ... 74
Tabela 9.1: Dados experimentais de cinéticas de SFE de óleo de semente de maracujá, realizadas a 16 MPa e 50 °C, sem aplicação de ultrassom, para determinação do tempo estático. ... 87
Tabela 9.2: Dados experimentais de cinéticas de SFE de óleo de semente de maracujá, realizadas a 50 °C e 26 MPa, sem aplicação de ultrassom, para determinação do tempo de extração. ... 88
Tabela 9.4: Dados experimentais de cinéticas de SFE de óleo de semente de maracujá para modelagem. Ensaios realizados a 26 MPa e 40 °C, nas potências de ultrassom indicadas. ... 90
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
SFE Supercritical Fluid Extraction - Extração com Fluido Supercrítico
TE Trolox Equivalente
r Coeficiente de correlação de Pearson
CER Constant extraction rate - Período de taxa de extração constante
FER Falling extraction rate - Período de taxa de extração decrescente
DC Diffusion controlled - Período difusional
EAG Equivalente em Ácido Gálico
FESEM Field emission scanning electron microscopy -
Microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão de campo AS-DPPH Atividade sequestrante do radical DPPH
P Pressão
U Potência de ultrassom
T Temperatura
US Ultrassom
LISTA DE SÍMBOLOS
X0 Rendimento global de extração (M/M)
Componente axial da velocidade do solvente (L/T) Concentração de soluto na fase fluida (M/M) ( ) Fluxo de transferência de massa interfacial (T-1)
Porosidade do leito
Concentração de soluto na fase sólida (M/M)
T Tempo (T)
Coeficiente de transferência de massa na fase fluida (T-1) Concentração de equilíbrio (M/M)
Coeficiente de transferência de massa na fase sólida (T-1) Massa de extrato (M)
Comprimento total do leito (L)
Vazão de solvente (M/T)
Parâmetro do modelo de Sovová (1994) Parâmetro do modelo de Sovová (1994)
Tempo da etapa CER (T)
Tempo da etapa FER (T)
Parâmetro do modelo de Sovová (1994) Concentração de soluto de fácil acesso (M/M) Massa de material não extraível (M)
̅ Diâmetro médio das partículas (L)
ρr Densidade real (M/L3)
ρa Densidade aparente (M/L3)
S Massa de solvente utilizada no processo de extração (M) F Massa de sementes de maracujá alimentada no extrator (M)
ρs Densidade do solvente (M/L3)
D Diámetro do leito de extração (L)
Mexp Massa de extrato experimental (M)
1. INTRODUÇÃO.
O maracujá é importante industrialmente devido a sua polpa e suco (Liu et al., 2008). Contudo, a indústria de processamento de maracujá gera grandes quantidades de resíduos (casca e sementes com arilo). Assim, é de interesse tanto econômico como científico e ecológico estudar o aproveitamento destes resíduos (Ferrari, Colussi e Ayub, 2004). As sementes de maracujá, atualmente, são usadas na produção de óleo destinado tanto à indústria cosmética como à de alimentos (Liu et al., 2008).
Os óleos vegetais na indústria são extraídos por prensagem a frio ou por extração com solvente orgânico. A extração por prensagem a frio é usada quando o conteúdo de óleo na matéria-prima supera 20% e há demanda de uma grande quantidade de energia. Quando o conteúdo de óleo não supera este valor, a extração com solvente orgânico se torna vantajosa, sendo a extração com hexano a mais usada, devido ao baixo ponto de ebulição desse solvente. No entanto, esta tecnologia de extração demanda grande quantidade de energia para o processo de evaporação do solvente que, além disso, é caro e inflamável (Ramalho e Suarez, 2013).
O alto consumo de energia e/ou o uso de solventes tóxicos são deficiências nas tecnologias de extração tradicionais que têm forçado as indústrias químicas e de alimentos a investigar novas técnicas de separação ―verdes‖, que usem menor quantidade de solventes e energia. Como exemplos, temos a extração com micro-ondas, com fluidos supercríticos, com ultrassom, ultrafiltração, destilação flash, a redução controlada de pressão em processos e a extração com água subcrítica. Processos de separação em condições extremas
ou não clássicas são, atualmente, objeto de pesquisas aplicadas que se encontram em constante evolução (Chemat, Zill-e-Huma e Khan, 2011).
O método de extração com fluido supercrítico (SFE – Supercritical Fluid
Extraction) apresenta vantagens sobre as técnicas tradicionais porque permite empregar
solventes de baixo impacto ambiental. A extração com dióxido de carbono (CO2) supercrítico é particularmente vantajosa, devido à temperatura e à pressão críticas relativamente baixas desse solvente, que o tornam ideal para a extração de compostos termicamente sensíveis. Após a extração o solvente pode ser totalmente separado por descompressão, sendo que o CO2 usado pode reciclado por compressão (Sahena et al., 2009).
Contudo, a SFE apresenta a desvantagem de não permitir agitação, que poderia aumentar os coeficientes de transferência de massa, tornando o método ainda mais atraente. Uma forma de superar esta deficiência é realizar a SFE assistida por ultrassom. As ondas de ultrassom produzem agitação dentro do leito de extração, contribuindo para o aumento dos coeficientes de transferência de massa, e também têm um efeito de cavitação que ajuda a romper as estruturas celulares de vegetais, facilitando o acesso do solvente aos compostos de interesse uque- arc a e Luque de Castro, 2003). Portanto, a aplicação de ultrassom na SFE pode reduzir o tempo e incrementar o rendimento de extração, diminuindo assim os custos de produção dos extratos (Vilkhu et al., 2008).
2. OBJETIVOS
O objetivo geral deste trabalho foi extrair óleo de semente de maracujá usando CO2 supercrítico assistido por ultrassom. A fim de atingir o objetivo geral, os seguintes objetivos específicos foram definidos:
o Caracterizar física e quimicamente a matéria-prima;
o Obter extratos de sementes de maracujá por Soxhlet, usando hexano como solvente, e por SFE assistida por ultrassom em diferentes condições de pressão, temperatura e potência de ultrassom;
o Calcular o rendimento global (X0) para cada condição experimental de extração aplicada;
o Avaliar a atividade sequestrante do radical DPPH dos extratos;
o Avaliar o efeito de pressão, temperatura e potência de ultrassom no rendimento global e na atividade sequestrante do radical DPPH dos extratos obtidos por SFE assistida por ultrassom;
o Realizar cinéticas de extrações SFE em condições de pressão e potência de ultrassom escolhidas após avaliação dos extratos;
o Construir curvas de extração para avaliação dos efeitos das diversas condições aplicadas nas cinéticas de SFE;
o Caracterizar quimicamente os extratos obtidos por SFE e Soxhlet, através da determinação do perfil de ácidos graxos, identificação e quantificação de tocoferóis e tocotrienóis, e determinação de atividade sequestrante do radical DPPH;
o Avaliar o efeito do ultrassom na estrutura das sementes de maracujá, por microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão de campo (FESEM).
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.
3.1 MARACUJÁ (Passiflora edulis sp.)
―Maracujá‖ é o nome popular que recebem as espécies do gênero Passiflora. Cerca de 90% das 400 espécies deste gênero são originárias de regiões tropicais e subtropicais do planeta, sendo o maior foco de distribuição geográfica o centro-norte do Brasil, onde se encontram pelo menos 79 espécies. O maracujá azedo ou amarelo (Passiflora edulis
flavicarpa) é o mais cultivado e comercializado no Brasil devido à qualidade de seus frutos
(Zeraik et al., 2010).
O Brasil é o maior produtor mundial de maracujá e o maior exportador de suco concentrado (FAO, 2011). A maior importância econômica do fruto está no produto industrializado na forma de suco concentrado (Meletti, 2011). O maracujá in natura é composto por casca (50,3%), suco (23,2%) e sementes (26,2%). As sementes contêm um teor de óleo de 25,7% segundo Ferrari, Colussi e Ayub (2004), sendo o principal ácido graxo presente o linoleico (68,79%). Existem na literatura estudos que reportam presença de compostos fenólicos com atividade antioxidante tanto na polpa, sementes e casca (Contreras-Calderón et al., 2011; Vasco, Ruales e Kamal-Eldin, 2008), como nas folhas (Moraes, Vilegas e Lanças, 1997; Silva, da et al., 2013). Logo, os subprodutos da indústria do maracujá podem ser considerados importantes fontes de ácidos graxos poli-insaturados e compostos fenólicos com atividade antioxidante.
3.2 POLIFENÓIS E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE EM MARACUJÁ
Os polifenóis são metabólitos secundários das plantas que compreendem uma grande variedade de moléculas contendo vários grupos hidroxila em pelo menos um anel aromático. Existe uma variedade diversa de compostos fenólicos, classificados em dois grupos, flavonoides e não flavonoides, e que se apresentam amplamente distribuídos entre as distintas partes das plantas. Porém, sua maior concentração está nas frutas, hortaliças e em seus derivados industrializados (Naczk e Shahidi, 2006).
Os frutos do maracujá contêm, além dos nutrientes essenciais e de micronutrientes como minerais, fibras e vitaminas, diversos compostos secundários de natureza fenólica, denominados polifenóis (Kuskoski et al., 2006). Diferentes efeitos protetores da saúde, como efeitos antioxidantes, anticâncer, vasodilatador, anti-inflamatório, entre outros, é atribuído aos polifenóis e a outros compostos antioxidantes (carotenoides, vitaminas C e E) (John e Shahidi, 2010). O conhecimento crescente do impacto de promoção da saúde dos antioxidantes naturais na dieta, combinado com os efeitos perigosos de um grande número de conservantes sintéticos, tem direcionado o interesse dos pesquisadores ao campo dos antioxidantes naturais (Oliveira et al., 2009).
Oliveira et al. (2009) determinaram o conteúdo de polifenóis totais para os subprodutos do suco de maracujá, trabalhando com semente, casca e polpa juntos, empregando o método de Folin-Ciocalteu e obtiveram 41 ± 4 mg de ácido gálico por grama de extrato seco. Lourith e Kanlayavattanakul (2013) avaliaram o conteúdo de polifenóis em
aquosa, uma de n-hexano e uma de acetato de etila. Aplicaram o método de Folin-Ciocalteu a cada fração, sendo que a fração de n-hexano não apresentou polifenóis, a fração aquosa apresentou 27,0 ± 0,0 mg EAG/g de fração e a fração de acetato de etila apresentou 580 ± 10 mg EAG/g de fração, evidenciando o conteúdo de polifenóis na semente do maracujá. Portanto, estes resultados tornam de interesse realizar a determinação de polifenóis no óleo de semente de maracujá pelo método descrito nas seções seguintes do presente trabalho.
3.3 TOCOFERÓIS E TOCOTRIENÓIS
A vitamina E natural compreende oito moléculas diferentes: α-, β-, γ-, e δ-tocoferol; e α-, β-, γ-, e δ-tocotrienol. De forma geral, estas moléculas são chamadas de tococromanóis porque contêm um grupo cromanol polar com uma longa cadeia isoprenoide. A natureza da cadeia isoprenoide diferencia os tocoferóis (que contêm uma cadeia isoprenoide saturada) dos tocotrienóis (que contêm cadeia isoprenoide insaturada). Os isômeros α-, β-, γ-, e δ-, são determinados pelo número e posição dos substitutos metílicos no grupo cromanol (Schwartz et al. 2008). Estas estruturas encontram-se ilustradas na Figura 3.1.
Figura 3.1: Estrutura geral de tocoferóis e tocotrienóis.
Resultados de estudos em humanos sugerem que tocotrienóis têm efeitos biológicos e sobre a saúde, tais como redução do colesterol sanguíneo, atividade anticâncer e supressora de tumores, e propriedades antioxidantes. Os tocotrienóis têm maior mobilidade através das membranas celulares e maiores taxas de colisão com radicais livres, segundo resultados de estudos in vitro, que poderiam explicar a alta atividade biológica destes (Drotleff et al. 2014).
Os tocoferóis são comumente encontrados em altas concentrações em óleos vegetais, gordura animal, vegetais, e frutas, enquanto os tocotrienóis são menos abundantes e encontrados em quantidades apreciáveis em alguns óleos específicos como o óleo de palma e de farelo de arroz (Schwartz et al., 2008).
Cromanol Cromanol Isoprenoide saturado Isoprenoide insaturado Tocoferol Tocotrienol
3.4 EXTRAÇÃO DE ÓLEO DA SEMENTE DE MARACUJÁ
O potencial do maracujá como uma fonte de ácidos graxos poli-insaturados essenciais na dieta humana tem recebido pouca atenção porque as sementes do maracujá, que contêm a maior parte dos ácidos graxos poli-insaturados na fruta, usualmente são descartadas logo após a extração do suco. Porém, estudos feitos nas sementes de maracujá sugerem que elas podem representar uma nobre fonte de óleo comestível de grau premium com variados níveis de ácidos graxos insaturados (Nyanzi, Carstensen e Schwack, 2005).
Ferreira et al. (2011) estudaram o perfil de ácidos graxos do óleo da semente do maracujá por cromatografia gasosa para o óleo extraído por prensagem a frio e Soxhlet com éter de petróleo como solvente. O óleo obtido resultou de alto teor de ácido linoleico (C18:2), e contendo também grandes quantidades de ácido palmítico (C16:0) e ácido oleico (C18:1). As porcentagens dos ácidos graxos mencionados são apresentadas na Tabela 3.1.
Tabela 3.1: Perfil de ácidos graxos do óleo de semente de maracujá, expressado em porcentagem dos ácidos graxos majoritários.
Ácido graxo Compressão a frio Soxhlet
Palmítico (C16:0) 14,1 12,8
Oleico (C18:1) 13,2 10,7
Linoleico (C18:2) 72,6 72,6
Fonte: Ferreira et al. (2011)
Liu, et al (2009) otimizaram o processo de SFE de óleo da semente de maracujá, usando CO2 como solvente, por meio da metodologia de superfície de resposta, obtendo assim as variáveis de processo (pressão, temperatura e tempo) que maximizam o rendimento da extração (25,8 %± 0,2% sobre a semente seca, para condições de 55 °C e 26 MPa). O rendimento foi estatisticamente igual ao apresentado para extração Soxhlet (23% ± 2%, usando éter de petróleo como solvente) a partir da mesma matéria-prima (Liu et al.,
3.5 EXTRAÇÃO COM CO2 SUPERCRÍTICO (SFE)
Fluidos supercríticos têm sido usados em processos industriais como substitutos de solventes orgânicos. Quando água, dióxido de carbono (CO2) e/ou etanol são usados como solventes supercríticos, o impacto ambiental resulta menor que quando as extrações são realizadas com solventes geralmente usados como hexano ou metanol no caso de extração de compostos bioativos. Além disso, estes solventes não são tóxicos. O uso de CO2 como solvente possibilita uma fácil separação do extrato e permite o uso de temperaturas amenas. Aliás, a extração com fluidos supercríticos possibilita a obtenção de produtos de alta pureza, com consequente aumento de valor agregado (Oliveira, Silvestre e Silva, 2011).
O CO2 é o solvente mais usado em SFE porque não é tóxico, não é inflamável, é barato, facilmente separado após a extração e dotado de uma grande capacidade de solvatação de moléculas apolares. Em um procedimento típico de SFE, o fluido supercrítico penetra continuamente na matriz sólida, onde solubiliza os materiais de interesse, com tempo, temperatura e pressão controlados (Sahena et al., 2009).
A técnica SFE apresenta grandes vantagens, como: i) baixa viscosidade e alta difusividade do fluido supercrítico, permitindo-lhe penetrar nos poros dos materiais sólidos com mais eficiência que solventes líquidos, o que pode tornar mais eficaz a transferência de massa, resultando em extrações mais rápidas; ii) a solubilidade do extrato no fluido pode aumentar por meio de modificação de pressão e temperatura, tornando o método de extração mais seletivo; iii) os solutos dissolvidos em CO supercrítico podem ser
processos em grande escala, o solvente, geralmente o CO2, pode ser reciclado ou reutilizado (Brunner, 1994).
Os inconvenientes da SFE são a necessidade de equipamentos mais caros e a dificuldade da extração de moléculas polares sem a adição de modificadores ao CO2 (Chemat, Zill-e-Huma e Khan, 2011).
3.6 ULTRASSOM
O ultrassom é empregado com sucesso na obtenção de extratos vegetais e é conhecido por ter efeito significativo sobre a velocidade de vários processos na indústria química e de alimentos. Muita atenção tem sido dada à aplicação de ultrassom para a extração de produtos naturais que geralmente precisam de horas ou dias de processo com métodos convencionais. Usando o ultrassom, a extração completa pode ser concluída em minutos com alta reprodutibilidade, reduzindo o consumo de solvente e consumindo apenas uma fração da energia necessária para um método de extração convencional como a extração Soxhlet, maceração ou destilação. Várias classes de componentes alimentares, tais como fragrâncias, pigmentos, antioxidantes, e outros compostos orgânicos e minerais têm sido extraídos e analisados eficientemente em uma variedade de matrizes (principalmente tecidos animais, alimentos e materiais vegetais). O uso de ultrassom representa uma forma potencialmente eficiente de melhorar os processos de transferência de massa. No caso da SFE, essa é provavelmente a única maneira prática de gerar vibração e melhorar assim os coeficientes de transferência de massa uque- arc a e Luque de Castro, 2003).
Quando as ondas de ultrassom atravessam um meio elástico, um deslocamento longitudinal das partículas é induzido. De fato, a fonte de ultrassom atua como um pistão na
superfície do meio. Isto resulta em uma sucessão de fases de compressão e rarefação no meio atravessado, criando assim bolhas de cavitação, que crescem durante a fase de rarefação e decrescem na fase de compressão. Quando o tamanho das bolhas atinge um ponto crítico, elas colapsam durante a compressão e liberam grandes quantidades de energia que resulta em um incremento pontual de pressão e temperatura. Quando as bolhas colapsam sobre a superfície do material sólido, a alta pressão e temperatura liberadas geram microjatos dirigidos à parede do sólido. A alta pressão e temperatura envolvidas no processo destroem as paredes celulares do vegetal e o conteúdo é liberado ao meio (Chemat, Zill-e-Huma e Khan, 2011).
Microfraturas e alteração das paredes celulares em soja (Haizhou, Pordesimo e Weiss, 2004) e sementes de cominho (Chemat et al., 2004) forneceram mais evidencias dos efeitos mecânicos do ultrassom, facilitando a liberação de seus conteúdos, em contraste com a maceração ou extração convencional.
3.7 EXTRAÇÃO COM CO2 SUPERCRÍTICO ASSISTIDA POR ULTRASSOM
A extração com CO2 supercrítico assistida com ultrassom tem sido estudada por poucos pesquisadores, em diversas matérias-primas, e seus aspectos mais relevantes encontram-se descritos a seguir.
Riera et al. (2004) examinaram o efeito do ultrassom em cinéticas de SFE de óleo de amêndoa. Como consequência dos ensaios, no final do tempo de extração o rendimento
comparáveis com aqueles obtidos por SFE puderam ser atingidos em tempo 30% menor que sem o uso de ultrassom.
Balachandran et al. (2006) também estudaram o efeito do ultrassom aplicado a processos de SFE. Os autores trabalharam com extração de compostos pungentes de gengibre. Ondas de ultrassom com frequência de 20 Hz foram aplicadas, por tempo de 6 h. Os melhores rendimentos de extração foram atingidos quando 300 W de potência de ultrassom foram aplicados ao sistema em condições de 40 °C e 16 MPa (0,13 kg/m3). A melhora do rendimento foi de até 30% (em comparação a 0,1 kg/m3 obtido sem aplicação de ultrassom nas mesmas condições de pressão e temperatura). Através de análises de imagens, reportaram também o efeito de cavitação sofrido pelas partículas no leito de extração quando o ultrassom foi aplicado.
Hu et al. (2007) estudaram o processo SFE assistido por ultrassom para extração de óleo de Coix lachrymal-jobi L. var. Adlay, trabalhando com frequência de ultrassom de 20 Hz, potência de 110 W com aplicação por 3,5 h, obtendo os melhores rendimentos de extração nas condições de 40 °C e 20 MPa (9,15 ± 0,09%), conseguindo assim melhorar o rendimento de extração em 14% (comparado com o 8.± 1% obtido sem aplicação de ultrassom).
Gao et al. (2009) estudaram a extração de ésteres de luteína de marigold (Tagetes
erecta L.) com CO2 supercrítico assistido com ultrassom, de 25 Hz de frequência, sendo 3 h de aplicação de ondas ultrassônicas. Obtiveram rendimento de 568 ± 5 mg de ésteres de luteína / 100 g quando trabalharam a 55 °C e 25 MPa quando potência de 400 W foi aplicada, representando um aumento de rendimento de 59% em relação aos 357 ± 9 mg de ésteres de luteína / 100 g obtidos nas mesmas condições, sem aplicação de ultrassom.
A extração com CO2 supercrítico assistida por ultrassom também foi estudada por Pasquel-Reátegui et al. (2014), que avaliaram a extração de compostos antioxidantes de bagaço de amora (Rubus sp.). O rendimento global máximo sem aplicação de ultrassom foi atingido em condições de 50 °C e 25 MPa (8,6 ± 0,2%). Quando 400 W de ultrassom foram aplicados na mesma condição de pressão e temperatura, o rendimento registrado foi 14% superior (9,9 ± 0,4%). O incremento observado no rendimento global foi respaldado pela análise das imagens obtidas por FESEM, onde as imagens do bagaço submetido à SFE com ultrassom apresentam irregularidades e partículas depositadas sobre as superfícies. Os autores concluíram que a deposição de fragmentos sobre as superfícies se deve à remoção das partes internas da parede celular, em consequência da aplicação do ultrassom.
Santos et al. (2015) estudaram a influência da aplicação do ultrassom em ensaios de SFE de pimenta malagueta, avaliando o efeito da potência e do tempo de aplicação de ultrassom. O rendimento de extração de oleorresina foi até 28% superior quando a extração SFE foi assistida por ultrassom, passando de 5,70 ± 0,05% sem aplicação de ultrassom para 7,3 ± 0,2% quando ondas de ultrassom de 360 W foram aplicadas, mantendo constantes as condições de pressão e temperatura (15 MPa e 40 °C), com tempo de aplicação de ondas ultrassônicas de 60 min. A avaliação das imagens obtidas por FESEM do material submetido à SFE mostrou ruptura do pericarpo da matriz vegetal, devido à aplicação de ondas ultrassônicas, o que explica o incremento do rendimento.
Segundo Sovová (1994), a cinética de extração global pode ser dividida em três etapas, sendo: i) período de taxa de extração constante; ii) período de taxa de extração decrescente e iii) período difusional. Estas etapas encontram-se ilustradas na Figura 3.2.
Figura 3.2: Curva de SFE com suas etapas: Taxa de extração constante (CER); taxa de extração decrescente (FER); período difusional (DC). Adaptado de Brunner (1994).
i) Período de taxa de extração constante (CER – constant extraction rate): é caracterizado pela extração do soluto de fácil acesso, que recobre a superfície externa das partículas ou daquele liberado pelo rompimento das paredes celulares no pré-tratamento (moagem, por exemplo). O mecanismo predominante de transferência de massa é a convecção;
ii) Período de taxa de extração decrescente (FER – falling extraction rate): Esta etapa tem inicio quando a quantidade de soluto presente nas superfícies não é
Etapa CER
suficiente para manter a taxa de extração constante. Tanto a convecção como a difusão são importantes nesta etapa;
iii) Período difusional (DC – diffusion controlled): o soluto de fácil acesso ou o que recobria a superfície das partículas foi esgotado. Assim, o processo de extração é controlado pela difusão do solvente para o interior das partículas e da difusão do conjunto soluto-solvente para a superfície das mesmas.
3.9 MODELOS CINÉTICOS DE CURVAS DE EXTRAÇÃO
A partir das curvas experimentais de extração, utiliza-se a modelagem matemática para compreender principalmente os fenômenos que controlam o processo de SFE. Além disso, a modelagem também é usada para estimar os parâmetros do processo para o projeto e o dimensionamento dos equipamentos e predição da viabilidade econômica do processo em escala industrial. Segundo Brunner (1994), o processo de extração pode ser modelado de uma maneira simples, considerando apenas os parâmetros de extração e o ajuste dos dados experimentais ao modelo para obter os coeficientes desconhecidos. Porém, sabe-se que tal modelo não irá representar totalmente a cinética de extração. Portanto, é necessária uma abordagem mais complexa para compreender os mecanismos envolvidos no processo de extração. Diversos modelos de SFE são propostos na literatura. Alguns são baseados no formato das curvas experimentais de extração e outros advêm do balanço de massa do processo. O presente trabalho utilizou o modelo de Sovová (1994) na modelagem
3.9.1 MODELO DE SOVOVÁ (1994)
O modelo de Sovová (1994) considera tanto a transferência de massa na fase fluida como na fase sólida, através dos respectivos coeficientes de transferência de massa. O modelo é baseado na extração de uma matriz sólida que pode ser um material moído, em forma de um leito de extração cilíndrico, onde o escoamento do solvente é axial. Considera-se que na entrada do extrator o solvente é livre de soluto, e o sistema opera de forma isotérmica e isobárica. Considera-se também que o tamanho e distribuição das partículas no leito são homogêneos no início da extração. Os balanços de massa para as fases fluída e sólida são dados pela Equação 1 e pela Equação 2, respectivamente.
( ) Equação 1 ( ) Equação 2
onde: : Componente axial da velocidade do solvente; : Concentração de soluto na dase fluida; : direção axial; ( ): Fluxo de transferência de massa interfacial; : Porosidade do leito; : Concentração na fase sólida; : Tempo; :Densidade real do leito de partículas; : Densidade do solvente.
Os termos de transferência interfacial são dados pela Equação 3 e Equação 4.
( ) ( ) Para Equação 3
onde: : Coeficiente de transferência de massa na fase fluida; : Coeficiente de transferência de massa na fase sólida; : Concentração de soluto no interior da partícula; Y*: Solubilidade do soluto na fase fluida.
Sovová (1994) propôs, em seu modelo, que a transferência de massa interfacial depende da disponibilidade do soluto de fácil acesso ao solvente. Uma hipótese usada pela autora é que parte do soluto está diretamente exposto ao solvente devido à etapa de pré-processamento da amostra, que ocasiona o rompimento das paredes celulares pelo processo de moagem. Desta forma, uma fração do soluto estaria cobrindo a superfície das partículas e outra fração estaria no interior das células intactas. Logo, o processo de SFE pode ser dividido segundo as etapas explicadas na Seção 3.8. Baseada nestas informações, a autora solucionou analiticamente as equações de balanço de massa para as fases sólida e fluida, podendo representar as cinéticas de extração global pelas seguintes equações:
( ) [ ( )] Para Equação 5 ( ) [ ( )] Para Equação 6 ( ) { [ [ ( ) ] [ ( )] ]} Para Equação 7 Onde
( ) Equação 9 { [ ] } Equação 10 Equação 11 * ( ) + Equação 12
onde: : Massa de extrato; : Direção axial; : Comprimento total do leito; : Tempo; : Vazão de solvente; : Concentração de equilíbrio; : Parâmetro do modelo de Sovová (1994); : Período de taxa de extração constante; : Parâmetro do modelo de Sovová (1994); : Período de taxa de extração decrescente; Massa do material não extraível; Rendimento global; : Concentração de soluto de fácil acesso; : Coeficiente de transferência de massa na fase fluida; : Concentração de soluto no interior da partícula.
4. MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi realizado no Laboratório de Alta Pressão em Engenharia de Alimentos (LAPEA-DEA-FEA-UNICAMP), exceto algumas análises que foram realizadas em outras dependências. As etapas da metodologia escolhida – i) Pré-tratamento e caracterização da matéria-prima; ii) Extração; iii) Análise dos extratos - encontram-se detalhadas na sequência, a fim de relatar o processo de transformação das matérias-primas em óleo e a sua posterior avaliação.
A Figura 4.1 ilustra as atividades desenvolvidas ao longo do trabalho. Matéria-Prima Pré-tratamento da matéria-prima Caracterização da matéria-prima Extrações (Soxhlet, SFE + US)
Extrações de Xo nas condições escolhidas Determinação de X0, AS-DPPH e fenólicos Determinação de AS-DPPH, Perfil de ácidos graxos e tocoferóis e tocotrienóis FESEM da matriz vegetal Cinéticas de extração Modelagem matemática Escolha de condições de Xo de interesse
4.1 MATÉRIA-PRIMA
Subprodutos da produção de polpa de maracujá da espécie Passiflora edulis sp., fornecidos pela fábrica de polpa de frutas ―Sítio do Belo‖, localizada em Paraibuna – SP, foram usados como matéria-prima. Este resíduo consiste em sementes de maracujá misturadas com restos de polpa, separadas diretamente da linha de produção de polpa de maracujá, que processa frutas procedentes da região do Vale do Paraíba – SP. Após a recepção, foi realizado o pré-tratamento da matéria-prima descrito na Seção 4.2.
4.2 PRÉ-TRATAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DA MATÉRIA-PRIMA
A matéria-prima recebida foi uma mistura de sementes com fibra da polpa. Com o intuito de visar ao desenvolvimento de um processo viável industrialmente, decidiu-se aproveitar o resíduo na íntegra, sem realizar separação de semente e fibras da polpa, já que a separação das fibras exigiria um consumo alto de água no processo.
O resíduo foi seco em estufa de circulação forçada (Fanem, modelo 320 SE, São Paulo) a 50 °C por 24 h. O produto seco foi triturado em liquidificador de 600 W (Philips, modelo R12008/81, Brasil) para reduzir o tamanho das partículas e incrementar a superfície de contato com o solvente de extração. A Figura 4.2 ilustra o aspecto da matéria-prima ao longo deste processo.
Figura 4.2: Etapas de pré-tratamento da matéria-prima.
O material seco e triturado (chamado de ―semente de maracujá‖ ao longo deste trabalho) foi estocado em frascos de vidro herméticos, em porções de 300 g, na ausência de luz e em temperatura próxima de -18 °C, até o momento de uso.
4.3 ANÁLISES DE COMPOSIÇÃO CENTESIMAL
Nesta seção são descritas as análises de composição centesimal realizadas com o objetivo de caracterizar a matéria-prima. Todas as análises foram realizadas em triplicata. O teor de umidade foi determinado tanto para o bagaço de maracujá in natura como para a semente de maracujá produzida depois da secagem e moagem. As outras análises foram realizadas apenas sobre a semente de maracujá seca e moída.
4.3.1 TEOR DE UMIDADE
O método utilizado para determinação da umidade foi o de secagem em estufa (105 ± 2 °C) (AOAC, 1997), baseado na remoção da água por aquecimento. As amostras foram
Matéria-Prima Matéria-Prima seca Semente de maracujá
seca e moída Secagem
em dessecador, tendo sua massa novamente determinada. Logo após, as placas retornaram à estufa e este procedimento foi repetido até a obtenção de massa constante. Foi calculada, então, a porcentagem de umidade.
4.3.2 CONTEÚDO DE LIPÍDIOS TOTAIS
A determinação de lipídios totais foi realizada usando o método de extração da fração etérea por fluxo intermitente utilizando éter de petróleo (laboratório Synth, São Paulo, Brasil) como solvente sob refluxo em aparelho Soxhlet (AOAC, 1997; método 963.15). Após a extração o solvente foi removido sob vácuo utilizando evaporador rotativo (Marconi, modelo MA 120/E, Campinas, Brasil).
4.3.3 CONTEÚDO DE PROTEÍNAS
A determinação de proteínas foi realizada pelo método de semi micro-Kjeldahl, no qual se avaliou o teor de nitrogênio total de origem orgânica, utilizando-se 0,3 g de amostra em tubo para digestão. O procedimento baseou-se na digestão da amostra com ácido sulfúrico (Synth, São Paulo, Brasil) e mistura catalisadora contendo sulfato de cobre e sulfato de potássio (Synth, São Paulo, Brasil) para acelerar a reação. Assim, todo o carbono e hidrogênio foram oxidados a CO2 e água. O nitrogênio da proteína foi reduzido e transformado em sulfato de amônio. Destilou-se a amostra digerida em meio básico por adição de hidróxido de sódio 40%, para a liberação da amônia. A amônia foi recolhida em solução de ácido bórico (Synth, São Paulo, Brasil), formando borato de amônio. O borato de amônio formado foi quantificado por titulação com ácido clorídrico padronizado com carbonato de sódio (Synth, São Paulo, Brasil). Usou-se fator de 6,25 para conversão de nitrogênio em proteína (AOAC, 1997; método 970.22).
4.3.4 RESÍDUO MINERAL FIXO (CINZAS)
O método usado para a determinação do teor de cinzas foi o da incineração em mufla, no qual toda a matéria orgânica foi queimada. A amostra foi colocada em um cadinho de porcelana, com massa previamente estabelecida e permaneceu na mufla a 550 ± 5 °C até total queima da matéria orgânica. A diferença entre a massa da amostra mais cadinho e a massa do cadinho forneceu a massa das cinzas da amostra.
4.3.5 CARBOIDRATOS TOTAIS
O conteúdo de carboidratos foi determinado por diferença: calculou-se a média da porcentagem de água, proteínas, lipídeos e cinzas e o restante foi considerado carboidrato.
4.3.6 CARACTERIZAÇÃO DAS PARTÍCULAS E DO LEITO DE EXTRAÇÃO
Com o intuito de obter parâmetros necessários para o estudo da cinética de SFE, foi realizada a caracterização das partículas obtidas com o pré-tratamento, que foram usadas na composição do leito de extração. Esta caracterização inclui as seguintes determinações: i) diâmetro médio das partículas do leito; ii) densidade real da partícula; iii) densidade aparente do leito; e iv) porosidade do leito.
i) Diâmetro médio das partículas do leito:
Realizou-se a análise de distribuição de tamanho das partículas do leito usando um conjunto de peneiras padronizadas da série Tyler (a Bronzinox, Taylor N° 14; 20; 18 e 35, São Paulo, Brasil). Para isso, foi montada uma torre de peneiras com diâmetros de abertura
A determinação do diâmetro médio das partículas foi realizada utilizando a Equação 13 (McCabe, Smith and Harriott, 1991).
̅ (∑ ∑ ∑
)
Equação 13
Onde: ̅: diâmetro médio das partículas do leito; : diâmetro de abertura da peneira i; : massa retida na peneira i.
ii) Densidade Real:
A densidade real (ρr) foi analisada por picnometria com gás hélio utilizando
densímetro (Micrometrics, modelo Multivolume Pycnometer 1305, Norcross, EUA). Esta análise foi realizada no Instituto de Química da UNICAMP.
iii) Densidade Aparente:
A densidade aparente (ρa) foi obtida pela divisão da massa de amostra utilizada para
empacotar o leito pelo volume do leito no extrator. iv) Porosidade do leito
Com os dados de densidade real da partícula e densidade aparente foi calculada a porosidade do leito (ε) pela Equação 14.
( ⁄ ) Equação 14
Todas as análises descritas nesta seção foram conduzidas em triplicata.
4.4 EXTRAÇÃO
Após o pré-tratamento da matéria-prima, as extrações com CO2 supercrítico sem ultrassom, assistidas por ultrassom e as extrações a baixa pressão foram realizadas.
4.4.1 EXTRAÇÕES COM CO2 SUPERCRÍTICO ASSISTIDAS POR ULTRASSOM
Usou-se uma unidade de SFE em escala de laboratório, montada no LAPEA. A Figura 4.3 mostra o fluxograma do equipamento.
Figura 4.3: Diagrama de fluxo do sistema de SFE assistido por ultrassom.
Onde: V-1, V-2, V-3, V-4 e V-5 – Válvulas de bloqueio; V-6 – Válvula micrométrica; C- Compressor; F - Filtro de ar comprimido; BR – Banho de refrigeração; B- Bomba (Booster); BA – Banho de aquecimento; I-1 e I-2 – Indicadores de pressão e temperatura, respectivamente; 1, IC-2 e IC-3 – Controladores de potência ultrassônica, temperatura da célula de extração e temperatura da válvula micrométrica, respectivamente; CE – Célula de extração (300 ml); S – Sonda ultrassônica.
A
Figura 4.4 ilustra a célula de extração em detalhe, com destaque para: i) sonda ultrassônica que foi usada nos ensaios; ii) entrada e saída de solvente; iii) espaço destinado
A sonda ultrassônica tem uma macroponta de titânio de 13 mm de diâmetro, que está ligada a um transdutor (Unique Group, modelo DES 500, Indaiatuba, SP, Brasil), que controla a potência de ultrassom. A potência pode ser ajustada de 20 a 99% da potência total de 800 W, com frequência de 20 Hz.
Figura 4.4: Esquema da coluna de extração assistida por ultrassom.
Dióxido de carbono com 99.9% de pureza (White Martins, Campinas, SP, Brasil) foi usado como solvente de extração. O processo de SFE foi conduzido conforme a descrição a seguir:
Em primeiro lugar, liga-se o banho de resfriamento (BR) (Marconi, modelo MA184, Piracicaba, SP, Brasil) para refrigerar o CO2 que ingressa na bomba (B) (Maximator, modelo M111-CO2, Nordhousen Alemanha) e o cabeçote da bomba, com o objetivo de assegurar o bombeamento de CO2 em estado liquido. Posteriormente, liga-se o banho de aquecimento (BA) (Marconi, modelo MA 126, Piracicaba, SP, Brasil), a fim de aquecer a célula de extração e o CO2, até atingir a condição de temperatura necessária para o processo. Posteriormente, o leito é montado dentro da célula de extração. Para isso, se
de lã de vidro que será a base do leito de extração. Em seguida se introduzem aproximadamente 5 g de sementes de maracujá, e por fim, uma camada de esferas de vidro para completar o volume do extrator. Uma vez montado o leito, a célula é acoplada à unidade de extração.
No início da extração, são abertas as válvulas que permitem a entrada do CO2 na célula de extração, que posteriormente é pressurizada até a pressão de trabalho correspondente. Uma vez atingidas a pressão e a temperatura desejadas para a extração, se mantêm estas condições constantes com a válvula de saída da célula de extração fechada por um tempo de 20 min. Esse período é chamado de tempo de extração estático, e é o tempo necessário para que todo o CO2 contido na célula de extração fique saturado com o extrato. O tempo estático foi determinado experimentalmente mediante ensaios prévios, conforme descrito na Seção 4.4.4.1. Transcorrido o tempo estático, se abre a válvula de saída da célula de extração, iniciando-se o tempo de extração dinâmico, mantendo uma vazão de solvente de 1,75x10-4 kg/s. A vazão é controlada pela válvula micrométrica que se encontra na saída da linha. Esta válvula possui um sistema de aquecimento elétrico monitorado por um termopar, com o objetivo de compensar o efeito Joule-Thompson da expansão. Na válvula micrométrica a mistura de solvente e soluto é despressurizada até pressão atmosférica, condição em que o CO2 passa ao estado gasoso, separando-se do óleo que se mantém em estado líquido e é coletado em frasco de penicilina de 100 ml. O solvente gasoso passa pelo fluxômetro, que permite monitorar a vazão do solvente no
Figura 4.5: Unidade de extração com CO2 supercrítico assistida por ultrassom.
Ensaios preliminares foram realizados com o intuito de determinar as condições de trabalho que seriam suportadas pela semente de maracujá, em relação à potência de ultrassom aplicada. Para tais ensaios as condições de extração usadas foram pressão de 16 MPa e temperatura de 50 °C, que são condições amenas de extração supercrítica de óleo de semente de maracujá (Liu, et al., 2009; Zahedi e Azarpour, 2011), variando a potência de ultrassom de 160 a 800 W, usando assim toda a amplitude de potência disponível no gerador de ondas ultrassônicas. A partir destes ensaios, concluiu-se que a semente de
maracujá não suportaria a aplicação de ultrassom no processo de SFE por mais de 40 min, em qualquer nível de potência, evidenciando-se uma obstrução da válvula micrométrica com finas partículas de semente de maracujá. Então, foi proposta como alternativa a aplicação do ultrassom apenas durante o tempo estático. Novos testes foram conduzidos considerando agora a nova forma de trabalho, mostrando que a matéria-prima suporta a aplicação de potências de 160 a 800 W no tempo estático.
Uma vez definida a forma de trabalho, procedeu-se à determinação do tempo de SFE, realizando extrações em uma boa condição de extração, considerando os parâmetros reportados por Liu et al. (2009) (pressão de 26 MPa e temperatura de 55 °C). Experimentos cinéticos foram realizados nessas condições, com base nas quais se escolheu 100 min como tempo de SFE para os experimentos posteriores. Assim definiu-se uma relação entre massa de solvente e massa de semente de maracujá (S/F) de aproximadamente 210 kg CO2/kg de semente de maracujá.
Uma vez definido o tempo de SFE, procedeu-se à avaliação da influência de temperatura, pressão e potência de ultrassom no rendimento global, composição de ácidos graxos, fenólicos totais e atividade sequestrante do radical DPPH dos extratos, segundo o planejamento experimental descrito nas Seções 4.4.5 e 4.4.6.
4.4.2 EXTRAÇÃO A BAIXA PRESSÃO
Figura 4.6: Ilustração do sistema de funcionamento do extrator Soxhlet.
Aproximadamente 5 g de semente de maracujá foram pesadas em cartucho de papel de filtro. Em seguida, o cartucho foi inserido em um extrator Soxhlet. A razão mássica entre solvente e semente de maracujá foi 1:30, e o tempo de extração foi de seis horas, sendo o solvente usado hexano (Synth, São Paulo, Brasil).
Após a extração, o hexano foi removido por em evaporador rotativo sob vácuo (Marconi, modelo MA 120/E, Campinas, Brasil), a temperatura de 40 °C, até remoção total do solvente.
4.4.3 DETERMINAÇÃO DO RENDIMENTO GLOBAL (X0)
Para cada ensaio de SFE, foi calculado o rendimento global de óleo obtido de acordo com a Equação 15, que relaciona a massa total de extrato (Mextrato), e a massa de amostra em base seca (F).
Equação 15
4.4.4 EXPERIMENTOS PRÉVIOS
4.4.4.1 Determinação do tempo estático
O tempo estático, como foi descrito na Seção 4.4.1, é o tempo necessário para saturar o CO2 com extrato antes do início da extração. Este tempo deve ser determinado experimentalmente, e neste trabalho foi determinado mediante ensaios cinéticos.
Experimentos cinéticos foram encaminhados variando o tempo estático usado, sendo testados os tempos de 10, 20 e 30 minutos. Para tais ensaios, usaram-se condições de pressão e temperatura de 16 MPa e 50 °C, respectivamente. Foi representado graficamente o rendimento global em função do tempo de extração, para cada tempo estático proposto. O tempo estático foi definido quando existiu sobreposição das cinéticas para diferentes tempos estáticos, devido a que essa condição assegura a condição de saturação do CO2 com o extrato.
4.4.4.2 Determinação do tempo de extração
O tempo de extração foi determinado através de experimentos cinéticos realizados nas condições de 26 MPa e 50 °C, mantendo sempre a vazão fixa de 1,75x10-4 kg/s. As condições de pressão e temperatura foram definidas com base no maior rendimento global atingido do trabalho de extração de óleo de semente de maracujá com CO2 supercrítico
A escolha do tempo de extração foi realizada levando em consideração a quantidade de CO2 consumido e a porcentagem de óleo extraído nessa condição. Foi selecionado o tempo em que se coletou 98% do óleo possível de extrair com CO2 supercrítico.
4.4.5 OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO DE EXTRAÇÃO
A metodologia de superfície de resposta foi usada para avaliar a influência dos parâmetros do processo de SFE. Temperatura (Z1), pressão (Z2) e potência de ultrassom (Z3) foram as variáveis independentes consideradas para otimizar o rendimento global de óleo (X0). Um planejamento experimental do tipo fatorial composto central foi usado para avaliar a influência dos parâmetros do processo e obter as superfícies de resposta. As variáveis independentes são transformadas em um intervalo entre -1 e +1, de acordo com a Equação 16.
Equação 16
Onde Xi é o valor codificado do parâmetro, Zi é o valor real, Zr é o valor real do parâmetro no ponto central, e ∆j é o passo entre níveis da variável Zi. A Tabela 4.1 apresenta os parâmetros codificados e seus valores reais usados no modelo.
Os níveis escolhidos para os parâmetros estão baseados em trabalhos realizados com maracujá (Liu et al., 2009), e em concordância com as limitações da unidade de SFE. Cada condição experimental foi realizada em duplicata, exceto no ponto central (0, 0, 0), onde se realizaram quatro ensaios. A ordem dos ensaios foi aleatória para minimizar o efeito de fatores que não podem ser controlados (Barros Neto, Scarminio e Bruns, 2010).
Tabela 4.1: Parâmetros codificados e sem codificar usados no planejamento experimental. Variáveis codificadas (Zi) Temperatura (Z1, °C) Pressão (Z2, MPa) Potência de ultrassom (Z3, W) +1.6 52 29 800 +1 50 26 640 0 45 21 400 -1 40 16 160 -1.6 38 13 0 ∆j 5 5 240
Os ensaios realizados estão enumerados na Tabela 4.2: Esquema dos ensaios realizados segundo o planejamento experimental.
Tabela 4.2: Esquema dos ensaios realizados segundo o planejamento experimental. N° Temperatura (X1) Pressão (X2) Potência de Ultrassom (X3)
1 -1 -1 -1 2 1 -1 -1 3 -1 1 -1 4 1 1 -1 5 -1 -1 1 6 1 -1 1 7 -1 1 1 8 1 1 1 9 -1.6 0 0 10 1.6 0 0 11 0 -1.6 0 12 0 1.6 0 13 0 0 -1.6 14 0 0 1.6 15 0 0 0 16 0 0 0
As respostas obtidas dos ensaios das extrações foram submetidas a análise de regressão polinomial de segunda ordem. A Equação 17 expressa o modelo estatístico a ser ajustado.
