VALMA MARTINS BARBOSA

VALMA MARTINS BARBOSA

Purificação e Propriedades da Gliceraldeído-3-Fosfato

Desidrogeoase de Músculo de

Am s sp

(pato)

Tese apresentada ao Curso de Pós-

Graduação em Bioquímica da Universi­

dade Federal do Paraná para obtenção

do grau de Mestre.

CURITIBA

Te s e o r i e n t a m p e l a p r o f e s s o r a

A O M EU M A R ID O

A G R A D E C I M E N T O S

Ã- pro f e s s o r a Dra. M o m o y o Nakano, p e l a ori e n t a ç ã o da tese e p e l a amizade.

Ãs professoras Dra. Ka z u k o H i s h i d a do Nascimento, Dra. M a ff

ria Lúcia W a mbier K l u p p e l e Liu Un Rigo pela revisão da

tese.

Ao prof e s s o r Celso C a r n i e r i do D e p a r t a m e n t o de M a t e m á t i c a p e l a analise computacional.

Ao prof e s s o r Guido F e rencz do D e p a r t a m e n t o de Farmácia pe la realização das fotografias.

Ao Dr. João Caetano Fortes do D e p a r t a m e n t o de M o r f o l o g i a pelo empréstimo do e s p e c t r o f o t o m e t r o P e r k i n - E l m e r .

A Dra. Muriel M o u r ã o V i e i r a p e l o a u x í l i o e apóio.

à Sra. Ruth L.dos Santos p e l a revisão bibliográfica.

Aos professores, f u n c i o n á r i o s e amigos do D e partamento de B i o química p ela a t e n ç ã o e carinho.

à Coordenação do Curso de P õ s - G r a d u a ç ã o em Bio q u í m i c a pela contribuição na c o n f e c ç ã o desse trabalho.

INDICE

LIS T A DE FIGURAS E T A B E L A S ... , viii

A B R E V I A T U R A S ... x RESUMO ... xi 1. INTRODUÇÃO ... 1 2. M A T E R I A I S E M É T O D O S ... 10 2.1 - M a t e r i a i s ... 10 2.2 - Métodos... 10 2.2.1 - D e t e r m i n a ç ã o de p r o t e í n a ... 10 2.2.2 - A t i v i d a d e enz i m ã t i c a ... 10 2.2.3 - U n idade de enzima ... 11

2.2.4 - Pre p a r a ç ã o e ensaio do gli c e r a l d e í d o -3-fosfato ... 11 2.2.5 - D e t e r m i n a ç ã o da c o n c e n t r a ç ã o do NAD e do N A D H ... 12 2.2.6 - Processo de p u r i f i c a ç ã o ... 12 2.2.6.1 - Extração ... 13 2 . 2 .6 .2 - F r a c i o n a m e n t o com sulfato de amónio ... 13 2.2.6.3 C r o m a t o g r a f i a em DEAESe -p h a d e x A -50 ... 14 2.2.6.4 - M a n u t e n ç ã o da enzima .... 14

2.2.7 - E l e t r o f o r e s e de zona em fitas de po-liacetato de celulose ... 15

2.2.8 E l e t r o f o r e s e em gel de p o l i a c r i l a m i -da em p r e s e n ç a de d o d e c i l sulfato de sodio ... 15

2.2.9 - E l e t r o f o r e s e de disco e m gel de po-liacri l a m i d a ... 16 2.2.10- C r o m a t o g r a f i a em gel s e p h a d e x G-150. 17

2.2,11 - Do s a g e m dos grupos -SH 18 2.2.11.1 - D o s a g e m dos grupos -SH " r á p i d o s " ... 18 2.2.11.2 - D o s a g e m dos grupos -SH "tota i s " ... 19 3, R E S U L T A D O S 3.1 - Purificação da g l i c e r a l d e í d o - 3 - f o s f ato desi-d rogenase ... 2 0 3.2 - Estabilidade da enzima ... 20

3.3 - Critérios de p u r e z a ... 20

3.4 - Determinação do peso m o l e c u l a r ... 21

3.5 - Propriedades oticas e c o n t e ú d o em NAD ... 21

3.6 - Efeito do p H :>bre a a t i v i d a d e e n z i m ã t i c a .. 2 2 3.7 - Determinação ;

a

3.10- Efeito inibitorio do p r o d u t o da reação, NADH, sobre a atividade e n z i m ã t i c a ... 23

3.11- Efeito de íons m e t á l i c o s d i v alentes sobre a atividade da g l i c e r a l d e í d o - 3 - f o s f ato desidro- g e n a s e ... 23

3.12- Titulação dos grupos -SH ... 24

3.13- Efeito de reagentes sulfidrilas na a t i v i d a d e da g l i c e r a l d e í d o - 3 - f o s f ato d e s i d r o g e n a s e de m u sculo dé Anas s p ... 24

4. D I S C U S S Ã O ... 38

5. C O N C L U S Õ E S . , . , ... > 44

6 . A N EXO ... ... 46

U S T A DE FIGURAS E TABELAS

de dodecil sulfato de sódio da g l i c e r a l d e x d o -3 -

fosfato d e s i d r o g e n a s e de m ú s c u l o de Anas s p ... 29

3 - D e t e r m i n a ç ã o do peso m o l e c u l a r a p a r e n t e da glice- r a l d e í d o - 3 - f osfato desid r o g e n a s e de m ú s c u l o de

Anas sp por filtração em gel s e p h a d e x G - 1 5 0 ... 30

4 - D e t e r m i n a ç ã o do peso m o l e c u l a r da s u b unidade da g l i c e r a l d e í d o - 3 - f o s f a t o d e s i d r o g e n a s e de m ú s c u l o de A nas sp por eletroforese em gel de p o l i a c r i l a ­

m i d a em p r e s e n ç a de dodecil s u l f a t o de sódio. ... 31

5 E s p e c t r o de absorção u l t r a v i o l e t a da g l i c e r aldeído -3- f o s f a t o d e s i drogenase de m ú s c u l o de Anas s p . .. 32

6 - 0 perfil da influência do p H na a t i v i d a d e da

gli-c e r a l d e í d o - 3 - f o s f a t o d e s i d r o g e n a s e de m ú s gli-c u l o de

Anas s p ... 33

7 - Efeito da c o n centração de a r s e n i a t o de sodio so

-bre a a t i v i d a d e da g l i c e r a l d e í d o - 3 - f osfato desi - d r o g e n a s e de m ú s c u l o de Anas s p . D e t e r m i n a ç ã o da c o n c e n t r a ç ã o ótima de a r s e n i a t o ... 34

8 - Efeito da concentração de g l i c e r a l d e í d o - 3 - f o s f a t o

sobre a a tividade da g l i c e r a l d e í d o - 3 - f osfato desiL drog e n a s e de m ú s c u l o de Anas s p . D e t e r m i n a ç ã o da cons t a n t e de M i c h a e l i s - M e n t e n ... 35

■

9 - Efeito da c o n c e n t r a ç ã o do NAD sobre a atividade

da g l i c e r a l d e í d o - 3 - f osfato d e s i d r o g e n a s e de mus-

culo de Anas s p . D e t erminação da c o n s t a n t e de

$5ich.aeli'S-Wenten... ... 10- Inibição da g l i c e r a l d e í d o - 3 - f o s f ato d e s i d r o g e n a ­ se de Anas sp p o r N A D H ... Tabelas X - Sumário do p r o c e s s o de p u r i f i c a ç ã o da gliceral - d e í d o - 3 - f osfato desidrogenase de A n a s s p ...

11- Efeito dos íons metálicos d i v a l e n t e s sobre a at_i

vidade da g l i c e r a l d e í d o - 3 - f o s f ato d e s i d r o g e n a s e de m u s c u l o de Anas s p ...

III^ Efeito de r e agentes sulfidrilas na a t i v i d a d e da

g l i c e r a l d e í d o - 3 - f o s f a t o d e s i d r o g e n a s e de m u s c u l o

LISTA DE ABREVIATURAS

GPDH - G l i c e r a l d e í d o - 3 -fosf a t o d e s i d r o g e n a s e

G3P - G 1 i c e r a I d e í d o - 3 - f osfato

NAD - 3-Nicotinamida a d e n i n a d i n u c l e o t í d e o

NADH - 3-Nicotinamida a d e n i n a d i n u c l e o t í d e o reduzido

DPGA - 1 ,3^difosfoglicerato

PGA - 3 -fosfoglicerato

P.M. - Peso Molecular

Km - Constante de M i c h a e l i s - M e n t e n

Ki - Constante de I nibição

SDS - Dodecil sulfato de sédio

EDTA - Etileno d i a m i n o t e t r a a c e t a t o - s a l d i s s o d i c o

Tris - Tris-hid rox ime til amino m e t a n o

N b s2 - Acido 5,5' ditiobis (2 -nitrobenzoico)

TNB~ - íon t i o n i t r o b e n z o a t o

-SH ''rápidos " - Numero de grupos -SH d e t e r m i n a d o por extra

polação no tempo zero da c i n é t i c a da reação com N b s 2 , em tampão tris- H C l 0,05 M, pH 8,2 contendo E D T A 1 mM.

-SH " t o t a i s ” - Numero de grupos -SH da enzima determinado

em presença de u r é i a 8 M.

R E S U M O

A g l i c e r a l d e i d o - 3 - f o s f ato d e s i d r o g e n a s e ( EC 1.2.

1.12 ) de musculo de Anas sp (pato) foi p u r i f i c a d a pelo

método de Cori et a l (15), com algumas m o d i f i c a ç õ e s . A e n zima foi de m o n s t r a d a ser pura por e l e t r o f o r e s e em gel de pol i a - crilamida na p r e s e n ç a e ausência de SDS e p o r elet r o f o r e s e

de zona em fitas de p o l i a c e t a t o de celulose. 0 peso ipolecü

lar foi estimado em 140.000 p a r a a enzima na t i v a e 36.000 para os monômeros. O p H otimo e n c o n t r a d o foi de 8,2. Os v a ­ lores de Km for a m d e t e r m i n a d o s p a r a o g l i c e r a l d e i d o - 3 - f osfa to e p a r a o NAD sendo em torno de 240 y M e 80 yM, r e s p e c t i ­ vamente. Foi d e m o n s t r a d o que o N A D H ê u m inibidor competiti^ vo em relação ao NAD, sendo o Ki de 17 yM. A adição de metais

f 2 . 1 0 -3M ] como M g + + , M n ++ e C a ++ não a l t e r a r a m s

ignifica-+ + + + + +

tivamente a a t i v i d a d e de GPDH, e n q u a n t o Hg , Cu e Zn

inibiram totalmente a enzima. A t i tulação de g r u p o s - S H com

N b s2 indicou 12,7 grupos -SH p o r mol de enzima mas apenas 4

são e s s e n c i a l m e n t e reafivos p o r t e t r a m e r o de enzima. Dos reagentes sulfidrilas testados, o p - h i d r o x i - m e r c u r i b e n z o a - to e o p - c l o r o m e r c u r i b e n z o a t o d e m o n s t r a r a m ser poten t e s inji bidores, mas a inibi ç ã o foi t o t almente r evertida com a a d i ­

ção subsequente de excesso de 2,-mercaptoetanol . A v a l i d a d e

dos dados cinéticos foi a n a l i s a d a através de p rogramas em

INTRODUÇÃO

1

.

A g l í c e r a l d e í d o - 3 - f o s f a t o d e s i d r o g e n a s e (D-glice^ r a l d e í d o - 3 - f o s f a t o : NAD o x i d o r e d u t a s e , E . C . 1.2.1.12) é uma

das e n zimas chaves da • v i a g l i c o l i t i c a e desempe -

nha um papel essencial no m e t a b o l i s m o de carboidratos. Seu papel é a f o s forilação o x i d a t i v a do g l i c e r a l d e í d o - 3 - f osfa-

to em 1 -3 -d i f o s f oglicerato (Fig. A).

A sequência de a m i n o ã c i d o s da GPDH jã foi determ_i nada p a r a algumas espécies c o m o B. s t e a r o t h e r m o p h i l u s (55), Thermus aquaticus (34), l e v e d u r a (36), m u s c u l o de lagosta

(18) ,e musculo de porco 0 2 ) * A t r a v é s destes estudos conclu iu-se que a GPDH, de modo geral, ê u m a p r o t e í n a composta de quatro subunidades. Cada m o n ô m e r o c o m p r e e n d e 330 resídu os de am i n o ã c i d o s c o r r e s p o n d e n d o a u m peso m o l e c u l a r de 36.-000, sendo a cisteína-149 se m p r e e n v o l v i d a d i r e t a m e n t e na a t i v i d a d e catalítica. E s t u d o s c r i s t a l o g r ã f i c o s (11,44) tem d e m o n s t r a d o que a e s t r u t u r a d a sub u n i d a d e consi s t e de dois domínios. 0 primeiro d o m í n i o c o m p r e e n d e os resíd u o s d e

1 a 149 e ê sobretudo o d o m í n i o de ligação do coenzima. 0

segundo, envolve os r e s í d u o s de 149 a 334, e c o rrespondeao domínio catalítico, que p r o v ê r e s í d u o s p a r a catálise, espe c i f i c i d a d e e c o o p e r a t i v i d a d e ent r e as s u b u n i d a d e s . .Segundo

Olsen et al (44) a s e q u ê n c i a de a m i n o ã c i d o s da GPDH ê

mais a l t a m e n t e conservada na r e g i ã o do d o mínio catalítico. Dados de difra ç ã o de r a i o s - x m o s t r a m que os cris tais d a h o l o e n z i m a exibem u m a cor a m arela característica, são o r torrômbicos (P 222) com o t e t r â m e r o como u n idade

as-CHO

h

A

I

CH2OPO3

+ NAD

+ E-SH

C -S -E

HCOH

/P

C -S -E

A

CH2OPO3

_COOH

HCOH

C-O-PO^

CH2OPO3

+ NADH+H+

simétrica. A s s u m i n d o que as quatro su b u n i d a d e s são quimicamente e q u i v alentes, mas c r i s t a l o g r a f i c a m e n t e dife - rentes e c o m a aju d a da s equência de aminoãcidos, pode- se fazer um m a p a e s q u e m á t i c o da GPDH (Fig. B ) .

Para d e f i n i r a e s trutura da G P D H tem sido usado

um s i stema de co o r d e n a d a s de eixos P, Q e R s i milar ao u t ^ lizado p a r a d e s i d r o g e n a s e lãtica (1), (Fig. C ) .0 traço mais marcante na e s t r u t u r a é que embora e x i b i n d o aparente s i m e ­

tria 222, o tetr â m e r o consiste f u n c i o n a l m e n t e de u m dímero de dímero r e l a c i o n a d o s através do eixo Q. A região de m a i ­

or interação entre as subunidades ê através do eixo P. Os

contatos r e l a c i o n a d o s ao eixo Q são r e l a t i v a m e n t e poucos e não tão c o nservados, enquanto os c o n t a t o s r elativos ao e i ­ xo R são mais n u m e r o s o s e mais co n s e r v a d o s (11).

A G PDH é a ú n i c a das d e s i d r o g e n a s e s na qual a pre paração c r i s t a l i n a ori g i n a r i a de m ú s c u l o pos s u i NAD f i r ­

memente ligado. Ha apr o x i m a d a m e n t e 3 a 4 mol e s de NAD l i ­

gados por mol de enzima. Para a enzima de músculo, foi moj;

trado que a afin i d a d e p elo NAD d e c r e s c e com o aumento do

número de m o l é c u l a s l i g a d a s ,a p r e s e n t a n d o o que se chama coopera t i v i d a d e n e g a t i v a (9, 14). Em contraste, a enzima de levedura exibe c o o p e r a t i v i d a d e p o s i t i v a e ê c r i s t a l i z a d a como apoe n z i m a (37,38).

0 sítio ativo da GPDH envolve o resíduo de cisteí n a - 149 o qual em p r e s e n ç a de N A D + e de G3P forma u m i n t e r ­ mediário tio- e s t e r ac i l - e n z i m a (Fig. A). A GPDH é especifi ca p ara o NAD; este coenzima não p o d e ser s u b s t ituído pelo NADP que é incapaz de se ligar â enzima. Al g u n s análogos

4,

5.

Fig. C - D i a g r a m a da associação das subunidades na GPDH.

sintéticos do NAD como a t i o n i c o t i n a m i d a a d enina dinucleo- tídeo, são reduzidos p e l a enzima mas não de f o rma tão efetil va como o NAD. S e g u n d o D u g g l e b y § Dennis (21) os substratos fisiológicos da G P D H (G3P, NAD, fosfato inorgânico), e x e r ­ cem algum grau de i n i b i ç ã o assim como os p r o d u t o s da reação DPGA e p r i n c i p a l m e n t e o NADH.

P ara e x p l i c a r a ação da GPDH tem sido p r o p o s t o o

mecanismo do tipo p i n g - p o n g , inicialmente suger i d o por S e ­

gai § Boyer (48). E s t e mec a n i s m o , e s q u e m a t i z a d o n a Fig. D , foi revisto e c o n f i r m a d o por outros autores como H a r r i g a n e

Trentham (30)e D u g g l e b y § Dennis (21). R e cente trabalho de

Cardon § Boyer (13) dã apoio a uma p r o p o s t a que é compatí - vel com o m o d e l o que sugere a alternância de sítios c a t a l í ­

ticos como e s q u e m a t i z a d o na Fig. E.

G eralmente, o isolamento da GPDH tem como etapa de terminante o f r a c i o n a m e n t o com sulfato de amónio (15,17,25 33,47), jã que o N A D ligado ã enzima é a ltamente solúvel em elevadas c o n c e n t r a ç õ e s desse sal. Extra ç ã o por c r o m a t o g r a - fia de a finidade em N A D imobilizado foi u t i l i z a d a p a r a GPDH de b actérias com b a s t a n t e êxito (31).

N estes ú l t i m o s anos, estudos compa r a t i v o s têm sido

feitos i s o l a ndo-se a G PDH de vãrios tecidos de n u m e r o s a s

espécies. Devido ao fato dela conservar sua c o m p o s i ç ã o e

sequência de a m i n o ã c i d o s por u m longo pe r í o d o e v o l u c i o n á r i o

esta en z i m a pode ser u m ótimo instrumento p a r a inve s t i g a -

ções f i l o g e n é t i c a s e fisiológicas. As relações f i l o g e n é t i -

cas entre os seres v i v o s , interpretados somente â luz de

métodos c o n v e n c i o n a i s , tais como, analise m o r f o l ó g i c a de

espécies vivas e fósseis, p o d e m estar sujeitas a erros. Co

7 o

Fig. D - M e c a n i s m o catalítico da G P D H e s q u ematizado em

8.

N

Fig. E - E s q u e m a de catálise da g l i c e r a l d e í d o - 3 - f o s f a t o de- s i d r o g e n a s e com c o o p e r a t i v i d a d e c a t a l í t i c a entre as s u b u n i d a d e s (13).

mo alternativa de estudos destas relaç õ e s f i l o g e n é t i c a s , a analise estrutural de proteínas, de e v o l u ç ã o lenta ou de evo lução r ã p i d a ,fornece valiosos subsídios p a r a novas interpre tações e estabele c i m e n t o de novas linhas filog e n e t i c a s (29). A g l i c e r a l d e í d o - 3 - f o s f ato d e s i d r o g e n a s e jã foi iso lada e estud a d a em aves. A l i s s o n § K a p l a n (2) i s o l a r a m a GPDH de m ü s c u l o de faisão, p e r u e g a l i n h a e r e a l i z a r a m estu dos sobre constantes de sedimentação, c o m p o s i ç ã o de aminoã- c i d o s , reatividade dos grupos s u l f i d r i l a s e reativ i d a d e com os análogos do coenzima N A D + . Todos os p a r â m e t r o s estudados

m o s t r a r a m ser semelhantes para as três aves. Petell et al

(4 5 ) r e l a t a r a m um processo de s e p a r a ç ã o de sete principais

enzimas da via glicolítica, incluindo a GPDH, que p o d e m ser s im u l t a n e a m e n t e extraídas de uma m e s m a a m o s t r a de müsculo e squelético de galinha. As enzimas f o r a m julgadas puras atra

vês da analise de eletroforese em gel de p o l i a c r i l a m i d a em

presença de SDS.

Estudos cinéticos r e f e rentes â G PDH de aves foram encontrados na literatura. V i s a n d o a m p l i a r o estudo da GPDH em aves nosso trabalho se propôs, a p u r i f i c a ç ã o da enzima de Anas sp £pato) e ao estudo de algumas de suas p r o p r i e d a ­ des f í s i c o - q u í m i c a s . Tendo por objeto u m m e l h o r ajuste dos dados .cinéticos foi elaborada também, uma analise estatísti^ ca dos resultados.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2*1. MATERIAIS

G 3 P , NAD, N A D H , N b s 2 , acrilamida, h e m o g l o b i n a " c r o s s - linked", catalase, aldolase, citocromo c e s oro de albumina

bovina foram obtidos da Sigma Chemical Co. D E AE- Sephadex

A-50, S e p h a d e x G-150 e r a m produtos da P h a r m a c i a Fine C h e m i ­ cals e as fitas de p o l i a c e t a t o de celulose da Chemetron.

Todos os outros p r o d u t o s utilizados f o r a m de grau a n a ­ lítico .

2.2. MÉTODOS

2.2.1. DITERMINAÇXO DA PROTElNA

A p r o t e í n a foi d e t e r m i n a d a p elo m é t o d o de W a r b u r g § C hristian (56) e também segundo Lowry et al (41) , usando so ro albumina como padrão.

2.2.2. ATIVIDADE ENZIMÂTICA

A a t i v i d a d e da g l i c e r a l d e í d o - 3 - f o s f a t o d e s i d r o g e n a s e foi m e d i d a e s p e c t r o f o t o m e t r i c a m e n t e a 25°C s e g u n d o o método de Dagher 5 Deal (17) c o m algumas m o d i f i c a ç õ e s . A m i s t u r a de ensaio em u m volume final de 1 ml continha: tampão Tris- HC1 0,05 M, p H 8,2, E D T A 1 mM, 2-me r c a p t o e t a n o l 1 mM, NAD

1,5 mM, g l i c e r a l d e í d o - 3 - fosfato 1,5 mM, a r s e n i a t o de sodio 30 m M e 0,1 a 0,5 n g de proteína. A reação era inici a d a p e ­ la adição de D - g l i c e r a l d e í d o - 3 - f o s f a t o dev i d o â sua instabi_ lidade em soluções aquosas (17,52).

11

As v e l o c i d a d e s de redução do NAD f o r a m d e t e r m i n a ­

das na v e l o c i d a d e inicial em intervalos de 1 0 a 30 seg u n -

dos a 340 nm.

Du r a n t e o p r o c e s s o de p u r i f i c a ç ã o foi u t i l i z a d o o espect r o f o t ô m e t r o Be c k m a n DB. As p r o p r i e d a d e s f í sicas e cinéticas da e n z i m a foram d e t e r m i n a d a s no e s p e c t r o f o t o m e t r o

Perkin-Elmer d i g i t a l X 1 (u.v.-visível) com s e n s i b i l i d a d e

de resposta de u m segundo.

2.2.3. UNIDADE DE ENZIMA

Uma u n i d a d e de enzima foi d e f i n i d a como a q u a n t i d a ­

de de enzima que catal i s a a redução de 1 u m o l de NAD por

minuto nas c o n d i ç õ e s de ensaio, a 25°C.

A a t i v i d a d e e s p e c í f i c a foi expre s s a como u n i d a d e s de -enzima p o r m i l i g r a m a de proteína.

2.2.4. PREPARAÇÃO E ENSAIO DO GLICERALDEÍDO-3-FOSFATO

A s o l u ç ã o de D L - g l i c e r a l d e í d o - 3 - f o s f ato foi p r e p a r a da a pa r t i r do D L - g l i c e r a l d e í d o - 3 - f o s f a t o d i e t i l a c e t a l sal de bario. O., sal era dissolvido com v i g o r o s a agita ç ã o em ã- gua dei o n i s a d a contendo uma s uspensão de Dowex 50 W X 4,re sina cati õ n i c a (15 g resina/ g de sal, forma H + ) . A solu - ção era a q u e c i d a em banho fervente p o r 3 minutos, r e s f r i a ­ da em banho de gelo e filtr a d a através de Millipore para a se

-terminada enzimaticamente em presença de excesso de NAD, arseniato de sõdio e GPDH, de ac o r d o com o m é t o d o de Da g h e r 5 Deal (17). A concentração de G3P era expre s s a em função do isômero atji vo calculada p e l a s e g u i n t e equação: 12. D . 0 . , . n . volume sistema /~"7n A* 34U nm G3P m M = 6 , 2 2 . v o l u m e amos t r a

Na hora do uso o p H era acertado p a r a 7,0 com u m a st) lução de KOH 15%.

2.2.5. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DO NAD E DO NADH

A d e t e r m i n a ç ã o do NAD era fei t a e s p e c t r o f o t o m e t r i c a - mente a 260 nm, u s a n d o - s e o c o e f i c i e n t e de extinção m o l a r

17.600 M_ 1 c m - 1 . U m a alíqu o t a de NAD era d i luída em tampão

Tris-HCl 0,05 M, p H 8,2 e a operação r e p e t i d a pelo menos du as v e z e s . NAD m M = n n • v o l u m e sistema u , u * 260 nm 1 7 ^ 6 . volume amostra A c o n c e n t r a ç ã o de N A D H foi d e t e r m i n a d a e s p e ctrofoto metricamente da m e s m a m a n e i r a que p a r a o NAD, u s a n d o - s e o coeficiente de e x t i n ç ã o m o l a r 6.220 M ^ cm ^ (35).

2.2.6. PROCESSO DE PURIFICAÇÃO

A GPDH de A nas sp foi p u r i f i c a d a segundo o m é t o d o de Cori et al (15) com algumas modi f i c a ç õ e s . Todas as ope

rações foram efetuadas entre 0-4°C. 0 fraci o n a m e n t o com s u l ­ fato de amõnio foi feito com a d ições vaga r o s a s do sal sõli -

do sob a g i t a ç ã o suave. E m t o d a s as etapas houve controle do

pH e alíquotas foram r e t i r a d a s para testes en z i m ã t i c o s e do

sagem de proteínas.

2.2.6.1.

EXTRAÇÃO

A ave foi m o r t a p o r decapitação, r a p i d a m e n t e d e p e ­ nada e seu m u s c u l o p i c a d o e s e p a r a d o de nervos e gorduras. 0

müsculo foi passado p o r u m m o e d o r de carne eletr i c o e a p r £

teína foi extraída a d i c i o n a n d o - s e ao m u s c u l o m o í d o (450 m l ) o dobro do v o l u m e de KOH (900 ml) 0,03 N, contendo 2-mercaptoe^ tanol 1 mM, A m i s t u r a p e r m a n e c e u em repouso p o r 20 m i n u t o s e em seguida f o i filtr a d a a t r a v é s de gaze.

2.2.6.2.

F M CI ONÂ MÜNT © COM SULFATO DE AMONIO

Ao filtrado (750 ml) foi adicionado lentamente sul

fato de a m õ n i o solido de m o d o a ser obtida uma saturaçao de

a proxim a d a m e n t e 52%. A m i s t u r a p e r m a n e c e u em r e pouso durante 30 m i n u t o s e cs p r e c i p i t a d o foi removido por c e n t r i f u g a ç ã o a 7.800 g durante 30 minut o s . A o sobrenadante (740 ml) resul -

tante foi adicionado s u l f a t o de amõnio solido, v i s a n d o u ma

saturação de 1 2 % . A m i s t u r a foi c e n t r i f u g a d a a 7.800 g d uran

te 30 m i n u t o s e o p r e c i p i t a d o desprezado por conter baixa a- tividade específica. 0 p H da fração sobrenadante (765 ml)f o i ajustado p a r a 8,4 com N H ^ O H e deixado em repouso na camara fria por aproxima d a m e n t e 70 horas, na tentativa de c r i s t a l i ­ zação da enzima. Não tendo s ido obtido os cristais e, sim,um

pr e c i p i t a d o amorfo, a s o lução foi c e n t r i f u g a d a a 7.800 g du rante 30 minutos. A solução s o b r e n a d a n t e foi des p r e z a d a e o precipitado foi suspenso e m E D T A 5 mM, p H 7,6 e c o l o c a d o pa ra dialisar contra uma s o lução s a t u r a d a de sulfato de amo - nio pH 8,4, contendo 2 - m e r c a p t o e t a n o l 1 mM, com o obj e t i v o de concentrar o m a t e r i a l p r o t e i c o p a r a etapa seguinte de pu r i f i c a ç ã o .

2.2.6.3.

CROMATOGRAFIÃ EM DEAE-SEPHADEX A-50

A solução de e n z i m a da e t a p a anterior (50 ml) foi

dialisada contra 500. v o l u m e s de tampão Tris-HCl 0,05 p H 8,0, contendo E DTA 1 m M e 2 - m e r c a p t o e t a n o l 1 m M por 24 h e c u i d a ­ dosamente colocada n u m a c o l u n a de D E A E - S e p h a d e x A-50 (2,1 x 38 cm) equilibrada com ta m p ã o T r i s - H C l 0,05 M, p H 8,0, con - tendo E D T A 1 m M e 2 - m e r c a o t o e t a n o l 1 mM, sendo a enzima eluí^ da com o mesmo tampão. 0 flu x o da c o l u n a era de 0,3 m l / m i n e

frações de 3 ml foram coletadas. A ab s o r b â n c i a foi m e d i d a a

280 e 260 nm. A enzima n ã o foi r e t i d a nesta coluna (49) e

saiu imediatamente apos o v o l u m e m o r t o (39 m l ) .

2.2.6.4. MANUTENÇÃO DA ENZIMA

As frações de m a i o r a t i v i d a d e e s p e c í f i c a (26 ml) fo­ ram reunidas e dialisadas c o n t r a u m a s o l u ç ã o de sulfato de amo- nio saturada, p H 8,4 c o n t e n d o E D T A 1 m M e 2 - m e r c a p t o e t a -

nol 1 mM. A solução de G P D H foi então, m a ntida a 4°C sem

perda sensível de ativ i d a d e por vã r i o s meses. M e n s a l m e n t e , o pH da solução e n z i m â t i c a era v e r i f i c a d o e eram acr e s c e n t a d a s quantidades de 2 - m e r c a p t o e t a n o l (lmM) e, de NAD (lmM) (3) para a proteção da ativ i d a d e da enzima.

A cada ex p e r i m e n t o a e n z i m a era dial i s a d a contra

tampão Tris HC1 0,05 M, pH 8,2, c o n t e n d o EDTA 1 m H e 2-mer^

captoetanol 1 m M n u m volume de 1:500, sendo a conc e n t r a ç ã o de prote í n a d e t e r m i n a d a e s p e c t r o f o t o m ê t r i c a m e n t e a 280 n m u- sando co e f i c i e n t e de extinção igual a 1,0 ml mg ^ cm ^ (47).

2.2.7. BLBTR0P0RIS1 Dl ZONA BM FITAS DE POLIACETATO DE CE­

LULOSE

A e l e t r o f o r e s e de zona em fitas de p o l i a c e t a t o de

celulose foi e f e t u a d a em tampão a c e t a t o de amónio 0,025 M,

pH 5,8. As fitas f o ram m e r g u l h a d a s no tampão antes d a apli^

cação da p r o t e í n a (15-50 pg) sen d o o p o nto de a plicação da

amostra e q u i d i s t a n t e dos eletrodos. A eletroforese foi c o r ­

rida a 250 V, 2,5 m A por fita, d u r a n t e 5 horas a 4°C. A b a n ­

da de p r o t e í n a foi fixada com aci d o tricloro a c ê t i c o 1 0 % e

corada com azul de comassie b r i l h a n t e R (6,25 mg do corante + 228 ml de m e t a n o l 50% v/v + 23 ml de ãcido acético glaci - a l ) . A m i s t u r a d e s c o l o r a n t e c o n t i n h a metanol, agua e ãcido acético (9,5:9, 5: 1).

2.2.8. ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA EM PRESENÇA DE

SDS

0 peso m o l e c u l a r das s u b u n i d a d e s assim como a homoge

15,

neidade da enzima f o r a m verificados através de e l e t r oforese em gel de p o l i a c r i l a m i d a em S D S (58) . Os géis a 10°$ em p o l i a crilamida, contendo 0 ,1 % de SDS for a m p o l i m e r i z a d o s em ci -

lindros de vidro (0,6 x 9,5 cm). P ara a calibração do gel

foi u t i l i z a d a a " h e m o g l o b i n a c r o s s - l i n k e d " como pro t e í n a

marcadora, c o n s i d e r a n d o pesos m o l e c u l a r e s aproximados de

16.000, 32.000, 48.000 e 64.000, c o r r e s p o n d e n d o r e s p e c t i v a ­ mente ao monomero, dímero, trímero e tetrâmero, de acordo

com o b o l e t i m técnico n9 MWS-877 da Sig m a Chemical Co. A

quantidade de GPDH u t i l i z a d a v a r i o u de 10 a 40 y g . A s bandas de p roteínas foram l ocalizadas i m e r g i n d o o gel por a proxima damente 3 horas n uma solução conte n d o 227 ml de azul de co- massie brilhante R. A d e s c o l o r a ç ã o foi feita numa solução

de 25 m l de metanol, 37,5 ml de ãcido acético glacial pa r a

500 ml de ãgua destilada.

2.2.9.

ELETROFORESE DE DISCO EM GEL DE POLIACRILAMIDA

A eletroforese da GPDH n a t i v a de m u s c u l o de pato

foi efetuada pelo m é t o d o de K u chler (39) com algumas m o d i f i

cações, apos inúmeras tentativas infru t í f e r a s de u t i l i z a -

ção de métodos mais conhecidos ( 1 9 , 2 6 , 3 9 ) .Os géis foram p o ­ limerizados em cili n d r o s de vidro (0,6 x 9,5 cm). 0 gel s e ­

pa rador era 2,5% em a c r i l a m i d a (pH 5,9), enquanto o gel de

corrida continha 6 % de acrilamida. A r i b o f l a v i n a a 4% foi

u til i z a d a como ca t a l i s a d o r na p o l i m e r i z a ç ã o de ambos os géis. A eletroforese foi efetuada e m tampão ãcido acêtico-

KOH 0,03 N, p H 4,3 com o qual t a m b é m fora preparado o gel

de corrida. A qua n t i d a d e de p r o t e í n a aplic a d a v a r i o u de 20 a 100 yg. A s eparação foi feita us a n d o uma corre n t e de 2 mA por tubo d u r a n t e 4 horas em media. A p r o t e í n a foi corada

com azul de comassie b r i l h a n t e G (8), sendo os géis m a n t i ­

dos nes t a s o lução d u rante 48 horas e então co n s e r v a d o s em

1 ^ 0 destilada.

2.2.10.

CROMATOGRAFIA EM GEL SEPHADEX G- 150

0 gel S e p h a d e x G- 150 finç foi p r e p a r a d o de acordo com A n d r e w s (5) e C u rling (16) e foi u t i l i z a d o com o objeti

vo de e s t i m a r o peso m o l e c u l a r da GPDH nativa, Uma coluna

de 2,2 x 6 8 cm com u m fluxo de 0,36 m l / m i n foi e m p a cotada a

10°C em câ m a r a fria onde t a m b é m o c o r r e u o experimento, com

uma p r e s s ã o de opera ç ã o de 10 cm em ãgua. A col u n a foi equ_i librada e eluída com tampão Tris- H C l 0,05 M, p H 8,0 ^conten do EDTA 1 m M e 2- m e r c a p t o e t a n o l 1 mM. As p r o t e í n a s usadas

como p a d r ã o foram ident i f i c a d a s ou através da a b s o r b â n c i a ou através de ensaios enzimãticos. As p r o t e í n a s foram diluí das em 2 ml no tampão de eluição. A amostra era c o n stituída

de azul de d e x t r a n a 2.000 (P.M. 2. 10 X m a x 625 nm) cata

lase (P.M. 240.000, X m a x 405 n m ) , aldolase (P.M. 158.000 , ensaio enz i m ã t i c o (50), X m a x 340 n m ) ,album i n a (P.M. 67.000 X max 280 nm) e a g l i c e r a l d e í d o - 3 - f o s f a t o d e s i d r o g e n a s e en­

saio enzimãtico, como d e s c r i t o em Mate r i a i s e Métodos. F r a ­

ções de 3 ml foram separadas u s a n d o o coletor automático

LKB 7000. 0 volume m o r t o da coluna foi de 85 ml. 0

peso m o l e c u l a r da G PDH de Anas sp foi calc u l a d o de

18.

acordo com o m é t o d o de Andrews (5).

2.2.11.

DOSAGEM DOS GRUPOS -SH

A t i t u l a ç ã o dos grupos -SH foi feita s e gundo o m é ­

todo de E l l m a n (23) . 0 N b s2 reage e s p e c i f i c a m e n t e c o m os

tiois a p H 8,0 dan d o um mol de t i o n i t r o b e n z o a t o (TNB ) por

mol de tiol, s e g ü n d o a reação

N b s 2

O N b s2 absorve a 330 nm e o produto, o T N B , c o l o ­

rido, a p r e s e n t a um máximo de absorção a 412 nm.

2.2.11.1.

DOSAGEM DOS GRUPOS -SH"RÁPIDOS”

P a r a a dosagem de grupos -SH"rãpidos',' a enzima foi d i a l i s a d a c o n t r a tampão Tris- HC1 0,05 M, p H 8,2, EDTA 1 mM, em ausência de 2-mercaptoetanol por aproximadamente 16 horas.

O s i s t e m a de incubação ( 1 ml) era c o n s t i t u i d o

de enzima (5,2 yM) , em prese n ç a de N b s2 0,6 m M e tampão Tris

minuto. P ara o cálculo dos grupos -SH foi util i z a d o o coefi^ ciente de extinção de 13.600 M ^ cm ^ p a r a o TNB , a 412 nm.

2.2.11.2

DOSAGEM DOS GRUPOS -SH"TOTAIS"

0 sistema de i n c u b a ç ã o ( 1 ml) p a r a a determinação

dos grupos -SH totais da G P D H era c o n s t i t u í d o de e n z i m a (2,1

pM) , u r e i a 8M, tampão T r i s - H C l 0,05 M, pH 8,2. Essa mistura

foi incub a d a por um minuto, ã t e m p e r a t u r a ambiente. A rea -

ção foi iniciada p ela ad i ç ã o de N b s2 0,6 m M e a titulação

foi feita como na etapa 2.2.11.1. A ab s o r b ã n c i a foi lida a- pos cinco minutos.

20.

3.1.

PURIFICAÇÃO DA GL1CERALDEÍDO-3-FOSFATO DESIDROGENASE

A GPDH de Anas sp foi p u r i f i c a d a segundo o método de Cori et al (15) seguida apenas de uma c r o m a t o g r a f i a em DEAE Sephadex A-50. Os resultados de u m a p u r i f i c a ç ã o típica e s ­ tão r e s u m i d o s na Tabela I. F o r a m obtidos 190 m g de enzima pura com a lta atividade e s p e c í f i c a (203 U/ijig) . Em b o r a a en

zima não tenha sido c r i s t a l i z a d a ela p ode ser c o n siderada

homo g ê n e a p o r eletroforese em gel de polia c r i l a m i d a .

3.2.

ESTABILIDADE DA ENZIMA

A e n z i m a p u r ificada p e l o m é t o d o descr i t o demon s t r o u ser m u i t o estãvel em solução s a t u r a d a de s u lfato de amónio, pH 8,4, conte n d o EDTA l.mM e 2 - m e r c a p t o e t a n ó l 1 m M a tempe

ratura de 4°C. Apos 9 meses de sua p u r i f i c a ç ã o a GPDH de

mú sculo de Anas sp ainda a p r e s e n t a v a 901 da a t ividade in i ­ cial .

3.3.

CRITÉRIOS DE PUREZA

Na eletroforese de zona e m fitas de p o l i a c e t a t o de

celulose em pH 5,8, a r e v e l a ç ã o r e g i s t r o u u m a úni c a banda,

4 , 1 cm dista n t e da ori g e m em d i r e ç ã o ao catodo, demonstran

do ser a G P D H de m ú sculo de p ato uma enzima bãsica.

A p u r e z a e a h o m o g e n e i d a d e da en z i m a foi também veriL

ficada por e l e t r o f o r e s e era gel de p o l i a c r i l a m i d a na a u s ê n c i a

de SDS em p H 4,3 (Fig. 1) e na p r e s e n ç a de SDS (Fig. 2). Em

ambas foi revelada u m a ú n i c a banda. Em p H 9,0 (19) a p r o t e í - na-enzima não migrou, p r o v a v e l m e n t e devido ao seu alto p o n t o

isoelêtrico. T a m b é m em p H 7,5 (26) a G PDH p r a t i c a m e n t e não

migrou, aparecendo u m a ú n i c a banda de p r o t e í n a m u ito p r ó x i m a

ã origem, coincidente c o m a banda d e t e c t a d a pelo teste de

atividade da enzima.

3.4.

DETERMINAÇÃO DO PESO MOLECULAR

0 peso m o l e c u l a r da G P D H de Anas sp foi d e t e r m i n a d o por filtração em S e p h a d e x G- 150 e por e l e t r o f o r e s e em gel de p o l i a c r i l a m i d a em p r e s e n ç a de SDS. A enzima foi el u í d a em coluna de gèl S e p h a d e x G-150, sendo estimado p a r a â m e s m a u m peso m olecular aparente de 1 4 0 . 0 0 ® daltons (Fig. 3).

0 peso m o l e c u l a r das su b u n i d a d e s foi estimado por e l e ­

troforese em gel de p o l i a c r i l a m i d a em p r e s e n ç a de SDS, i n d i ­ cando um valor de 36.000 (Fig. 4), sugerindo que a en z i m a de músculo de pato a s s i m c o m o v e r i f i c a d o na m a i o r i a das outras

espécies tem e s t r u t u r a q u a t e r n á r i a , tetramérica.

3.5. PROPRIEDADES ÕTICAS E CONTEÚDO DE NAD

A h o l o enzima p u r i f i c a d a apre s e n t a u m val o r má x i m o de

absorção a 278 nm (Fig. 5). A razão A2 gQ^ ^ 2 6 0 e n c o n trada pa

ra a GPDH de músculo de p a t o fói 1,16 e segundo Seydoux et

al (49) sugere que esta h o l o e n z i m a possui a p r o x i m a d a m e n t e 3,7 moles de NAD ligados p o r mol de enzima.

22.

3.6.

EFEITO DO pH SOBRE A ATIVIDADE ENZIMÃTICA

O perfil da a t i v i d a d e d a GPDH em função do p H ê m o s ­

trado n a Fig. 6 . 0 p H ótimo foi estimado ser em torno de

8,2, u s a n d o - s e um s i s t e m a com tampão Tris-HCl. D u r a n t e o processo de p u r i f i c a ç ã o da e n z i m a os testes e n z i m ãticos f o ­ ram realizados em p H 8,0.

3.7. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO ÓTIMA DO ARSENIATO

A c o n c e n t r a ç ã o óti m a de arse n i a t o foi v e r i f i c a d a no sistema de ensaio já desc r i t o , v a r i a n d o apenas a c o n c e n t r a ­

ção de arseniato. Como m o s t r a d o na Fig. 7, a con c e n t r a ç ã o

ótima do arseniato e de 30 mM.

3.8.

EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO GLICERALDEÍDO-3-FOSFATO. DE

TERMINAÇÃO DA CONSTANTE DE MICHAELIS-MENTEN

Para o estudo do e f e i t o do G3P foi con s t r u í d o um g r á ­ fico, cuja variável era a c o n c e n t r a ç ã o deste s ubstrato (Fig*

8 ). O Km obtido p e l o m e t o d o de L i n e w e a v e r - B u r k (40), u s ando

regressão linear foi de 218 y M e por regressão não linear

(28) de 240 yM, em p H 8 ,2 e a 25°C.

3.9. EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO NAD. DETERMINAÇÃO DA CONS -

TANTE DE MICHAELIS-MENTEN

a vel o c i d a d e da reação foi c o n s t r u í d o um gráfico c uja v a r i ã vel era a c o n c e n t r a ç ã o de NAD(Fig. 9). Os dados experimentaijS’

foram, avaliados pelo método de Lineweaver-Burk(40), fornecendo um Km

de 85 y M por regressão linear é de 8 0 y M p o r regressão n ã o line ar (28), em p H 8,2 e a 25°C.

3.10. EFE I T O INIBITÓRIO DO P R O D U T O DA REAÇAO, NADH, S O B R E

A A T I V I D A D E E N Z I M Í T I C A

Os resultados m o s t r a r a m que o N A D H ê u m inibidor com - p e t i t i v o em relação ao NAD c omo s ubstrato v a r i á v e l (Fig. 10) em p r e s e n ç a de G3P em c o n c e n t r a ç ã o saturante. Os gráficos de inibição f o ram analisados p o r r e g r e s s ã o linear e não linear

fornecendo um valor da c o n s t a n t e de inibição (Ki) de 30 yM

e 17 yM, r e s pectivamente.

3.11. E F E I T O DE ÍONS M E T Á L I C O S Dl V A L E N T E S S O B R E A A T I V I D A D E D A G P D H D E MíJSCULO D E A N A S SP.

O efeito de vários íons metálicos, na c o n c e n t r a ç ã o 2 mM, sobre a a t i v i d a d e da e n z i m a foi estudado. Para os en - saios, a enzima foi p r é - i n c u b a d a p o r 1 0 m i n u t o s em p r e s e n ç a

do r e s pectivo íon metálico, na ausên c i a de G3P. Como m o s t r a

a Ta b e l ã II a GPDH foi t o t a lmente inibida pelos íons m e r c ú -

rio, cúprico e zinco. A a t i v i d a d e enz i m ã t i c a não foi signi-

ficantemente afetada pel o s íons Mg , Ca e Mn . A inibi -

ção p o r íons cúprico e m e r c ú r i o s u gerem a p r e s e n ç a de grupos sulfidrilas no sítio ativo da enzima.

24.

3.12.

TITULAÇÃO DOS GRUPOS -SH

A titulação dos grupos -SH com N b s2 > pelo m é t o d o de

Ellman (23) indicou que hã q u a t r o grupos -SH especia l m e n t e reativos por tetrâmero de enzima, correspondendo, p r o v á v e l - mente, aos quatro grupos su l f i d r i l a s do sítio ativo da e n z i ­ ma. A titulação feita apos d e s n a t u r a ç ã o da enzima com uréia

8 M m o s t r o u que a enzima p o s s u i um total d.e 12,7 grupos -SH

por mol de enzima.

3.13.

EFEITO DE REAGENTES SULFIDRILAS NA ATIVIDADE DA GPDH

DE MÜSCULO DE ANAS SP

Para o estudo do ef e i t o de reagentes sulfidrilas na

atividade da GPDH de Anas s p , a enzima foi d i a l i s a d a por 18

horas c o n t r a tampão T r i s - H C l 0,05 M, p H 8,2, contendo EDTA

1 mM, n a ausência de 2 - m e r c a p t o e t a n o l . A enzima foi incubada

por 1 0 m i n u t o s no citado tampão e na p r e s e n ç a dos respecti -

vos reagentes sulfidrilas. A enzima foi t o t almente inibida pelos ãcidos p-cloro m e r c u r i b e n z o i c o e p- hidroxi m e r c u r i b e n

zoico e p a r c i a l m e n t e inibida pelos ãcidos o- iodosobenzoico

2- cl o r o -4 -amino-benzoico e p e l a i o d o a c e t a m i d a (Tabela I I I ) ,

mas a inibição foi t o t almente r e v e r t i d a p ela adição de 2-mer

captoetanol 5 mM, sendo exceção, o caso da inibição por iodo^ acetamida. Isto ê esperado, uma vez que o m e c a n i s m o de inibi^

ção por i o d o a cetamida ê d i f e r e n t e das anteriores, ligando -

se o reagente cova l e n t e m e n t e aos grupos -SH da enzima e, por tanto, não sendo deslocado p e l o agente redutor.

Eração Volu m e (ml) U n i d a d e s To tais P r o t e í n a (mg/ml) A t i v i d a d e e s p e c í f i c a U / m g Rendi m e n t o 1 P u r i f i c a ­ ção Extração KOH 0,03 N 750 120.750 2 0 8 1 0 0 1 Cnh4 )2s o4 740 142.080 7,0 27 118 3,4 521 ; CNH4)2s o4 7 2 % 50 41.800 15 56 35 7,0 C r o m a t o g r a f i a D E A E - S e p h a d e x A- 50 26 38.610 7,3 203 32 25 * 1 sobrenadante * 2 prec i p i t a d o tn

#

TABELA II - Efeito de íons metálicos divalentes sobre

atividade da GPDH de másculo de Anas sp.

S AL (2 usM > A T I V I D A D E R E L A T I V A t 1 0 0 , 0 M g C l2 1 1 0 , 0 M n C l2 90,0 C a C l2 82,5 C u C l2 0 Z n C l2 0 H g C l2 0

A en z i m a foi p r ê - i n c u b a d a em p r e s e n ç a do ion metálico

por 10 m i n u t o s a 25°C, na ausên c i a de G3P e a seguir a

atividade enzimática foi d e t e r m i n a d a em u m s i s t e m a de in­ cubação contendo em 1 m l : tampão T r i s - H C l 0,05 M p H 8,2 ,

ED3A lmM e 2 -m e r c a p t o e t a n o l 1 mM, arseniato de

T A B E L A III - E F E I T O DE R E A G E N T E S S U L F I D R I L I C O S N A A T I V I D A ­ D E D A G PDH DE M Ú S C U L O D E A N A S sp. R E A G E N T E S a) 0,1 m M A T I V I D A D E R E L A T I V A % b) A T I V I D A D E R E L A T I V A A P Ó S A D I Ç Ã O DE M E R C A P T O E T A N O L % — 1 0 0 1 0 0 o r t o - i o d o s o b e n z o a t o 52 1 0 0 i o d o a c e t a m i d a 62 62 2 - c l o r o - 4 - a m i n o b e n z o a t o 84 1 0 0 p-hidroxi-ínercuribenzoato 0 1 0 0 p-cloro-mercuribLenzoato 0 1 0 0 a- A e n z i m a (0,2 mg) foi i n c u b a d a p o r 10 iíinutos a 25°C

em p r e s e n ç a dos reagentes em tampão Tris- HC1, 0,05 M p H 8,2,

contendo E D T A 1 mM. A atividade r e m a n e s c e n t e foi d e t e r m i n a d a pela ad i ç ã o de N A D 1,5 mM, arseniato de sodio 30 m M e G3P 1,5 mM.

b- A m i s t u r a de incubação foi a m e s m a que em a, p o r e m

2 -mercapt o e t a n o l na concentração 5 m M foi a d i c i o n a d o imediata

28 o r i g e m C+) i C-) Fig. 1 ELET R O F O R E S E D E D I S C O E M G E L D E P O L I A C R I L A M I D A D A GLICERAL- D E Í D O - 3 - F O S F A T O D E S I D R O G E N A S E DE M Ü S C U L O DE A N A S S P .

A e l e t r o f o r e s e foi des e n v o l v i d a em gel de poliacri_ lamida na c o n c e n t r a ç ã o de 6,0$ ,pH 4,3, sendo de 30 y g a amos_ tra de proteína. Foi u s a d o u m sistema p a r a p r o t e í n a bãsicas como d e scrito em M a t eriais e Métodos.

(-) origem (+) Fig. 2 ELET R O F O R E S E E M G E L DE P O L I A C R I L A M I D A E M P R E S E N Ç A DE SDS DA G L I C E R A L D E I D O - 3 - F O S F A T O D E S I D R O G E N A S E DE M Ú S C U L O DE ANAS s p . A e l e t r o f o r e s e e m gel, n a con c e n t r a ç ã o de 10% de po l i a c r i l a m i d a , c o n t e n d o 0,1% de SDS foi realizada de acordo com o m é t o d o d e scrito p o r W e b e r 5 O s b o r n (58) sendo de 10 pg a amostra de proteína.

Fig. 3

DETERMINAÇÃO DO PESO M O L E C U L A R A P A R E N T E DA GPDH DE M Ú S C U L O DE ANAS sp P O R F I LTRAÇÃO E M GEL S E P H A D E X - 1 5 0 .

A cr.omatografia em gel sephadex G-150 foi efe

tuada conforme descrito em Materiais e Métodos. Os padrões ■ de re

ferência foram: c itocromo c (P.M. 12.500), soro a l b u m i n a bo vina (P.M. 67.000), aldolase (P.M. 158.000) e c atalase

(240.000). O volume mor t o da coluna foi estimado através de azul de d e x t r a n a em 85 ml.

31.

Fig. 4

DETERMINAÇÃO d o p e s o m o l e c u l a r d a s u b u n i d a d e d a g p d h d e m ú s­

c u l o DE A N A S sp POR E L E T R O F O R E S E E M GEL DE P O L I A C R I L A M I D A Eli P RESENÇA DE SDS.

Apos eletroforese a 230 V e 8mA / g e l d u rante 5 horas,

as prot e í n a s foram reveladas com azul de c o m a s s i e brilhante R como descrito em M a t e r i a i s e Métodos. Como p r o t e í n a m a r c a ­ dora foi u t i l i z a d a a h e m o g l o b i n a "cross-linked" sendo consi­ derado os pesos m o l e c u l a r e s dos monômeros: 16.000, 32.000, 48.000 e 64.000.

32. <

o

LU

ESPECTRO DE A B SORÇÃO U L T R A V I O L E T A DA G L I C E R A L D E Í D O - 3-F OSFATO DESID R O G E N A S E DE M Ú S C U L O DE A N A S s p .

No sistema de ensaio (1 ml) foi u t i l i z a d a 180 y g de enzima, tampão Tris-HCl p H 8,2 E D T A 1 mM, a 25°C.

33.

No sistema de ensaio (1 ml) foi util i z a d o 0,4 u g de

proteína, NAD 1,5 mM, G3P 1,5 mM, arseniato de sõdio 30 mM, EDTA 1 m M e 2 - m e r c a p t o e t a n o l 1 mM. Os tampões 150 mM| uti l i z a dos foram: T r i s - m a l e a t o ( A ) (pH 5,2-7,3), Tris- H C l ( o ) (pH 7,3-8,5), g l icina NaOH (□ ) e c a r b o n a t o - b i c a r b o n a t o de sõdio

AT

IVID

AD

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ES

PE

Clh

CA

EFEITO D A CONCEN T R A Ç Ã O DE A R S E N I A T O DE SÕDIO SOBRE A A T I V I D A D E DA GPDH DE M Ú S C U L O DE A N A S s p . D E T E R M I N A Ç Ã O D A C O N C E N T R A Ç Ã O Õ- TIMA DE ARSENIATO.

A m i s t u r a de incubação continha, em volume final de 1

ml: 0,5 yg de enzima; tampão T r i s - H C l 50 m M p H 8,2, contendo

E DTA 1 m M e 2-mercaptoetanol 1 m M , N A D 1,5 mM, G3P 1,5 m M e

(AT

IVI

DA

DE

ES

PE

CÍF

ICA

)"

.10

[G3P]

A m i s t u r a de incubação continha, em um vo l u m e final de 1 ml; 0,5 y g de proteína, tampão T r i s - H C l 50 m M pH 8,2 , EDTA 1 m M e 2 m e r c a p t o e t a n o l 1 mM, a r s e n i a t o de sodio 30 mM, NAD 1,5 m M e q u a n t i d a d e s variãveis de G3P.

O erro p a d r ã o foi de 3,05.10 ^ e o coefic i e n t e de

36.

Fig. 9

EFEITO DA C O N C E N T R A Ç Ã O DO N A D + SOBRE A A T I V I D A D E DA G P D H DE MÚSCULO DE A N A S s p . D E T E R M I N A Ç Ã O DA CONSTANTE DE M I C H A E L I S - MENTEN.

A m i s t u r a de incubação continha, em volume final de 1 ml: 0,5 yg de proteína, tampão Tris-HCl 50 m M pH 8,2,

EDTA 1 mM, 2- m e r c a p t o e t a n o l 1 m M , arseniato de sodio

30 mM, G3P 1,5 m M e qu a n t i d a d e s variáveis de NAD.

O erro p a d r ã o foi de 1,5.10 ^ e o c o e f i c i e n t e de correlação de 1,04 c a l c u l a d o s de acordo com Toledo (51).

37.

Fig. 10

INIBIÇÃO DA G L I C E R A L D E I D O - 3 - F O S F A T O D E S I D R O G E N A S E DE A N A S sp POR NADH.

A m i s t u r a de i ncubação continha, em volume final de

1 ml: 0,5 pg de p r o t e í n a , tampão Tris-HCl 50 mM, p H 8,2 ,

EDTA 1 mM, 2 - m e r c a p t o e t a n o l 1 mM, G3P 1,5 mM, arse n i a

to de sõdio 30 m M e q u a n t i d a d e s variáveis de NAD. As c o n c e n ­ trações de N A D H foram: zero(o), 0,24 m M ( A ) e 0,72 m M (a ) ? ^

sendo obtidos os v a l o r e s de erro padrão de 1,5.10 ; S,07.10

e 1,28.10~3 e os de c o e f i c i e n t e de correlação 1,04; 1,03 e

4. DISCUSSÃO

A GPDH ê uma e n z i m a relat i v a m e n t e fãcil de ser o b t i ­ da na forma p u r a e c o m b o m rendimento (2,4,15,33,47). E m n o £ so trabalho a enzima foi p u r i f i c a d a à h o m o g e n e i d a d e e á l g u - mas de suas p r o p r i e d a d e s foram estudadas. A G P D H de m ú s c u l o de pato não a p r e s e n t o u d i f e r e n ç a consid e r á v e l quando compara^ da ãs GPDHs de outras fontes nos estudos realizados.

A GPDH de m ú s c u l o de Anas sp foi p u r i f i c a d a p o r fra-

cionamento com sulfato de amonio . Semelhante as enzimas de

Thermus thermo p h i l u s (25), jacaré (54) e m ú s c u l o de c o elho

(4 7 ) dentre outras, ela precipitou-.a uma saturação em torno

de 701 em sulfato de amonio. Uma c r o m a tografia em coluna de

DEAE-Sephadex A-50 fòi suficiente para que a enzima d e m o n s - trasse ser p u r a por e l e t r o f o r e s e e m gel de p o l i a c r i l a m i d a

(Fig. 1 ) tanto p a r a a e n z i m a na t i v a como p a r a a enzima d i s s o ­ ciada em seus m o n ô m e r o s (Fig. 2).

A ativ i d a d e e n z i m ã t i c a da GPDH pode ser ensai a d a de várias formas. Sendo u m a enzima de cinética rápida, fac i l m e n

te reversível e que sofre inibição pelos p r o d u t o s (2 1 ) deve-

se procu r a r um metodo que contorne estas p r o p r i e d a d e s e faci^ lite a m e d i d a da v e l o c i d a d e inicial de tal m a n e i r a que os da

dos sejam fidedignos. O método u tilizado neste trabalho foi

o arsenolítico. O uso do arseniato em lugar do fosfato (24) possui efeito semelhante, e resulta na formação do l - a r s e n o - 3 - f o s - foglicerato, que ê rá p i d o e não e n z i m a t i c a m e n t e hidro l i s a d o

a 3-fosfoglicerato, Este m é t o d o

evita

reação e a inibição por 1 - 3 - d i f o s f o g l i c e r a t o , sendo conside rado um m é t o d o sensível p a r a a analise de estudos cinéticos (12,17). A GPDH exibe outras atividades, embora não fisiolo gicas e que contribuem p a r a e l u c i d a r o m e c a n i s m o de ação da atividade fisiológica. S e gundo D u g g l e b y e Dennis (21) o m e ­ lhor m é t o d o é aquele no qual se e m prega fosfato inorgânico e f o s f o g liceratoquinase que dã c o n t i n u i d a d e â r e a ç ã o ,c o n s u ­ mindo o ãcido 1-3- d i f o s f o g l i c é r i c o . Neste caso, a l i n e a r i ­ dade ê m a n t i d a por u m p e r í o d o de tempo mai o r do que quando se emprega o método a r s e n o l í t i c o . De acordo com Byers et al

(1 2 ) a estreita faixa linear no m é t o d o arsenolítico ê d e v i ­

do a contaminação por fosfato, p o d e n d o o nível de contamina ção m e nor que 25% ser tolerado. Para amenizar a possível contaminação por fosfato f o r a m sempre u t i lizadas soluções dé

G3P recentes e este era c o l o c a d o por último no sistema de

ensaio, pois como jã m e n c i o n a d o , este substrato sofre hidro lise em curto espaço de tempo (17,52). E m nossas condições

de trabalho, a c o ncentração õti m a p a r a o arseniato foi de

30 m M (Fig. 7), sendo que, p a r a a GPDH de m ú s c u l o de jacaré (54) e m ú s c u l o de coelho (24) foi enc o n t r a d o o v a lor de 50

mM para a concentração oti m a de a r seniato e de 10 m M para

a enzima de fígado de p o r c o (17) .

Não foi conseguida a c r i s t a l i z a ç ã o da enzima; esta

fof obtida como um p r e c i p i t a d o amorfo e m solução de sulfato de a m o n i o . A enzima foi p u r i f i c a d a 25 vezes com u m rendimen to de 32%, isto ê, a p r o x i m a d a m e n t e u m terço da atividade i-

nicial foi recuperada. A p r e p a r a ç ã o enzimãtica foi obtida