In II.1 II 7 11,1111 J

(22) Data de Depósito: 20/04/2007 (43) Data da Publicação: 09/08/2011 (RPI 2118)

In II .1 II

7

11,1111 J1111111

2

11

(54) Título: DERIVADO DE NICOTINA, PRECURSOR (57) Resumo: DERIVADO DE NICOTINA, PRECURSOR DE

DE DERIVADO DE NICOTINA, CONJUGADO DE DERIVADO DE NICOTINA, CONJUGADO DE HAPTENO- HAPTENO-CARREADOR, USO DE UM CONJUGADO CARREADOR, USO DE UM CONJUGADO DE HAPTENO-

CARREADOR, E, COMPOSIÇÃO DE VACINA A presente invenção

DE HAPTENO-CARREADOR, E, COMPOSIÇÃO DE _{fornece um hapteno na forma de um novo derivado de nicotina que} VACINA pode ser adequadamente conjugado com um carreador apropriado para produzir uma vacina eficaz contra a dependência de nicotina.

(30) Prioridade Unionista: 21/04/2006 EP 06112873.2 Mais particularmente, a invenção diz respeito a um derivado de nicotina da seguinte fórmula (1): A presente invenção também diz respeito a um conjugado de hapteno-carreador derivado do

(73) Titular(es): De Staat Der Nederlanden, Vert. Door de Minister _{derivado de nicotina anteriormente mencionado e uma composição de} Van VWS _{vacina compreendendo o dito conjugado de hapteno-carreador.}

(72) Inventor(es): Gijsbert Zomer, Peter Hoogerhout

(74) Procurador(es): Momsen, Leonardos & CIA. (86) Pedido Internacional: PCT NL2007050173 de 20/04/2007

P1011010

-1

"DERIVADO DE NICOTINA, PRECURSOR DE DERIVADO DE NICOTINA, CONJUGADO DE HAPTENO-CARREADOR, USO DE UM CONJUGADO DE HAPTENO-CARREADOR, E, COMPOSIÇÃO DE VACINA"

5 CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece uma vacina contra a dependência de nicotina. Mais particularmente, a presente invenção fornece um hapteno na forma de um novo derivado de nicotina que pode ser adequadamente conjugado com um carreador apropriado para produzir uma vacina eficaz 10 contra a dependência de nicotina.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

De acordo com a World Health Organisation, existem mais do que um bilhão de fumantes pelo mundo inteiro. É estimado que cerca de quatro milhões morrem a cada ano por causa de câncer, doença cardíaca e 15 outras doenças relacionadas com o ato de fumar.

É amplamente aceito que as pessoas continuam a fumar porque o tabaco contém nicotina, que é um produto químico que causa dependência. Muitas estratégias para a cessação do ato de fumar, de fato, supre os viciados em cigarro com nicotina de fontes outras que não o tabaco, tais como 20 emplastros ou goma de mascar.

Uma estratégia de cessação alternativa é fornecer uma vacina que estimule o sistema imune a limpar a nicotina do sistema pela produção de anticorpos contra a nicotina. Assim, se a seguir da imunização com uma vacina contra a nicotina, um indivíduo fuma um cigarro, os anticorpos 25 limparão a nicotina do sistema antes que ela atinja o cérebro. Como um

resultado, o efeito estimulante esperado da nicotina não será experienciado ou será significantemente reduzido. Porque o fumante experienciará uma diminuição ou cessação do efeito estimulante da nicotina, ele/ela perderão o desejo de fumar.

As vacinas contra a nicotina para o uso em estratégias de cessação do ato de fumar foram descritas em várias publicações de patente:

A WO 99/61054, por exemplo, descreve um imunógeno de nicotina compreendendo uma proteína de 5- ou 6-nicotinil-ligador-carreador. 5 Além disso, a US 6.232.082 descreve conjugados de

nicotina-carreador em que o nicotina-carreador é ligado ao resíduo de nicotina nas posições 3', 4' ou 5'. Os haptenos da US 6.232.082 contêm uma porção de nicotina derivatizada na posição 3', 4' ou 5' com uma porção (CH 2)n-Z, em que Z é NH2, COOH, CHO ou SH. Estes haptenos são conjugados à proteína 10 carreadora usando um reticulador homobifuncional ou um heterobifuncional.

Na fórmula (I) deste documento, X e Y representa os grupos de ligação do reticulador com o hapteno e o carreador respectivamente. Entretanto, os estudos de imunogenicidade descritos na patente US fazem uso dos adjuvantes de Freund completo e incompleto para reforçar a resposta imune. 15 Este adjuvante não é permitido para o uso em seres humanos.

A WO 2004/09116 descreve um método de produzir um conjugado de nicotina-Q(3 compreendendo as etapas de sintetizar o éster de N-hidroxisuccinimida de 0-succiniltrans-3'-hidroximetilnicotina e deixando o derivado de nicotina reagir com lisinas na superfície de QÍ3 sob formação de 20 uma ligação de amida. Uma desvantagem importante destes conjugados reside

na sua estabilidade in vivo deficiente.

A WO 02/49667 descreve um conjugado de cotinina em que a cotinina é conjugada a um carreador por intermédio da posição 1, 2, 5, 6 ou 4'. A WO 02/49667 divulga um conjugado de um hapteno compreendendo 25 uma porção de cotinina derivatizada com um grupo -CO-NH-CH 2-CH2-SH,

hapteno este que é conjugado com ovalbumina usando o éster de gama- maleimidobutiriloxissuccinimida (GMBS). No pedido internacional é observado que a cotinina pode antagonizar os efeitos da nicotina in vivo. Além disso, é levantada a hipótese de que uma reação imune contra a cotinina

possa reduzir o efeito de abafamento da cotinina sobre o efeito neurológico da nicotina, resultando deste modo no paciente desejando uma quantidade menor de nicotina. Esta hipótese não é plausível, especialmente não visto que a mesma não é confirmada por nenhuma evidência experimental.

5 SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os presentes inventores desenvolveram um novo hapteno que pode ser vantajosamente usado na produção de vacinas contra a nicotina altamente eficazes.

O hapteno de acordo com a presente invenção é um derivado 10 de nicotina da seguinte fórmula:

R-SH R-SH

,1

■

N) CH 3

em que o anel de cinco membros ou o anel de seis membros é substituído com um radical R-SH, em que R representa: CH 2-Y-Z:

- Y representando O, S, NH ou NH-CO; e

- Z representando um alquileno C 1 -C22 linear ou ramificado, 15 um alquenileno C2-C22 linear ou ramificado ou uma porção de polialquileno

glicol.

Os derivados de nicotina anteriormente mencionados podem ser usados para produzir um conjugado nicotina-carreador imunogênico que pode ser vantajosamente usado no tratamento terapêutico ou profilático da 20 dependência de nicotina, o dito tratamento compreendendo a administração do conjugado a um indivíduo que sofre de dependência de nicotina ou estando em risco de se tornar viciado em nicotina. Os conjugados de nicotina-carreador da presente invenção são altamente estáveis e podem ser armazenados por vários meses ou mesmo anos sem perda significante da 25 eficácia imunogênica. Também, a estabilidade in vivo dos cojugados

presentes é muito alta, especialmente se o derivado de nicotina é ligado ao conjugado por um reticulador de succinimida e o derivado de nicotina e reticulador são ligados por uma ligação de tioéter. Além disso, os conjugados presentes de nicotina-carreador podem ser produzidos usando não mais do 5 que algumas etapas de síntese relativamente simples, produzindo um produto

conjugado bem definido em alto rendimento. DESCRIÇÃO ETALHADA DA INVENÇÃO

Conseqüentemente, um aspecto da invenção diz respeito a um derivado de nicotina da seguinte fórmula (I):

R-SH R-SH . 1 N 1 CH3 N

10 _{em que o anel de cinco membros ou o anel de seis membros é} substituído com um radical R-SH, em que R representa: CH 2-Y-Z:

- Y representando O, S, NH ou NH-CO; e

- Z representando um alquileno C 1 -C22 linear ou ramificado, um alquenileno C2- C22 linear ou ramificado ou uma porção de polialquileno

15 glicol.

De acordo com uma outra, forma de realização particularmente preferida, na fórmula I, Y representa NH ou NH-CO. Mais preferivelmente, Y representa NH.

De acordo com outra forma de realização preferida, Z na 20 fórmula (I) alquileno C 1 -C4, mais preferivelmente etileno.

O resíduo R-SH na fórmula (I) pode ser ligado às posições 3', 4' ou 5' do anel de cinco membros da molécula de nicotina. Preferivelmente, R é ligado às posições 3'- ou 4', mais preferivelmente à posição 3' do dito anel de cinco membros.

5

preferida, o derivado de nicotina da fórmula (I) é trans-substituído com o resíduo R-SH. Em uma outra forma de realização particularmente preferida, o derivado de nicotina da presente invenção é um derivado de L-nicotina.

Os derivados de nicotina especialmente preferidos da presente 5 invenção são 3 '-(2-mercaptoetilaminometil)nicotina, 3'-(3-

mercaptopropionamidometil)nicotina e 3' -(mercaptoacetamidometil)- nicotina.

Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a um precursor do derivado de nicotina da presente invenção, que é representado 10 pela seguinte fórmula (Ia):

W-CO-S-R

R-S-CO-R'

CH 3

N

em que o anel de cinco membros ou o anel de seis membros é substituído com uma porção R-S-CO-CH 3 , R tendo o mesmo significado como aqui definido aqui antes e em que R' representa um grupo acila inferior, preferivelmente um grupo acila ramificado ou linear compreendendo de 1 a 8 15 átomos de carbono, mais preferivelmente de 1 a 6 átomos de carbono, ainda mais preferivelmente de 1 a 5 átomos de carbono. Em uma forma de realização particularmente preferida R' na fórmula acima representa acila inferior selecionada a partir de formila, acetila, propionila, butirila, valerila e pivaloíla, mais preferivelmente acetila e propionila.

20 Em uma forma de realização particularmente preferida da invenção, o dito percursor é 3'-(S-acetilmercaptacetamido-metil)-nicotina. Estes precursores podem ser facilmente convertidos a um conjugado derivado de nicotina correspondente da presente invenção pela S-desacetilação e conjugação subseqüente, preferivelmente em uma procedimento em um etapa

recipiente de duas etapas. As reações de S-desacetilação adequadas são no geral conhecidas pela pessoa habilitada. Além disso, os inventores descobriram que estes compostos S-acetilmercapto são um tanto insensíveis à oxidação, isto é, formação de dímeros de dissulfeto, e o precursor é muito 5 mais conveniente manusear durante a purificação e armazenagem do que os

derivados de nicotina correspondentes.

Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a um conjugado de hapteno-carreador da seguinte fórmula (II):

R-S-espaçad r- carreador

R-SH

!`

CH3

em que o anel de cinco membros ou o anel de seis membros é 10 substituído com um radical R-SH; p é 1 a 500; e R tem o mesmo significado

como aqui definido antes em relação à fórmula (I).

O carreador utilizado no conjugado de hapteno-carreador da presente invenção pode ser qualquer material imunogênico que possa ser seguramente usado em seres humanos e que possa ser quimicamente ligado ao 15 presente derivado de nicotina. Em uma forma de realização preferida, o

carreador é selecionado a partir do grupo que consiste de substâncias imunogênicas, vírus, partículas equivalentes a vírus, complexos de proteína, proteínas, polipeptídeos, lipossomas e complexos imuno-estimuladores (ISCOM). De acordo com uma forma de realização particularmente preferida, 20 o carreador é um proteína ou polipeptídeo imunogênicos. Os exemplos

particularmente adequados das proteínas imunogênicas incluem toxóide do tétano, toxóide da difteria, hemocianina do lapa buraco de fechadura (KLH), hemocianina, albumina, toxóide da difteria mutante não tóxico CRM197,

complexo de proteína de membrana externa (OMPC) de Neisseria meningitidis, a sub-unidade B de Escherichia coli instável ao calor, exoproteína A recombinante de Pseudomonas aeruginosa (rEPA) e uma partícula equivalente a vírus montada a partir de proteína de revestimento 5 recombinante de bacteriófago Qb, os exemplos mais preferidos sendo toxóide

do tétano, toxóide da difteria, hemocianina do lapa buraco de fechadura (KLH), hemocianina, albumina, toxóide da difteria mutante não tóxico CRM 197, complexo de proteína de membrana externa (OMPC) de Neisseria meningitidis, a sub-unidade B de Escherichia coli instável ao calor e uma 10 partícula equivalente a vírus montada a partir de proteína de revestimento

recombinante de bacteriófago Qb. Em uma forma de realização preferida da invenção um conjugado de hapteno-carreador como aqui definido é fornecido, em que o carreador é uma proteína e em que a razão molar de hapteno:proteína excede 1.

15 O espaçador no presente imunoconjugado covalentemente liga o derivado de nicotina ao carreador. O espaçador que pode ser usado para reticular os haptenos e carreadores (especialmente componentes de proteína/polipeptídeo) são bem conhecidos na técnica. Preferivelmente, na presente invenção, o espaçador é um resíduo de um reticulador 20 heterobifuncional, notavelmente um reticulador de succinimidila, como:

- Bromoacetato de N-succinimidila,

- 3-(bromoacetamido)propionato de N-succinimidila (SBAP), - Éster de N-(c-maleimidocaproilóxi)succinimida (EMCS), - Éster N-succinimida do ácido N-(N-maleimidilpropioni1)-9- 25 amino-4,7-dioxanonaóico (NHS-PEG2-maleimida), ou

- 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidila (SPDP),

reticulador este que é usado para modificar o carreador para dar um carreador reativo em sulfidrila. Em uma segunda etapa, o derivado de nicotina é ligado a proteína reativa em sulfidrila para dar o imunoconjugado

em que o espaçador derivado do reticulador hetero-bifuncional conecta o derivado de nicotina ao carreador. De acordo com uma forma de realização preferida, no conjugado presente, o hapteno e o espaçador são ligados juntos por uma ligação de tioéter. Os conjugados em que o hapteno o espaçador são 5 ligados por uma ligação de tioéter oferece a vantagem de estabilidade alta in

vivo.

Um outro aspecto da presente invenção diz respeito ao uso de um conjugado de hapteno-carreador como aqui definido antes na preparação de uma composição de vacina, especialmente uma composição de vacina para 10 o uso em um método de prevenir ou tratar a dependência de nicotina, o dito

método compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do conjugado de hapteno-carreador. Os conjugados da presente invenção oferecem a vantagem de que eles são altamente estáveis sob condições in vivo. Além disso, os conjugados presentes de hapteno-carreador podem ser 15 preparados de uma forma bem definida que significa que o risco de efeitos

colaterais indesejáveis é eficazmente minimizado.

Os modos adequados de administração incluem administração subcutânea, intramuscular, transmucósica e intravenosa. Mais preferivelmente, a composição de vacina é administrada subcutânea ou 20 intramuscularmente.

Acredita-se que o efeito de dependência da nicotina esteja associado com a capacidade de nicotina para cruzar a barreira hemato-encefálica. O método presente de tratar ou prevenir a dependência de nicotina conta com impedir a nicotina de cruzar a barreira hemato-encefálica. Em 25 particular, a administração de um conjugado de nicotina de hapteno-carreador

a uma pessoa gerará anticorpos contra nicotina, na corrente sangüínea da pessoa. Se a pessoa fuma, a nicotina no seu sangue será ligada pelos anticorpos anti-nicotina circulantes, impedindo a nicotina de atingir o cérebro. Portanto, os anticorpos impedirão os efeitos fisiológicos e psicológicos de

nicotina que se originam no cérebro. Porque o fumante experienciará uma diminuição ou cessação destes efeitos, ele/ela deixarão o desejo de fumar. Os mesmos efeitos terapêuticos são esperados se uma pessoa usa tabaco sem fumaça, depois sendo imunizado com um conjugado de nicotina de hapteno- 5 carreador da invenção. Adicionalmente, os conjugados e anticorpos da

invenção podem exercer seus efeitos afetando a capacidade da nicotina para estimular o sistema nervoso periférico.

Os conjugados da invenção são adequados para tratar e prevenir a dependência de nicotina. Para tratar a dependência de nicotina, o 10 conjugado nicotina-carreador da invenção é administrado a uma pessoa que sofre de dependência de nicotina. Para prevenir a dependência de nicotina, as pessoas em risco de desenvolver a dependência de nicotina são tratados com o conjugado de acordo com a invenção.

Uma composição de vacina da presente invenção compreende 15 pelo menos um conjugado de hapteno de nicotina-carreador em uma

quantidade suficiente para evocar uma resposta imune para isso. A vacinação inicial com o conjugado de hapteno de nicotina-carreador da presente invenção cria altos títulos de anticorpos que são específicos para a nicotina. A quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado que é administrado a 20 uma pessoa em necessidade de tratamento para dependência de nicotina é prontamente determinada pelo técnico habilitado. As faixas de dosagem adequadas são de 1 a 1000 gg/dose. Esta faixa de dosagem no geral faz com que uma pessoa leve de uma a várias semanas para gerar anticorpos contra um antígeno estranho. A produção de anticorpos no sangue da pessoa pode ser 25 monitorada usando-se técnicas que são bem conhecidas pelo técnico habilitado, tais como ELISA, radioimunoensaio, ressonância de plasma de superficie, e métodos de Western blotting. A efetividade terapêutica também pode ser monitorada pela avaliação de vários efeitos fisicos da nicotina, tal como a pressão sangüínea.

Será entendido que a administração inicial do presente conjugado imunogênico pode ser seguido pela administração subsequente de um ou mais "reforçadores" de conjugado. Um tal reforçador aumentará a produção de anticorpos contra o conjugado de hapteno de nicotina-carreador 5 da invenção.

As composições de vacina da presente invenção podem conter pelo menos um adjuvante. O adjuvante usado na presente invenção será selecionado de modo que o efeito da proteína carreadora não é inibida. Os adjuvantes usados na presente invenção são aqueles que são fisiologicamente 10 aceitáveis pelos seres humanos, estes incluem, mas não são limitados a

hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, adjuvantes de emulsão com base em óleo/tensoativo tais como Montanide ® em que tensoativos diferentes (especialmente oleato de manitila) são combinados com um óleo mineral, emulsões contendo esqualeno tais como MF59 ®, monofosforil lipídio A, ou 15 lipopolissacarídeo mutante de Neisseriae (como descritos na

PCT/NL98/0063).

As composições de vacina da presente invenção opcionalmente podem conter um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Os excipientes adequados incluem água estéril, soluções salinas e 20 tampões. De acordo com uma forma de realização preferida, a composição de vacina dos conjugados presentes de hapteno-carreador solubilizada em uma solução aquosa, salina em um pH farmaceuticamente aceitável. Alternativamente, a composição de vacina compreende uma suspensão do conjugado de hapteno-carreador.

25 Adicionalmente, a composição de vacina opcionalmente podem conter pelo menos um agente auxiliar, tal como meios de dispersão, camadas, microesferas, lipossomas, microcápsulas, lipídeos, tensoativos, lubrificantes, conservantes e estabilizadores.

é estéril. Além disso, a composição pode conter componentes que preservem contra infestação com, e crescimento de, microorganismos.

É preferido que a composição de vacina seja fabricada na forma de um líquido aquoso estéril que está pronta para administração 5 imediata.

Os derivados de nicotina de acordo com a presente invenção podem ser vantajosamente ligados aos carreadores usando vias de síntese que não produzem conjugados de proteína-proteína. Porque tais conjugados de proteína-proteína afetam adversamente a solubilidade assim como a eficácia 10 da composição de vacina, um outro aspecto da invenção diz respeito a uma

composição de vacina compreendendo um conjugado de hapteno-carreador de acordo com a presente invenção e um excipiente farmaceuticamente aceitável, em que a composição de vacina não contém nenhum conjugado de proteína-proteína.

15 A invenção é ilustrada ainda por meio dos seguintes exemplos. EXEMPLOS

Exemplo 1

Trans-3'-nicotino-N-(2-mercaptoetil)carboxamida (1) foi sintetizado como segue:

20 N,N' -B is-(trans-4'-cotininilcarbonipcistamina (A)

Uma mistura de 1,00 g (4,54 mmol) ácido trans-4'-cotinino-carboxílico, 0,45 g (2,00 mmol) de dicloridreto de cistamina e 0,68 g (4,44 mmol) de N-hidroxibenzotriazol foi concentrada a partir de 25 ml de N,N-dimetilformamida secada duas vezes. O resíduo foi dissolvido em 25 ml de 25 dimetilformamida secado e 0,80 ml (4,59 mmol) de

N,N-diisopropiletilamina e 0,68 ml (4,39 mmol) de N,N'-diisopropil-carbodiimida foram adicionadas. A mistura foi agitada na temperatura ambiente. Depois de 20 horas, 4 ml (0,2 mol) de água foram adicionados e a agitação foi continuada por 1 hora. Depois, a mistura foi concentrada a vácuo. O resíduo

foi absorvido em 100 ml de KHSO 4 0,5 M e lavado com clorofórmio (3 x 25 ml). O Na2CO3.H20 sólido (8,0 g) foi adicionado lentamente à camada aquosa que foi depois extraída com clorofórmio (3 x 25 ml). As camadas orgânicas foram combinadas, secadas (MgSO4), filtradas e concentradas para dar o 5 composto A como um xarope que foi usado na etapa seguinte sem purificação Uma amostra pequena do composto A em clorofórmio foi acidificada com ácido trifluoroacético e depois concentrada. O resíduo foi concentrado a partir de metanol (2 x 10 ml); 1H RMN (D20), 848,84 - 8,86 (m, 2 x 2H), 8,59 - 8,64 (m, 2 x 1H), 8,17 (dd, 2 x 1H), 5,14 (d, 2 x 1H), 3,45 - 10 3,85 (m, 2 x 2H), 3,17 - 3,24 (m, 2 x 1H), 2,93 - 3,02 (m, 2 x 1H), 2,76 - 2,86 (m, 2 x 3H), 2,71 (s, 2 x 3H). 13C RMN (D20), 8 180,0, 176,4, 149,2, 145,5,

143,9, 142,9, 131,8, 68,0, 50,1, 41,6, 40,1, 37,5, 32,0. Espectrometria de massa de pulverização de íon:

mui+

Trans-4' -cotinino-N-(2-mercaptoetil)carboxamida (B)

15 Composto A 2 mmol, base livre) foi dissolvido em 20 ml de metanol e concentrado. O resíduo foi redissolvido em 20 ml de metanol / água, 99/1, v/v, e 0,60 g (2,10 mmol) de cloridreto de tris-(2- carboxietil)fosfina adicionado. A mistura foi agitada na temperatura ambiente por 3 horas, o período no qual a fosfina gradualmente dissolveu. Depois, a 20 mistura foi diluída com 100 ml de clorofórmio e lavada com 50 ml de NaHCO3 1 M. A camada aquosa foi extraída com clorofórmio (2 x 25 ml). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com 50 ml de NaHCO 3 1 M mais uma vez e novamente a camada aquosa foi extraída com clorofórmio (2 x 25 ml). As camadas orgânicas foram combinadas, secadas (MgSO 4), e 25 filtradas. O filtrado foi concentrado para dar B como um xarope de

aproximadamente 97 % de pureza, como determinado pela TLC e HPLC. A análise de HPLC foi realizada usando uma HPLC de Waters Alliance 2695 que foi equipada e operada como segue:

Fluxo: 0,2 ml/min, divisor no detetor de UV Eluentes A: Água, TFA a 0,1 %

Eluentes B: Acetonitrila, TFA a 0,08 %

Gradiente: em 20 minutos de 5 % a 67 % de eluentes B

5 Detecção: UV - Waters PDA 996: 254 nm; Massa - Micromassa Quattro Micro API: ES+

Espectrometria de massa de pulverização de íon: MiEl ÷ (encontrado/calculado) 280/280. 1H RMN (CDC13), 3 8,61(dd, 1H), 8,52 (d, 1H), 7,58 (dt, 1H), 7,34 - 7,39 (m, 1H), 6,04 (br, 1H), 4,77 (dd, 1H), 3,33 - 10 3,50 (m, 2H), 2,72 - 2,88 (m, 3H), 2,60 - 2,66 (m, 2H), 2,65 (s, 3H),1,26 (t, 1H). 13C RMN (CDC1 3), 3 173,2, 170,8, 150,2, 148,7, 135,3, 134,6, 124,3, 65,0, 48,6, 42,6, 34,6, 28,6, 24,6. Trans-3 '-(2-mercaptoetilaminometil)nicotina (1):

Composto bruto B 2 mmol) foi concentrado a partir de 15 tetraidrofurano seco (2 x 5 ml) e dissolvido em 10 ml de tetraidrofurano seco.

A solução foi adicionada lentamente a 10 ml complexo de borano-tetraidrofurano 1 M em borano-tetraidrofurano sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente por 20 horas. Metanol seco (5 ml) foi adicionado e a mistura foi concentrada. O resíduo foi 20 concentrado a partir de metanol seco (3 x 10 ml) e dissolvido em 10 ml HC1 1

N. Depois, 50 ml de NaHCO 3 1 M foram adicionados lentamente e a mistura foi extraída com clorofórmio (3 x 25 ml). As camadas orgânicas foram combinadas, secadas (MgSO4) e filtradas ácido trifluoroacético (0,45 ml, 6 mmol) foi adicionado ao filtrado que foi depois concentrado. O resíduo foi 25 concentrado a partir de metanol (2 x 10 ml) e purificação adicional usando

HPLC foi realizada. Exemplo 2

Os imunoconjugados são preparados partindo de hapteno contendo tiol descritos no Exemplo 1, usando a metodologia descrita por J.

W. Drijfhout e P. Hoogerhout: "Methods of preparing peptide-carrier conjugates" Em: Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (W. C. Chan e P. D. White, eds.). Oxford University Press, 2000, pp. 229-241.

5 Materiais

• Os carreadores: toxóide do tétano (TTd) ou albumina sérica bovina, (BSA).

• Reticuladores: Bromoacetato de N-succinimidila, 3-(bromo-acetamido)propionato de N-succinimidila (SBAP), éster de N-succinimida do 10 ácido N-(N-maleimidilpropionil)-9-amino-4,7- dioxano-naóico (NHS-PEG2-

maleimida), e 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidila (SPDP).

O carreador é dissolvido em um tampão de fosfato de sódio 0,1 M, pH 8, em uma concentração de 3,0 mg/ml para TTd e 3,0 mg/ml para BSA. O reticulador é recém dissolvido em N,N-dimetilacetamida em uma 15 concentração de 0,20 M ou 80 mM. Uma alíquota de 50 gl de reticulador a 0,20 M é adicionada à solução de TTd a 1,75 ml, ao passo que 50 gl de reticulador a 80 mM é adicionado à solução de BSA a 1,75 ml. As soluções são misturadas e deixadas repousar na temperatura ambiente por 1 hora. Depois, a mistura de reação é aplicada a uma coluna PD1O® equilibrada em 20 um tampão de fosfato de sódio 0,1 M, contendo 5 mM de EDTA, pH 6 (desaerado com hélio). A eluição é efetuada com o mesmo tampão. A proteína modificada é coletada em um volume de 3,0 ml e usada imediatamente para a conjugação dos haptenos contendo tiol.

O hapteno purificado contendo tiol (trifluoroacetato) (3-4 25 pmol) é dissolvido em 250 gl de água e adicionado a 2,0 ml de uma solução

recém preparada do carreador reativo em sulfidrila em um tampão de fosfato de sódio 0,1 M, contendo 5 mM de EDTA, pH 6. As soluções são misturadas e deixadas repousar na temperatura ambiente por 16 a 24 horas. Depois, a mistura de reação é aplicada a uma coluna PD-10 ® equilibrada em solução

salina tamponada com fosfato, pH 7,2 (PBS). A eluição é efetuada com o mesmo tampão. O imunoconjugado (,'-'‘ 3,5 mg) é coletado em um volume de 3,5 ml e armazenado a 2 a 8° C até a preparação de um vacina.

Os conjugados preparados a partir de haptenos contendo tiol e 5 proteínas modificadas por piridilditiopropionila mostraram razões molares de

heptano/proteína de aproximadamente 60 e 30, para TTd e BSA respectivamente.

Exemplo 3

Vacinas e imunização

10 As vacinas são preparadas pela diluição apropriada das soluções de estoque (1 mg/ml) dos conjugados preparados a partir de compostos 1 e TTd bromoacetilado e TTd (bromoacetamido)-propionilado com uma suspensão de fosfato de alumínio (0,51,5 mg/ml) em PBS, pH 7. PBS simples é diluído com suspensão de fosfato de alumínio para se obter 15 uma vacina simulada. Os grupos de oito camundongos são imunizados nos

dias O e 28 com composições de vacina contendo 50 In de imunoconjugado e 75 gg AIPO,' em 0,3 ml de PBS. Os soros são coletados no dia 42 e armazenado a -20° C até o uso.

Exemplo 4

20 Títulos de anticorpo

Os títulos de anticorpo nos soros do Exemplo 3 são determinados pelo ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA). O conjugado de hapteno-BSA do Exemplo 2, preparado pelo uso do reticulador de NHS-PEG2-maleimida, foi usado como antígeno de revestimento. A 25 nicotina, cotinina, ou acetilcolina foram usados como inibidores em uma

inibição ELISA.

O conjugado testado foi encontrado para induzir títulos de anticorpo satisfatórios em camundongos. A resposta é específica da nicotina. Os anticorpos não reagem cruzado significantemente com cotinina ou

acetilcolina. Exemplo 5

Trans-3'-(3-mercaptopropionamidometil)nicotina (2) foi sintetizado como segue:

5 Uma mistura de 90 mg (0,47 mmol) de 3'-aminometil-nicotina [Pentel et al. 2000], 0,42 g (2,0 mmol) de ácido 3,3'-ditiodi-propiônico, e 144 mg (1,0 mmol) de hidrato de hidroxibenzotriazol foi concentrada a partir de 5 ml de N,N-dimetilformamida secada duas vezes, redissolvida em 5 ml de N,N-dimetilformamida seca, e 155 gm (1,0 mmol) de N,N'- 10 diisopropilcarbodiimida adicionados. A mistura de reação foi agitada durante

a noite na temperatura ambiente. Depois, 100 p,1 de água foram adicionados e a agitação foi continuada por 1 hora. Finalmente, 0,43 g (1,5 mmol) de cloridreto de tris-carboxietilfosfina foi adicionado e a agitação foi continuada por mais 3 horas. A mistura de reação foi concentrada. O resíduo foi 15 absorvido em 10 ml de KHSO 4 0,5 M e lavado com clorofórmio (4 x 3 ml). A camada aquosa foi neutralizada pela adição lenta de Na 2CO3 sólido e extraída com clorofórmio (4 x 3 ml). a camada orgânica foi secada (MgSO 4), filtrada e concentrada para dar 2 como o produto principal (MI-1 + = 279,9). o composto puro foi obtido pela HPLC preparativa.

20 Exemplo 6

Trans-3'-(S-Acetilmercaptacetamidometil)nicotina (precursor de 3) foi preparado como segue:

90 mg (0,47 mmol) de 3'-Aminometilnicotina [Pentel et al. 2000] foram dissolvidos em 5 ml de acetonitrila e 144 mg (1,0 mmol) de 25 hidrato de hidroxibenzotriazol e 165 mg (0,55 mmol) de

S-acetil-mercaptoacetato de pentafluorofenila foram adicionados. Depois de 2 horas, 77 111 (1,0 mmol) de ácido trifluoroacético foram adicionados e a mistura de reação foi concentrada. 3'-(S-acetilmercaptacetamidometil)-nicotina foi purificada pela HPLC preparativa e mostrou MEI + = 308,0 pela análise

espectrométrica de massa. O composto purificado foi armazenado a -20° C até o uso na conjugação. O composto 3 foi gerado a partir de 3'-(S-acetilmercaptacetamidometil)nicotina pela S-desacetilação com por exemplo, hidroxilamina. É mais conveniente realizar a desacetilação na presença de 5 uma proteína reativa em sulfidrila [Drijfhout e Hoogerhout 2000] para dar de

um conjugado de nicotina sem a isolação do intermediário de 3. Exemplo 7

As vacinas da invenção são preparadas a partir de conjugados de toxóide do tétano dos compostos 1, 2 e 3 de acordo com os métodos 10 descritos nos exemplos 2 e 3. Cada vacina foi testada em um grupo de oito

camundongos pela imunização nos dias O e 28 com composição de vacina contendo 50 lig de imunoconjugado e 75 Kg A1PO 4 em 0,3 ml de PBS. O soro foi coletado no dia 42, os títulos de anticorpo dos soros foram determinados por Direct ELISA usando os conjugados hapteno-BSA homólogos. 15 Subseqüentemente os soros coletados dos quatro grupos de camundongos foram testados em um conjugado de hapteno 1-BSO ("1-BSA") por Direct ELISA. ELISA's de inibição usando nicotina e acetilcolina respectivamente no conjugado hapteno 1-BSO foram usados para avaliar a afinidade de ligação da nicotina e especificidade dos anticorpos de anti-nicotina dos soros 20 coletados de quatro grupos de camundongos.

ELISA Direto

Os reservatórios de placas de microtítulo foram incubados com 100 I.11 de soluções de conjugados de hapteno BSA (0,5 gg/m1) em PBS durante a noite na temperatura ambiente. As placas foram lavadas com água 25 de torneira contendo 0,04 % de Tween 80. Os reservatórios incubados com 100 gl de diluições em série de soros individuais em 0,1 % de Tween 80 em PBS por 60 minutos a 37° C. As placas foram lavadas com água de torneira contendo 0,04 % de Tween 80 e os reservatórios incubados com 100 vil de uma solução de uma diluição de 1:5.000 de IgG anti-camundongo de cabra

rotulada com peroxidase de rábano em 0,1 % de Tween 80 em PBS por 60 minutos a 37° C. As placas foram lavadas novamente com água de torneira contendo 0,04 % de Tween 80. A solução do substrato foi recém preparada pela adição sucessiva de 100 gl de 3,3',5,5'- tetrametilbenzidina (10 mg/ml) 5 em 96 % de etanol e 4 gl de 30 % de peróxido de hidrogênio em 10 ml de tampão de acetato de sódio 0,11 M/ácido cítrico, pH 5,5. cada reservatório foi incubado com 100 gl solução de substrato por 10 minutos na temperatura ambiente. Finalmente, a reação foi extinta pela adição de 100 gl de ácido sulfúrico 2 M e a densidade óptica a 450 nm foi lida. O título é calculado 10 como o logaritmo da diluição recíproca do soro a 50 % da densidade óptica

máxima (0D50). ELISA de Inibição

As alíquotas iguais dos soros de oito camundongos de cada grupo foram misturadas e diluídas 1:400.000 em 0,1 % de Tween 80 em PBS. 15 O inibidor (nicotina, cotinina, ou acetilcolina) foi dissolvido em uma

concentração de 10 -1 M no soro reunido diluído a 1:400.000. Diluições de dez vezes em série (até 10 12 M) do inibidor foram feitas na diluição do soro a

1:400.000 fixa.

As placas foram revestidas com conjugado de hapteno-BSA e 20 lavadas como descritos acima. Na segunda etapa, os reservatórios incubados com 100 gl da solução inibidora por 60 minutos a 37° C e, depois disso, lavada com água de torneira contendo 0,04 % de Tween 80. A incubação com IgG anticamundongo de cabra rotulada com peroxidase de rábano e, depois disso, o substrato foi realizado como descrito acima. O título é calculado 25 como o logaritmo de base 10 negativo da concentração do inibidor (mol/L) a

50 % de densidade óptica máxima (0D 50). Os valores de IC 50 são determinados a partir de um gráfico em que o OD (a 450 nm) é plotado contra o logaritmo de base 10 negativo da concentração do inibidor (em mol/L).

Os títulos de anticorpos médios dos soros determinados por Direct ELISA no conjugado homólogo de hapteno-BSA são mostrados na tabela 1.

Tabela 1

diluição recíproca do soro em log OD50 média no conjugado homólogo

Hapteno 1 5,9 + 0,3 Hapteno 2 5,6 ± 0,1 Hapteno 3 5,4 ± 0,4

5 Os títulos de anticorpos médios dos soros determinado por Direct ELISA nos revestimentos de conjugado de 1-BSO são mostrados na tabela 2.

Tabela 2

diluição recíproca do soro em log OD50 média no 1-BSA

Hapteno 2 5,9 ± 0,3 Hapteno 3 5,7 ± 0,4

Os resultados dos ELISA's de inibição no revestimento de 10 conjugado de 1-BSA com nicotina como inibidor são mostrados na figura 1,

que representa um gráfico em que o OD (a 450 nm) é plotado contra logaritmo na base 10 negativo da concentração do inibidor (em mol/L).

O gráfico mostra que em 1-BSA, IC 50 da nicotina é maior para o anticorpo do camundongo imunizado com o conjugado de hapteno 1 e o 15 menor para os anticorpos de camundongos imunizados com o conjugado de

hapteno 3.

Os resultados dos ELISA's de inibição sobre o revestimento de conjugado 1-BSA com acetilcolina como inibidor são mostrados na figura 2, que representa um gráfico em que o OD (a 450 nm) é plotado contra 20 logaritmo na base 10 negativo da concentração do inibidor (em mol/L).

Os resultados de inibição ELISA usando acetilcolina mostram que a ligação do anticorpo de nicotina é específica.

Com base nestes resultados foi concluído que os conjugados de haptenos 1, 2 e 3 com toxóide do tétano carreador de acordo com a

presente invenção, podem ser adequadamente usados para induzir respostas de anticorpo anti-nicotina em camundongos e assim fornecem vacinas adequadas para o tratamento terapêutico ou profilático da dependência de nicotina.

REIVINDICAÇÕES

1. Derivado de nicotina, caracterizado pelo fato de que é da seguinte fórmula:

R-SH R-SH

CH 3

em que o anel de cinco membros ou o anel de seis membros é 5 substituído com um radical R-SH, em que R representa: CH 2-Y-Z:

- Y representando O, S, NH ou NH-CO; e

- Z representando um alquileno C 1 -C22 linear ou ramificado, um alquenileno C2 -C22 linear ou ramificado ou uma porção de polialquileno

glicol.

10 2. Derivado de nicotina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Y representa NH ou NH-CO.

3. Derivado de nicotina de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que Y representa NH.

4. Derivado de nicotina de acordo com qualquer uma das 15 reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que Z representa um

alquileno C 1 -C4, preferivelmente etileno.

5. Derivado de nicotina de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que R é ligado às posições 3' ou 4', preferivelmente à posição 3' do anel de cinco membros. 20 6. Derivado de nicotina de acordo com qualquer uma das

reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o derivado é 3'-(2- mercaptoetil-aminometil)-nicotina.

7. Derivado de nicotina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o derivado é 3'-(3 - 25 mercaptopropionamidometil)-nicotina.

R-S-espaçad r- carreador

R-SH

CH3

2

8. Derivado de nicotina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o derivado é 3'- (mercaptoacetamidometil)-nicotina.

9. Precursor de derivado de nicotina, caracterizado pelo fato de 5 que é representado pela seguinte fórmula:

RI-CO-S-R i R-S-CO-R' N ₁ CH 3 N

em que o anel de cinco membros ou o anel de seis membros é substituído com uma porção R-S-CO-CH 3 , R tendo o mesmo significado como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 e em que R' representa um grupo acila inferior.

10 10. Precursor de derivado de nicotina de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o precursor é 3'-(S-acetilmercaptacetamidometil)nicotina.

11. Conjugado de hapteno-carreador, caracterizado pelo fato de que é da seguinte fórmula:

P

15 em que o anel de cinco membros ou o anel de seis membros é substituído com um radical R-SH; p é de 1 a 500; e R tem o mesmo significado de acordo com a reivindicação 1.

reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o carreador é selecionado do grupo que consiste de substâncias imunogênicas, vírus, partículas equivalentes a vírus, complexos de proteína, proteínas, polipeptídeos, lipossomas e complexo de imuno-estimuladores (ISCOM).

5 13. Conjugado de hapteno-carreador de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o carreador é uma proteína selecionada do grupo que consiste de toxóide do tétano, toxóide da difteria, hemocianina do lapa buraco de fechadura (KLH), hemocianina, albumina, toxóide da difteria mutante não tóxico CRM197, complexo de proteína de 10 membrana externa (OMPC) de Neisseria meningitidis, a sub-unidade B de

Escherichia coli instável ao calor, exoproteína A recombinante de Pseudomonas aeruginosa (rEPA) e uma partícula equivalente a vírus montada a partir de proteína de revestimento recombinante de bacteriófago Qb.

14. Uso de um conjugado de hapteno-carreador, caracterizado 15 pelo fato de ser na preparação de uma composição de vacina para o uso em um método de prevenir ou tratar a dependência de nicotina, o dito método compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do conjugado de hapteno-carreador como definido em qualquer uma das reivindicações de 11 a 13.

20 15. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende o conjugado de hapteno-carreador como definido em qualquer uma das reivindicações de 11 a 13 e um excipiente farmaceuticamente aceitável, em que a vacina não contém nenhum conjugado de proteína-proteína.

ELISA de inibição de nicotina em 1-BSA

■

á

à

1,6— 1,4— 1,2— ■ hapteno 1 A hapteno 2 0 hapteno 3

Ar....■"■„„nédt...Ar...n&■•■.4...■ier,

2 4 1 6 8 10 12 14 1 - LOG M E 1,0— c. V. 0,8— 0 O _0,6— 0,4— 0,2— 0 0

RESUMO

"DERIVADO DE NICOTINA, PRECURSOR DE DERIVADO DE NICOTINA, CONJUGADO DE HAPTENO-CARREADOR, USO DE UM CONJUGADO DE HAPTENO-CARREADOR, E, COMPOSIÇÃO DE 5 VACINA"

A presente invenção fornece um hapteno na forma de um novo derivado de nicotina que pode ser adequadamente conjugado com um carreador apropriado para produzir uma vacina eficaz contra a dependência de nicotina. Mais particularmente, a invenção diz respeito a um derivado de 10 nicotina da seguinte fórmula (I):

R-SH R-SH

CH3

A presente invenção também diz respeito a um conjugado de hapteno-carreador derivado do derivado de nicotina anteriormente mencionado e uma composição de vacina compreendendo o dito conjugado de hapteno-carreador.