ESTUDO in vitro DO EFEITO DO DIMETILSULFÓXIDO (DMSO) E DO
ÓLEO ESSENCIAL DE Ageratum fastigiatum NAS PROPRIEDADES
BIOMECÂNICAS DE LEUCÓCITOS HUMANOS: UMA ANÁLISE POR
MEIO DA CITOMETRIA DE FLUXO, MICROSCOPIA ÓPTICA E
CONFOCAL
Priscila. G. M. de Alvarenga¹; Bárbara E. Souza¹; Marcelo H. F. Ottoni²; Bethânia A. Avelar-Freitas²; João V.W. Silveira¹; Agnes B. Meireles²; Cristiane F. F. Grael²; Gustavo E. A. Brito-Melo²; Libardo A. Gonzáles-Torres¹
¹Instituto de Ciência e Tecnologia – Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM) ²Departamento de Farmácia – Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM)
Rodovia MGT 367, Km 583, nº 5000 - Diamantina - MG, 39100-000 E-mail: [email protected]
Resumo. O óleo essencial de A. fastigiatum é utilizado para tratar dores e inflamações. Entretanto, o
mecanismo da migração leucocitária, envolvido na ação anti-inflamatória, ainda não foi devidamente elucidado. Analogamente o Dimetilsulfóxido (DMSO) é um composto orgânico sintetizado com diversas propriedades farmacológicas e Terapêuticas já verificadas. No entanto, o seu efeito isolado sobre as propriedades mecânicas das células é pouco conhecido. O objetivo deste estudo é analisar a influência de diferentes teores desse óleo essencial sobre as estruturas internas dos leucócitos, utilizando métodos de citometria de fluxo e microscopia óptica. Foi possível demonstrar que a ação do óleo aumenta a expressão de CD18, marcador de integrinas da membrana leucocitária. Além disso, pode modificar a estrutura do citoesqueleto, permitindo dessa forma interferir no mecanismo de migração celular. A compreensão desse fenômeno pode auxiliar no desenvolvimento de métodos de diagnóstico e tratamento de doenças do sistema imune.
Palavras-chave: leucócitos, imunologia, citometria de fluxo, migração celular. 1. INTRODUÇÃO
O Ageratum fastigiatum (Gardner) R. M. King & H. Rob. (Asteraceae), conhecida popularmente no estado de Minas Gerais - Brasil como “matapasto” ou "enxota", é utilizado na medicina popular como anti-inflamatório e analgésico (2) (7). Seu extrato é obtido através da maceração de folhas e ramos frescos obtendo um extrato aquoso que após filtração é aplicado topicamente para tratar dor e inflamações. Seu óleo essencial pode ser obtido através de processos de hidrodestilação, o qual foi demonstrado in vivo que possui efeito anti-inflamatório e analgésico, através da redução de edema e da migração leucocitária induzidos em modelo animal (7). Contudo, os mecanismos envolvidos na ação anti-inflamatória da planta ainda não foram bem elucidados. Em contra partida, o DMSO é um composto orgânico e sintetizado formado por uma ligação entre enxofre e oxigênio juntamente a mais duas ligações com metila (C2H6OS), ele apresenta elevada capacidade higroscópica, levando-o a ser comumente utilizado na solubilização de extratos vegetais ou fármacos cuja ação se deseja investigar. A partir do início de sua utilização na medicina em 1960 mais de trinta propriedades famacológicas e terapêuticas foram descritas para esse composto que é capaz de realizar diversas interações sem produzir alterações em sua configuração molecular (8). Suas inúmeras propriedades garantem ao DMSO o título de um dos fármacos mais versáteis. No entanto, o seu efeito isolado sobre as propriedades mecânicas das células é pouco conhecido.
Alguns estudos demonstraram o efeito do óleo essencial de A. fastigiatum na redução de linfócitos e neutrófilos que produziram a citocina TNF-α (5), um mediador importante na resposta imune inflamatória, capaz de induzir a expressão de moléculas de adesão no endotélio, favorecendo o recrutamento celular para o sítio da inflamação (3) (10). Porém até
então não há estudos que avaliaram o efeito do óleo essencial da planta sobre integrinas de membrana leucocitárias envolvidas na migração celular e nos arranjos de elementos do citoesqueleto. Partindo da premissa de ação anti-inflamatória de A. fastigiatum e do DMSO e seus potenciais de atuação sobre leucócitos, o objetivo desse estudo foi investigar o efeito de ambos sobre a expressão de CD18, bem como avaliar mudanças geométricas nas células de culturas de células mononucleares do sangue periférico humano in vitro, as quais são avaliadas devido a possíveis mudanças causadas por alterações no citoesqueleto.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Obtenção e análise química do óleo essencial
O material vegetal fresco foi cominuído e a extração de seu óleo essencial foi realizada através de aparato de Clevenger, por 2 h(6). O óleo essencial foi acondicionado em frasco tipo eppendorff e conservado a –20°C até o momento de análise química. A identificação dos constituintes químicos do óleo essencial foi realizada com base nos dados de análises através de cromatografia gasosa/espectrometria de massas (CG/EM). Foram realizadas duas análises sob as mesmas condições experimentais: uma análise do óleo essencial sem a adição de nenhuma substância e outra análise do óleo essencial misturado com uma série homóloga de hidrocarbonetos (C7 a C40 - padrões de hidrocarbonetos saturados dissolvidos em hexano). A partir da primeira injeção do óleo essencial foram obtidos os espectros de massas dos componentes químicos. A segunda injeção foi realizada para se obter tempos de retenção dos constituintes químicos e dos hidrocarbonetos para se calcular o índice de retenção relativa, de acordo com a equação (A) (4).
(1)
Onde:
IRR = número do índice de retenção relativa;
n = número de átomos de carbono do hidrocarboneto eluído imediatamente antes do composto “x” de interesse;
tn e tn+1 = tempos de retenção dos hidrocarbonetos eluídos imediatamente antes e após o composto “x” de interesse, respectivamente;
tx = tempo de retenção do composto “x”.
Os espectros interpretados e os IRR calculados foram comparados com dados da literatura (1) e de sites especializados e de acesso livre (http://www.pherobase.com/ e http://www.flavornet.org/flavornet.html) para se confirmar a identificação dos componentes químicos do óleo analisado. Os espectros obtidos experimentalmente foram comparados a espectros contidos na espectroteca (NIST).
2.2 Análise da viabilidade de leucócitos do sangue periférico tratados in vitro com diferentes concentrações do óleo essencial de Ageratum fastigiatum
Para avaliar o efeito do óleo essencial da A. fastigiatum sobre a viabilidade dos leucócitos, 5x106 células foram incubadas com meio RPMI (acrescido de soro humano (10%), L-glutamina (1%) e coquetel antibiótico e antimicótico (1%)) e tratadas com óleo essencial nas concentrações finais de 25x10-3 μL/mL, 12,5x103 μL/mL e 6,25x10-3 μL/mL por 5 dias, em estufa com 5% de CO2 e 37ºC. Culturas celulares contendo apenas RPMI e culturas acrescidas de dimetilsulfóxido (DMSO) constituíram a cultura controle e controle do solvente, respectivamente. O óleo essencial foi diluído em DMSO à 1/160 e adicionado à cultura no
volume máximo de 8 μL. Após o período de incubação as células foram removidas da placa por lavagem com tampão fosfato salina (PBS) gelado, centrifugadas a 200 G, 10 min, 4ºC. O precipitado foi suspenso em PBS para avaliação da viabilidade pela técnica de exclusão de azul de tripan por citometria de fluxo (5). A viabilidade celular foi determinada pelo percentual de células viáveis no universo de células totais, coradas (inviáveis) e não coradas (viáveis).
2.3 Estimulação das células com óleo essencial e DMSO
Inicialmente, para o óleo essencial, foi testado o protocolo de cultura de sangue total com estimulação por 4 h. Posteriormente foi realizado um segundo protocolo, com culturas duplicadas, que consiste na estimulação de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) por 24 h.
Cultura de sangue total. Para teste do protocolo 500 μL de sangue total foram
estimulados ou não com PMA-ionomicina (25 ng/mL). As culturas permaneceram por 4 h em estufa úmida a 37ºC e 5 % de CO2. Em seguida, as amostras foram submetidas à lise das hemácias por adição de uma solução de lise eritrocitária e incubadas à temperatura ambiente por 15 min. Após a incubação, as amostras foram centrifugadas, o sobrenadante descartado e as células suspensas em PBS (PBS 0,015 M pH 7,4). As células foram então marcadas com anticorpos monoclonais anti-CD18 conjugados com phycoerythrin (PE) por 30 min. Terminada a incubação, as células foram lavadas com PBS e avaliadas por citometria de fluxo (FACScanto - Becton Dickinson), procedendo-se a aquisição de 30.000 eventos por tubo.
Cultura de Células mononucleares do sangue periférico (PBMC). As PBMCs foram
obtidas a partir de sangue periférico venoso após centrifugação em Histopaque 1077 (Sigma, St. Louis, MO, USA). O anel de PBMC, formado após a centrifugação, foi recolhido e lavado duas vezes em PBS. O precipitado de células foi em seguida suspenso em 1 mL de PBS/BSA 1% ou RPMI (Sigma, St. Louis, MO, USA). Após contagem das células em câmara hemocitométrica de Neubauer, as células foram novamente centrifugadas e suspensas em PBS/BSA 1% ou RPMI (Sigma, St. Louis, MO, USA) suplementado com L-glutamina (Sigma, St. Louis, MO, USA) (2 mM), e coquetel antibiótico/antimicótico (penicilina G 100 UI/mL, estreptomicina 100 µg/mL e anfotericina B 250 ng/mL - Sigma, St. Louis, MO, USA) na concentração de 1x107 células/mL.
A partir de um volume de 50 μL, 5x105 células foram incubadas em RPMI da suspensão celular. As culturas tratadas com os produtos naturais e as tratadas com DMSO foram estimuladas ou não com o PMA. A cultura estimulada com PMA constituiu o controle positivo. As células foram incubadas por 24 h em estufa úmida, a 37ºC contendo 5% de CO2. Após o período de incubação, as células foram lavadas duas vezes com PBS. Nas amostras tratadas com o óleo essencial e DMSO foi realizada a marcação com anticorpos anti-CD18 e realizada a leitura de 30.000 eventos por citometria.
Baseado na literatura (GUCK, J. et al., 2005), microscopias óptica e confocal foram aplicadas à células incubadas em RPMI suplementado com L-glutamina (2 mM), e coquetel antibiótico/antimicótico (penicilina G 100 µL/mL, estreptomicina 100 µg/mL e anfotericina B 250 ng/mL) foram analisadas ao serem divididas em cinco grupos: controle negativo, controle positivo estimuladas com Phorbol Myristate Acetate (PMA) (25 µLmL-1 ) e culturas teste estimuladas com PMA (25 µLmL-1 ) e tratadas com três diferentes concentrações de DMSO (5, 10 e 20 µLmL-1 ). O software ZEN®, dedicado à análise das imagens, foi utilizado para avaliação de alterações no citoesqueleto a partir do diâmetro celular e da razão de aspecto (dmenor/dmaior).
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES
3.1 Análise da composição do óleo essencial de A. fastigiatum
A análise da cromatografia gasosa revelou a presença das substâncias listadas na Tabela 1. Das substâncias elucidadas, as que se encontram em maiores concentrações são o germacreno e α-pineno, os quais já foram encontradas em outras amostras do óleo essencial desta planta (5)(7).
Tabela 1: Substâncias presentes no óleo essencial Composto identificado Tempo de
retenção (min)
IRR calculado
IRR
literatura Área do pico*
α-pineno 6,90 934,9 932 143.331.056 β-pineno 8,22 979,1 974 16.696.142 β-mirceno 8,55 990,3 988 4.322.807 d-limoneno 9,96 1029,6 1024 87.911.992 β-ocimeno 10,60 1046,6 1044 11.151.418 α-copaeno 24,45 1379,7 1374 9.273.628 4,8-β-epóxi-cariofileno 26,31 1425,1 1423 64.096.240 Germacreno 28,82 1487,6 1484 151.216.768 Biciclogermacreno 29,43 1502,9 1500 12.008.181 NI 34,17 1627,7 - 81.561.200 NI 34,93 1648,5 - 8.961.346 NI 40,92 1819,0 - 19.160.288
*Área absoluta do pico no cromatograma; corrente de íons total, sem padronização; NI= não identificado.
3.2 Análise da viabilidade de leucócitos do sangue periférico tratados in vitro com diferentes concentrações do óleo essencial de Ageratum fastigiatum
A viabilidade celular foi determinada pelo percentual de células viáveis no universo de células totais, coradas (inviáveis) e não coradas (viáveis). Os resultados indicaram que o tratamento com até 25x10-3 μL/mL do óleo essencial de A. fastigiatum em DMSO, em cultura celular não altera a viabilidade dos linfócitos para culturas com incubação de 5 dias. De tal forma, todas as concentrações utilizadas em tais testes foram consideradas de baixa toxicidade “Figura 1”.
Controle DMSO 25 12,5 6,25 Óleo Essencial de A. fastigiatum
x10-3 μL/mL 0 1 2 3 % C é lu la s I n v iá v e is
Figura 1: Percentual de células inviáveis após incubação com concentrações do óleo essencial A. fastigiatum por cinco dias. Anova seguida de Tukey, n=4.
Até o momento o que se pode concluir é que o óleo essencial na concentração de 25x10-3 μL/mL não foi tóxico e, portanto, é a primeira concentração a ser utilizada nos ensaios de inibição da expressão de moléculas de adesão como a CD18.
3.3 Resultados da padronização do experimento para escolha do uso de Sangue Total ou PBMC
Os resultados com sangue total indicaram que após 4 horas de incubação e análise dos linfócitos o PMA não foi capaz de induzir o aumento na expressão de citocinas. O percentual de células CD18+, bem como a intensidade de fluorescência das culturas estimuladas e não estimuladas foram semelhantes. Portanto o estimulo do PMA (25 ng/mL) por quatro horas não produziu o efeito desejado (Figura 2).
Figura 2: Resultado da padronização do estimulo do PMA por 4 h em sangue total para expressão de CD18 na cultura não estimulada (A) e estimulada (B).
Já a análise com PBMC indicou que após 24 h de incubação foi possível observar o efeito do PMA na indução da expressão de CD18 em linfócitos (Figura 3). Portanto os testes para verificação do efeito do óleo essencial de A. fastigiatum foram realizados com o a incubação de 24 h. Tendo em vista que os neutrófilos e hemácias presentes no sangue total
possuem tempo de vida limitado em culturas, para incubação de 24 h foram utilizadas células PBMC’s.
Figura 3: Resultado da padronização do estimulo do PMA por 24 h em sangue PBMC na expressão de CD18 na cultura não estimulada (A) e estimulada (B).
3.4 Expressão de CD18 em linfócitos estimulados com PMA e tratados com o óleo essencial de A. fastigiatum
O CD18 representa uma família de integrinas expressas na superfície de leucócitos que vão auxiliar na adesão dos leucócitos para a diapedese e migração nos tecidos. Na inflamação ocorre uma alta taxa de migração celular, a fim de restaurar a homeostase tecidual. No entanto, em algumas doenças autoimunes é necessária a intervenção farmacológica para cessar os efeitos da inflamação. Os resultados indicaram que o óleo essencial na 1/160 reduziu a intensidade de fluorescência das células marcadas com anti-CD18, o que demonstra que as células tratadas com o óleo essencial da planta reduziram o efeito provocado pelo PMA de induzir a expressão de CD18 (Figura 4). As células estimuladas com PMA apresentaram uma intensidade média de fluorescência (IMF) para a marcação de CD18 no valor de 1008, as células estimuladas com PMA e tratadas com o óleo essencial apresentaram o valor de IMF de 619, muito próximo do controle não estimulado IMF 622. É possível que parte dos mecanismos envolvidos na ação do CD18 sejam medidas pela diminuição do recrutamento de células inflamatórias para o tecido.
Figura 4: Resultados da Intensidade média de fluorescência (IMF) das culturas marcadas com anti-CD18 nas culturas: controle não marcado (A), controle negativo (B), controle positivo estimulado com PMA (C) e cultura teste estimulada com PMA e tratada com óleo essencial
(D).
3.5 Análise de alterações no citoesqueleto a partir do diâmetro celular nas amostras tratadas com óleo essencial de A. fastigiatum
Utilizando-se o protocolo de obtenção de PBMC, dessa vez, após a mesma cultura de 24 h, foram feitas análises em microscópio óptico para que fossem tomadas medidas dos eixos das células. Foi padronizado um número de dez medidas por amostra (não marcada, não estimulada, controle positivo e tratada com óleo essencial). A “Figura 5” apresenta um comparativo do resultado médio e do desvio padrão das medições dos diâmetros (em μm).
Figura 5: Diâmetros das células com e sem influência de óleo essencial.
Apesar das análises em citometria de fluxo apresentarem alterações significativas, não foi possível observar alterações conclusivas no tamanho das células, o que poderia sugerir alterações nas estruturas internas da célula. Porém a falta de alterações perceptíveis se deve ao fato de que essa é uma medida indireta e pouco sensível para avaliar a deformação do citoesqueleto.
3.6 Análise de alterações no citoesqueleto a partir do diâmetro celular nas amostras tratadas com DMSO
Após a preparação das culturas de células separadas nos cinco grupos listados, passou-se para o tratamento das imagens obtidas por meio de microscopia confocal. Utilizando ferramentas do software Zen®, foram mensuradas as dimensões das células, como representado pela “Figura 6”. A partir de tais dimensões, os cálculos dos diâmetros médios e da razão de aspecto, com os respectivos desvios padrões foram calculados e encontram-se representados na “Tabela 2”. O objetivo principal da análise das imagens era verificar alterações no tamanho das células após tratadas com as diferentes concentrações de DMSO, a partir dos diâmetros médios, e mudanças no formato das mesmas, a partir da razão de aspecto.
Figura 6 – Linfócitos com representação das dimensões mensuradas: A – linfócito com marcações dos diâmetros menor e maior; B – linfócito exibindo leve fluorescência como
resultado da marcação do anticorpo CD18
Considerando o diâmetro maior apresentado pelas células, foi possível traçar um gráfico de colunas, utilizado na comparação entre o tamanho das células para cada um 5 dos diferentes tratamentos. O gráfico encontra-se representado na “Figura 7”, na qual também estão relacionados os desvios padrões de cada medição.
Figura 7 – Diâmetros das células com e sem influência do DMSO
A partir da análise destes resultados, verificou-se que não foi possível observar alterações conclusivas no tamanho das células, o que poderia sugerir alterações em suas estruturas internas como o citoesqueleto. A sobreposição dos desvios evidenciou a inexistência de alterações significativas no tamanho das células, levando ao descarte do estabelecimento de testes estatísticos na análise destes resultados.
4. CONCLUSÃO
Foi comprovada a ação do óleo essencial de A. fastigiatum em integrinas CD18 de linfócitos humanos através dos dados apresentados de citometria que mostram que o óleo diminui a expressão das integrinas que são responsáveis pela adesão celular e contribuem para o processo de migração, nos levando a conclusão de que tal processo é afetado de forma significativa, bem como a estrutura celular que é de suma importância para o mesmo, alterando a conformação do citoesqueleto. Os ensaios em microscopia óptica e confocal foram realizados para avaliar a alteração na conformação de tal estrutura, porém em virtude do método pouco sensível, os resultados foram inconclusivos. Acerca do DMSO não foi possível comprovar sua ação nas células, pois as análises de medida de diâmetros e razões de espectro não apresentaram resultados significativos, porém, por ser esta uma substância utilizada na diluição de outras as quais se quer comprovar propriedades farmacológicas a ausência de alterações nas dadas concentrações podem ser consideradas satisfatórias, uma vez que se influenciasse na conformação celular também influenciaria no resultado do estudo das substâncias as quais são diluídas no mesmo, como é o caso do próprio óleo essencial de A. fastigiatum.
AGRADECIMENTOS
Os autores gostariam de agradecer à FAPEMIG e à CNPq pelo suporte financeiro para a realização desse trabalho e ao laboratório de imunologia da UFVJM por todo suporte estrutural para o desenvolvimento da pesquisa.
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In vitro STUDY OF THE DYETILSULFOXIDE (DMSO) AND ESSENTIAL OIL OF Ageratum fastigiatum ON THE BIOMECHANICAL PROPERTIES OF HUMAN
LEUKOCYTES: AN ANALYSIS BY FLUX CYTOMETRY, OPTICAL AND CONFOCAL MICROSCOPY
Priscila. G. M. de Alvarenga¹; Bárbara E. Souza¹; Marcelo H. F. Ottoni²; Bethânia A. Avelar-Freitas²; João V.W. Silveira¹; Agnes B. Meireles²; Cristiane F. F. Grael²; Gustavo E. A. Brito-Melo²; Libardo A. Gonzáles-Torres¹
¹Science and Technology Institute – Federal University of Vouchers of Jequitinhonha and Mucuri (UFVJM) ² Department of Pharmacy – Federal University of Vouchers of Jequitinhonha and Mucuri (UFVJM)
Rodovia MGT 367, Km 583, nº 5000 - Diamantina - MG, 39100-000 E-mail: [email protected]
Abstract. A. fastigiatum essential oil is employed to treat pains and inflammations. Even though, the mechanism of leucocitary migration, involved in the anti-inflammatory action, is not elucidated properly. Analogously the Dimetilsulfóxido (DMSO) it’s a compound organic synthetized with many pharmacological and therapies properties verified. However, your separate effect about the mechanical properties of cells is little known. The objective of this study is to analyze the influence of different essential oils contents over the leucocytes internal structure, by the flux cytometry and optical microscopy methods. It was demonstrated that the presence of oil increases the CD18 expression, an integrin marker from leucocitary membrane. Also, it is possible to modify the cytoskeleton structure, that allows to interfere in the cell migration mechanism. The comprehension of this phenomena can help the development of diagnosis methods and treatments for immunological system diseases.
