CORRELAÇÃO DOS MARCADORES INFLAMATÓRIOS DE FASE AGUDA COM A ALTERAÇÃO COGNITIVA A LONGO PRAZO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

DAIANE BIFF

CORRELAÇÃO DOS MARCADORES INFLAMATÓRIOS DE FASE

AGUDA COM A ALTERAÇÃO COGNITIVA A LONGO PRAZO

Livros Grátis

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DAIANE BIFF

CORRELAÇÃO DOS MARCADORES INFLAMATÓRIOS DE FASE

AGUDA COM A ALTERAÇÃO COGNITIVA A LONGO PRAZO

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.

Orientador: Prof. Dr. Felipe Dal Pizzol

Agradeço a Deus por ter me dado forças para superar os desafios que encontrei e chegar até aqui.

Agradeço aos meus pais pelo incentivo, carinho e por acreditar sempre que eu conseguiria. Obrigada pelas noites sem dormir, pelos “extras” no orçamento, pela

força e reconhecimento.

Agradeço ao meu companheiro que esteve do meu lado, com apoio e força que sempre precisei, nunca me deixando desamparada nos momentos mais difíceis. Obrigada pela alegria, palavras de conforto e ânimo e, principalmente, por todo amor

dedicado.

Agradeço aos meus irmãos pelo incentivo e apoio de sempre, em quaisquer situações.

Agradeço de coração ao meu orientador Professor Dr Felipe Dal Pizzol que me ajudou muito com a bolsa de estudos da CAPES /PROCAD, sem ela eu não conseguiria concluir o mestrado. Agradeço ainda pela amizade, pelos sustos e pelas

pesquisas que tanto me acrescentaram no âmbito pessoal e profissional. Agradeço ao laboratório de Fisiopatologia, onde passei boa parte dos meus dias estudando, trabalhando. Obrigada às pessoas que nele se encontram, pelos braços

sempre abertos a me receber com carinho.

Agradeço aos meus amigos e colegas de mestrado, pude conhecer pessoas que mostraram o verdadeiro valor da palavra amizade.

Agradeço à minha amiga Giselli Scaini que sempre esteve do meu lado me ajudando com os compromissos do mestrado e, principalmente foi meu ombro direito na fase

Dedico esta dissertação aos meus pais e meu noivo pela paciência e incentivo de sempre. Sem o apoio deles eu não teria conseguido.

A sepse é uma síndrome complexa caracterizada por um desequilíbrio entre a resposta pró-inflamatória e anti-inflamatória ao patógeno. Ela deve ser entendida como um processo, já que ela pode derivar de múltiplas causas e envolvem múltiplos processos. A ocorrência e a evolução da clínica estão diretamente ligadas à resposta imune. A inflamação é uma resposta tecidual à agressão a despeito da natureza do agente causador. Inicia de maneira localizada, desencadeada por uma série de processos inflamatórios considerados fisiológicos, ou seja, uma resposta tecidual protetora do organismo ao agente agressor. Nesta cascata, as moléculas desencadeantes estimulam a liberação de mediadores primários como o TNF-α (fator de necrose tumoral alfa) e interleucina-1 (IL-1). Nos doentes sépticos, encontram-se com frequência níveis elevados de mediadores pró-inflamatórios como o TNF-α e a IL-1, assim como níveis elevados de citocinas essencialmente anti-inflamatórias, como a Interleucina 10. Esses biomarcadores podem se tornar aliados como indicadores de processos biológicos normais, processo patogênico, ou resposta farmacológica a uma intervenção terapêutica. Além deles, os níveis de estresse oxidativo tem importantes mecanismos envolvidos na fisiopatologia da sepse. A geração maciça de espécies reativas de oxigênio (ROS) durante a sepse compromete funções como a sobrevivência da célula. Todos esses mecanismos estão envolvidos na fisiopatologia da encefalopatia séptica que parece ser multifatorial, como sugerido por alguns estudos. Estas pesquisas propõem que os organismos infectantes ou suas toxinas não são os responsáveis diretos pela encefalopatia, mas sim a inflamação sistêmica resultante da infecção. Vários estudos têm demonstrado que os sobreviventes de sepse apresentam comprometimento cognitivo a longo prazo, incluindo as alterações de memória, atenção, concentração e/ou perda da função cognitiva global. Desse modo, verificamos neste trabalho a correlação dos marcadores inflamatórios de fase aguda e de estresse oxidativo, como o TNF-α e a Interleucina 1 e 10 com os níveis de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), respectivamente, com a memória a longo prazo. Nossos resultados comprovaram o dano cognitivo a longo prazo em ratos com indução de sepse. Também demonstraram que os níveis de TNF-α e TBARS elevaram-se consideravelmente nos ratos que tiveram a indução de sepse, quando comparados ao controle. Demonstraram dentro do grupo CLP, que os ratos que tiveram melhor desempenho no teste de esquiva inibitória tiveram alta concentração de TNF-α e TBARS logo nas 6 horas após a indução. Puderam mostrar que os ratos que tiveram maior inflamação e maior índice de estresse oxidativo obtiveram melhor desempenho de memória a longo prazo. Desse modo, pode-se entender que o estresse e a inflamação aumentada fisiologicamente na sepse significa um sinal de preparo do organismo para combater com mais eficiência o patógeno, levando a uma melhor adaptação celular.

ABSTRACT

Sepsis is a complex syndrome characterized by an imbalance between pro-inflammatory and anti-pro-inflammatory responses to the pathogen. It must be understood as a process, since it can derive from multiple causes and involve multiple processes. The clinical occurrence and evolution are directly linked to immune response. Inflammation is a tissue response to aggression, regardless of the nature of the causing agent. It starts in a localized way, triggered by a series of physiological inflammatory processes, i.e., an organism’s protective tissue response to the attacker agent. In this cascade, triggering molecules stimulate the release of primary mediators like TNF-α (tumor necrosis factor alpha) and interleukin-1 (IL-1). In septic patients, high levels of pro-inflammatory mediators such as TNF-α and IL-1 are often found, as well as high levels of essentially anti-inflammatory cytokines, such as interleukin 10. These biomarkers may be used as indicators of normal biological processes, pathogenic processes, or pharmacological response to therapeutic intervention. Besides them, the oxidative stress levels and its mechanisms are involved in the pathophysiology of sepsis. The massive reactive oxygen species’ (ROS) generation during sepsis undertakes functions such as cell survival. All these mechanisms are involved in the pathophysiology of septic encephalopathy, which seems to be multifactorial, as suggested by some studies. These researches propose that the infecting organisms or their toxins are not directly responsible for the encephalopathy, but the inflammation resulting from infection is linked to the disease. Several studies have shown that sepsis’ survivors have long-term cognitive impairment, including memory, attention, and concentration changes; and / or global cognitive function loss. Thus, this study found a correlation between acute phase inflammatory markers, such as TNF-α and Interleukin 1 and 10, and the oxidative stress with the levels of thiobarbituric acid reactive species (TBARS), respectively, with the long-term memory. Our results confirm the long-term cognitive impairment in rats with induced sepsis. They also showed that TNF-α and TBARS levels increased considerably in mice that had the induction of sepsis, when compared to control. In the CLP group, the results demonstrate that mice with a better performance in inhibitory avoidance test had higher concentrations of TNF-α and TBARS in the first 6 hours after induction. This study also shows that mice with greater inflammation and increased oxidative stress levels had a better performance of long-term memory. Therefore, it’s possible to understand that the oxidative stress and the physiologically increased inflammation in sepsis is due to the preparation of the body to effectively combat the pathogen, leading to better cellular adaptation.

Key words: sepsis; biomarkers; cognitive impairment.

LISTA DE ABREVIATURAS

BASES – Brazilian sepsis epidemiological study BBB – Barreira hemato-encefálica

C5a – Fator do sistema complemento 5a CAT – Catalase

DC – Células Dendríticas

EROs – Espécies Reativas de Oxigênio

LBP – Proteínas ligantes ao Lipopolissacarídeo LPS – Lipopolissacarídeo IL-1 – Interleucina 1 IL-2 – Interleucina 2 IL-4 – Interleucina 4 IL-6 – Interleucina 6 IL-8 – Interleucina 8 IL-10 – Interleucina 10

NFkB – do ingles nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (fator nuclear kappa B)

NK – Natural Killer

PAF – Fator de ativação plaquetária PCR – Proteína C Reativa

RLO – Radicais Livres derivados do Oxigênio SIRS - Systemic Inflamatory Response Syndrome SOD – Superóxido dismutase

SPSS – Statistical Package for the Social Sciences TBARS – Espécies Reativas ao ácido Tiobarbitúrico TLRs – Toll Like Receptors

TNF-α – Fator de Necrose tumoral UTI – Unidade de terapia intensiva

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ... 09

1.1 Conceitos Fundamentais ... 09

1.2 Fisiopatologia da Sepse ... 11

1.3 Biomarcadores Inflamatórios de Sepse ... 14

1.4 TNF-α ... 15

1.5 Interleucina-1 ... 17

1.6 Interleucina-10 ... 18

1.7 Sepse e Estresse Oxidativo ... 20

1.8 Sepse e Sistema Nervoso Central ... 21

1.9 Modelo animal de sepse ... 24

2 OBJETIVOS ... 26 2.1 Objetivo Geral ... 26 2.2 Objetivos Específicos ... 26 3 METODOLOGIA ... 27 3.1 Animais Experimentais ... 27 3.2. Modelo animal de CLP ... 27

3.3 Teste de Esquiva Inibitória ... 29

3.4 Determinação de Citocina(IL-1 e IL-10) e TNF-α em líquor ... 31

3.5 Medida de substâncias reativas ao ácido tiobartúrico (TBARS) ... 31

3.6 Analise Estatística ... 31

4 RESULTADOS ... 32

5 DISCUSSÃO ... 41

1 INTRODUÇÃO

1.1 Conceitos Fundamentais

A sepse é uma doença caracterizada por infecção grave associada a reação inflamatória sistêmica (Vandijck et al., 2006). É uma desregulação da expressão gênica com acentuação da resposta sistêmica à agressão caracterizada por vários e complexos mecanismos envolvendo mediadores inflamatórios, alterações nos sistemas de coagulação, da anticoagulação e da fibrinólise. Esses mecanismos levam à hipoperfusão tissular, à morte celular, à síndrome de múltipla disfunção orgânica e morte do paciente (David & Neto, 2007). Além disso, a sepse é uma síndrome complexa caracterizada por um desequilíbrio entre a resposta pró-inflamatória e anti-pró-inflamatória ao patógeno (Hotchkiss & Karl, 2003).

As complicações da sepse são as causas mais frequentes de morbidade e mortalidade em unidades de terapia intensiva (UTI), contribuindo para 750.000 casos por ano nos Estados Unidos, com uma média de mortalidade de 29%, cerca de 215.000 mortes (Sands et al., 1997). Apesar dos inúmeros estudos realizados, a incidência da sepse está aumentando continuamente e esta tendência epidemiológica reflete o envelhecimento da população e o aumento do número de pacientes cronicamente doentes. Uma resistência crescente dos agentes infecciosos que causam a sepse também possui um papel importante no processo (O’Brien, 2007).

Recentemente, vários estudos têm demonstrado que os sobreviventes de sepse apresentam comprometimento cognitivo a longo prazo, incluindo as alterações de memória, atenção, concentração e/ou perda da função cognitiva

global. No entanto, a patogênese e história natural da encefalopatia séptica e disfunção cognitiva, ainda são pouco conhecidos e uma maior compreensão destes processos é necessário para o desenvolvimento de intervenções eficazes de preventivas e terapêuticas (Streck et al., 2008).

No Brasil, apesar de ainda não existirem estimativas precisas, a elevada frequência de sepse pode ser observada em um estudo epidemiológico denominado BASES (do inglês Brazilian Sepsis Epidemiological Study). Este estudo foi sendo desenvolvido entre maio de 2001 e janeiro de 2002, trata-se de um estudo prospectivo, de coorte que avaliou todos os pacientes internados em UTIs, independente de sua patologia. As incidências de sepse grave e choque séptico nos centros considerados foram de 27% e 23%, respectivamente, e a taxa de letalidade global foi de 22% (Silva et al., 2004), sendo de 47% para sepse grave e de 52% para choque séptico.

Com o intuito de aumentar a precisão e a rapidez do seu diagnóstico, em 1991 foi realizada a Conferência de Consenso de Sepse, a qual elaborou novas definições e critérios diagnósticos sobre a sepse. A síndrome da resposta inflamatória sistêmica (do inglês Systemic Inflammatory Response Syndrome, SIRS) foi definida como a resposta do organismo a um insulto variado (trauma, pancreatite, infecção sistêmica), com a presença de pelo menos 2 dos critérios abaixo:

1. Febre, temperatura corporal maior que 38ºC ou hipotermia, temperatura corporal menor que 36ºC;

2. Taquicardia – frequência cardíaca maior que 90 bpm;

3. Taquipnéia – frequência respiratória maior que20 rpm ou PaCO2 menor que

4. Leucocitose ou leucopenia – Leucócitos acima de 12.000 cels/mm3 ou <

4.000 cels/mm3, ou presença de mais de 10% de formas jovens (bastões) (Matos &

Victorino, 2007).

Estudos mais aprofundados estão identificando uma melhor relação entre os mediadores da cascata imunológica com o mecanismo da fisiopatologia da sepse. Como esta rede de mediadores ainda não está completamente esclarecida, buscar formas de conhecer melhor a ação desses biomarcadores pode nos mostrar um diagrama aproximado dos primeiros eventos bioquímicos que conduzem à sepse.

1.2 Fisiopatologia da Sepse

A sepse deve ser entendida como um processo, já que ela pode derivar de múltiplas causas e encerrar em si mesmo múltiplas ações. Na sua abordagem mais atual, a sepse compreende, no seu desenvolvimento, uma resposta inflamatória aguda sistêmica a partir de um foco de infecção (David & Neto, 2007).

A inflamação é uma resposta tecidual à agressão a despeito da natureza do agente agressor. Inicia de maneira localizada, desencadeada por uma série de processos inflamatórios “considerados fisiológicos”, ou seja, uma resposta tecidual protetora do organismo ao agente agressor. Dessa forma, acredita-se que o início e a progressão da sepse se devem a uma “desregulação” da resposta normal, com uma maciça e descontrolada ativação de células inflamatórias, resultando em uma anarquia metabólica, na qual “o próprio organismo não consegue controlar o que ele próprio criou” (Bone, 1991).

Um dos componentes principais que envolvem a fisiopatologia da sepse é a exacerbada ativação da resposta imune inata. O papel central do sistema imune inato durante a síndrome da resposta inflamatória sistêmica e a sepse é documentado pelo aumento dos fatores pró-inflamatórios após a infecção (Wong et al., 1996; Wong et al., 1997; Williams et al., 2000; Mastronardi et al., 2000; Mastronardi et al., 2001; Mastronardi et al., 2005), com consequente aumento de citocinas pró-inflamatórias tais como o IL-1 e o TNF-α para o sistema nervoso central (Takala et al., 2002). Como a maioria dos estudos envolvendo sepse focalizou órgãos periféricos como citados previamente, a participação do cérebro durante este processo ainda não está muito clara.

A ocorrência e a evolução da clínica estão diretamente ligadas à resposta imune. Logo, genes envolvidos na resposta imune inata, respondem a uma sequência de eventos desencadeados pela infecção, como: os receptores Toll (do inglês Toll-like Receptors, TLRs), que funcionam como um sistema de monitorização da presença de moléculas associadas à patógenos; as proteínas ligantes ao Lipopolissacarideo (LPS), como a LBP e CD-14; fatores de coagulação; citocinas pró e antiinflamatórias e quimiocinas.

Um dos processos mais importantes da ativação das vias desencadeadas na sepse, hoje conhecidos, é a ativação da resposta imune mediada por citocinas pró e antiinflamatórias (IL-1, IL-10 e TNF-α) que regulam a intensidade e a duração da resposta imune, exercendo vários efeitos sobre linfócitos e outras populações celulares do sistema imune (David & Neto, 2007).

Nesta cascata, as moléculas desencadeantes estimulam a liberação de mediadores primários como o TNF-α (fator de necrose tumoral), interleucina-1 (IL-1),

complemento 5a (C5a), que induzem a resposta imune celular e humoral com ativação de mediadores secundários como citocinas, proteínas do sistema complemento, prostanóides, fator ativador plaquetário (PAF), espécies reativas de oxigênio (EROs), ativando também leucócitos, ou seja, os macrófagos e monócitos, produzindo sequencialmente, TNF-α, IL-1, interleucina-6 (IL-6) e interleucina-8 (IL-8), estas citocinas agem em outras células ou elementos sanguíneos, através da ligação a seus receptores de superfície, induzindo a produção e liberação de mediadores. Após a liberação de TNF-α, IL-1 e PAF, o ácido araquidônico é metabolizado, formando os leucotrienos, tromboxano A2 e prostaglandinas (Bozza et al., 2005).

A IL-1 e IL-6 ativam as células T, que passam a produzir interferon γ, interleucina-2 (IL-2) e interleucina-4 (IL-4), contribuindo assim para uma resposta inflamatória tardia. Estes mediadores são os responsáveis pela reativação das células fagocitárias e da cascata inflamatória resultando em um ciclo vicioso inflamatório que induz a vasodilatação, o aumento da permeabilidade com vazamento dos componentes do plasma e o extravasamento, e ativação de leucócitos. Além disso, os mediadores ativam também o sistema de coagulação levando a uma coagulação intravascular disseminada, sendo que a junção destes efeitos provoca a hipoperfusão e a hipóxia tissular que levam ao choque e a síndrome da disfunção de múltiplos órgãos (Bozza et al., 2005).

Estas citocinas agem em outras células ou elementos sanguíneos (polimorfonucleares, células endoteliais, fibroblastos, plaquetas e nos próprios monócitos) através da ligação a seus receptores de superfície, induzindo a produção e liberação de mediadores, contribuindo para uma resposta inflamatória tardia

(Bone, 1991; Parrilo, 1993; European Society of Intensive Care Medicine, 1994; Thijs et al., 1995).

A IL-1 e IL-6 ativam as células T a produzir interferon-γ, IL-2 e IL-4 (Moldawer, 1994; Lowry, 1993; Fong et al., 1990). Quase todos estes agentes agem diretamente no endotélio vascular (Fong et al., 1990; Bone, 1991; Lowry, 1993).

Deve ser feita uma distinção entre os efeitos locais das citocinas (efeitos parácrinos) e as consequências de seus altos níveis na circulação sistêmica (Fong et al., 1990; Lowry, 1993). Os efeitos locais envolvem o recrutamento de células fagocitárias, essencial para a eliminação dos microorganismos, enquanto que os efeitos sistêmicos causam danos ao hospedeiro. Isto é particularmente verdadeiro para o anti-TNF-α, que parece ser o mediador chave no choque séptico (Fong et al., 1990; Bone, 1991; Lowry, 1993).

1.3 Biomarcadores inflamatórios da sepse

Um biomarcador é definido como “uma característica que é objetivamente medida ou avaliada como um indicador de processo biológico normal, processo patogênico, ou resposta farmacológica a uma intervenção terapêutica (Ventetuolo & Levy, 2001). Atualmente a utilização dos biomarcadores inflamatórios vem auxiliando no diagnóstico precoce da sepse.

Nos doentes sépticos, encontram-se com frequência níveis elevados de mediadores pró-inflamatórios como o TNF-α e a IL-1, assim como níveis elevados de citocinas essencialmente anti-inflamatórias, como a IL-6 e a IL-10 (Póvoa, 2000). Idealmente, um biomarcador útil deve ser preciso e disponível, melhorar a avaliação

clínica e auxiliar na tomada de decisões para o cuidado do paciente (Ventetuolo & Levy, 2001).

Grande parte da atenção tem sido desviada para o TNF-α. Porém, este mediador inflamatório não é exclusivo da sepse, sendo encontrado em pacientes com outras patologias. No entanto, parece ser o mediador que mais reflete à resposta imune (Bone, 1991; Réa Neto, 1996).

Como parece não haver um mediador central que explique a origem da sepse, podemos considerar que há uma interação específica entre dois ou mais mediadores que desencadeiam o estímulo inicial. A complexidade desta cascata torna difícil a elucidação exata de quais os efeitos que podem ser atribuídos a cada mediador, pois muitos têm efeitos sinérgicos (Bone, 1991; Moldawer, 1994). Após a ação do TNF-α inicia-se a elevação da Interleucina-1 (IL-1) e Interleucina-6 (IL-6). Juntos, TNF, IL-1 e IL-6 induzem a liberação de proteínas de fase aguda, particularmente a PCR (proteína C reativa), e a IL-6 também atua inibindo a liberação de TNF-α e IL-1, num mecanismo de feedback negativo que impede, juntamente com as interleucinas antiinflamatórias, a perpetuação da resposta imuno-inflamatória (Girardini et al, 1993).

Há alguns anos vêm-se tentando utilizar as citocinas como marcadores precoces de sepse. O TNF-α e IL-1, IL-10 estão sendo considerados candidatos promissores num diagnóstico mais preciso e eficaz.

O TNF-α é uma citocina pró-inflamatória que representa uma das mais importantes linhas de defesa contra patógenos (especialmente intracelulares), pois induz a formação de granulomas, além de exercer ações quimiotáticas sobre neutrófilos (David & Neto, 2007).

O TNF-α é um quimiotático para monócitos e neutrófilos, induzindo a fagocitose e a aderência dessas células ao endotélio, o que leva à geração de radicais livres derivados do oxigênio (RLO). Na parede endotelial ele é responsável por aumentar a permeabilidade vascular e a expressão de moléculas de adesão (Kilpatrick & Harris, 1998). O TNF-α também estimulará a liberação de outras interleucinas e citocinas quimiotáticas, que ampliarão a resposta inflamatória.

Algumas citocinas inflamatórias são mediadores liberados predominantemente pelos monócitos e linfócitos (Salles et al., 1999). O lipolossacarídeo (LPS) é um dos maiores indutores de produção de TNF-α, razão pela qual tal citocina vem sendo constantemente discutida como um dos mais importantes mediadores do choque séptico. Aparentemente essa resposta precoce de instabilidade hemodinâmica é devida à excessiva e precoce liberação de TNF-α, o qual é liberado minutos após a exposição ao antígeno, porém seus níveis séricos podem tornar-se indetectáveis após 3 a 4 horas do início do processo infeccioso. Além disso, o TNF-α também é responsável pela liberação de IL-10 (Bont et al., 1994).

O TNF-α não é o único mediador que pode reproduzir os sintomas da sepse. A administração de baixas doses de IL-1 ou PAF (Fator de Ativação Plaquetária) também induzem a um estado de sepse (Bone, 1991).

Atuando sinergicamente, o TNF-α e IL-1 estimulam a liberação de IL6, a qual se dá principalmente pelos macrófagos, fibroblastos e células endoteliais. Uma de suas ações seria a indução da diferenciação dos linfócitos B em anticorpos específicos, além de atuar de maneira semelhante ao TNF-α e IL-1, aumentando a proliferação de timócitos (Reyes et al., 2003).

1.5 Interleucina-1

Originalmente descrito como a molécula endógena da febre, a interleucina (IL-1_, um polipeptídeo não estrutural) é uma citocina pró-inflamatória, com a capacidade de induzir a expressão de uma ampla gama de genes normalmente não expresso. Por exemplo, a IL-1 aumenta a expressão de quase todas as outras citocinas, como o TNF-α e a IL-6, além das quimiocinas e/ou as moléculas de adesão. Além disso, IL-1 aumenta a expressão de diferentes proteases de tecido e metaloproteases de matriz e inibe a síntese de proteoglicanos. Ao contrário do TNF-α, a IL-1 é um estimulante da medula óssea que aumenta o número de células

progenitoras mielóide e promove a liberação de neutrófilos, resultando em neutrofilia (Dinarello, 2005).

A participação da IL-1, na fisiopatologia da sepse foi bem demonstrada pela observação de que um antagonista do receptor para essa citocina (IL-1ra) reduziu a letalidade causada pela administração de endotoxina (Ohlsson et al., 1990) ou E.

Coli (Wakabayashi et al., 1991), em coelhos. Além disso, a IL-1, quando

choque séptico, como a hipotensão, febre e outros. Também foi demonstrado que camundongos deficientes na produção da enzima conversora da IL-1β (responsável pela clivagem da pró-IL-1β em IL-1β madura) não produzem essa citocina após estimulação com LPS e são resistentes ao choque séptico (Li et al., 1995). Nos estudos de sepse, em humanos, o aumento dos níveis plasmáticos de TNF-α e IL-1β foi correlacionado com o grau de severidade da doença, detectando-se níveis mais elevados nos casos fatais (Gardlund et al., 1995). Cabe ressaltar que a IL-1β e o TNF-α estimulam a liberação sistêmica de IL-6 e IL-8, amplificando, desse modo, a resposta inflamatória (Dinarello, 1997).

1.6 Interleucina-10

A interleucina 10 (IL-10) é uma citocina antiinflamatória que inibe a síntese de vários mediadores inflamatórios normalmente secretados por monócitos/macrófagos ativados, como: IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-α (Mocellin et al., 2001).

A principal função biológica da IL-10 parece ser exercida sobre as DCs (células dendítricas) e macrófagos. Ela é um potente inibidor da apresentação de antígenos, pois inibe o principal complexo de histo-compatibilidade, bem como a regulação positiva de moléculas de co-estimulação CD80 e CD86. O outro efeito significante da IL-10 é a inibição da produção de citocinas e mediadores pró-inflamatórios, como os macrófagos e as células dendríticas. As principais citocinas inflamatórias, IL-1, IL-6, IL-12 e fator de necrose tumoral (TNF), são reprimidas drasticamente à exposição de IL-10. Ela pode ainda inibir a inflamação, aumentando

a liberação do antagonista do receptor de IL-1 de macrófagos (Akdis & Blaser, 2001).

É importante ressaltar também que nem todas as bioatividades da IL-10 resultam na supressão de respostas imunes. A IL-10 estimula a ativação de células B e contribui para a mudança de classe de células B. Ela também pode coestimular as células Natural killer (NK) e a produção de citocinas inflamatórias (Cai et al., 1999). A IL-10 também pode funcionar como um fator de crescimento para estimular a proliferação de determinados subgrupos de células T CD8 + (Groux et al., 1998; Rowbottom et al., 1999; Santin et al., 2000). Essas atividades estimulantes de IL-10 parecem ser dose dependente, explicando o excesso de produção de citocinas inflamatórias em humanos tratados com altas doses de IL-10 (Laux et al., 2000).

Estudos recentes demonstram que o aumento na apoptose de linfócitos T contribui para indução da mortalidade na sepse. Além disso, estudos evidenciam que a apoptose de linfócitos acontece, em parte, pela alta regulação da expressão de Bcl-2 (B-cell lymphoma 2, família que genes regulam a permeabilidade da membrana externa da mitocôndria) diminuindo a ativação da morte celular programada (Tschoeke et al., 2008).

Como afirma um grupo Alemão Oberholzer (2001), a expressão tímica de IL-10 humana por meio de terapia genética pode levar a uma alta regulação da proteína anti-apoptótica Bcl-2 em alguns órgãos. Consequentemente, os animais sépticos sem a expressão de IL-10 humana demonstraram diminuição significativa da apoptose de linfócitos do timo, com melhoria do resultado (Tschoeke et al., 2008). Foi mostrado previamente que a administração intratímicas de IL-10 com um vetor adenoviral em camundongos “selvagem” melhora significativamente o

resultado de sepse. Assim, a expressão local de IL-10 no timo reduz a apoptose do tecido local e ativação da caspase-3 e parece atenuar a resposta sistêmica de citocinas pró-inflamatórias (Tschoeke et al., 2008).

1.7 Sepse e o extresse oxidativo

O estresse oxidativo é um dos vários e mais importantes mecanismos envolvidos na fisiopatologia da sepse. A geração maciça de ROS durante a sepse compromete as funções bem como a sobrevivência da célula, especificamente agindo sobre a mitocôndria e alterando a fosforilação oxidativa por meio da inibição dos complexos enzimáticos, gerando mais ROS e tendo como desfecho final a diminuição da produção energética mitocondrial que por fim culmina com morte celular (Clementi et al., 1998; Siami et al., 2008).

A resposta inflamatória determina a liberação de radicais livres de oxigênio, os quais mantêm um ciclo vicioso de lesão-inflamação-ativação de fatores nucleares. Nesse ponto, houveram muitos estudos a respeito do estresse oxidativo na sepse. A sepse gera um estado de desequilíbrio entre a produção de oxidantes e antioxidantes, gerando um excesso de radicais livres de oxigênio. Essas moléculas têm a função de destruir o agente agressor, entretanto não são específicas e acabam por determinar lesão também no hospedeiro (Macdonald & Webster 2003).

Basicamente o que se observa é um desequilíbrio entre a produção de ROS (principalmente pelos complexos I e IV) e os agentes contra-reguladores (antioxidantes fisiológicos), principalmente as enzimas catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD) (Barichello et al., 2006), nas células de órgãos vitais (Crouser,

2004). Ritter et al. (2003) demonstraram que a atividade da CAT estava reduzida durante a sepse, havendo mais acúmulo de ROS e por consequência maior dano. Já foi demonstrado experimentalmente a existência de dano neuronal em algumas regiões do cérebro de ratos causados por ROS, após indução de sepse por CLP. Esses achados são de grande valor, pois ajudam a explicar a alteração da consciência presente na encefalopatia séptica (Streck et al., 2008).

Estudos têm demonstrado que a disfunção orgânica está associada à hipóxia citopática, mediada por radicais livres de oxigênio lesando a mitocôndria (Fink, 2002). Sabe-se que o dano orgânico secundário ao choque séptico está associado à liberação de radicais livres de oxigênio. Mais ainda, o estado redox celular influencia a ativação do fator nuclear κB (NFκB) que iniciará o processo imunoinflamatório observado na sepse, com liberação de interleucinas e amplificação da resposta do hospedeiro (Batra et al., 2000).

A resposta inflamatória gerada na sepse é mediada por fatores de transcrição nuclear, destacando-se o NFκB. A ativação desse fator pode ocorrer via reconhecimento de patógeno pelos receptores Toll-like na membrana celular ou por alterações no estado redox celular. Tais flutuações no estado redox teriam a capacidade de deflagrar uma resposta inflamatória no hospedeiro, via ativação de fatores de transcrição nuclear. Nesse ponto, então, se tem uma situação na qual a resposta determina liberação de radicais livres que continuará ativando fatores nucleares e amplificará a resposta inflamatória (Vistos & Rocha Fuente, 2004).

Vários estudos têm demonstrado que os sobreviventes da UTI apresentam comprometimento de funções cognitivas em longo prazo, incluindo alterações de memória, atenção, concentração e/ou perda da função cognitiva global (Angus et al., 2001; Gordon et al., 2004; Granja et al., 2005). Estudos envolvendo modelos animais de sepse em modelos murinos de ligação e perfuração cecal (CLP) são clinicamente relevantes, uma vez que induzem uma sepse polimicrobiana que imita a sepse humana (Ritter et al., 2004).

O termo dano cognitivo, tal como definido aqui se refere a anormalidades clinicamente significativas em um ou mais funções do cérebro incluindo memória, atenção, velocidade de processamento mental, função executiva, habilidades visuo-espaciais e função intelectual. O prejuízo cognitivo pode ser leve, moderado ou grave e pode limitar a capacidade do indivíduo de pensar, raciocinar e executar as tarefas diárias (Streck et al., 2008).

Recíprocas interações entre o sistema imunológico e sistema nervoso central (SNC) são considerados os principais componentes da resposta do hospedeiro em estado de choque séptico. O cérebro é muitas vezes considerado um órgão privilegiado, pois é anatomicamente isolado do sistema imunológico pela barreira hemato-encefálica (BBB), carente de um sistema linfático e com baixa expressão de antígenos do complexo histocompatibilidade em seu parênquima celular (Sharshar et al., 2003).

O SNC controla uma grande variedade de funções fisiológicas que são cruciais para manter a homeostase da resposta do hospedeiro em níveis comportamentais, neuroendócrinos e níveis autonômicos. Alterações em qualquer

uma dessas funções adaptativas podem influenciar o curso de choque séptico. (Sharshar et al., 2003).

Os efeitos biológicos causados pela liberação de citocinas se refletem no SNC, como: febre, anorexia (Maier et al., 1998), e ativação do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal, tendo por resultado o aumento da produção dos corticóides adrenais (Licínio & Wong, 1997). As interações recíprocas entre o sistema nervoso central e o sistema imunológico são considerados como os componentes principais da resposta inflamatória a sepse, o que acaba causando alterações nos sistemas neuroendócrino, autonômico (Chrousos, 1995), comportamental (Gordon et al., 2004) e distúrbios em quaisquer funções adaptáveis como as respostas inflamatórias e hemodinâmicas no SNC (Saper & Breder, 1994; Sharshar et al., 2003; Sharshar et al., 2004).

A fisiopatologia da encefalopatia séptica parece ser multifatorial, pois estudos sugerem que os organismos infectantes ou as toxinas produzidas por eles não são os responsáveis diretos pela encefalopatia, mas sim a inflamação sistêmica resultante da infecção. A sequência de eventos que leva à inflamação sistêmica inclui a ativação de leucócitos e liberação de mediadores inflamatórios. O cérebro comporta-se de maneira diferente, pois a presença da barreira hemato-encefálica e a diminuição da expressão de moléculas de adesão (VCAM-1 e ICAM-1) nesse tecido impedem o acúmulo de leucócitos no mesmo. Apesar desse acúmulo não ocorrer no cérebro, sabe-se que mediadores inflamatórios passam pela barreira hemato-encefálica e provocam efeitos importantes nesse tecido. Estudos sugerem que esses mediadores provocam alterações significativas nas células endoteliais

cerebrais, responsáveis pela integridade da barreira hemato-encefálica e pela proteção e isolamento do cérebro (Papadopoulos et al., 2000).

Portanto, a inflamação sistêmica decorrente de um foco infeccioso ou outras causas, parece ser a causa mais plausível da encefalopatia séptica (Deitch, 1998). Endotoxinas ou outros produtos bacterianos ativam macrófagos e linfócitos, os quais geram dano neuronal (Bardenheuer et al., 1999; Weigand et al., 1999; Bauer et al., 2000). A ocorrência do dano oxidativo e produção aumentada de citocinas (1; IL-2; TNF-α) parecem ter sinaptotoxidade causando morte neuronal (Papadopoulos et al., 2000).

Além disso, as células gliais, células com função de suporte e homeostase no SNC e cuja ativação/desregulação pode levar à lesão e morte neuronal por diversos mecanismos, parecem participar efetivamente do dano cerebral na sepse. Estudos mostram que alterações nas funções dos astrócitos podem induzir morte neuronal por diminuição da regulação de fluxo cerebral local, redução da atividade sináptica causada por menor aporte de nutrientes aos neurônios e aumento da permeabilidade da barreira hemato-encefálica (Papadopoulos et al., 2000).

1.9 Modelo animal de sepse

Realizar pesquisas experimentais de sepse em humanos são difíceis devido à severidade da doença, a necessidade de intervenções terapêuticas imediatas e a heterogeneidade dos pacientes. Devido a isso, modelos animais tornam-se opções de estudos para explorar a patogênese e determinar dados pré-clínicos capazes de propor intervenções terapêuticas corretas. Para estas propostas, deve-se utilizar um

modelo animal que reproduza as características da sepse: vasodilatação, hipotensão, aumento do débito cardíaco, resposta ao tratamento e mortalidade vistos em pacientes sépticos.

Alguns modelos animais de indução de sepse são muito utilizados, como a sepse induzida pelo LPS ou por TNF-α que reproduz exemplo de sepse abdominal e sepse cutânea. Desse modo, também os modelos que induzem peritonite são bastante aceitos e utilizados.

Entretanto, o modelo mais aceito, conhecido hoje, e que parece reproduzir mais adequadamente o quadro clínico de sepse, é o chamado CLP (cecal ligation

and perforation). O modelo de CLP tem contribuído para elucidar a patogênese e

determinar novas terapias em sepse (Ritter et al., 2004). Também tem sido amplamente utilizados para explicar o comprometimento cognitivo dos sobreviventes da sepse (Ritter et al., 2004). Este modelo refere-se a ligação do ceco logo abaixo da válvula ileocecal (desta forma não obstruindo todo o trânsito intestinal) e perfuração do ceco com agulha de tamanho padronizado e a liberação de conteúdo fecal para a cavidade peritoneal, conforme classicamente descrito por Wichterman e coleboradores em 1980.

Com isso, além de induzir a peritonite ocasiona uma isquemia mesentérica simulando melhor as grandes síndromes clínicas de sepse abdominal. Recentemente este modelo foi modificado para melhor simular as características clínicas dos pacientes com sepse abdominal, incluindo desta maneira a ressuscitação volêmica e o emprego de antibióticos de amplo espectro (Hollenberg et al., 2001).

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Avaliar a correlação entre os marcadores inflamatórios de fase aguda e a alteração cognitiva a longo prazo.

2.2 Objetivos Específicos

Avaliar os efeitos da sepse sobre os níveis de TNF-α, interleucinas 1 e 10 em líquor na fase aguda da inflamação.

Correlacionar os resultados dos testes de memória à longo prazo com os níveis de marcadores inflamatórios de fase aguda.

Avaliar os efeitos da sepse sobre os níveis de TBARS.

Correlacionar os resultados dos testes de memória à longo prazo com os níveis de TBARS na fase aguda.

3 METODOLOGIA

Os experimentos foram feitos na Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC – nos laboratórios de Neurociências e de Fisiopatologia Experimental.

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as recomendações internacionais para o cuidado e o uso de animais de laboratório, além das recomendações para o uso de animais da Sociedade Brasileira de Neurociências e Comportamento (SBNeC).

3.1 Animais experimentais

Foram utilizados 80 ratos Wistar machos (60 dias) procedentes do Biotério da UNESC. Os animais foram acondicionados em 5 animais por caixa, com ciclo claro - escuro de 12 horas (07:00h às 19:00h) e comida e água ad libitum. O ambiente será mantido a temperatura de 23 + 1º C. Todos os animais (ratos Wistar, adultos, machos) randomizados participarão dos experimentos.

Os animais foram mortos por decapitação (guilhotina) e o descarte dos mesmos será o acondicionamento em saco branco leitoso e, em seguida, serão encaminhados para freezer (conservação) na universidade e após foram coletados e transportados por empresa terceirizada.

Primeiramente os ratos foram divididos em dois grupos. O grupo Sham (controle) e grupo Sepse. Todos os ratos foram anestesiados com Cetamina (50mg/kg) injetados na parte intraperitoneal. Os animais foram submetidos a CLP como previamente descritos (Fink & Heard, 1990) (figura 1). Primeiramente os ratos foram submetidos a laparotomia abdominal (passo1). Os ratos tiveram o ceco exposto (passo 2) e firmemente amarrados (não ocluindo totalmente a luz de passagem da parede intestinal) com sutura de fio seda de 3.0mm, debaixo da válvula de ileocecal (passo 3). O grupo sham terá o ceco apenas exposto e colocado novamente dentro da cavidade peritoneal. O grupo sepse, antes de recolocado o ceco de volta à cavidade peritoneal teve o ceco perfurado uma vez com uma agulha de 14mm (passo 4). O ceco foi apertado suavemente para expulsar uma quantia pequena de conteúdo fecal do local de perfuração e então devolvido na cavidade peritoneal (passo 5), em seguida foi realizado o fechamento da incisão peritoneal com fio de suturas de seda de 4.0.

Os animais foram hidratados com solução salina (50 mL/kg subcutâneo) imediatamente e 12 h após realização de CLP (passo 6). Todos os animais foram devolvidos às suas gaiolas com acesso livre para comida e água. O grupo sepse recebereu a cada 6 horas durante 3 dias, antibioticoterapia com 30 mg/kg ceftriaxone e 25 mg/kg clindamicina. O grupo sham recebereu solução salina correspondente à quantidade de administração da antibioticoterapia.

Figura 1: Modelo animal de sepse.

3.3 Teste de esquiva inibitória

Este teste consegue avaliar a memória a longo prazo do animal. Ele foi realizado 2 vezes, 30 dias após indução de sepse. Primeiramente como pré-teste e 24 horas após, realizado o teste.

O equipamento consiste em uma caixa de acrílico (50 x 25 x 25 cm) na qual o piso é formado por barras paralelas de metal (1 mm de diâmetro). Os espaços entre

as barras medem 1 cm. Uma plataforma com 7 cm de largura e 2,5 cm de altura é colocada junto à parede esquerda do aparelho (Quevedo et al., 1997; Roesler et al., 2003; 2004).

Na sessão de treino os animais foram colocados sobre a plataforma e determinou-se o tempo que o animal levava para descer com as quatro patas da plataforma. Esse tempo é denominado latência. Imediatamente após descer da plataforma (com as 4 patas), o animal recebeu um choque de 0,4 µA durante 2 segundos.

Na sessão de teste, o animal foi novamente colocado na plataforma e determinou-se o tempo que o mesmo levava para descer da plataforma (latência), porém não foi administrado choque. Sendo que após 180 segundos de latência os ratos seriam retirados da caixa.

A latência é um parâmetro clássico de retenção de memória. Os intervalos entre o treino e o teste foi de 24 horas para memória de longa duração (Izquierdo et al., 1998; Quevedo et al., 1997; Roesler et al., 2003; 2004).

3.4 Determinação de citocinas (IL-1 e IL-10) e TNF-α no líquor

As concentrações de IL-1, IL-10 e TNF-α foram avaliadas 6 horas após a indução da sepse. No tempo inicial (6 horas) o sangue foi coletado através de punção da veia ocular. IL-1, IL-10 e TNF-α foram determinados pelo método imuno-enzimático: Standard Sandwich Enzymelinked Immunosoberbent Assay (ELISA), empregando kits comercias (R & D Systems, Minneapolis, MN).

3.5 Medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)

Como indício de peroxidação lipídica e avaliação de dano oxidativo será medida a concentração de TBARS tecidual durante uma reação ácida aquecida como previamente descrito (Draper, 1990). Brevemente, as amostras obtidas (líquor) serão misturadas com 1mL de ácido tricloroacético 10% e 1mL de ácido tiobarbitúrico, fervidas por 15 minutos, e após a quantidade de TBARS será determinada pela absorbância em 532 nm por espectrofotometria.

3.6 Análise Estatística

A análise estatística foi realizada utilizando o programa SPSS (Statistical

Package for the Social Sciences) versão 17.0. Os dados serão expressos em forma

de média e desvio padrão e analisados pelo teste T Student com P<0,05 considerado estatisticamente significativo.

4 RESULTADOS

No presente estudo realizamos as dosagens de TNF-α, interleucinas 1 e 10 e TBARS 6 horas após a realização de CLP como marcadores de inflamação e de lipoperoxidação, relacionando tais concentrações com o cognição a longo prazo.

A avaliação de memória dos grupos, através do teste de esquiva inibitória, comprova que há realmente déficit neurológico, como mostrado na figura 3. O grupo Sham (controle) teve seu tempo de latência estatisticamente maior que os ratos submetidos a CLP.

Figura 3: Tempo de latência do teste de esquiva inibitória em ratos submetidos ao modelo animal de sepse. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em segundos, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05. N= .

Foram avaliadas as concentrações de IL-1 e IL-10 em animais submetidos ao modelo animal de sepse por CLP, as avaliações foram realizadas 6 horas após a indução. Os animais do grupo CLP apresentaram um aumento significativo nos

níveis de IL-1 no líquor em comparação com o grupo sham (figuras 4 e 5, respectivamente). Entretanto não foram encontradas diferenças significativas nos níveis da IL-10 quando comparada ao grupo sham.

Figura 4: Concentração de IL-1 em líquor de ratos submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após). Com N=80. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (em relação ao grupo SHAM).

Figura 5: Concentração de IL-10 em líquor de ratos submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após). Com N = 80. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (em relação ao grupo SHAM).

Dentre o grupo CLP, selecionamos os 50% e 25% dos ratos que tiveram melhor desempenho no teste de esquiva inibitória e correlacionamos com os níveis de IL-1 e IL-10 (figuras 6, 7, 8 e 9, respectivamente). Não encontramos diferença estatística nessas correlações.

Figura 6: Correlação dos níveis de IL-1 com o desempenho do teste de esquiva inibitória submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após) Percentil 50. Com N=. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (Apenas no grupo CLP).

Figura 7: Correlação dos níveis de IL-1 com o desempenho do teste de esquiva inibitória submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após) Percentil 75. Com N=. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (Apenas no grupo CLP).

Figura 8: Correlação dos níveis de IL-10 com o desempenho do teste de esquiva inibitória submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após) Percentil 50. Com N=. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (Apenas no grupo CLP).

Figura 9: Correlação dos níveis de IL-10 com o desempenho do teste de esquiva inibitória submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após) Percentil 75. Com N=. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (Apenas no grupo CLP).

Os níveis de TNF-α após em 6 horas da indução da sepse aumentaram consideravelmente nos ratos submetidos a CLP quando comparados com o grupo sham (figura 10).

Figura 10: Concentração de TNF-α em líquor de ratos submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após). Com N=80. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (em relação ao grupo SHAM).

Não encontramos correlação estatisticamente significativa ao compararmos os níveis de TNF-α e TBARS com o desfecho dos animais submetidos a CLP (figuras 11 e 12, respectivamente).

Figura 11: Correlação dos níveis de TNF-α em líquor 6 horas após indução modelo animal de sepse em ratos com o desfecho. * Com N=36. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL x10-3, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (em relação ao grupo SHAM).

Figura 12: Correlação dos níveis de TBARS em líquor 6 horas após indução modelo animal de sepse em ratos com o desfecho. * Com N=36. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL x10-3, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (em relação ao grupo SHAM)

Ao analisarmos os 50% dos ratos que tiveram melhor desempenho no teste de esquiva inibitória e correlacionamos com os níveis de TNF-α coletados 6 horas após indução de CLP, encontramos significativo aumento de TNF-α nos animais que apresentaram melhor desempenho (figura 13).

Figura 13: Correlação dos níveis de TNF-α submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após) Percentil 50. * Com N=13. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL x10-3, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (Apenas grupo CLP).

Verificou-se na figura 14 um aumento considerável nos níveis de TBARS nos ratos submetidos ao modelo animal de sepse quando comparados ao grupo sham.

Figura 14: Lipoperoxidação em líquor de ratos submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após). Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em nmol de TBARS/mg de proteínas. * p < 0,05 (em relação ao grupo SHAM).

Observa-se que os níveis de TBARS dosados nos grupos com melhor e pior desempenho no teste de esquiva inibitória estão aumentados nos ratos que apresentaram um melhor desempenho quanto ao tempo de latência. Dentre os ratos que apresentaram melhor desempenho do grupo sepse, selecionamos 25% dos ratos que tiveram melhor desempenho, sendo que nestas avaliações observou-se que os níveis de TBARS estão aumentados nos ratos que apresentaram um melhor desempenho quanto ao tempo de latência (figura 15).

Figura 15: Lipoperoxidação em líquor de ratos submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após) Percentil 75. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em nmol de TBARS/mg de proteínas. * p < 0,05.

5 DISCUSSÃO

As incapacidades observadas neste estudo, como as alterações cognitivas, são verificadas em sobreviventes de sepse, principalmente a incapacidade na memória. Desta forma, o modelo de CLP pode ajudar a investigar os mecanismos biológicos que estão associados com a incapacidade cognitiva, determinando possíveis ações terapêuticas para esta situação. Estudos prévios em pacientes em Unidade de Terapia Intensiva que apresentaram sepse constataram que estes pacientes apresentam alguma incapacidade cognitiva na alta hospitalar (Hopkins et al., 1999; Granja et. al, 2004). Apesar disso, os mecanismos envolvidos na incapacidade cognitiva ainda não estão bem elucidados.

Nossos estudos demonstram que os animais sépticos submetidos ao teste de esquiva inibitória apresentaram um tempo de latência menor quando comparados ao controle. O teste de esquiva inibitória envolve vários estímulos, incluindo percepção espacial e visual, sensibilidade a dor, acompanhados de um componente emocional amplamente controlados por hormônios relacionados ao estresse (Gold, 1986). Estes resultados indicam que o déficit de memória persiste após 30 dias da indução de sepse. Essa persistência reforça a idéia que este modelo poderia ser uma ferramenta importante no estudo das sequelas cognitivas em sobreviventes à sepse.

Barrichello e colaboradores (2006) demonstraram que 10 dias após a indução de sepse por CLP, os ratos apresentaram diminuição da capacidade de memória aversiva, mostrando que o grupo sepse necessita aproximadamente duas vezes mais estímulos para alcançar o critério de aquisição de memória, quando comparado com o grupo sham, comprovando, assim, a dificuldade na aprendizagem.

Semmler e colaboradores (2007) mostraram que ratos submetidos à sepse pelo modelo LPS (injeções de lipopolissacarídeos) apresentaram após 3 meses, alterações comportamentais, dano neuronal em sub-regiões hipocampais e redução da inervação colinérgica em áreas corticais.

Em um modelo animal de sepse induzido por LPS, foram encontrados mecanismos conhecidos de apoptose no hipocampo 24 horas após a indução, sendo assim o mais severamente afetado de sepse (Semmler et al., 2005). As incapacidades cognitivas parecem estar relacionadas diretamente aos processos dependentes do hipocampo, danificando a memória (Squire e Zola-Morgan, 1991) Similarmente, como indicou Semmler e colaboladores (2007) em estudo, caracterizado por uma redução significativa na densidade dos neurônios na região CA1/CA2 do hipocampo.

Como clinicamente quase nenhuma manifestação pode ser considerada exclusiva da sepse, a utilização de outros marcadores inflamatórios torna-se essencial. Muitas pesquisas sobre marcadores precoces de sepse vem acontecendo há alguns anos e a utilização das interleucinas parece ser promissora.

Dentre os mediadores endógenos, liberados, primeiramente, pelas células residentes e, posteriormente, pelas células recrutadas para o foco infeccioso, as citocinas desempenham um papel primordial na resposta do hospedeiro. Citocinas como a interleucina-1 (IL-1), o fator de necrose tumoral (TNF-α) e as demais quimiocinas promovem o recrutamento de leucócitos para o sítio inflamatório, bem como sua ativação com consequente aumento da atividade microbicida, sendo a resposta local fundamental para o controle da infecção (Reyes et al., 2003).

A evolução de uma infecção localizada para um quadro sistêmico caracteriza-se pela precaracteriza-sença de citocinas pró-inflamatórias na circulação e ativação das células circulantes, podendo, também, haver a presença de bactérias, endotoxinas ou exotoxinas (Wei & Li & Li, 1995). Esse fato é responsável pela maioria das alterações fisiopatológicas, observadas em um quadro clínico de sepse e em modelos experimentais (Van Der Poll & Sauerwein, 1993).

Como demonstrado em nosso estudo, os níveis de TNF-α e IL-1 elevam-se significativamente logo nas primeiras horas após a indução de sepse por CLP, sugerindo que a resposta inflamatória ao agente infeccioso inicia-se imediatamente após indução de sepse.

Esse aumento de dos níveis de TNF-α e IL-1 corroboram com achados de outros autores (Girardin et al., 1993; Kilpatrick & Harris, 1998; Dollner et al., 2001; Reyes et al., 2003).

Além desses dados, quando comparamos os níveis de TNF-α com o teste de memória a longo prazo em ratos sobreviventes de sepse, podemos encontrar que 25% dos ratos que tiveram melhor desempenho, ou seja, maior tempo de latência, tiveram seus níveis aumentados. Isto pode mostrar que os animais que tiveram melhor desempenho a longo prazo, consequentemente, menos dano, foram aqueles que tiveram maior inflamação inicial. Esta inflamação inicial (antes da sepse realmente acontecer) funcionaria como uma organização antecipada do sistema imunológico do organismo do animal. Assim, no momento da agressão pelo patógeno, seu sistema imunológico estaria mais resistente ou mais preparado, acarretando em uma defesa inicial importante na prevenção da lesão celular, o que levaria a tornar-se um mecanismo de proteção celular.

Com aumento da inflamação logo no inicio da indução acontece então o aumento da defesa imunológica de primeiro impacto do animal, ou seja, a inflamação aumentada é importante apenas na fase inicial da sepse, pois na fase tardia, o aumento significativo da inflamação acaba sendo outro problema no animal. Diferentes mediadores da resposta inflamatória da sepse podem levar a disfunção mitocondrial e esta, a liberação de espécies reativas de oxigênio. Foi demonstrado que, o dano oxidativo avaliado pela técnica de TBARS ocorrem precocemente no desenvolvimento do curso da sepse. Os níveis de TBARS foram significativamente elevados no grupo CLP em relação ao grupo sham.

Em contraste, quando correlacionados apenas dentro do grupo CLP, encontramos aumento dos níveis de TBARS nos animais que tiveram melhor desempenho no teste de esquiva inibitória. Ou seja, os ratos sépticos que tiveram maior tempo de latência no teste de memória a longo prazo, apresentaram maior concentração de TBARS nas primeiras 6 horas após a indução de CLP.

Logo, o maior tempo de permanência dos ratos que tiveram indução de sepse na plataforma relacionou-se ao acentuado nível do dano, o que pode levar a explicação de que os ratos que apresentaram maior dano obtiveram maior adaptação e melhor desempenho cognitivo.

Talvez esse mecanismo que envolva a proteção celular, não bem compreendido ainda, seja o fator principal que leve esses ratos a terem um melhor desempenho no teste de memória.

O que poderia explicar muitos desses acontecimentos seria a indução de proteínas existentes no interior das células que são induzidas por tipos específicos de estresse. Como por exemplo, as proteínas de choque térmico (HSP), também

chamadas de proteínas de estresse. Estas são induzidas por tipos específicos de estresse como o calor. Um fato importante que explicaria o provável efeito de quanto maior a inflamação no animal, melhor seu desempenho no teste de cognição é que ao interagir com um intervalo de HSPs, a proteína é induzida a regular seu funcionamento. Além disso, membros da família HSP tem sido reconhecidos por terem efeitos citoprotetor (Weiss et al., 2002).

Dentro da família das HSP, existem algumas proteínas específicas que desempenham um papel importante como citoprotetora, antiapoptótica, imunológica e com efeitos de regulação, e é de longe a melhor estudada. O aumento da expressão de HSP72 em modelos experimentais de acidente vascular cerebral, sepse, síndrome do desconforto respiratório agudo, insuficiência renal e isquemia miocárdica foi mostrado para reduzir lesões de órgãos e, em alguns casos, e melhorar a sobrevida. O aparecimento do gene HSP está associado com melhores resultados em ratos (Singleton & Wischmeyer, 2006).

Assim, aumento dos níveis de HSP pode indicar não só danos nos tecidos, mas podem indicar também o sucesso de montagem de uma resposta ao estresse que se correlaciona com proteção de tecido e melhor desfecho (Ganter et al., 2006).

As HSP foram mostradas para fornecer neuroproteção da isquemia cerebral em animais com cultura celular em modelos de choque (Giffard & Yenari, 2004). Também, trabalhos recentes tem demonstrado que elas também podem interferir diretamente com a vias da morte celular, como apoptose e necrose e pode modular a inflamação (Jaattela, 1999).

A morte celular programada ocorre por múltiplos caminhos (Leist & Jaattela, 2001). A apoptose ocorre principalmente por um da via intrínseca que responde ao

estresse e alterações intracelulares, esta se baseia sobre a liberação de moléculas pró-apoptóticas mitocondriais, a abertura da permeabilidade mitocondrial dos poros de transição, e ativação de caspases (Gogvadze & Orrenius, 2006).

O segundo bem descrito caminho é a via extrínseca, que é desencadeada pela ativação de receptores de membrana plasmática que libera sinal através de domínios de sua morte. Esta sinalização ativa a caspase-8 e pode prosseguir, independentemente da via intrínseca, mas também pode levar a ativação da via intrínsica (Kroemer & Martin, 2005).

Apesar de nossos estudos não terem sido correlacionados com os níveis dessa proteína citoprotetora, ela pode ser a explicação de porque as altas concentrações dos indicadores de inflamação e de dano oxidativo tiveram direta relação com o melhor desempenho dos ratos no teste de esquiva inibitória. Talvez em estudos futuros, seja necessário verificar a correlação desses níveis que se apresentaram significantes com os níveis iniciais e tardios dessa proteína que parece ser tão importante nesses animais.

Muitos estudos mostraram fenômenos neurobiológicos envolvidos no dano cognitivo em sobreviventes da sepse, contudo falta um aprofundamento do entendimento da fisiopatologia dessa doença e da relação dela com o déficit cognitivo a curto e longo prazo.

Pode-se afirmar com clareza que os níveis inflamatórios e de danos oxidativos iniciais nos ratos submetidos à sepse por CLP apresentam ótimos resultados. Confirmando a teoria de que o organismo que mais concentradamente responder (em fase inicial) ao agente agressor tem melhor adaptação e, consequentemente, melhor resultado prognóstico.

Neste contexto, os resultados deste estudo sugerem uma incapacidade cognitiva a longo prazo como alterações de memória. É difícil afirmar claramente com os dados que encontramos o exato mecanismo que leva esse estresse celular a relacionar-se com a melhoria da capacidade cognitiva dos animais submetidos a CLP. Verificar a relação desses estudos com níveis de mediadores induzidos pelo estresse poderia ser uma importante explicação de como exatamente os animais conseguem apresentar melhor desempenho com maiores níveis de dano e de inflamação.

6 REFERÊNCIAS

ANGUS DC; MUSTHAFA AA; CLERMONT G; GRIFFIN MF; LINDE-ZWIRBLE WT; DREMSIZOV TT; PINSKY MR. Qualityadjusted survival in the first year after the acute respiratory distress syndrome. American Journal of Respiratory and

Critical Care Medicine. 163:1389–1394, 2001.

BARDENHEUER HJ; WEIGAND MA. Leukocyte endothelial interactions—a double edged sword. Cardiovascular Research. 41(3): 511-513, 1999.

BARICHELLO T; FORTUNATO JJ; VITALI AM; FEIER G; REINKE A; MOREIRA JC; QUEVEDO J; DAL-PIZZOL F. Oxidative variables in the rat brain after sepsis induced by cecal ligation and perforation. Critical Care Medicine. 34: 886-889, 2006.

BATRA S; KUMAR R; KAPOR AK; RAY G. Alterations in antioxidant status during neonatal sepsis. Annals of Tropical Paediatrics. 20: 27-33, 2000.

BAUER P; LUSH CW; KVIETYS PR; RUSSELL JM; GRANGER DN. Role of endotoxin in the expression of endothelial selectins after cecal ligation and perforation. American journal of physiology. Regulatory, Integrative and

Comparative Physiology 278(5): 1140-1147, 2000.

BONE RC. The pathogenesis of sepsis. Annals of Internal Medicine. 115: 457-469, 1991.

BONT ES; MARTENS A; RAAN J; SAMSON G; FETTER WP; OKKEN A; LEIJ LH; KIMPEN JL. Diagnostic value og plama levels of tumour necrosis alpha and interleukin-6 in newborns with sepsis. Acta Paediatrica. 83: 696-699, 1994.

BOZZA FA; BOZZA PT; FARIA NETO HCC. Beyond sepsis pathophysiology with cytokines: what is their value as biomarkers for disease severity? Instituto

Oswaldo Cruz. 100 (1): 217–221, 2005.

CAI G; KASTELEIN RA; HUNTER CA. IL-10 enhances NK cell proliferation, cytotoxicity and production of IFN-gamma when combined with IL-18.

European Journal of Immunology. 29: 2658–2665, 1999.

CHROUSOS GP; GOLD PW. The concepts of stress and stress system disorders. Overview of physical and behavorial homeostasis. JAMA: The Journal of The

American Medical Association. 267: 1244–1252. 1992.

CLEMENTI E; BROWN GC; FEELISCH M; MONCADA S. Persistent inhibition of cell respiration by nitric oxide: Crucial role of S-nitrosylation of mitochondrial complex I and protective action of glutathione. Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America. 95: 7631–7636,

1998.

CROUSER ED. Mitochondrial Dysfunction in Sepsis Shock and Multiple Organ Dysfunction Syndrome. Mitochondrion. 4: 729-741, 2004.

DAVID CM; NETO HCF. Sepse: da Bancada á beira do leito. Revinter, Rio de Janeiro, pp. 36, 2007.

DEITCH EA. Animal models of sepsis and shock: a review and lessons learned.

Shock. 9(1): 1-11, 1998.

DINARELLO CA. Proinflammatory and anti-inflammatory cytokines as mediators in the pathogenesis of septic shock. Chest. 112: 321S-329S, 1997

DRAPER HH; HADLEY M. Malondialdehyde determination as index of lipid peroxidation. Methods in Enzymology. 186: 421-431, 1990.

DYBDAHL B; SLORDAHL SA; WAAGE Al; KIERULF P; ESPEVIK T; SUNDAN A. Myocardial ischaemia and the inflammatory response: release of heat shock protein 70 after myocardial infarction. Heart. 91: 299–304, 2005.

EUROPEAN SOCIETY OF INTENSIVE CARE MEDICINE. The problem of sepsis.

Intensive Care Medicine. 20: 300-304, 1994.

FINK MP. Bench-to-bedside review: Cytopathic hypoxia. Critical Care. 6: 491– 499, 2002.

FINK MP; HEARD SO. Laboratory models of sepsis and septic shock. The Journal

of Surgical Research. 49: 186-196, 1990.

FONG Y; MOLDAWER LL; SHIRES GT; LOWRY SF. The biologic characteristics of cytokines and their implication in surgical injury. Surgery, Gynecology &

Obstetrics. 170: 363-378, 1990.

GANTER MT; WARE LB; HOWARD M; ROUX J; GARTLAND B; MATTHAY MA; FLESHNER M; PITTET JF. Extracellular heat shock protein 72 is a marker of the stress protein response in acute lung injury. Am Journal Lung Cellular

and Molecular Physiology. 291: 354–6, 2006.

GARDLUND B; SJOLIN J; NILSSON A; ROLL M; WICKERTS CJ; WRETLIND B. Plasma levels of cytokines in primary septic shock in humans: correlation with disease severity. The Journal of infectious diseases. 172: 296-301, 1995. GIFFARD RG; YENARI MA. Many mechanisms for HSP70 protection from cerebral