Parâmetros de estresse oxidativo em cães naturalmente infectados pelo vírus da cinomose

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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA. PARÂMETROS DE ESTRESSE OXIDATIVO EM CÃES NATURALMENTE INFECTADOS PELO VÍRUS DA CINOMOSE. DISSERTAÇÃO DE MESTRADO. Andressa Oliveira de Curtis. Santa Maria, RS, Brasil 2013.

(2) PARÂMETROS DE ESTRESSE OXIDATIVO EM CÃES NATURALMENTE INFECTADOS PELO VÍRUS DA CINOMOSE. Andressa Oliveira de Curtis. Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, Área de Concentração em Clínica Médica, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM,RS), como requisito parcial para obtenção de grau de Mestre em Medicina Veterinária.. Orientador: Prof. Alexandre Krause. Santa Maria, RS, Brasil 2013.

(3) Universidade Federal de Santa Maria Centro de Ciências Rurais Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária. A comissão examinadora, abaixo assinada, aprova a Dissertação de Mestrado. PARÂMETROS DE ESTRESSE OXIDATIVO EM CÃES NATURALMENTE INFECTADOS PELO VÍRUS DA CINOMOSE. Elaborada por Andressa Oliveira de Curtis. como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Medicina Veterinária. COMISSÃO EXAMINADORA:. Alexandre Krause, Dr. (Presidente/Orientador). Stella de Faria Valle, Dra. (UFRGS). Roberta Schmatz, Dra. (UFSM). Santa Maria, 04 de março de 2013..

(4) AGRADECIMENTOS. Agradeço em primeiro lugar a Deus, por ter colocado em meu caminho pessoas tão importantes para que este trabalho pudesse ser concretizado. A minha mãe, Dilnara, e ao meu noivo, Cassiano, pois sem seu suporte jamais teria dado início a mais uma etapa acadêmica. À professora Cinthia Mazzanti, pela importante coorientação e apoio prestado durante todas as etapas deste projeto, desde a sua criação. As minhas colegas de mestrado, Heloisa Palma, Ana Rita e Desydere, que ajudaram com o processamento das amostras, análises sanguíneas, transporte de material e coletas de sangue. As minhas amigas Bianca Bertoletti e Luciana Wolle. À professora Stella Valle, que teve papel fundamental para que este projeto pudesse ter sua parte prática executada na UFRGS. Obrigada por me receber no LACVET e obrigada por colaborar com a realização dos hemogramas. Às médicas-veterinárias residentes da UFRGS por estarem sempre dispostas a colaborar com este estudo. À equipe do Laboratório de Virologia da UFRGS, mais precisamente ao Oscar e à Renata, que realizaram as PCR. À Fátima, do Laboratório de Enzimologia e Toxicologia da UFSM, pelas análises laboratoriais referentes ao estresse oxidativo. Ao Fabiano, pela ajuda com a estatística. E por fim ao meu orientador, Alexandre Krause, pela oportunidade, confiança e compreensão nos momentos de dificuldade. Obrigada!.

(5) Dedico. este. estudo. a. minha. querida mãe, incansável em seus esforços, e ao meu amado noivo, pelo apoio em todos os momentos..

(6) RESUMO Dissertação de Mestrado Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária Universidade Federal de Santa Maria. PARÂMETROS DE ESTRESSE OXIDATIVO EM CÃES NATURALMENTE INFECTADOS PELO VÍRUS DA CINOMOSE AUTORA: ANDRESSA OLIVEIRA DE CURTIS ORIENTADOR: ALEXANDRE KRAUSE Santa Maria, 04 de março de 2013.. A cinomose canina é uma doença multissistêmica grave, que afeta os sistemas respiratório, hemolinfático, gastrointestinal e neurológico. As lesões induzidas pela replicação do vírus da cinomose canina (VCC) produzem um aumento das espécies reativas de oxigênio (EROs), que levam a um quadro de estresse oxidativo. O objetivo deste trabalho foi verificar parâmetros de estresse oxidativo através da mensuração da peroxidação lipídica através das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e da atividade das enzimas catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) em cães naturalmente infectados com o vírus da cinomose. Neste estudo, foram utilizados 33 animais positivos para o VCC, provenientes do atendimento da rotina do Hospital de Clínicas Veterinárias da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) e 21 animais clinicamente sadios como controle. Para a confirmação do diagnóstico da doença a técnica de RT-PCR (Reação em Cadeia da Polimerase pela Transcriptase Reversa) foi realizada em amostras de swab retal e/ou soro. Este estudo demonstrou que houve diferença significativa na peroxidação lipídica, atividades da SOD e CAT entre grupos analisados, sugerindo o envolvimento do estresse oxidativo na patogênese desta doença. Palavras-chave: Morbillivirus. Peroxidação lipídica. TBARS. Catalase. CAT. Superóxido dismutase. SOD..

(7) ABSTRACT Master Dissertation Post-Graduate Program in Veterinary Medicine Federal University of Santa Maria. OXIDATIVE STRESS PARAMETERS IN DOGS NATURALLY INFECTED WITH CANINE DISTEMPER VIRUS AUTHOR: ANDRESSA OLIVEIRA DE CURTIS ADVISER: ALEXANDRE KRAUSE Santa Maria, March 04th, 2013.. Canine distemper disease is a severe multisystem disease that affects the respiratory, hemolymphatic, gastrointestinal and neurological systems. The lesions induced by replication of canine distemper virus (CDV) produce an increase in reactive oxygen species (ROS), leading to oxidative stress. The aim of this study was to investigate parameters of oxidative stress by measuring the lipid peroxidation through the thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and the activity of the enzymes catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) in dogs naturally infected with distemper virus. In this study we used 33 animals positive for CDV, attended at the Veterinary Hospital of the University of Rio Grande do Sul (UFRGS) and 21 clinically healthy animals were used as control. For the confirmation of the diagnosis RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) was performed in samples of rectal swab and/or serum. This study demonstrated a significant difference in lipid peroxidation, SOD and CAT activities in the analyzed groups, suggesting the involvement of oxidative stress in the pathogenesis of the disease. Key words: Morbillivirus. Superoxidedismutase. SOD.. Lipid. peroxidation.. TBARS.. Catalase.. CAT..

(8) LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO I Figura 1 - Esquema ilustrativo da progressão da infecção sistêmica para a infecção nervosa na cinomose canina................................................................................................... 17. Figura 2 - Esfregaço sanguíneo de canino exibindo inclusões patognomônicas da cinomose (Corpúsculos de Lentz) em hemácia e neutrófilo................................................... 19 Figura 3 – Formação mitocondrial de radicais livres via cadeia transportadora de elétrons.................................................................................................................................... 24 Figura 4 – Integração dos sistemas de defesa antioxidante enzimáticos................................ 26. CAPÍTULO II Figura 1 - Níveis de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) no soro de cães sadios e cães infectados com o vírus da cinomose (**P<0,01).............................................. 41. Figura 2- A: Atividade da superóxido dismutase (SOD) no sangue de cães sadios e cães infectados com o vírus da cinomose (*P<0,05). B: Atividade da catalase (CAT) no sangue de cães sadios e cães infectados com o vírus da cinomose. (*P<0,05).................................. 42.

(9) LISTA DE TABELAS CAPÍTULO II Tabela 1 – Frequência (f) das alterações clínicas observadas no exame físico de 33 cães positivos para o vírus da cinomose......................................................................................... 43 Tabela 2 – Frequência (f) das alterações hematológicas observadas no hemograma de 33 cães positivos para o vírus da cinomose................................................................................. 44.

(10) LISTA DE APÊNDICES APÊNDICE A - Termo de Consentimento Livre Esclarecido de Participação em Pesquisa................................................................................................................................... 52 APÊNDICE B- Sinais clínicos apresentados pelos cães positivos para o vírus da cinomose................................................................................................................................. 53 APÊNDICE C – Eritrograma dos cães positivos para o vírus da cinomose........................... 57 APÊNDICE D – Leucograma dos cães positivos para o vírus da cinomose.......................... 59.

(11) SUMÁRIO CAPÍTULO I ....................................................................................................................... 12 1 - INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 12 2 - REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................... 15 2.1 Cinomose canina .................................................................................................... 15 2.2 Radicais livres e estresse oxidativo ......................................................................... 20 2.2.1 Peroxidação lipídica ......................................................................................... 22 2.3 Enzimas antioxidantes ............................................................................................ 23 2.3.1. Superóxido dismutase (SOD) .......................................................................... 25 2.3.2 Catalase (CAT) ................................................................................................ 26 CAPÍTULO II ...................................................................................................................... 28 3 - ARTIGO CIENTÍFICO .............................................................................................. 28 RESUMO..................................................................................................................... 29 ABSTRACT................................................................................................................. 30 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 30 MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................... 32 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................. 34 CONCLUSÃO ............................................................................................................. 37 AGRADECIMENTOS ................................................................................................. 37 COMISSÃO DE ÉTICA EM USO DE ANIMAIS ....................................................... 37 REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 37 4 – CONCLUSÃO ........................................................................................................... 45 5 – REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 46.

(12) 12. CAPÍTULO I. 1 - INTRODUÇÃO. O vírus da cinomose canina (VCC) é o causador de uma doença de distribuição mundial sistêmica grave e altamente contagiosa que afeta os sistemas respiratório, hemolinfático, gastrintestinal e nervoso (BEINECKE et al., 2009; KAPIL & YEARY, 2011). O cão doméstico é o principal hospedeiro do VCC, um Morbillivirus da família Paramyxoviridae (NORRIS et al., 2006), que acomete outros carnívoros, incluindo todos os membros das famílias Canideae, Mustelidae e alguns membros das famílias Procyonidae, Hyenidae, Ursidae e Viverridae, sendo também observado em felídeos e mamíferos marinhos (KAPIL & YEARY, 2011). Cães de qualquer idade, raça e sexo, com maior predileção por filhotes e cães impropriamente, ou não vacinados são acometidos (GREENE & APPEL, 2006). Os cães infectados pelo vírus da cinomose podem manifestar uma combinação de sinais e/ou lesões respiratórias, gastrintestinais, cutâneas e neurológicas que podem ocorrer em sequência ou simultaneamente (GRÖNE et al., 2003; KOUTINAS et al., 2004; BEINECKE et al., 2009). Os radicais livres são espécies químicas constituídas de um átomo ou associação dos mesmos, possuindo um elétron desemparelhado na sua órbita mais externa. Essa situação implica em alta instabilidade energética e cinética, e para se manter estáveis precisam doar ou retirar um elétron de outra molécula. A formação de radicais livres conduz ao estresse oxidativo, processo no qual estes iniciarão uma cadeia de reações, originando alterações em proteínas extracelulares e a modificações celulares. O maior dano causado pelo estresse oxidativo é a peroxidação dos ácidos graxos constituintes da dupla camada lipídica que, em última instância, leva à morte celular. (HIRATA et al., 2004; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007). A principal fonte de radicais livres em sistemas biológicos é a molécula de oxigênio, que, no entanto, é fundamental para o metabolismo celular e para a produção de energia (HIRATA et al., 2004). Sendo assim, a mais abundante fonte endógena geradora são as mitocôndrias (que usam cerca de 90% do oxigênio) onde o oxigênio é reduzido em etapas sequenciais para produzir água. Ou seja, ele participa da cadeia de transporte de elétrons da mitocôndria para que haja a produção de ATP. Para a completa redução de uma molécula de.

(13) 13. oxigênio em duas moléculas de água, quatro elétrons são transportados dentro da membrana mitocondrial interna. Entretanto, 1a 2% desses elétrons são perdidos durante o transporte, levando a formação de superóxido (O2-) e subsequentemente de outras numerosas espécies reativas de oxigênio (EROs) como o peróxido de hidrogênio (H2O2) e radicais hidroxila (OH) (HIRATA et al., 2004). Em condições patológicas, entretanto, a formação de EROs pode se elevar, resultando em estresse oxidativo, o qual leva ao aumento na peroxidação lipídica, que é mensurada através das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Em contrapartida, as consequências nocivas causadas pelo estresse oxidativo são minimizadas por sistemas de defesa antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos. As principais enzimas que apresentam ação antioxidante são a superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (GPx), as quais constituem a primeira linha de defesa endógena do organismo (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007; BARBOSA et al., 2010). Segundo RAO & BALACHANDRAN (2002), antioxidantes incluem compostos de baixo peso molecular como a glutationa, tocoferol (vitamina E), ácido retinoico, ácido ascórbico (vitamina C), albumina, bilirrubina, ferritina, ceruloplasmina, melatonina, ácido úrico, minerais (selênio) e fitonutrientes (flavonoides e carotenoides). Normalmente há um equilíbrio entre os mecanismos de defesa antioxidante e os fatores que promovem a formação dos radicais livres assim sendo, qualquer desequilíbrio que favoreça a formação de radicais livres é definido com um estado de estresse oxidativo (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007). Na cinomose canina, assim como na etiopatogenia de diversas outras doenças neurodegenerativas bem conhecidas em humanos (Parkinson e Alzheimer), o estresse oxidativo contribui para a ocorrência de lesões no SNC, destacando principalmente a desmielinização, sendo que os mecanismos patogênicos de muita destas condições são pouco compreendidos. O SNC parece ser particularmente vulnerável ao estresse oxidativo, visto que as membranas neuronais contêm uma alta proporção de ácidos graxos poliinsaturados suscetíveis às espécies reativas de oxigênio (EROs), por conseguinte, ao dano oxidativo (KARADENIZ et al., 2008; ORSINI & BONDAN, 2008). Estudos realizados por KARADENIZ et al. (2008) comprovaram que existe aumento das concentrações de malondialdeído (MDA), um produto da peroxidação lipídica, e acúmulo de EROs em cães infectados com o vírus da cinomose. Segundo estes autores, existe um aumento das concentrações plasmáticas de marcadores para o dano oxidativo associado à diminuição das concentrações de antioxidantes não enzimáticos (como retinol e β-caroteno) em cães infectados pelo VCC..

(14) 14. Apesar desses resultados sugerirem insuficiência dos sistemas antioxidantes não enzimáticos durante a cinomose em cães, não há até o momento estudos associando o estresse oxidativo com alterações no sistema antioxidante enzimático. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi verificar as alterações clínicas e hematológicas, bem como parâmetros de estresse oxidativo, através da mensuração da peroxidação lipídica e da atividade da catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) em cães naturalmente infectados com o vírus da cinomose..

(15) 2 - REVISÃO DE LITERATURA. 2.1 Cinomose canina. A cinomose é uma grave doença infecciosa, altamente contagiosa, com elevado índice de mortalidade e geradora de transtornos oculares, respiratórios, gastrintestinais e neurológicos (GREENE & APPEL, 2006; MARTELLA et al., 2008). Segundo SPITZBARTH et al. (2012), é a uma das doenças do sistema nervoso central (SNC) mais comum nesta espécie. É causada por um Morbillivirus, da família Paramyxoviridae, sendo mundialmente importante para os cães domésticos (Canis familiaris), pois apresenta alta morbidade (GREENE & APPEL, 2006). As lesões e os sinais clínicos da forma neurológica da cinomose são extremamente variáveis. Os cães são frequentemente afetados por várias condições inflamatórias e degenerativas espontâneas do sistema nervoso central (SNC). Devido à baixa capacidade de regeneração do SNC um conhecimento detalhado sobre a base molecular relacionada ao início, progressão e remissão das doenças do SNC em caninos representa um pré-requisito para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas. Além disso, como muitas doenças espontâneas do SNC em cães compartilham semelhanças marcantes com as doenças em humanos, o conhecimento sobre a patogênese da cinomose pode em parte ser traduzida para uma melhor compreensão de determinadas doenças humanas. (SPITZBARTH et al., 2012). São descritas quatro formas de encefalite: uma que afeta os cães novos, de caráter severo e agudo, na qual os sinais sistêmicos ocorrem ao mesmo tempo que os neurológicos; outra que atinge cães adultos, do tipo crônica, na qual os distúrbios neurológicos podem aparecer desacompanhados de transtornos sistêmicos e outras duas denominadas encefalite do cão velho e encefalite recidivante crônica (BRAUND, 1994; TUDURY et al., 1997). A encefalite aguda, que ocorre inicialmente no curso da infecção em animais jovens ou imunossuprimidos, é caracterizada por lesão viral direta (SUMMERS et al., 1995; GREENE & APPEL, 2006). O vírus causa lesão multifocal nas substâncias cinzenta e branca. As lesões na substância cinzenta são resultados de infecção neuronal e necrose, e podem levar a uma poliencefalomalácea. Lesões na substância branca são caracterizadas por danos mielínicos e estão associados com replicação viral nas células da glia. Mudanças inflamatórias são mínimas devido à imunodeficiência resultante de imaturidade fisiológica do sistema imune.

(16) 16. e/ou decorrente da imunossupressão viral induzida (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005; GREENE & APPEL, 2006). A encefalite multifocal em cães adultos acomete frequentemente animais entre os quatro e seis anos, com curso crônico. Esta enfermidade não é precedida nem coincide com os sinais sistêmicos (SILVA et al., 2009). As alterações têm início com hiperplasia dos astrócitos e proliferação microglial em estruturas subpiais e subependimárias na substância branca. Esta forma também está associada com a alta concentração de anticorpos antimielínicos, podendo ser uma reação secundária ao processo inflamatório. Anticorpos contra o vírus interagem com macrófagos infectados em lesões no SNC, causando sua ativação com liberação de radicais livres de oxigênio. Esta atividade por sua vez pode levar à destruição de oligodendrócitos e bainha de mielina (SUMMERS et al., 1995; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). Há indícios que as lesões induzidas pela replicação do vírus da cinomose canina (VCC) produzam um intenso estresse oxidativo (KARADENIZ et al., 2008). Durante a exposição natural, o vírus da cinomose se propaga por gotas de aerossóis e entra em contato com o epitélio do trato respiratório superior. Em 24 horas, as partículas virais se replicam nos macrófagos e se disseminam pela via linfática local, para tonsilas e linfonodos brônquicos, resultando em uma severa imunossupressão (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005; MARTELLA et al., 2008). A função imune prejudicada, associada à depleção dos órgãos linfoides, consiste em perda de linfócitos, especialmente de células T CD4+ (devido à apoptose de células linfoides) (BEINECKE et al., 2009). De dois a quatro dias pós-infecção, o número de partículas virais nas tonsilas, linfonodos retrofaríngeos e bronquiais aumenta, porém uma quantidade pequena de células mononucleares infectadas é encontrada no sistema linfoide, medula óssea, timo, baço, linfonodos mesentéricos, placas de Peyer, células estomacais, células de Küpffer e células mononucleares ao redor dos vasos pulmonares e bronquiais. A ampla proliferação viral nos órgãos linfoides induz um aumento inicial na temperatura corporal, entre o segundo e sexto dia, ocorrendo leucopenia, causada por danos virais nas células linfoides (GREENE & APPEL, 2006). A disseminação do vírus no epitélio e nos tecidos do SNC (Figura 1) ocorre no período de 8 a 10 dias pós-infecção, por via hematógena ou pelo líquor, após viremia (GREENE & APPEL, 2006). O período de incubação pode variar de uma a quatro semanas ou mais. Febre transitória atinge o pico de três a seis dias pós-infecção e está associada com o início da viremia. Perda de apetite, prostração, descarga nasal e ocular e tonsilite podem ser observados (MARTELLA et al., 2008)..

(17) 17. O VCC causa uma doença desmielinizante multifocal que ocorre naturalmente em cães e outros carnívoros e é considerado um modelo experimental para doenças desmielinizantes. em. humanos,. como. a. esclerose. múltipla. (VANDEVELDE. &. ZURBRIGGEN, 2005). Estudos experimentais têm demonstrado que a desmielinização aguda da cinomose canina é uma lesão não inflamatória, que ocorre aproximadamente três semanas pós-infecção e durante período de intensa imunossupressão. A desmielinização está também diretamente relacionada à replicação viral ativa, principalmente em astrócitos e, possivelmente, a uma infecção do VCC restrita de oligodendrócitos, as células produtoras de mielina, e tem predileção por algumas regiões como cerebelo, sistema óptico e medula espinhal (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005).. Figura 1 - Esquema ilustrativo da progressão da infecção sistêmica para a infecção nervosa na cinomose canina (MORO et al., 2004).. As áreas com desmielinização aguda e sem inflamação são consideradas uma consequência da replicação viral no interior de oligodendrócitos levando a destruição celular e.

(18) 18. a perda de habilidade para manter a bainha de mielina (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). Na maioria, ou em todos os casos de infecção pelo VCC, o vírus atinge o encéfalo, mesmo que o animal não apresente manifestações de transtornos neurológicos (SUMMERS et al., 1995). No entanto, alguns estudos sugerem que a infecção do SNC ocorre precocemente, na fase sistêmica da doença. Neste caso, a cinomose progride da forma sistêmica para a neurológica, aparentemente por falha do sistema imune (MANGIA & PAES, 2008). A frequente ocorrência de lesões periventriculares e subpiais, e o fato do vírus ser encontrado facilmente nas células do plexo coroide e do epêndima, sugerem que este penetre nos tecidos cerebrais pelo líquor, onde o agente pode ser encontrado em células mononucleares fundidas com células ependimárias (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). Os sinais clínicos neurológicos incluem mioclonias, convulsão, rigidez cervical, hiperestesia, tremores musculares, paresia, paralisia, ataxia, mudanças comportamentais, depressão e desorientação (NEGRÃO et al., 2007). As mioclonias são constatadas mais comumente nos músculos faciais, mastigatórios e apendiculares (BRAUND, 1994) e foram consideradas como sendo patognomônicas da cinomose (GREENE & APPEL, 2006). Distúrbios neurológicos multifocais acompanhados de febre, transtornos respiratórios, diarreia, corrimento ocular, hiperqueratose naso-digital, mioclonias, linfopenia, coriorretinite e história de não vacinação são também indicativos da doença (SUMMERS et al., 1995; TUDURY et al., 1997). Cães com cinomose apresentam leucopenia quatro a seis dias após a infecção. Uma vez que a doença esteja instalada, observar-se linfopenia, monocitose e leve neutrofilia (GREENE & APPEL, 2006), podendo haver leucocitose devido à infecção bacteriana secundária. Cães com encefalomielite por cinomose podem ou não apresentar alterações no líquor. As anormalidades possíveis de serem encontradas são: aumento de proteínas (superior a 25mg/dl) e pleocitose (mais de 10 células/mm3), com predomínio de células. mononucleares. (BRAUND,. 1994).. A. cinomose. pode. ser. diagnosticada. laboratorialmente através da visualização de corpúsculos de inclusão de Lentz em hemácias e leucócitos visualizados a partir de esfregaços sanguíneos (Figura 2), no líquor e em impressões das mucosas nasal, prepucial, vaginal e principalmente conjuntival, corados com corantes tipo Romanowsky, como o panótico rápido, (WEISS & WARDROP, 2010). O encontro destes corpúsculos de inclusão em células das conjuntivas ocular ou vaginal é sinal patognomônico de cinomose. Inclusões intracitoplasmáticas e intranucleares podem também.

(19) 19. ocorrer em neurônios, astrócitos, células das meninges e epêndima (BRAUND, 1994; TUDURY et al., 1997). Diferentes técnicas têm sido utilizadas como diagnóstico complementar da cinomose, como o isolamento viral, RT-PCR, hibridização in situ e imuno-histoquímica (MASUDA et al., 2006). A imuno-histoquímica permite a detecção de antígenos virais em diferentes tecidos fixados em formol. Como diagnóstico post mortem utilizam-se órgãos como estômago, pulmão, bexiga, encéfalo, baço, linfonodos, tonsila, rim, intestino e coxins digitais (DUCATELLE et al., 1980; KOUTINAS et al., 2004; LIANG et al., 2007). A RT-PCR (Reação em cadeia da polimerase pela transcriptase reversa) vem sendo empregada na detecção do vírus da cinomose, devido sua rapidez na obtenção dos resultados, a não exigência da infecciosidade da partícula viral e os altos níveis de sensibilidade e especificidade. Seu procedimento requer diferentes tipos de amostras biológicas como sangue, soro, urina e fragmentos de órgãos (GEBARA et al., 2004; CURTI et al., 2012).. Figura 2 - Esfregaço sanguíneo canino exibindo inclusões patognomônicas da cinomose (Corpúsculos de Lentz) (setas) em hemácia e neutrófilo (Panótico Rápido, 1000x) (MARTINS et al., 2009)..

(20) 20. 2.2 Radicais livres e estresse oxidativo. O termo radical livre é frequentemente usado para designar qualquer átomo ou molécula contendo um ou mais elétrons não pareados nos orbitais externos capazes de reagir com qualquer composto situado próximo à sua órbita externa, passando a ter uma função oxidante ou redutora (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007; CAROCHO & FERREIRA, 2013). Essa configuração faz dos radicais livres espécies altamente instáveis, de meia vida relativamente curta e quimicamente muito reativas. O radical livre mais simples é o átomo de hidrogênio, pois o mesmo tem apenas um elétron que é, portanto, desemparelhado (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007). Os radicais livres são gerados em muitos processos fisiológicos e exercem funções importantes no organismo. Sua geração é decorrente de uma ação contínua e fisiológica, cumprindo funções biológicas essenciais. São formados em um cenário de reações de óxidoredução, provocando essas reações ou delas resultando. Podem ceder o elétron desemparelhado e serem oxidados ou podem receber outro elétron e serem reduzidos (OKEZIE, 1998). Essas reações ocorrem no citoplasma, nas mitocôndrias ou na membrana citoplasmática, e o seu alvo celular (proteínas, lipídeos, carboidratos e moléculas de DNA) está relacionado com seu local de formação (MANACH et al., 2004). As mitocôndrias consomem mais de 90% do oxigênio disponível no organismo, sendo o principal local de formação de espécies reativas de oxigênio e radicais livres. Durante o processo de obtenção de energia, a enzima citocromo oxidase adiciona quatro elétrons à molécula de oxigênio e a reduz a água, seguindo quatro passos sequenciais, nos quais libera sucessivas espécies reativas (VALKO et al., 2007). As espécies reativas de oxigênio (EROs) incluem radicais livres, como: ânion superóxido (O2.-), hidroxil (OH), peroxil (RO2), hidroperoxil (HRO2 -), assim como espécies não radicais, que apesar de não possuírem elétrons desemparelhados são muito instáveis, como por exemplo: peróxido de hidrogênio (H2O2) e ácido hipocloroso (HOCL). As espécies reativas ao nitrogênio (ERN) incluem radicais livres como o óxido nítrico (ON) e dióxido de nitrogênio (NO 2-), assim como espécies não radicais, por exemplo: peroxinitrito (ONOO-), óxido nitroso (HNO2) e peroxinitrato (RONOO) (TURKO et al., 2001; EVANS et al., 2002; EDEAS, 2011). Outra fonte endógena de radicais livres são os fagócitos, que destroem células infectadas por bactérias ou vírus, liberando oxidantes: óxido nítrico, ânion superóxido e peróxido de hidrogênio. Desse modo, os radicais livres também possuem um papel de destaque no organismo, fazendo parte da defesa imune primária (VALKO et al., 2007). Os.

(21) 21. radicais livres participam ainda da atividade bactericida, de processos de sinalização celular e estão envolvidos na síntese e regulação de algumas proteínas, em condições fisiológicas (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007). O estresse oxidativo é definido como o excesso de formação e/ou remoção insuficiente de moléculas reativas (radicais livres), tais como: espécies reativas de oxigênio (EROs) e espécies reativas de nitrogênio (ERNs) (SIES, 1993; TURKO et al., 2001; CAROCHO & FERREIRA, 2013). Durante a redução do oxigênio molecular, EROs são formadas e existe a necessidade permanente de inativar estes radicais livres. As consequências do estresse oxidativo podem ser variadas, de acordo com o tipo celular e com sua intensidade. Segundo HALLIWELL & GUTTERIDGE (2007), os principais efeitos são: 1. Proliferação celular: algumas células podem responder ao estresse oxidativo através do aumento da taxa de divisão celular. 2. Adaptação: aumento das defesas celulares, como catalase, superóxido dismutase e glutationa, deixando a célula totalmente, parcialmente ou superprotegida (a célula estará mais resistente frente a futuros insultos oxidativos mais intensos). Além disto, os alvos de dano oxidativo podem ser redirecionados, ou ainda, a produção basal de EROs pode ser reduzida. 3. Dano celular: pode envolver dano a um ou mais tipos de biomoléculas, como lipídios, proteínas, DNA e carboidratos. Em casos de dano menor, a célula pode sobreviver com algum dano oxidativo persistente e irreparável, ou ainda promover o seu reparo. 4. Senescência: sobrevivência da célula, mas com o sistema de divisão celular comprometido. 5. Morte celular: após o dano a célula pode desencadear o processo de morte celular. Danos oxidativos ao DNA, mitocôndria, ou em outros alvos celulares, podem causar morte celular por apoptose ou por necrose. O estresse oxidativo pode ser devido à exposição ambiental aos oxidantes; à ingestão insuficiente de antioxidantes na dieta; à produção excessiva de radicais livres durante o metabolismo de fármacos ou substâncias tóxicas; à ativação excessiva do sistema celular que produz radicais livres, como os fagócitos, durante o processo inflamatório; ou ainda devido a alterações enzimáticas, resultando em níveis patológicos de danos oxidativos. Há uma forte evidência de que o estresse oxidativo tem um papel importante na patogênese de diversas doenças (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007). Na cinomose canina, assim como na etiopatogenia de diversas outras doenças neurodegenerativas bem conhecidas em humanos (Parkinson e Alzheimer), o estresse.

(22) 22. oxidativo contribui para o surgimento e o desenvolvimento da degeneração neurológica, principalmente no SNC e pode participar da desmielinização (KARADENIZ et al., 2008). As EROs são capazes de induzir tanto a necrose como a apoptose celular, entretanto não parecem ser importantes intermediários da morte neuronal sob condições patológicas. A ruptura das membranas celulares na lipoperoxidação faz com que ocorra uma mudança no gradiente dos íons dos diferentes compartimentos celulares. Já foi demonstrado, em cultura de células, que os neurônios podem sofrer morte celular após a degradação de toda a glutationa (GSH) intracelular, o principal antioxidante endógeno (LEWERENZ et al., 2003). 2.2.1 Peroxidação lipídica. As membranas biológicas são constituídas principalmente por fosfolipídios, os quais possuem uma porção polar e duas hidrofóbicas. Geralmente, as "caudas" hidrofóbicas são compostas por ácidos graxos, que podem diferir no comprimento e na configuração em que se apresentam, e também no grau de insaturação (ALBERTS et al., 2007; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007). Quando ocorre um desbalanço no status antioxidante, as EROs atacam os ácidos graxos insaturados das membranas celulares num processo chamado de peroxidação lipídica. Este mecanismo resulta em modificações nos lipídeos de membrana, que perde suas características arquitetônicas, tornando-se mais firme e menos flexível. Com isso, criam-se "fendas iônicas" que alteram a permeabilidade da membrana e favorecem o fluxo indiscriminado de metabólitos e detritos celulares. Este desequilíbrio hidroeletrolítico leva à ruptura e lise da membrana, levando à necrose celular (JOSEPHY, 1997; TIMBRELL, 2000). A peroxidação lipídica é um mecanismo geral pelo qual os radicais livres podem induzir danos teciduais, e está associada a várias condições patológicas (HALLIWELL & CHIRICO, 1993). O grau de peroxidação dos fosfolipídios é determinado pelas concentrações de malondialdeído (MDA) e o método comumente aplicado de mensuração é o de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) (ESTERBAUER, 1993). A peroxidação lipídica é considerada um evento fisiopatológico importante no estudo de substâncias farmacológicas, como os estrógenos, em diversas doenças neurodegenerativas, e em danos isquêmicos e traumáticos (BRAUGHLER et al., 1987; VEDDER et al., 1999; MOSSBERG et al., 2009). Assim, o excesso ou acúmulo de EROs e ERNs no organismo, além de iniciar a peroxidação das membranas lipídicas (permitindo o acúmulo de peróxidos de lipídios), também pode.

(23) 23. prejudicar as proteínas e o DNA celular, acelerando processos como o envelhecimento e o câncer (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007). Uma fonte importante de elétrons são os ácidos graxos insaturados encontrados na dupla camada de lipídios das membranas celulares, que são vitais para o funcionamento da célula (JOSEPHY, 1997; TIMBRELL, 2000). O SNC é um tecido que consiste substancialmente de membranas e ácidos graxos, o que aumenta a vulnerabilidade dos constituintes da membrana lipídica aos danos oxidativos e à ação direta dos radicais livres (VEDDER et al., 1999). Este processo ocorre em diferentes condições neurotóxicas e/ou neurodegenerativas e, em grau bem menor, nas atividades fisiológicas normais dos circuitos neurais. Os radicais livres podem modificar a produção e o reaproveitamento de neurotransmissores, a atividade dos canais de íons e a função de diversos transportadores de substâncias para a célula e mitocôndrias, além dos receptores de superfície (MATTSON, 1998). O sistema nervoso e, especialmente, o cérebro são vulneráveis aos danos dos radicais livres por uma série de razões, tais como a forma de consumo do oxigênio, a abundância de ácidos graxos poli-insaturados e lipídios e a capacidade antioxidante relativamente limitada em comparação com outros órgãos (COYLE e PUTTFARCKEN, 1993). Estudos comprovaram que existe aumento das concentrações de malondialdeído (MDA), acúmulo de EROs e ocorrência de estresse oxidativo em cães infectados com o vírus da cinomose (KARADENIZ et al., 2008).. 2.3 Enzimas antioxidantes Um antioxidante pode ser definido como uma substância que, em baixas concentrações, retarda ou previne a oxidação do substrato (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007). Quando o mecanismo de ação do antioxidante for através de sua reação com o radical livre, o novo radical formado deve ser estável e incapaz de propagar a reação (SHAHIDI et al., 1992). As características de um bom antioxidante são: presença de substituintes doadores de elétrons ou de hidrogênio ao radical (em função de seu potencial de redução); capacidade de deslocamento do radical formado em sua estrutura; capacidade de quelar metais de transição implicados no processo oxidativo; e acesso ao local de ação, dependendo de sua hidrofilia ou lipofilia e de seu coeficiente de partição (MANACH et al., 2004). Os antioxidantes podem ser classificados em primários e secundários. Os antioxidantes primários atuam como doadores de prótons, impedindo o processo de iniciação.

(24) 24. desencadeado pelos radicais livres. Nesta classe de antioxidantes são encontrados os compostos fenólicos, tocoferol, aminoácidos, carotenoides e os antioxidantes sintéticos (BRAVO, 1998; EDEAS, 2011; HANAFY & SELIM, 2012). Os antioxidantes secundários atuam no bloqueio da decomposição dos peróxidos e hidroperóxidos, convertendo-os na forma inativa, por ação de agentes redutores, bloqueando a reação em cadeia através da captação de intermediários reativos, como os radicais peroxila e alcooxila (DONNELLI & ROBINSON, 1995). A remoção dos radicais livres do organismo ocorre a partir de mecanismos de defesa enzimáticos e não enzimáticos. Os processos não enzimáticos incluem a glutationa tripeptídeo (GSH) e as vitaminas A, C e E (SIES, 1997; EDEAS, 2011; HANAFY & SELIM, 2012). A ausência ou falha na defesa antioxidante contribui para o aumento da peroxidação lipídica, podendo acelerar reações prejudiciais à célula (RAO et al., 2000). O conjunto enzimático inclui a superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT), a glutationa peroxidase (GPx). As enzimas CAT e GPx agem com o mesmo propósito, ou seja, o de impedir o acúmulo de peróxido de hidrogênio. Tal ação integrada é de grande importância, uma vez que essa espécie reativa, por meio das reações de Fenton e HaberWeiss, mediante a participação dos metais ferro e cobre, culmina na geração do radical (OH), contra o qual não há sistema enzimático de defesa (BARBOSA et al., 2010) (Figura 3).. Figura 3- Formação mitocondrial de radicais livres via cadeia transportadora de elétrons. 1) Redução tetravalente do oxigênio, por meio da qual recebe quatro elétrons (e-) e quatro íons de hidrogênio (H+), formando duas moléculas de água (H2O) e liberando energia. 2) Geração do radical superóxido (O2-) pela adição de um elétron a uma molécula de oxigênio no estado fundamental (O2). 3) Por meio de um processo denominado dismutação, o radical O2-, ao receber íons de hidrogênio, gera peróxido de hidrogênio (H2O2). Tal reação é catalisada pela superóxido dismutase (SOD), que acelera a reação na ordem de 104 vezes. 4) Reação de Fenton: quando o H2O2 reage com íons ferro (Fe2+) ou cobre (Cu+) é gerado o radical hidroxila (OH). 5) Reação de Haber-Weiss: os referidos íons também podem catalisar a reação entre H2O2 e O2- gerando, da mesma forma, (OH). 6) O radical O2- pode também reagir com o óxido nítrico (NO) gerando peroxinitrito (ONOO -) (BARBOSA et al., 2010)..

(25) 25. O referido radical (OH) vem sendo indicado como o de maior potencial reativo e com extrema instabilidade (vida média de 10 -9 segundos). Essas características os capacitam como o radical livre mais propício na produção de danos oxidativos. Além de ser o principal iniciador do processo de peroxidação lipídica, tendo como consequência a alteração da função biológica das membranas celulares, esse radical é capaz de agir sobre as proteínas, alterandoas em relação à sua estrutura e/ou função biológica. Seu ataque ao DNA possibilita a ocorrência de mutações (BARBOSA et al., 2010). A GPx também existe sob duas formas: dependente e independente de selênio e pode apresentar-se no citoplasma ou na mitocôndria (BARBOSA et al., 2010).. 2.3.1. Superóxido dismutase (SOD) A SOD (E.C. 1.15.1.1) é também conhecida como eritrocupreína ou indofenoloxidase (GUTTERIDGE & HALLIWELL, 2000). É uma metaloenzima amplamente encontrada em organismos eucarióticos e procarióticos (FRIDOVICH, 1995). Constitui-se numa enzima capaz de catalisar a conversão de ânion superóxido (O2-) a peróxido de hidrogênio (H2O2) através de dois passos reacionais. O primeiro passo consiste na reação do ânion superóxido com o grupo prostético da SOD na sua forma oxidada. Essa ligação conduz à aquisição de um próton e, consequente, liberação de oxigênio molecular. A forma reduzida da enzima liga, então, um segundo ânion superóxido e próton, para liberar H2O2 e retornar à sua forma oxidada (JOHNSON & GIULIVI, 2005). A concentração da SOD celular varia de 10-6 a 10-5 M. Nas mitocôndrias se encontra ligada, em seu sítio ativo, ao manganês (MnSOD); no citosol celular, possui cobre e zinco em seu sítio ativo (CuZnSOD) (HALIWELL & GUTTERIDGE, 2007; QIN et al., 2008; BARBOSA et al., 2010). A função catalítica dessa enzima de transformar o radical superóxido em peróxido de hidrogênio foi descoberta por MISRA & FRIDOVITCH, em 1972. A degradação do superóxido é assegurada pela enzima SOD, enquanto que os hidroperóxidos são destruídos pela CAT, pela glutationa peroxidase ou pela ascorbato peroxidase (KIN et al., 2008). A SOD pode ser encontrada sob duas formas: no citoplasma, é dependente de cobre e zinco (SOD-Cu/Zn), enquanto na mitocôndria, necessita do manganês como cofator (SOD-Mn)..

(26) 26. 2.3.2 Catalase (CAT). A CAT (E.C. 1.11.1.6) é uma das enzimas mais abundantes na natureza, encontrandose amplamente distribuída no organismo humano, nas mitocôndrias e nos peroxissomos; salvo nos eritrócitos, onde é encontrada no citoplasma. Sua atividade varia de acordo com o órgão ou tecido em que se localize, sendo mais elevada no fígado e nos rins e mais baixa nos tecidos conjuntivo e epitelial (CHAUDIÈRE e FERRARI-ILIOU, 1999). A enzima possui um grupamento heme que é o responsável pela sua atividade catalítica, convertendo peróxido de hidrogênio (H2O2) em duas moléculas de água (H2O) e oxigênio (O2) (MICHIELS et al., 1994) (Figura 4).. Figura 4 - Integração dos sistemas de defesa enzimático. Por meio da reação de dismutação, a superóxido dismutase (SOD) catalisa a geração de peróxido de hidrogênio (H2O2) a partir do radical superóxido (O2-). As enzimas catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx) se integram para impedir o acúmulo de H2O2 que, apesar de não ser um radical livre, é igualmente reativo e capaz de promover danos potenciais. O acúmulo dessa espécie reativa (H2O2) possibilita, por meio das reações de Fenton e Haber-Weiss, a geração do radical hidroxila (OH), contra o qual não existe defesa enzimática. A GPx reduz o H2O2 à água, no entanto o faz à custa da conversão da glutationa reduzida (GSH) em oxidada (GSSG), essa última que promove ação oxidante em função da ligação dissulfeto existente em sua estrutura. Assim, é de extrema importância a ação da glutationa redutase (GRd), responsável pela recuperação da glutationa reduzida (GSH), possibilitando a manutenção da integralidade do ciclo redox da glutationa e, consequentemente, do equilíbrio adequado entre os sistemas de defesa enzimáticos (BARBOSA et al., 2010)..

(27) 27. A CAT desempenha um papel importante na eliminação do H2O2 gerado pelas oxidases na oxidação dos ácidos graxos. Apresenta baixa afinidade pelo substrato, portanto possui papel crucial quando o H2O2 se encontra em altas concentrações - enquanto a GPx atua em baixas concentrações de H2O2 - (CHAUDIÈRE e FERRARI-ILIOU, 1999). O peróxido de hidrogênio forma o radical hidroxila e não existe nenhuma enzima que o remova. Por isso, as enzimas que decompõem o peróxido de hidrogênio, como a catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (GPx), são de extrema importância para os seres vivos (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007; BARBOSA et al., 2010). Em microrganismos patogênicos, a catalase desempenha uma importante função na destoxificação das EROs liberadas por células fagocíticas de defesa do hospedeiro (HAMPTON et al., 1998). Entretanto, os níveis de CAT são baixos na maioria das regiões do encéfalo (no hipotálamo e na substância nigra são um pouco maiores do que no córtex e no cerebelo) (HALLIWELL, 2001). A catalase, a superóxido dismutase e a glutationa peroxidase são consideradas as defesas antioxidantes endógenas mais importantes do organismo no combate à produção dos radicais livres e na degradação destas (BARBOSA et al., 2010)..

(28) CAPÍTULO II. 3 - ARTIGO CIENTÍFICO. Os resultados desta dissertação são apresentados na forma de artigo científico, com formatação de acordo com as orientações da revista ao qual será submetido:. Parâmetros de estresse oxidativo em cães naturalmente infectados pelo vírus da cinomose. De acordo com as normas para publicação em: Ciência Rural..

(29) 29 1. Parâmetros de estresse oxidativo em cães naturalmente infectados com o vírus da. 2. cinomose. 3. Oxidative stress parameters in dogs naturally infected with canine distemper virus. 4 5. RESUMO. 6. A cinomose canina é uma doença multissistêmica grave, que afeta os sistemas. 7. respiratório, gastrointestinal e neurológico, causando lesões de desmielinização multifocal na. 8. substância cinzenta e branca do sistema nervoso central (SNC). As lesões induzidas pela. 9. replicação do vírus da cinomose canina produzem um aumento das espécies reativas de. 10. oxigênio (EROs). O objetivo deste trabalho foi verificar alterações clínicas e hematológicas,. 11. bem como parâmetros de estresse oxidativo através da mensuração da peroxidação lipídica. 12. pela detecção das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e as atividades das. 13. enzimas antioxidantes catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD) em cães naturalmente. 14. infectados com o vírus da cinomose. Neste estudo, foram utilizados 33 animais positivos para. 15. o vírus, provenientes do atendimento de rotina do Hospital de Clínicas Veterinárias da. 16. Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) e 21 animais clinicamente sadios como. 17. controle. Este estudo demonstrou que houve diferença significativa na peroxidação lipídica,. 18. atividades da CAT e SOD entre grupos analisados, sugerindo o envolvimento do estresse. 19. oxidativo na patogênese desta doença.. 20 21 22. Palavras-chave: Morbillivirus, peroxidação lipídica, TBARS, catalase, CAT, superóxido dismutase, SOD..

(30) 30 1. ABSTRACT. 2. Canine distemper is a multisystem disease that is characterized by lesions in the. 3. respiratory, gastrointestinal, neurological systems causing multifocal demyelination in the. 4. gray and white matter of the central nervous system. The lesions induced by the replication of. 5. canine distemper virus produce an increase in reactive oxygen species (ROS), leading to. 6. oxidative stress. The objective of this study was to check clinical and hematological. 7. alterations as well as parameters of oxidative stress by measuring the lipid peroxidation by the. 8. thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) assay and activities of the antioxidants. 9. enzymes catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) and in dogs naturally infected with. 10. distemper virus. In this study we used 33 animals positive for canine distemper virus, from. 11. the routine of the Veterinary Hospital of the University of Rio Grande do Sul (UFRGS) and. 12. 21 clinically healthy animals, used as control. This study demonstrated a significant. 13. difference in lipid peroxidation (TBARS), CAT and SOD activities between the analyzed. 14. groups, suggesting the involvement of oxidative stress in the pathogenesis of this disease.. 15 16 17. Key words: Morbillivirus, Lipid peroxidation, TBARS, Catalase, CAT, Peroxide dismutase, SOD.. 18 19. INTRODUÇÃO. 20. A cinomose é uma doença viral altamente contagiosa causada pelo vírus da cinomose. 21. canina (VCC), um Morbillivirus da família Paramyxoviridae (GREENE & APPEL, 2006),. 22. que acomete cães de qualquer idade, raça e sexo, com maior predileção por filhotes e cães não. 23. vacinados (GREENE & APPEL, 2006). Os cães infectados pelo vírus da cinomose podem. 24. manifestar uma combinação de sinais e/ou lesões respiratórias, gastrintestinais, cutâneas e.

(31) 31 1. neurológicas que podem ocorrer em sequência ou simultaneamente (GRÖNE et al., 2003;. 2. KOUTINAS et al., 2004).. 3. Radicais livres são átomos ou moléculas altamente reativas contendo um ou mais. 4. elétrons desemparelhados (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007). Normalmente há um. 5. equilíbrio entre os mecanismos de defesa antioxidante e os fatores que promovem a formação. 6. dos radicais livres, assim sendo, qualquer desequilíbrio que favoreça a formação de radicais. 7. livres é definido como um estado de estresse oxidativo (HALLIWELL & GUTTERIDGE,. 8. 2007; BARBOSA et al., 2010). O estresse oxidativo tem seus danos minimizados pelo. 9. sistema de defesa antioxidante enzimático e não enzimático. As principais enzimas. 10. antioxidantes do organismo são a superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT) e a. 11. glutationa peroxidase (GPx) que constituem a primeira linha de defesa endógena. 12. (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007, BARBOSA et al., 2010).. 13. As espécies reativas de oxigênio (EROs), como ânion superóxido (O2), peróxido de. 14. hidrogênio (H2O2) e radical hidroxila (OH), se formam em condições fisiológicas. Porém, em. 15. condições patológicas esta produção pode se elevar, resultando em estresse oxidativo, o qual. 16. leva a um aumento na peroxidação lipídica, que é mensurada através das substâncias reativas. 17. ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007).. 18. Na cinomose canina, assim como na etiopatogenia de diversas outras doenças. 19. neurodegenerativas bem conhecidas em humanos (Parkinson e Alzheimer), o estresse. 20. oxidativo contribui para a ocorrência de lesões no SNC, destacando principalmente a. 21. desmielinização, sendo que os mecanismos patogênicos de muita destas condições são pouco. 22. compreendidos (KARADENIZ et al., 2008; ORSINI & BONDAN, 2008). O SNC parece ser. 23. particularmente vulnerável ao estresse oxidativo, visto que as membranas neuronais contêm. 24. uma alta proporção de ácidos graxos poli-insaturados suscetíveis às EROs, por conseguinte,. 25. ao dano oxidativo (RAO & BALACHANDRAN, 2002). Estudos realizados por.

(32) 32 1. KARADENIZ et al. (2008) comprovaram que existe aumento das concentrações de. 2. malondialdeído (MDA), um produto da peroxidação lipídica, e acúmulo de EROs em cães. 3. infectados com o vírus da cinomose. Segundo estes autores, existe um aumento das. 4. concentrações plasmáticas de marcadores para o dano oxidativo em cães infectados pelo VCC. 5. associado à diminuição das concentrações de antioxidantes não enzimáticos. Apesar de esses. 6. resultados sugerirem insuficiência dos sistemas antioxidantes não enzimáticos durante a. 7. cinomose em cães, não há até o momento estudos associando o estresse oxidativo com. 8. alterações no sistema antioxidante enzimático.. 9. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi verificar as alterações clínicas e. 10. hematológicas, bem como parâmetros de estresse oxidativo, através da mensuração da. 11. peroxidação lipídica e da atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT) e superóxido. 12. dismutase (SOD) em cães naturalmente infectados com o vírus da cinomose.. 13 14. MATERIAL E MÉTODOS. 15. Foram utilizados 54 cães, machos e fêmeas, com e sem raça definida, os quais foram. 16. divididos em dois grupos: cinomose positivo (n=33) e controle (n=21). Os animais positivos. 17. foram atendidos na rotina do Hospital de Clínicas Veterinárias da Universidade Federal do. 18. Rio Grande do Sul (HCV-UFRGS) e utilizados neste estudo mediante autorização de seu. 19. responsável, formalizada pela assinatura do Termo de Consentimento Livre Esclarecido de. 20. Participação em Pesquisa (Apêndice A) e aprovado pela Comissão de Ética no Uso de. 21. Animais da Universidade Federal de Santa Maria, sob o número 032/2012 (2). Os animais do. 22. grupo controle não apresentavam alterações ao exame físico e hemograma, sendo. 23. classificados como hígidos..

(33) 33 1. Foi realizada resenha e anamnese onde se registrou idade, sexo, raça, número de. 2. imunizações, alterações ao exame físico e presença de sinais clínicos descritos como parte do. 3. quadro compatível com cinomose como diarreia, febre, vômito, hiporexia, anorexia, secreção. 4. nasal, tosse, dispneia, apatia, hiperceratose naso-digital (GREENE & APPEL, 2006), além de. 5. sinais neurológicos como mioclonias, convulsão, tremores musculares, tetraparesia, ataxia e. 6. depressão (Apêndice B) (NEGRÃO et al., 2007). Foi realizado procedimento de colheita de. 7. sangue para avaliação do estado geral dos animais através de hemograma completo (Apêndice. 8. C e D), além de mensuração de TBARS e atividade de SOD e CAT.. 9. A confirmação/exclusão do diagnóstico de cinomose foi realizada através da técnica. 10. de RT-PCR (Reação em Cadeia da Polimerase pela Transcriptase Reversa) a partir de. 11. amostras de swab retal e/ou soro em todos os cães, incluindo os do grupo controle. Para a. 12. realização dos exames laboratoriais foram obtidos 6,8 mililitros de sangue total através de. 13. punção da veia jugular por sistema a vácuo 1, armazenados em três tubos distintos: um. 14. contendo EDTA (hemograma), um sem anticoagulante (TBARS) e outro contendo citrato de. 15. sódio (SOD e CAT). O hemograma foi realizado imediatamente após a colheita de sangue e o. 16. material para a realização dos demais exames foi congelado a -18ºC para determinação. 17. posterior dos parâmetros de estresse oxidativo.. 18. A quantificação das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) foi realizada. 19. em amostras de soro segundo o método de JENTZSCH et al. (1996) modificado e os. 20. resultados foram expressos em ƞmol MDA/mg proteína. A atividade da catalase (CAT) foi. 21. determinada em amostras de sangue total segundo o método espectrofotométrico de NELSON. 22. & KIESOW (1972) e os resultados foram expressos em ƞmol CAT/mg proteína. A. 23. determinação da atividade da superóxido dismutase (SOD) foi efetuada no sangue total pelo. 24. sistema de detecção adrenalina–adenocromo (MISRA & FRIDOVICH, 1972) e os resultados. 25. foram expressos em UI SOD/mg proteína. O teste t Student’s foi utilizado para 1. BD vacutainer®, BD – Brasil. Rua Alexandre Dumas, 1976, Chácara Santo Antônio. Cep: 04717-004 São Paulo -SP.

(34) 34. 1. avaliar diferenças entre os grupos. A análise estatística foi realizada com o programa SPSS. 2. (SPSS 10.0 Chicago, USA). Todos os dados foram expressos como média ± DP.. 3 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO. 5. Os cães cinomose positivos utilizados neste estudo (n=33) foram avaliados. 6. clinicamente de acordo com idade, sexo, raça, histórico vacinal, nutrição, apetite, coloração. 7. da mucosa, grau de hidratação, temperatura retal, presença de vômitos, diarreia,. 8. hiperqueratose naso-digital, secreção ocular, estertor respiratório, secreção nasal, tosse seca,. 9. tonsilite, convulsões, tremores, tetraparesia, ataxia e mioclonias. A maior parte dos cães eram. 10. filhotes de até seis meses de idade, sendo dezesseis machos e dezesete fêmeas, com e sem. 11. raça definida, a maioria não vacinados (n=30). Alguns animais não apresentavam nenhum. 12. sinal clínico (n=2).. 13. As alterações mais frequentemente observadas no exame físico estão representadas na. 14. Tabela 1. O leucograma (Tabela 2) foi a característica mais variável. As contagens variaram. 15. de leucopenia a leucocitose. Infecções bacterianas oportunistas no trato alimentar e. 16. respiratório podem ser observadas em cães com cinomose. Isso justificaria a leucocitose por. 17. neutrofilia (SILVA et al., 2005). Neste estudo, a linfopenia foi um achado pouco relevante,. 18. contradizendo ETTINGER & FELDMAN (1997) e SILVA et al. (2010) que afirmam que a. 19. linfopenia é uma característica consistente. Segundo WEISS & WARDROP (2010) cães. 20. filhotes infectados experimentalmente com o vírus da cinomose, desenvolveram marcada. 21. linfopenia. A trombocitopenia foi um achado frequente nos cães estudados. Sabe-se que para. 22. o gênero Morbillivirus já se observou aumento de anticorpos anti-plaquetas (WEISS &. 23. WARDROP, 2010; SILVA et al., 2010). Lesões no epitélio intestinal causadas pelo vírus,. 24. como consequência da diarreia, além da própria apatia determinada pela doença levam o. 25. animal a recusar o alimento. Dessa forma, a diminuição da ingestão proteica bem como o.

(35) 35. 1. comprometimento intestinal são fatores determinantes na redução dos níveis séricos de. 2. albumina na cinomose (KANECO et al., 1997; SILVA et al., 2005), o que justifica a. 3. hipoproteinemia observada na maioria dos animais.. 4. Anemia também foi um achado importante nos animais deste estudo. A anemia. 5. observada nos cães com cinomose pode ser atribuída ao aumento da destruição dos eritrócitos. 6. ou à diminuição da sua produção. A destruição é determinada pela presença do vírus no. 7. eritrócito ou pela deposição de imunocomplexos na membrana do eritrócito (MENDONÇA et. 8. al., 2000; SILVA et al., 2005). A queda na produção pode ser atribuída à falência da medula. 9. devido ao estresse desencadeado pela doença (MEYER et al., 1995; SILVA et al., 2005). É. 10. importante notar que a membrana dos eritrócitos é rica em ácidos graxos poli-insaturados, um. 11. alvo primário para reações envolvendo os radicais livres, e pode permitir que os eritrócitos. 12. sejam vulneráveis a danos oxidativos (MAY et al., 1998). Além disso, presença de. 13. hemoglobina e ferro, um poderoso catalisador de metal de transição, nos eritrócitos os torna. 14. altamente suscetíveis a danos peroxidativos (CLEMENS & WALLER, 1987). A peroxidação. 15. dos fosfolipídios causa um aumento da rigidez e deformidade das membranas das hemácias,. 16. que por sua vez aumenta a suscetibilidade destes à hemólise (ONGAJOOTH et al., 1996).. 17. O aumento do estresse oxidativo nos cães com cinomose quando comparados ao grupo. 18. controle também foi um dado importante observado neste estudo. A quantificação das. 19. substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), sugestiva da peroxidação lipídica,. 20. mostrou-se mais elevada nos animais com cinomose quando comparada ao grupo controle. 21. (Figura 1). Em contrapartida, a atividade das enzimas antioxidantes SOD e CAT (Figura 2). 22. mostrou-se mais elevada nos cães com cinomose, sugerindo uma resposta do organismo frente. 23. às EROs formadas.. 24. A destruição celular é uma das desagradáveis consequências de reações inflamatórias.. 25. Dos vários componentes do processo inflamatório, as EROs têm sido consideradas como a.

(36) 36. 1. causa da morte celular. As EROs são produzidas pelos neutrófilos sanguíneos, eosinófilos, ou. 2. monócitos/macrófagos que estão acumulados nos sítios de inflamação (HIRATA et al., 2004).. 3. Durante a ativação imunológica por vírus as EROs são produzidas como um mecanismo de. 4. defesa pelos neutrófilos e outras células para a amplificação de sinais (PETERHANS et al.,. 5. 1997). Sabe-se atualmente que estresse oxidativo está invariavelmente associado com. 6. inflamação, particularmente quando o infiltrado inflamatório é dominado por neutrófilos, os. 7. quais possuem uma grande capacidade de gerar espécies reativas de oxigênio (TIDÉN et al.,. 8. 2011).. 9. A remoção dos radicais livres do organismo ocorre a partir de mecanismos de defesa. 10. enzimáticos e não enzimáticos. A ausência ou falha na defesa antioxidante causa um aumento. 11. na peroxidação lipídica e consequentemente acelera reações prejudiciais à célula (RAO et al.,. 12. 2000). A atividade das enzimas antioxidantes é um marcador sensível do estresse oxidativo.. 13. Tanto o aumento quanto a diminuição na atividade das enzimas têm sido relatados em. 14. diferentes doenças como consequência da produção de EROs. Isso ocorre tanto pelo aumento. 15. da regulação da atividade da enzima quanto pela utilização destas enzimas para combater as. 16. EROs. No presente estudo, foi observado aumento nas atividades da SOD e CAT (Figuras 2A. 17. e 2B) provavelmente devido à síntese compensatória destas enzimas nos cães com cinomose. 18. quando comparados ao grupo controle.. 19. Assim como na etiopatogenia de doenças degenerativas bem conhecidas em humanos,. 20. o estresse oxidativo, na cinomose, acaba contribuindo para a lesão tecidual, principalmente no. 21. SNC (KARADENIZ et al., 2008). Além disso, o intenso estresse oxidativo, comprovado pelo. 22. aumento da peroxidação lipídica, independente do desenvolvimento de um mecanismo. 23. compensatório pelas enzimas antioxidantes, presente nos cães com cinomose quando. 24. comparados ao grupo controle (Figura 1) pode contribuir também para o desenvolvimento de. 25. anemia e agravamento da desmielinização nos animais infectados pelo VCC..

(37) 37. 1. CONCLUSÃO. 2. O aumento nos níveis do marcador de estresse oxidativo (TBARS) evidencia. 3. diretamente o acúmulo de EROs na cinomose. A resposta do sistema antioxidante frente ao. 4. estresse oxidativo nos animais positivos para o vírus da cinomose pode ser observada através. 5. do aumento da atividade das enzimas SOD e CAT. Estes resultados sugerem que o estresse. 6. oxidativo está envolvido na etiopatogenia da cinomose em cães.. 7 8. AGRADECIMENTOS. 9. Ao Laboratório de Análises Clínicas Veterinárias da UFRGS, ao Laboratório de. 10. Virologia da UFRGS, ao Laboratório de Análises Clínicas Veterinárias da UFSM e ao. 11. Laboratório de Enzimologia Toxicológica da UFSM pelo auxílio no processamento das. 12. amostras.. 13 14. COMISSÃO DE ÉTICA EM USO DE ANIMAIS. 15. O protocolo experimental foi aprovado pela Comissão de Ética em Uso de Animais da. 16. UFSM, nº 032/2012 (2), de acordo com legislação vigente e os Princípios Éticos publicados. 17. pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).. 18 19. REFERÊNCIAS. 20. BARBOSA, K.B. et al. Estresse oxidativo: conceito, implicações e fatores modulatórios.. 21. Revista de Nutrição, v.23, p.629-643, 2010.. 22. CLEMENS, M. R.; WALLER, H. D. Lipid peroxidation in erythrocytes. Chemistry and. 23. Physics of Lipids, v.45, p.251-268, 1987. 24. ETTINGER, S.J.; FELDMAN, E.C. Textbook of Veterinary Internal Medicine. 7th ed.. 25. Elsevier. 2010. 2218p..