Análises dos extratos

4.5.1 DETERMINAÇÃO DO PERFIL DE ÁCIDOS GRAXOS

A determinação da composição em ácidos graxos do óleo de maracujá foi realizada nos extratos descritos na Seção 4.4.6 por meio de esterificação da amostra seguida de cromatografia gasosa, segundo a metodologia oficial Ce 1f–96 da AOCS (2009). Para a preparação dos ésteres metílicos pesou-se 0,05 g de amostra. Logo após se adicionou 4 ml de solução de hidróxido de potássio em metanol (0,5 M), aquecendo em banho-maria com água em ebulição por 5 min. Em seguida se resfriou em banho de gelo e adicionou-se 5 ml de reagente de esterificação (preparado dissolvendo 20 g de NH4Cl em 600 ml de metanol P.A., acrescentando finalmente 60 ml de H2SO4 concentrado). A mistura foi aquecida em banho-maria de água em ebulição por 5 min e posteriormente resfriada em banho de gelo. Logo, foram adicionados 4 ml de solução aquosa saturada de NaCl, e por fim 5 ml de éter de petróleo P.A. Agitou-se vigorosamente a mistura durante 30 s e deixou-se repousar até que se separassem fases. Alíquotas de aproximadamente 1,5 ml da fase superior (fase orgânica) foram transferidas para vials com auxílio de pipeta Pasteur. Os vials foram

condições: Coluna capilar DB-23 (Agilent, 50% cyanopropyl-methylpolysiloxane, 0.25 µm × 60 m × 0.25 mm i.d., Santa Clara, CA, USA); hélio foi usado como fase móvel a uma vazão de 0,001 l/min; velocidade linear de 24 cm/s; temperatura de injeção de 250 °C; temperatura da coluna de 110 °C por 5 min, (110-215) °C (taxa de 5°C/min), 215 °C por 24 min; temperatura de detecção de 280 °C; e volume de injeção de 1,0 µl. Os ésteres metílicos dos ácidos graxos foram identificados por comparação com padrões externos adquiridos de Nu Check Prep (Elysian, MN, USA). Realizou-se a normalização interna por área para obter o perfil de ácidos graxos. Os reagentes e solventes usados nesta metodologia foram fornecidos pelo laboratório Synth, São Paulo, Brasil.

4.5.2 DETERMINAÇÃO DE TOCOFERÓIS E TOCOTRIENÓIS

A separação, identificação e quantificação de tocoferóis foram realizadas nos extratos obtidos na Seção 4.4.6 por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), também conhecida por High Performance Liquid Chromatography (HPLC), conforme o método oficial Ce 8-89 (Aocs, 2004). 0,10 g de óleo foram diluídos em volume de hexano (Synth, São Paulo, Brasil) para completar 10 ml. As injeções foram realizadas com um loop de 20 µl desta solução.

As determinações foram conduzidas utilizando o cromatógrafo Perkin-Elmer série 200, acoplado a um detector de fluorescência Perkin Elmer série 200a em condição isocrática à temperatura ambiente. As separações foram conduzidas utilizando coluna Hibar®, Cartridge n° 349710, sorbent lot n° F823888 (Merk KGaA Darmstadt, Germany), contendo LiChrosorb® Si 60 (5 µm). A fase móvel de grau cromatográfico foi composta por hexano:isopropanol (99:1, v:v) (Synth, São Paulo, Brasil). A detecção foi realizada por

fluorescência utilizando comprimento de onda de excitação igual a 290 nm e de emissão de 330 nm. A integração dos dados foi realizada através do Peak Simple Chromatography Software. A identificação foi baseada na comparação dos tempos de retenção com os de padrões validados sob as mesmas condições de operação. A quantificação foi realizada por padronização externa, tendo sido construída a curva analítica com 5 níveis de concentração. Cada ponto foi representado pela média de 5 determinações. As concentrações das frações α, β, γ, e δ de tocoferóis e tocotrienóis variaram na faixa de 1,4 a 10,8 µg/ml, 1,8 a 13,9 µg/ml, 2,2 a 17,5 µg/ml e 2,0 e 17,5 µg/ml, respectivamente. As análises foram realizadas para os extratos obtidos de cada réplica de extração e expressos em média ± desvio padrão.

4.5.3 POLIFENÓIS TOTAIS

Para determinar a quantidade de polifenóis totais em todos os extratos foi utilizado o método do reagente Folin-Ciocalteu para azeite de oliva, descrito por Hrncirik e Fritsche (2004) com modificações.

4.5.3.1 Extração de fenólicos do óleo.

Pesou-se 0,1 g de cada amostra em um eppendorf. Após a pesagem adicionou-se 0,2 ml de hexano (Synth, São Paulo, Brasil) 100% e 0,2 ml de solução de metanol (Synth, São Paulo, Brasil) em água destilada (60:40 v/v). Os eppendorfs foram agitados em vórtex (Fistom, modelo 774, São Paulo, Brasil) por 2 minutos, e posteriormente centrifugados a 3500 rpm por 10 minutos. Desprezou-se o sobrenadante e retiraram-se 80 µl do extrato

4.5.3.2 Construção de curva de calibração.

Preparou-se uma solução estoque em balão volumétrico de 100 mldissolvendo 0,5 g de ácido gálico (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil) em 10 mlde etanol (Synth, São Paulo, Brasil) e depois completando o volume com água destilada. Em seguida, foram preparadas as soluções de calibração para a construção da curva padrão em balões volumétricos de 10 ml, diluindo com água destilada frações da solução estoque para conseguir concentrações de ácido gálico iguais a 0,01; 0,015; 0,020; 0,030; 0,040; 0,050; 0,060; 0,070 e 0,075 mg/ml.

4.5.3.3 Determinação de fenólicos em amostras.

As reações foram conduzidas misturando 0,5 ml das diluições de calibração, das amostras e branco (água destilada) com 0,5 ml da solução do reagente Folin-Ciocalteu (Dinâmica, São Paulo, Brasil). Após 3 min se adicionaram 0,5 ml da solução de carbonato de sódio (Dinâmica, São Paulo, Brasil) e 3,5 ml de água destilada. Deixou-se reagir ao abrigo da luz, por um tempo de duas horas. Transcorrido esse tempo, a absorbância foi lida em espectrofotômetro UV-vis (Hach, modelo DR/4000U, Colorado, EEUU) usando comprimento de onda de 760 nm. O conteúdo de polifenóis totais nos extratos foi calculado em equivalentes de ácido gálico (EAG) por 100 g de óleo.

4.5.4 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

Existem diferentes metodologias empregadas para avaliar a atividade antioxidante

in vitro, que têm produzido resultados conflitantes e de difícil comparação. Variações na

capacidade sequestrante de radical peróxido (ORAC – capacidade de absorção de oxigênio); ii) Capacidade de redução de metais (FRAP – capacidade de redução de ferro; CUPRAC – capacidade antioxidante de redução de íon cúprico); iii) Capacidade sequestrante de radical hidroxila (método da desoxirribose); iv) Capacidade sequestrante de radical iônico (ABTS; DPPH). FRAP, ABTS, DPPH e ORAC são os métodos mais usados para determinar a capacidade antioxidante in vitro.

Neste trabalho, o método DPPH foi usado para avaliar a atividade antioxidante de todos os extratos.

4.5.4.1 Atividade sequestrante do reagente DPPH

A determinação de capacidade antioxidante in vitro foi realizada segundo a metodologia de DPPH (2,2-Diphenyl-1-picryl-hidrazil) descrita por Rufino et al. (2007), com modificações. Prepararam-se diluições do extrato em etanol (Synth, São Paulo, Brasil), com concentrações de 15 mg/ml. Posteriormente foi preparada uma solução de reagente DPPH (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil) 60 μM), dissolvendo 12 mg de reagente DPPH em 500 ml de etanol. Em seguida uma solução estoque de Trolox (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil) 2000 μM) foi preparada, dissolvendo 25 mg de reagente Trolox em 50 ml de etanol. A partir da solução estoque foram preparadas, em balões volumétricos de 5 ml, soluções com as seguintes concentrações: 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1000 e 1200 μM, para realizar a curva de calibração de Trolox. Em ambiente escuro, transferiu-se para tubos

que a reação ocorresse. Transcorrido esse tempo se realizou a leitura da absorbância no comprimento de onda de 515 nm em espectrofotômetro UV-vis (Hach, modelo DR/4000U, Colorado, EEUU), usando o etanol como branco.

Usando os valores de absorbância da curva padrão, calcularam-se os valores de concentração correspondente aos extratos, expressos em mg de trolox equivalente/g de óleo.

4.6 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA COM FONTE DE EMISSÃO DE CAMPO